Summary
I denne metoden er embryonale hjerte vev kirurgisk microdissected, dissosiert fluorescently merket og implantert i vert embryonale vev. Dette gir en plattform for å studere den person eller vev nivå utviklingsmessige organisasjonen under ektopisk hemodynamic forhold og/eller endrede paracrine/juxtacrine miljøer.
Abstract
Tolke relative effekten av cellen autonome mønstre mot ytre microenvironmental innflytelse på celle avstamning besluttsomhet representerer en generell utfordring i utviklingspsykologi biologi forskning. I embryonale hjertet, dette kan være spesielt vanskelig som regionale forskjeller i uttrykket av transcriptional regulatorer, paracrine/juxtacrine signalnettverk signaler, og hemodynamic kraft er kjent for å påvirke cardiomyocyte modning. En forenklet metode for å endre en utvikle cardiomyocyte molekylære og biomekaniske microenvironment vil derfor være en kraftfull teknikk for å undersøke hvordan lokale forhold innflytelse celle skjebne og funksjon. For å løse dette, har vi optimalisert en metode for å fysisk transplantasjon juvenile cardiomyocytes i ektopisk steder i hjertet eller de omkringliggende embryonale vev. Dette tillater oss å undersøke hvordan microenvironmental forhold innflytelse cardiomyocyte skjebne overganger enkeltcelle oppløsning i intakt fosteret. Her beskriver vi en protokoll som embryonale myocytter kan være isolert fra en rekke cardiac underdomener atskilt, fluorescently merket og microinjected til verten embryo med høy presisjon. Cellene kan bli direkte analysert i situ bruker en rekke bildebehandling og histologiske teknikker. Denne protokollen er et kraftig alternativ til tradisjonelle pode eksperimenter som kan være prohibitively vanskelig i et bevegelig vev som hjertet. Oversikt over denne metoden også kan tilpasses en rekke donor vev og vertsmiljøer, og dens lette av bruk, lave kostnader, og hastighet gjør det et potensielt nyttig program for en rekke utviklingsmessige studier.
Introduction
CARDIAC utviklingsmessige forskning har nytt godt enormt fra ankomsten av germline transgene modellsystemer som har identifisert mange av genet regulatoriske nettverkene som mønster ulike celle overleveringslinjer og funksjonelle domener i hjertet. Imidlertid kan identifisere hvordan disse genet nettverk samhandle med og svare microenvironmental forhold, inkludert paracrine/juxtacrine signaler og Biofysiske innganger (strekk, belastning, hemodynamic flyt), være utfordrende. Som sådan, er det ikke alltid lett å avgjøre om en mobilnettet fenotypen oppstår som en direkte konsekvens av en genetisk forstyrrelsene eller som en sekundær resultatet av en tilpasning til endringer i cardiac biomekanikk eller høyere orden vev komposisjon1,2 .
Pode eksperimenter, som klassisk blitt brukt til adressen konsepter av skjebnen-spesifikasjonen, vil engasjement, induksjon og kompetanse3,4, representere en ideell tilnærming til å omgå noen av utfordringene som er iboende i definere celle autonome mot miljømessige påvirkning i hjertet. Dessverre gjør hjertet sammentrekninger standard pode tilnærmingsmåter vanskelig. Rask bevegelse av vev forhindrer ofte podet celler fra å hjertet og store vev punkteringer (normalt kreves for pode) ofte føre til hjertesvikt og embryonale dødelighet5,6,7. Derfor har vi utviklet en trykk-basert, microinjection systemet for presisjon mobilnettet implantasjon i utviklingsland chick hjertet, omgå den tekniske hekk av vev pode beskrevet tidligere8,9. Bruker denne teknikken, kan individuelle eller små grupper av cardiac celler isolert fra en donor fosteret bli microinjected til en rekke områder av en vert embryonale hjerte eliminerer behovet for omfattende vert forberedelse og store vev fornærmelser som oppstår ved hjelp av standard pode teknikker. Microinjection nålene brukes for disse implantasjon studier har en ytre diameter på ~ 30−40 µm, som betyr at nålen kan plasseres direkte i vevet (dvs. kan trenge embryonale hjerteinfarkt veggen) og celler focally leveres med minimal skade de omkringliggende vev. Protokollen kan brukes til å utføre en rekke isotopanrikning, heterotopic, Isokor og heterochronic manipulasjoner, gir en rask, fleksibel og rimelig tilnærming for å direkte undersøke klassisk eksperimentelle embryologiske paradigmer i utviklingsland 4-chambered hjerte.
I protokollen skissert nedenfor, vi merke giver celler med en celle permeant fluorescerende farge, som gjør at suksessen til en microinjection eksperiment overvåkes i sanntid og plasseringen av engrafted celler dokumenteres uten behov for noen ekstra flekker. Det bør imidlertid bemerkes at denne tilnærmingen er best egnet for kortsiktige eksperimenter (ca 48 h) som fluorescerende fargestoff kan gå tapt gjennom celledeling. Alternative tilnærminger kan brukes for lengre sikt eksperimenter.
Mens vi presenterer denne teknikken i sammenheng med hjerte utvikling, har vi brukt den med stor virkning for cellen implantasjon eksperimenter i mesoderm, hodet, lemmer og somites. Slik den grunnleggende fremgangsmåten beskrevet nedenfor er svært tett og kan brukes i en rekke organsystemer.
Protocol
Alle metodene beskrevet følge retningslinjer for dyr omsorg av The University of North Carolina i Chapel Hill.
1. utarbeidelse av mikro-injeksjon Pipetter
- Trekk glass kapillærene bruker en brønnene avtrekker. For noen injeksjoner, er nål innstillingsmuligheter anbefalt som det gir en svært skarpe overflate uten strukturelle urenheter. Dette polske slutten av en trakk nål på beveling hjul i en vinkel på 45° i 15−20 min.
Merk: Nøyaktige innstillingene for trekking vil variere avhengig av puller blir brukt. Den endelige indre diameteren på skråkanten må være mellom 20−40 µm. - Coat indre og ytre overflater av glasset kapillær med silikon. Først dukkert nålene i siliconizing agent til coat den ytre overflaten av p og deretter backload siliconizing agent løsningen i hver brønnene til coat overflatebehandling.
Merk: Belegg på glasset kapillærene bør gjøres 24 timer før implantasjon eksperimentet. Belegg glass kapillærene med silikon gir en kjemisk inert overflate til glasset. Hvis kapillærene er venstre vil ubehandlet, celle suspensjon generert i senere trinn overholder glasset og koble nålen. Belegget er derfor nødvendig og avgjørende for suksessen til metoden.
FORSIKTIG: Siliconizing agent er en ferdige kommersielt tilgjengelig blanding av heptane og 1,7-dichloro-1,1,3,3,5,5,7,7-octamethyltetrasiloxane (Tabell for materiale). Det er ekstremt brannfarlig og akutt giftig. Håndtere med riktig PPE i avtrekksvifte.- Å backload nålen, laste ~ 5−10 µL av siliconizing agent i en mikro-injeksjon pipette tips (Tabell for materiale). Plassere mikro-injeksjon i den vide enden av trakk glasset kapillære og plasser tuppen så langt ned som mulig (nær glass pinne-spissen). Løse ut siliconizing agent mens langsomt fjerner lasting pipette for å minimere luftbobler i nålen.
- La siliconizing agent i glass nålen i 10 min, fjerne av aspirating med en ny lasting pipette og tillate nåler tørke over natten i avtrekksvifte.
- Morgenen eksperimentet, skyll glass kapillærene med deionisert vann følge fremgangsmåten i trinn 1.2 og la tørke 3−4 h.
2. forberedelse av løsninger
- Forberede 5 mL av trypsin nøytralisere løsning ved å supplere 4,2 mL Dulbeccos endret Eagle's medium og Ham næringsstoff blanding F12 (DMEM/F12) med 750 µL av Fetal Bovine Serum (FBS) og 50 µL av Penicillin/Streptomycin. Lagre på 37 ° C før bruk.
- Forberede 5 µM merking fargestoff løsning av pipettering 5 µL av 1 mM lager merking fargestoff (i dimethyl sulfoxide [DMSO] Tabellen of Materials) til 995 µL av Hanks balansert salt løsning (HBSS). Vortex for 1 min og butikk på 37 ° C før bruk.
- Forberede fersk paraformaldehyde (PFA) ved å kombinere 10 mL av 32% PFA lagerløsning med 62 mL molekylærbiologi klasse vann og 8 mL 10 x Dulbeccos fosfat-bufret saltvann (DPBS). Siste konsentrasjonen er 4% PFA i 1 x DPBS.
3. forberedelse av verten embryo
- Inkuber fertile chicken egg i en horisontal orientering i en fuktet inkubator på 38 ° C til Hamburger og Hamilton (HH) scenen 1910.
Merk: Scenen valgt for manipulasjon er fleksibel og helt avhengig av målet for hvert enkelt eksperiment. - Score "flat" slutten av egg shell langs egg ekvator med vinklet tang for å gjøre en liten punktering > 1 mm i diameter. Sett inn en 18 G nål med vedlagte 10 mL sprøyte gjennom punktering og fjerne ~ 5 mL albumin.
Merk: Denne anatomiske plasseringen utenfor "air celle" inne i egget og holder albumin lekker når punktering er gjort. Dette trinnet er anbefalt den "faller" embryoet fra egg shell, forebygge skader i de etterfølgende trinnene. - Bruke gjennomsiktige tapen på toppen av egg shell. Score med vinklet tang og skjær et ~2.5 cm vindu med buet tenotomy saks.
- Inspisere scenen embryoet basert på vilkår fastsatt av Hamburger og Hamilton10 og forsegle punktering fra trinn 3.2 med gjennomsiktig tape.
Merk: Her scenen HH 19 embryo brukes som har 37−40 somites utvide til halen bud. Punktering skal ikke tettes til når vinduet åpnes øverst på egg (trinn 3.3). - Injisere ~ 200 µL av blekk/HBSS blanding (1:5) under embryoet bruker en 32 G nål med vedlagte 1 mL sprøyte.
Merk: tusj gir visuell kontrast mellom embryoet og eggeplomme under. Alternativ fargestoffer som nøytral rød eller kommersielt tilgjengelig cyan fluorescerende protein (CFP) eller blå fluorescerende protein (for) fluorescens filteret sett kan brukes til å forbedre kontrast. - Legg 1 mL av HBSS dropwise på embryonale platen og forsegle windowed skjell med parafin film. Plasser egg tilbake i fuktet inkubator til klar for injeksjon.
4. isolering av donor vev
- Inkuber donor fertile chicken egg i en fuktet inkubator på 38 ° C til scenen HH 19 (eller ønsket scenen).
- Fjerne fosteret fra egg og Legg i en 100 x 15 mm Petriskål inneholder sterilt HBSS ved romtemperatur (RT).
- Kirurgisk microdissect atrial donor vev fra hver fosteret ved første isolere hele embryonale hjertet embryoet og deretter av aisolering atria fra hjertet bruke tang, tenotomy saks og microspatula under en stereo dissekere mikroskop. Basseng i et sterilt 1,5 mL microcentrifuge rør som inneholder 1 mL av HBSS på is.
- Når du har samlet alle donor vev, pellets vevet med sentrifugering 1000 x g i 5 min på 4 ° C i en bestemt vinkel microcentrifuge.
5. trypsin fordøyelsen av donor vev
- Resuspend celle pellets i 1 mL av prewarmed 0,05% trypsin-EDTA og ruge på 37 ° C i 15 min i en risting varme blokk på 300 rpm. Alternativt bruke et vannbad med periodisk uro i utvalget.
- Pipetter fordøyelsen løsningen opp og ned for å bryte opp noen gjenværende vev og pellets som i trinn 4.4.
- Resuspend pellet i 1 mL av trypsin nøytralisere løsning og sentrifuger som i trinn 4.4.
- Resuspend cellene i 400 µL av røde fluorescerende merking fargestoff løsning og ruge på 37 ° C for 20 min i en varme blokk. Alternativt bruke et vannbad.
- Når merking reaksjonen er fullført, pellets cellene som i trinn 4.4 og vaskes med 1 mL av HBSS (antall wash trinn kan være varierte mellom 1 og 3).
- Resuspend merket, pelleted cellene i en konsentrasjon av ~ 50 000 celler/µL, som vanligvis resulterer i et 5−10 µL volum avhengig av total-celle avkastningen.
Merk: Cellen konsentrasjoner under ~ 50 000 celler/µL kan resultere i dårlig injeksjon effektivitet.
6. i-vivo injeksjon
- Backload celle suspensjon i en silikon behandlet glass kapillær pipette følge fremgangsmåten i trinn 1.2. Montere Pipetter i press microinjector apparatet.
- Fjern vert embryoer fra fuktet inkubator og plasser i en egg holder under fluorescerende stereo dissekere mikroskop.
- Åpne eggeplomme membranen bruker sterilt fine tang og lag et lite innsnitt (~0.5−1.0 mm i lengde) i pericardium. Ytterligere manipulasjon/disseksjon kan være nødvendig avhengig av regionen du målretter til injeksjon.
- Plasser microinjector slik at spissen av microinjection nålen trenger vevet.
- Trykk injisere cellene, og bruke fluorescerende etiketten til å fastslå at implantert celler finnes i ønsket vev. Bruk enkelt pulser mindre enn 0,5 for typiske injeksjoner, s varighet fra 100-400 hectopascals i trykk.
Merk: Puls lengde og absolutt trykk varierer avhengig av antall celler skal injiseres og kan endres for å passe individuelle behov. - Trekke microinjector apparatet og fjerne egg fra abonnenten etter press sprøytebruk.
- Trykk injisere cellene, og bruke fluorescerende etiketten til å fastslå at implantert celler finnes i ønsket vev. Bruk enkelt pulser mindre enn 0,5 for typiske injeksjoner, s varighet fra 100-400 hectopascals i trykk.
- Legge 1 mL av varm HBSS dropwise på fosteret, forsegle egg bruke gjennomsiktig pakking tape og ruge i fuktet inkubator på 38 ° C for 24 h innlegget implantasjon.
7. isolering og analyse
- Isolere vert embryo i RT HBSS tang, tenotomy saks og microspatula lik trinn 4.3 og ordne i 4% PFA overnatting på 4 ° C med milde rocking.
- Vask embryo 3 x 5 min i HBSS på RT med milde rocking og lagre i HBSS på 4 ° C for videre nedstrøms analyse (mikroskopi, immunohistochemistry, på plass hybridisering, etc.).
Representative Results
Etter 24-timers inkubasjon, hjertet og surround vev av verten embryo ble isolert, fotografert (figur 1A), og behandlet for immunofluorescent analyse. I dette eksemplet donor atrial myocytter var microinjected i den proepicardium av en lignende trinnvis vert fosteret. Verten embryoet ble deretter farget med muskel markøren (MF20 grønn) og 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, blå). Injisert celler (rød) er synlig (figur 1B). Mulige justeringer vurdere hvis celler ikke er synlige inkluderer: donor vev ble over fordøyd (celler dermed ikke knytte), merking fargestoff løsning var også fortynnet, celler var over vasket eller flere celledelinger ført til tap av etiketten.
For å bekrefte at de injiserte cellene i dette eksemplet var hjerteinfarkt, delt vi optisk denne fosteret ved hjelp av en AC confocal mikroskop (figur 1C-E). Bare MF20 positive cellene i den proepicardium (PE) er fluorescerende røde positiv cellene som ble focally implantert.
Figur 1 : Representant bilder av embryo isolert 24 timer innlegget injeksjon. (A) lav forstørrelse brightfield bilde av stammen regionen på en E3.5 (HH scenen 19) chick fosteret. (B) sammenslått bilde viser injisert celler (rød), cardiomyocytes (grønn) og DAPI. Cellene ble isolert fra atria og microinjected i den proepicardium. (C) forstørring AC confocal imaging viser merket celler i kjernen av det proepicardium. (D) forstørring AC confocal imaging bekrefter CT røde merket cellene er cardiomyocytes. (E) tredimensjonale (3D) rekonstruksjon av injisert celler fra paneler D og E. På, atria; OFTE, utstrømming skrift; PE, proepicardium; VT, ventrikkel; MF20, Myosin 4. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Muligheten til å definere hvordan microenvironmental forhold innvirkning cardiac celle skjebne spesifikasjonen og slekten stabilisering er grunnleggende for å skape en kompresjons forståelse av medfødt hjertesykdom også å utvikle effektive protokoller for riktig modning av stilk cellen eller somatisk cell reprograming-baserte cardiomyocytes. Protokollen skissert ovenfor gir etterforskerne muligheten til å direkte analysen cardiac celle utvikling under endret i vivo forhold, slik at cellen autonome modning prosesser skal skilles fra paracrine/juxtacrine og/eller hemodynamic signaler. Kombinert med høy oppløsning bilder, genetisk analyse og fysiologiske analyser, kan denne teknikken fungere som et kraftig supplement til eksisterende transgene modeller.
Form et teknisk stand punkt, protokollen presenteres her er avhengig av effektiv isolasjon, merking og presis implantering av donor hjerte cellene i vert embryonale vev. Bruk av en microinjection system sterkt hjelpemidler i målretting av donor cellene og tillater vellykkede implantasjon uten behov for oppretting av store engraftment områder i vert vev. Noen operative ferdigheter er nødvendig for å utføre denne teknikken men som redusert levedyktighet kan resultere hvis injeksjon nålen ikke er nøye plassert i vevet (forårsaker brudd i hjertet eller lokale blodkar). Stell og tenkte bør også gis til isolasjon og merking trinnene. Over fordøyelsen av donor vev kan føre til dårlig implantasjon effektivitet, og forbigående merking teknikker kan begrense tidsvinduet som giver celler kan spores (som celledeling kan fortynnes etiketten).
Denne teknikken er svært modifiserbare og kan tilpasses til en rekke formål. Eksempelvis sprøytes donor cellene fra et stort utvalg av vev og stadier kan isoleres (selv om optimalisering av enzymatisk fordøyelsen er nødvendig) og kan tilsvarende inn en rekke vert vev over ulike stadier av utvikling. Tilsvarende kan etikettmetoden endres for å spore celler på tvers av ulike timelige windows, inkludert bruk av fluorescerende uorganiske semiconductor nanokrystaller for lenger forbigående merking og implantering av vaktel celler eller celler fra green fluorescerende protein transgene (GFP +) donor embryo11 for permeant merking.
Mens vi bruker denne teknikken for avian implantasjon studier, føler vi at det kunne bli brukt for et stort utvalg av chimeric studier i fremtiden. Genetisk forandret hjerte celler fra transgene organismer kunne for eksempel isolert og microinjected inn i avian hjertet bruker en veldig lignende protokoll. Videre celler i cardiomyocytes fra stammer cellene eller via somatisk cell reprograming tilnærminger kan være microinjected inn i embryonale hjertet å vurdere deres integrering i vev og/eller modning under i vivo biomekaniske forhold.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av grant R00HL122360 fra National Institutes of Health, nasjonale hjerte, lunge og blod Institute (NHLBI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Insulin Syringe | BD | 329654 | |
| 1.7 mL Microtubes, Clear | Genesee Scientific | 24-282 | |
| 10 ml Syringe | BD | 305482 | |
| 1000ul Reach Barrier Tip Racked, Sterile | Genesee Scientific | 24-430 | |
| 15 mL Centriguge Tubes, Racked | Genesee Scientific | 28-101 | |
| 1588 Genesis Hova-Bator Incubator | GQF | 813927021221 | |
| 18G x 1 1/2 Needle | BD | 305196 | |
| 200ul Barrier Tip Low Binding, Racked, Sterile | Genesee Scientific | 24-412 | |
| 32G x 1/2" Needle | TSK Steriject Air-Tite | TSK3213 | |
| Alchohol Wipes 70% | Thermo Fisher Scientific | 19015744 | |
| Angled Forceps | Fine Scientific Tools | 11260-20 | |
| Backloading Tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Black India Ink | KOH-I-NOOR | 3084-F | |
| CellTracker Green CMF | Thermo Fisher Scientific | C7025 | 1 mM in DMSO |
| CellTracker Red CMTPX | Thermo Fisher Scientific | C34552 | 1 mM in DMSO |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Commercial Grade Packing Tape | Staples | 2619001 | |
| Curved Tenotomy Scissors | Fine Scientific Tools | 14067-11 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330-032 | |
| DMSO, anhydrous | Thermo Fisher Scientific | D12345 | |
| DPBS (10X), no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
| Femtojet 4i | Eppendorf | 5252000021 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | |
| Hatching Eggs | Pilgrim's Hatchery | -- | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| Injectman 4 | Eppendorf | 5192000027D | |
| Micromanipulator | Leica Microsystems | -- | |
| Parafilm | SIGMA | P6543-1EA | |
| Paraformaldehyde 32% in aqueous solution, EM Grade | VWR | 100496-496 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-022 | |
| Petri Dish | Genesee Scientific | 32-107 | |
| Pipette Grinder | Narishige | EG-44 | |
| Pipette Puller | HEKA | PIP 6 | |
| Scotch Transparent Tape | Staples | 487909 | |
| Sigmacote | SIGMA | SL2-25ML | |
| Stereo Microscope | Leica | -- | |
| ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| Transfer Pipette | Thermo Fisher Scientific | 273 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 |
References
- Guo, Y. X., Pu, W. T. Genetic Mosaics for Greater Precision in Cardiovascular Research. Circulation Research. 123, 27-29 (2018).
- Guo, Y. X., et al. Analysis of Cardiac Myocyte Maturation Using CASAAV, a Platform for Rapid Dissection of Cardiac Myocyte Gene Function In Vivo. Circulation Research. 120 (12), 1874-1888 (2017).
- Rugh, R. Experimental embryology; techniques and procedures. 3rd edition. , Burgess Pub. Co. (1962).
- Slack, J. M. W. Essential developmental biology. 3rd edition. , Wiley. (2013).
- Reinecke, H., Zhang, M., Bartosek, T., Murray, C. E. Survival, integration, and differentation of cardiomyocyte grafts: a study in normal and injured rat hearts. Circulation. 100, 193-202 (1999).
- Rojas, S. V., et al. Transplantation of purified iPSC-derived cardiomyocytes in myocardial infarction. PLOS ONE. 12, 0173222 (2017).
- Zhang, M., et al. Cardiomyocyte Grafting for Cardiac Repair: Graft Cell Death and Anti-Death Strategies. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (5), 907-921 (2001).
- Bressan, M., Liu, G., Mikawa, T. Early mesodermal cues assign avian cardiac pacemaker fate potential in a tertiary heart field. Science. 340 (6133), 744-748 (2013).
- Bressan, M., et al. Reciprocal myocardial-endocardial interactions pattern the delay in atrioventricular junction conduction. Development. 141 (21), 4149-4157 (2014).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
