Summary

En Galleria mellonella Oral Administration modell till Study Commensal-Induced medfödda immunsvar

Published: March 21, 2019
doi:

Summary

Här vi tillhandahålla ett detaljerat protokoll för en oral administrering modell använder Galleria mellonella larver och hur att karakterisera inducerad medfödda immunsvar. Användning av detta protokoll, kommer forskare utan praktisk erfarenhet att kunna använda den G. mellonella tvångsmatning metod.

Abstract

Undersökningen av kommensaler bakterier på värd immunsystemet immunogena potential är en viktig komponent när man studerar intestinal värd-mikrobinteraktioner. Det är väletablerat att olika förknippas uppvisar olika potential att stimulera värd intestinal immunförsvaret. Sådana undersökningar inbegriper ryggradsdjur, speciellt gnagare. Eftersom ökande etiska frågor är kopplade till experiment med ryggradsdjur, finns det en hög efterfrågan på ryggradslösa ersättare modeller.

Här ger vi en Galleria mellonella oral administrering modell använder kommensaler icke-patogena bakterier och bedömningen som möjligt av förknippas immunogena potential på G. mellonella immunsystemet. Vi visar att G. mellonella är ett användbart alternativ ryggradslösa återinsättande modell som gör analysen av förknippas med olika immunogena potential såsom Bacteroides vulgatus och Escherichia coli. Intressant, uppvisade bakterierna ingen dödande effekt på larverna, som är liknande till däggdjur. Immunsvaret av G. mellonella var jämförbara med ryggradsdjur medfödda immunsvar och omfattar produktion av antimikrobiella molekyler och erkännande av bakterier. Vi föreslår att G. mellonella kunde återställa tidigare bakterieflora balans, vilket är väl känt från friska däggdjur individer. Trots att tillhandahålla jämförbara medfödda immunsvaret hos både G. mellonella och ryggradsdjur, G. mellonella inte hyser en adaptiva immunsystemet. Eftersom de undersökta komponenterna i det medfödda immunsystemet är evolutionär bevarad, tillåter modellen en prescreening och första analys av bakteriell immunogena egenskaper.

Introduction

Den intestinala mikrobiomet är en viktig komponent för underhåll av homeostas, och innebär både medfödd och adaptiv immunsvar1,2. Kommensaler bakterieflora gemenskapen kännetecknas av olika kommensaler huvudbeståndsdelar: symbionter som ger positiva effekter av viktiga immunmodulerande funktioner och pathobionts som kan ha skadliga effekter i genetiskt predisponerade värd och främja och utlösa tarminflammation3,4. Många studier på symbionter och pathobionts och deras påverkan på immunsystemet värd har publicerats främst studera adaptiva immunsvaret.

Eftersom dessa studier involvera många djur för utredningarna och skydd och byte av djur som används för experiment är att öka allmänhetens intresse, försöker vi hitta en ersättare modell som möjliggör en screening av olika bakteriell immunogena egenskaper. Insekter, särskilt Galleria mellonella, är en allmänt använd ersättare modell i infektionsforskning. G. mellonella kombinerar olika fördelar såsom låga kostnader och hög genomströmning; Det gör att oral administrering av bakterier, som är den naturliga exponeringsvägen, och gör det möjligt för systemisk infektion5,6. G. mellonella ytterligare möjliggör inkubation vid 37 ° C, vilket är fysiologiska kroppstemperaturen hos däggdjur och optimaln för bakteriell virulens faktor uttryck5. Den största fördelen med G. mellonella är bevarade medfödda immunsystemet som möjliggör diskrimineringen av jaget från icke-jaget och kodar en mängd mönster erkännande receptorer som apolipophorin eller den opsonin hemolin6, 7. vid mikrob erkännande, G. mellonella kan utlösa olika nedströms humorala immunsvar. Det kan framkalla oxidativ stress svaren och utsöndrar reaktiva syreradikaler (ROS) som innebär att aktiviteten av ändringsförslagen (nitrat oxidas synthase) och NOX (NADPH-oxidas)6,8. Dessutom G. mellonella aktiverar ett potent antimikrobiell peptid (AMP) svar, vilket resulterar i utsöndringen av en blandning av olika ampere såsom gloverin, moricin, cecropin eller defensin-liknande gallerimycin6, 8,9,10. Allmänhet, ampere har ganska bred Värdspecificitet mot grampositiva och Gramnegativa bakterier och svampar och att tillhandahålla ett potent svar eftersom insekter saknas någon adaptiva svar10. Gloverin är en förstärkare som är verksamt mot bakterier och svampar och hämmar yttre membran bildas6,11. Moricins uppvisar deras antimikrobiell funktion mot grampositiva och Gramnegativa bakterier med genomträngande membranet och bildar en por9,11. Cecropins ger aktivitet mot bakterier och svampar och permeabilize membranet på samma sätt som moricins9,10. Gallerimycin är en defensin-lik peptid med anti-svamp egenskaper9. Intressant nog fann att kombinationen av cecropin och gallerimycin hade en synergistisk aktivitet mot E. coli10.

På grund av sin lätt-till-använda karaktär G. mellonella är larverna en ofta använd infektion modell att bedöma bakteriell patogenicitet. I synnerhet korrelerar studier i vilka uppgifter som erhållits från G. mellonella med uppgifter som erhållits från möss stöd styrkan i denna alternativa värd modell. Det konstaterades att de mest sjukdomsframkallande serotyperna av Listeria monocytogenes i en musmodell för infektion leder också till högre dödlighet i G. mellonella efter systemisk infektion. Ytterligare, mindre virulenta serotyperna visade sig också vara mindre virulenta i G. mellonella modell12. Liknande observationer har gjorts med de mänskliga patogena svamparna Candida albicans. Virulens olika C. albicans stammar har bedömts av systemisk infektion och efterföljande övervakning av larval överlevnad. Mus Avirulenta stammar var också Avirulenta eller utställda minskad virulens i G. mellonella, medan mus virulenta stammar leda också till hög larval dödlighet13. G. mellonella modellen kan vidare användas för att identifiera typ 3 utsöndring system patogenicitet faktorer av Pseudomonas aeruginosa14.

Eftersom de flesta undersökningar med G. mellonella var fokuserade på virulensfaktorer som använder metoden systemisk infektion var vi särskilt intresserade av att tillhandahålla en metod som är lämplig för analys av intestinal förknippas i en muntlig tvångsmatning modell där vi kan tillämpa en distinkt dosering av bakterier per larver och inte bara iaktta larval dödligheten men analysera olika kontrollstämplar av medfödda immunsvar att upprätthålla tarmens homeostas.

Vår metod bidrar till att öka användningen av G. mellonella som en ersättare modell eftersom vi kombinerar tillämpningen av bakterier och analys av RNA uttryck. Det är inte bara användbart för att stärka innebörden av bakteriell patogenes studier när inklusive analys av immunsvar efter oral administrering och inte bara observation av dödlighet efter systemisk infektion. Våra metoder möjliggör analys av immunogena egenskaper av bakteriell icke-patogena förknippas eftersom det ger mer komplexa villkor än cellodling genom att erbjuda en tarmbarriären i en levande organism.

Protocol

1. G. mellonella uppfödning och förberedelse av larverna för experiment Obs: Cykeln från ägget till senast instar larven tar ungefär 5-6 veckor. Överföra de ägg som lagts av vuxna nattfjärilar till 2 L lådor som innehåller vax moth substrat (22% majsgryn, 22% vete måltid, 17,5% bivax, 11% skummjölkspulver, 11% honung, 11% glycerol, 5,5% torkad jäst). Utför hela avel på 30 ° C i mörker. Överför 25 g substrat som innehåller larver i färskt subs…

Representative Results

G. mellonella hemolymph infektion modellen i ofta används för att analysera virulensfaktorer av ett enormt utbud av patogener. De flesta mätningar inkluderar en analys av larver dödlighet, vilket är en ganska enkel metod. Dock denna metod inte tillåta slutsatser om immunsvar i allmänhet och länka resultaten av G. mellonella immunsvar med ryggradsdjur immunologiska mekanismer. G. mellonella oral administrering modellen används å andra sidan sällan för…

Discussion

G. mellonella modellen är en ofta använd modell att bedöma Bakteriella virulensfaktorer i en systemisk infektion strategi21. Eftersom många patogener och bakterier ange värden via oralt Kolonisation eller infektion, måste nya insikter hittas för att utvärdera G. mellonella som modell för oral colonization och infektion.

Möjligheten till bakre G. mellonella mellan 15-37 ° C är en stor fördel eftersom mest däggdjur modeller behåll…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete finansierades av DFGEN (SPP1656), DFG forskning utbildning koncernen 1708, Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) och den tyska Center för infektion forskning (DZIF).

Materials

1.5 mL tubes Eppendorf 0030120086
100 bp DNA ladder  Thermo Fisher Scientific 15628019
1-Bromo-3-Chloropropane (BCP) Sigma-Aldrich B9673
2 mL tubes Eppendorf 0030120094
2x Mangomix Bioline BIO-25033 Colony PCR
50 mL tubes Greiner Bio-One 210 261
Agarose Biozym 840004
Beeswax Mixed-Store.de  -
Brain heart infusion broth Thermo Fisher Scientific CM1135
CloneJET PCR Cloning Kit Thermo Fisher Scientific K1232 Cloning vector for 16S fragments
Corn grits Ostermühle Naturkost GmbH 306 Organic cultivation
Difco LB Agar, Miller (Luria-Bertani) Becton Dickinson BD
Difoco LB Broth, Miller (Luria-Bertani) Becton Dickinson 244610
DNA-free DNA Removal Kit  Thermo Fisher Scientific 244510  Dnase digestion
Dried yeast Rapunzel  - Organic cultivation
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) Thermo Fisher Scientific 14040
Ethanol VWR 20821.330
Glycerol Sigma-Aldrich W252506
Honey Ostermühle Naturkost GmbH 487
Isopropanol  VWR 20842.330
Lightcycler 480 Instrument II Roche Molecular Systems 5015278001
LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white Roche Molecular Systems 4729692001
Manual Microsyringe Pump with Digital Display World Precision Instruments DMP
Micro-Fine+ U-100 insulin syringe 0.3 x 8 mm Becton Dickinson 324826 Oral administration
Mortar, unglazed VWR 410-9327 
Nanodrop Thermo Fisher Scientific 13-400-518
Nuclease-free water  Thermo Fisher Scientific 10977035
Oxoid AnaeroGen sachets  Thermo Fisher Scientific AN0025A Quality and quantity of RNA
PCR stripes Biozym 710970
Pestle, unglazed grinding surface VWR 410-9324 
Phusion proof-reading enzyme  Thermo Fisher Scientific F553S
Primers Biomers  -
PureYield Plasmid Miniprep System Promega A1222
QuantiFast SYBR Green PCR kit  Qiagen 204056 qPCR for bacterial copy number measurment
QuantiFast SYBR Green RT-PCR Kit  Qiagen 204156 qRT-PCR for gene expression measurements
QuantiTect Reverse Transcription Kit  Qiagen 205311 cDNA synthesis
Qubit Assay Tubes Thermo Fisher Scientific Q32856
Qubit dsHS DNA kit  Thermo Fisher Scientific Q32851 Quantification of plasmid and cDNA samples
Qubit fluorometer Thermo Fisher Scientific Q33226 Quantification of plasmid and cDNA samples
RNase-ExitusPlus AppliChem A7153
Rnasin Ribonuclease Inhibitor Promega N2511
Skimmed milk powder Sucofin  -
SYBR safe DNA Gel Stain Thermo Fisher Scientific S33102
TRI reagent  Sigma-Aldrich T9424
Weighing boat VWR 10803-148
Wheat meal Ostermühle Naturkost GmbH 6462 Organic cultivation

References

  1. Nell, S., Suerbaum, S., Josenhans, C. The impact of the microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nature Reviews Microbiology. 8 (8), 564-577 (2010).
  2. Muniz, L. R., Knosp, C., Yeretssian, G. Intestinal antimicrobial peptides during homeostasis, infection, and disease. Frontiers in Immunology. 3, 310 (2012).
  3. Ivanov, I. I., Honda, K. Intestinal commensal microbes as immune modulators. Cell Host Microbe. 12 (4), 496-508 (2012).
  4. Ayres, J. S. Inflammasome-microbiota interplay in host physiologies. Cell Host Microbe. 14 (5), 491-497 (2013).
  5. Champion, O. L., Titball, R. W., Bates, S. Standardization of G. mellonella Larvae to Provide Reliable and Reproducible Results in the Study of Fungal Pathogens. Journal of Fungi (Basel). 4 (3), (2018).
  6. Wojda, I. Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella. Insect Science. , (2016).
  7. Buchmann, K. Evolution of Innate Immunity: Clues from Invertebrates via Fish to Mammals. Frontiers in Immunology. 5, 459 (2014).
  8. Lange, A., et al. Galleria mellonella: A Novel Invertebrate Model to Distinguish Intestinal Symbionts From Pathobionts. Frontiers in Immunology. 9 (2114), (2018).
  9. Tsai, C. J., Loh, J. M., Proft, T. Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing. Virulence. , 1-16 (2016).
  10. Bolouri Moghaddam, M. R., et al. The potential of the Galleria mellonella innate immune system is maximized by the co-presentation of diverse antimicrobial peptides. Biological Chemistry. 397 (9), 939-945 (2016).
  11. Casanova-Torres, A. M., Goodrich-Blair, H. Immune Signaling and Antimicrobial Peptide Expression in Lepidoptera. Insects. 4 (3), 320-338 (2013).
  12. Mukherjee, K., et al. Galleria mellonella as a model system for studying Listeria pathogenesis. Applied and Environmental Microbiology. 76 (1), 310-317 (2010).
  13. Brennan, M., Thomas, D. Y., Whiteway, M., Kavanagh, K. Correlation between virulence of Candida albicans mutants in mice and Galleria mellonella larvae. FEMS Immunological and Medical Microbiology. 34 (2), 153-157 (2002).
  14. Miyata, S., Casey, M., Frank, D. W., Ausubel, F. M., Drenkard, E. Use of the Galleria mellonella caterpillar as a model host to study the role of the type III secretion system in Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infection and Immunity. 71 (5), 2404-2413 (2003).
  15. Waidmann, M., et al. Bacteroides vulgatus protects against Escherichia coli-induced colitis in gnotobiotic interleukin-2-deficient mice. Gastroenterology. 125 (1), 162-177 (2003).
  16. Lange, A., et al. Extensive Mobilome-Driven Genome Diversification in Mouse Gut-Associated Bacteroides vulgatus mpk. Genome Biology and Evolution. 8 (4), 1197-1207 (2016).
  17. Hermann-Bank, M. L., Skovgaard, K., Stockmarr, A., Larsen, N., Molbak, L. The Gut Microbiotassay: a high-throughput qPCR approach combinable with next generation sequencing to study gut microbial diversity. BMC Genomics. 14, 788 (2013).
  18. Sato, K., et al. OmpA variants affecting the adherence of ulcerative colitis-derived Bacteroides vulgatus. Journal of Medical and Dental Science. 57 (1), 55-64 (2010).
  19. Freitak, D., et al. The maternal transfer of bacteria can mediate trans-generational immune priming in insects. Virulence. 5 (4), 547-554 (2014).
  20. Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Research. 29 (9), 45 (2001).
  21. Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).
  22. Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).

Play Video

Cite This Article
Lange, A., Schäfer, A., Frick, J. A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses. J. Vis. Exp. (145), e59270, doi:10.3791/59270 (2019).

View Video