Här vi tillhandahålla ett detaljerat protokoll för en oral administrering modell använder Galleria mellonella larver och hur att karakterisera inducerad medfödda immunsvar. Användning av detta protokoll, kommer forskare utan praktisk erfarenhet att kunna använda den G. mellonella tvångsmatning metod.
Undersökningen av kommensaler bakterier på värd immunsystemet immunogena potential är en viktig komponent när man studerar intestinal värd-mikrobinteraktioner. Det är väletablerat att olika förknippas uppvisar olika potential att stimulera värd intestinal immunförsvaret. Sådana undersökningar inbegriper ryggradsdjur, speciellt gnagare. Eftersom ökande etiska frågor är kopplade till experiment med ryggradsdjur, finns det en hög efterfrågan på ryggradslösa ersättare modeller.
Här ger vi en Galleria mellonella oral administrering modell använder kommensaler icke-patogena bakterier och bedömningen som möjligt av förknippas immunogena potential på G. mellonella immunsystemet. Vi visar att G. mellonella är ett användbart alternativ ryggradslösa återinsättande modell som gör analysen av förknippas med olika immunogena potential såsom Bacteroides vulgatus och Escherichia coli. Intressant, uppvisade bakterierna ingen dödande effekt på larverna, som är liknande till däggdjur. Immunsvaret av G. mellonella var jämförbara med ryggradsdjur medfödda immunsvar och omfattar produktion av antimikrobiella molekyler och erkännande av bakterier. Vi föreslår att G. mellonella kunde återställa tidigare bakterieflora balans, vilket är väl känt från friska däggdjur individer. Trots att tillhandahålla jämförbara medfödda immunsvaret hos både G. mellonella och ryggradsdjur, G. mellonella inte hyser en adaptiva immunsystemet. Eftersom de undersökta komponenterna i det medfödda immunsystemet är evolutionär bevarad, tillåter modellen en prescreening och första analys av bakteriell immunogena egenskaper.
Den intestinala mikrobiomet är en viktig komponent för underhåll av homeostas, och innebär både medfödd och adaptiv immunsvar1,2. Kommensaler bakterieflora gemenskapen kännetecknas av olika kommensaler huvudbeståndsdelar: symbionter som ger positiva effekter av viktiga immunmodulerande funktioner och pathobionts som kan ha skadliga effekter i genetiskt predisponerade värd och främja och utlösa tarminflammation3,4. Många studier på symbionter och pathobionts och deras påverkan på immunsystemet värd har publicerats främst studera adaptiva immunsvaret.
Eftersom dessa studier involvera många djur för utredningarna och skydd och byte av djur som används för experiment är att öka allmänhetens intresse, försöker vi hitta en ersättare modell som möjliggör en screening av olika bakteriell immunogena egenskaper. Insekter, särskilt Galleria mellonella, är en allmänt använd ersättare modell i infektionsforskning. G. mellonella kombinerar olika fördelar såsom låga kostnader och hög genomströmning; Det gör att oral administrering av bakterier, som är den naturliga exponeringsvägen, och gör det möjligt för systemisk infektion5,6. G. mellonella ytterligare möjliggör inkubation vid 37 ° C, vilket är fysiologiska kroppstemperaturen hos däggdjur och optimaln för bakteriell virulens faktor uttryck5. Den största fördelen med G. mellonella är bevarade medfödda immunsystemet som möjliggör diskrimineringen av jaget från icke-jaget och kodar en mängd mönster erkännande receptorer som apolipophorin eller den opsonin hemolin6, 7. vid mikrob erkännande, G. mellonella kan utlösa olika nedströms humorala immunsvar. Det kan framkalla oxidativ stress svaren och utsöndrar reaktiva syreradikaler (ROS) som innebär att aktiviteten av ändringsförslagen (nitrat oxidas synthase) och NOX (NADPH-oxidas)6,8. Dessutom G. mellonella aktiverar ett potent antimikrobiell peptid (AMP) svar, vilket resulterar i utsöndringen av en blandning av olika ampere såsom gloverin, moricin, cecropin eller defensin-liknande gallerimycin6, 8,9,10. Allmänhet, ampere har ganska bred Värdspecificitet mot grampositiva och Gramnegativa bakterier och svampar och att tillhandahålla ett potent svar eftersom insekter saknas någon adaptiva svar10. Gloverin är en förstärkare som är verksamt mot bakterier och svampar och hämmar yttre membran bildas6,11. Moricins uppvisar deras antimikrobiell funktion mot grampositiva och Gramnegativa bakterier med genomträngande membranet och bildar en por9,11. Cecropins ger aktivitet mot bakterier och svampar och permeabilize membranet på samma sätt som moricins9,10. Gallerimycin är en defensin-lik peptid med anti-svamp egenskaper9. Intressant nog fann att kombinationen av cecropin och gallerimycin hade en synergistisk aktivitet mot E. coli10.
På grund av sin lätt-till-använda karaktär G. mellonella är larverna en ofta använd infektion modell att bedöma bakteriell patogenicitet. I synnerhet korrelerar studier i vilka uppgifter som erhållits från G. mellonella med uppgifter som erhållits från möss stöd styrkan i denna alternativa värd modell. Det konstaterades att de mest sjukdomsframkallande serotyperna av Listeria monocytogenes i en musmodell för infektion leder också till högre dödlighet i G. mellonella efter systemisk infektion. Ytterligare, mindre virulenta serotyperna visade sig också vara mindre virulenta i G. mellonella modell12. Liknande observationer har gjorts med de mänskliga patogena svamparna Candida albicans. Virulens olika C. albicans stammar har bedömts av systemisk infektion och efterföljande övervakning av larval överlevnad. Mus Avirulenta stammar var också Avirulenta eller utställda minskad virulens i G. mellonella, medan mus virulenta stammar leda också till hög larval dödlighet13. G. mellonella modellen kan vidare användas för att identifiera typ 3 utsöndring system patogenicitet faktorer av Pseudomonas aeruginosa14.
Eftersom de flesta undersökningar med G. mellonella var fokuserade på virulensfaktorer som använder metoden systemisk infektion var vi särskilt intresserade av att tillhandahålla en metod som är lämplig för analys av intestinal förknippas i en muntlig tvångsmatning modell där vi kan tillämpa en distinkt dosering av bakterier per larver och inte bara iaktta larval dödligheten men analysera olika kontrollstämplar av medfödda immunsvar att upprätthålla tarmens homeostas.
Vår metod bidrar till att öka användningen av G. mellonella som en ersättare modell eftersom vi kombinerar tillämpningen av bakterier och analys av RNA uttryck. Det är inte bara användbart för att stärka innebörden av bakteriell patogenes studier när inklusive analys av immunsvar efter oral administrering och inte bara observation av dödlighet efter systemisk infektion. Våra metoder möjliggör analys av immunogena egenskaper av bakteriell icke-patogena förknippas eftersom det ger mer komplexa villkor än cellodling genom att erbjuda en tarmbarriären i en levande organism.
G. mellonella modellen är en ofta använd modell att bedöma Bakteriella virulensfaktorer i en systemisk infektion strategi21. Eftersom många patogener och bakterier ange värden via oralt Kolonisation eller infektion, måste nya insikter hittas för att utvärdera G. mellonella som modell för oral colonization och infektion.
Möjligheten till bakre G. mellonella mellan 15-37 ° C är en stor fördel eftersom mest däggdjur modeller behåll…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete finansierades av DFGEN (SPP1656), DFG forskning utbildning koncernen 1708, Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) och den tyska Center för infektion forskning (DZIF).
1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030120086 | |
100 bp DNA ladder | Thermo Fisher Scientific | 15628019 | |
1-Bromo-3-Chloropropane (BCP) | Sigma-Aldrich | B9673 | |
2 mL tubes | Eppendorf | 0030120094 | |
2x Mangomix | Bioline | BIO-25033 | Colony PCR |
50 mL tubes | Greiner Bio-One | 210 261 | |
Agarose | Biozym | 840004 | |
Beeswax | Mixed-Store.de | - | |
Brain heart infusion broth | Thermo Fisher Scientific | CM1135 | |
CloneJET PCR Cloning Kit | Thermo Fisher Scientific | K1232 | Cloning vector for 16S fragments |
Corn grits | Ostermühle Naturkost GmbH | 306 | Organic cultivation |
Difco LB Agar, Miller (Luria-Bertani) | Becton Dickinson | BD | |
Difoco LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Becton Dickinson | 244610 | |
DNA-free DNA Removal Kit | Thermo Fisher Scientific | 244510 | Dnase digestion |
Dried yeast | Rapunzel | - | Organic cultivation |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14040 | |
Ethanol | VWR | 20821.330 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | W252506 | |
Honey | Ostermühle Naturkost GmbH | 487 | |
Isopropanol | VWR | 20842.330 | |
Lightcycler 480 Instrument II | Roche Molecular Systems | 5015278001 | |
LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche Molecular Systems | 4729692001 | |
Manual Microsyringe Pump with Digital Display | World Precision Instruments | DMP | |
Micro-Fine+ U-100 insulin syringe 0.3 x 8 mm | Becton Dickinson | 324826 | Oral administration |
Mortar, unglazed | VWR | 410-9327 | |
Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | 13-400-518 | |
Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | 10977035 | |
Oxoid AnaeroGen sachets | Thermo Fisher Scientific | AN0025A | Quality and quantity of RNA |
PCR stripes | Biozym | 710970 | |
Pestle, unglazed grinding surface | VWR | 410-9324 | |
Phusion proof-reading enzyme | Thermo Fisher Scientific | F553S | |
Primers | Biomers | - | |
PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1222 | |
QuantiFast SYBR Green PCR kit | Qiagen | 204056 | qPCR for bacterial copy number measurment |
QuantiFast SYBR Green RT-PCR Kit | Qiagen | 204156 | qRT-PCR for gene expression measurements |
QuantiTect Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205311 | cDNA synthesis |
Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
Qubit dsHS DNA kit | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | Quantification of plasmid and cDNA samples |
Qubit fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33226 | Quantification of plasmid and cDNA samples |
RNase-ExitusPlus | AppliChem | A7153 | |
Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 | |
Skimmed milk powder | Sucofin | - | |
SYBR safe DNA Gel Stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | |
TRI reagent | Sigma-Aldrich | T9424 | |
Weighing boat | VWR | 10803-148 | |
Wheat meal | Ostermühle Naturkost GmbH | 6462 | Organic cultivation |