Summary
Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para um modelo de administração oral usando Galleria mellonella larvas e como caracterizar induzido inatas respostas imunes. Usando este protocolo, será capazes de usar a alimentação forçada método mellonella g. pesquisadores sem experiência prática.
Abstract
A investigação do potencial imunogênico de bactérias comensais sobre o sistema imunológico do hospedeiro é um componente essencial ao estudar interações do anfitrião-micróbio intestinal. Está bem estabelecido que os comensais diferentes apresentam um potencial diferente para estimular o sistema imunitário intestinal do hospedeiro. Tais investigações envolvem animais vertebrados, especialmente roedores. Que crescentes preocupações éticas estão relacionadas com a realização de experiências com vertebrados, existe uma alta demanda por modelos de invertebrados substituições.
Aqui, nós fornecemos um modelo de administração oral de Galleria mellonella usando bactérias não-patogênicas são comensais e a possível avaliação do potencial imunogênico de comensais no sistema imunitário mellonella g. . Demonstramos que mellonella g. é um modelo de substituição de invertebrados alternativa útil que permite a análise dos comensais com potencial imunogênico diferente tais como Bacteroides vulgatus e Escherichia coli. Curiosamente, as bactérias não exibiram nenhum efeito sobre as larvas, que é semelhante para os mamíferos. As respostas imunes de g. mellonella eram comparáveis com respostas de imunes inatas vertebradas e envolvem a produção de moléculas antimicrobianas e reconhecimento das bactérias. Propomos que mellonella g. foi capaz de restaurar o equilíbrio anterior de microbiota, que é bem conhecido de indivíduos saudáveis de mamíferos. Apesar de fornecer respostas de imune inatas comparáveis em vertebrados e mellonella g. , g. mellonella não abriga um sistema imune adaptativo. Desde que os investigados componentes do sistema imunitário inato são evolutivos conservada, o modelo permite uma análise prescreening e primeira de propriedades imunogênicas bacterianas.
Introduction
A microbiome intestinal é um componente essencial para a manutenção da homeostase e envolve ambas as respostas de imune inata e adaptativa1,2. A Comunidade microbiota comensal é caracterizada por diferentes componentes principais de comensais: simbiontes que conferem efeitos benéficos por funções immunomodulatory importante e pathobionts que pode ter efeitos prejudiciais geneticamente predispostos hospeda e promover e provocar inflamação intestinal3,4. Muitos estudos sobre simbiontes e pathobionts e sua influência sobre o sistema imunológico do hospedeiro têm sido publicados principalmente estudar respostas imunes adaptáveis.
Uma vez que estes estudos envolvem muitos animais para as investigações e a proteção e a substituição dos animais utilizados para experimentação é de aumentar o interesse público, buscamos encontrar um modelo de substituição para permitir a exibição de diferentes bactérias imunogênicas Propriedades. Insetos, especialmente Galleria mellonella, são um modelo de substituição amplamente utilizado na investigação de infecção. G. mellonella combina diferentes vantagens como baixo custo e alto rendimento; Ele permite que a administração oral de bactérias, que é a rota de exposição natural, e permite a infecção sistêmica5,6. G. mellonella mais permite a incubação a 37 ° C, qual é a temperatura do corpo fisiológico de mamíferos e o ideal para o factor de virulência bacteriana expressão5. A principal vantagem do mellonella g. é conservado sistema imunitário inato que permite a discriminação do self da não-auto e codifica uma variedade de receptores de reconhecimento padrão como apolipophorin ou o opsoninas hemolin6, 7. sobre reconhecimento de micróbio, g. mellonella pode desencadear respostas diferentes a jusante imune humorais. Pode induzir respostas de estresse oxidativo e secretam espécies reativas de oxigênio (ROS), que envolve a atividade de n º s (oxidase nítrico sintase) e NOX (oxidase de NADPH)6,8. Além disso, g. mellonella ativa uma resposta potente peptídeo antimicrobiano (AMP), que resulta na secreção de uma mistura de AMPs diferentes tais como gloverin, moricin, Cecropina ou o defensina-como gallerimycin6, 8,9,10. Geralmente, amplificadores têm bastante amplo acolhimento especificidade contra bactérias gram-positivas e Gram-negativas e fungos e tem que dar uma resposta potente, desde que os insetos estão faltando qualquer resposta adaptativa10. Gloverin é um amplificador ativo contra bactérias e fungos e inibe a formação de membrana exterior6,11. Moricins exibem sua função antimicrobiana contra bactérias gram-positivas e Gram-negativas por penetrar a membrana e formando um poro9,11. Cecropins fornecer atividade contra bactérias e fungos e permeabilize a membrana da mesma forma como moricins9,10. Gallerimycin é um peptídeo de defensina-como com propriedades anti-fúngicos9. Curiosamente, verificou-se que a combinação de Cecropina e gallerimycin tinha uma atividade sinérgica contra e. coli10.
Devido ao seu caráter de easy-to-use mellonella g. as larvas são um modelo de infecção frequentemente usados para avaliar a patogenicidade bacteriana. Em particular, estudos em que dados obtidos de g. mellonella correlacionam com dados obtidos de ratos apoio a força deste modelo hospedeiro alternativo. Verificou-se que os serótipos mais patogênicos de Listeria monocytogenes em um modelo de infecção do rato também conduzem a maiores taxas de mortalidade em g. mellonella após infecção sistêmica. Além disso, menos serotipos virulentos acabou por ser também menos virulentos no modelo mellonella g. 12. Observações semelhantes foram feitas com os fungos patogênicos humanos Candida albicans. Virulência de c. albicans de diferentes estirpes tenha sido avaliada por infecção sistêmica e posterior acompanhamento de sobrevivência larval. Cepas avirulentas mouse também foram expostas ou avirulentas reduzida virulência em g. mellonella, Considerando que as estirpes virulentas rato conduzem também a alta mortalidade larval13. O modelo de g. mellonella mais poderia ser usado para identificar fatores de patogenicidade de sistema tipo 3 secreção de Pseudomonas aeruginosa14.
Desde que a maioria das investigações que envolvem mellonella g. concentraram-se em fatores de virulência usando a abordagem de infecção sistêmica estávamos especialmente interessados em fornecer um método adequado para a análise dos comensais intestinais em uma alimentação oral forçada modelo em que podemos aplicar uma dosagem distinta de bactérias por larvas e não apenas observar a taxa de mortalidade larval mas analisar diferentes marcas da inatas respostas imunes para manter a homeostase intestinal.
Nosso método ajuda a aumentar o uso de g. mellonella como um modelo de substituição, desde que combinamos a aplicação de bactérias e a análise da expressão do RNA. Não só é útil reforçar o significado dos estudos de patogênese bacteriana quando incluindo a análise das respostas imunes após administração oral e não apenas a observação das taxas de mortalidade após infecção sistêmica. Nossos métodos permite que para a análise das propriedades imunogênicas de bactérias não-patogênicas comensais desde que é fornece condições mais complexas do que a cultura celular, oferecendo uma barreira intestinal em um organismo vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. mellonella g. criação e preparação das larvas para os experimentos
Nota: O ciclo de ovo a último ínstar larva leva aproximadamente 5-6 semanas.
- Transferi os ovos postos pelas traças adultas para caixas de 2 L, contendo substrato traça da cera (grãos de milho 22%, 22% de farelo de trigo, 17,5% cera de abelha, 11% leite em pó desnatado, mel de 11%, 11% de glicerol, 5,5% secada levedura). Execute toda a criação a 30 ° C, no escuro.
- Transferi 25 g de substrato contendo as larvas no substrato fresco após aproximadamente 1-2 semanas quando pequenas e minúsculas larvas eram visíveis. Sincronizar as larvas após 2 semanas de acordo com seu tamanho e manter grupos de larvas de 30-40 em recipientes de 2L em substrato de traça de cera por mais 2 semanas.
- Selecione as larvas para experimentos em peso. Use apenas pálidas e rápidas larvas em movimento com uma massa de 180-200 mg.
2. cultivo e preparação de Bacteroides vulgatus e Escherichia coli para administração oral
- Crescer a bactéria anaeróbica obrigatórios Bacteroides vulgatus mpk a 37 ° C por via anaeróbia usando potes e saquinhos para a criação de um ambiente anaeróbio (ver Tabela de materiais)15,16. B. vulgatus de cultivar por 2 dias e crescer uma subcultura durante a noite no cérebro coração (BHI) de infusão caldo de carne.
- Crescer a bactéria anaeróbicas facultativas mpk de Escherichia coli em condições aeróbias em caldo Luria-Bertani (LB) a 37 ° C. Cultivar a Escherichia coli , pernoite em caldo LB e crescer subcultura durante 2 h a 37 ° C no dia do experimento.
- Colheita das culturas por centrifugação a 1.700 x g durante 5 min. Ressuspender as bactérias aglomerados em DPBS (de Dulbecco Phosphate-Buffered salina). Determinar a densidade óptica (OD) das culturas bacterianas em OD 600 nm e calcular as concentrações bacterianas. As concentrações bacterianas foram ajustadas para 109/mL.
3. alimentação forçada de g. mellonella larvas com suspensões bacterianas
- Força cada larva com 10 µ l da suspensão bacteriana ajustada contendo 107 bactérias por dose. Use uma seringa de insulina com uma agulha sem corte-terminado para aplicação oral da suspensão bacteriana.
- Fixar a seringa sobre uma microsseringa bomba (Figura 1) para garantir a exatidão do volume suspensão aplicada a cada larva (ver Tabela de materiais). Insira a seringa cuidadosamente entre suas mandíbulas. Não force a seringa entre as mandíbulas. Espere que as larvas para abri-lo aparelho bucal e depois inserir a seringa.
- Incube as larvas à força no escuro a 37 ° C entre larvas de uso DPBS-administrado 1-24 h. como controles de fundo falso para excluir potenciais respostas de estresse induzidas devido a manipulação das larvas durante a alimentação forçada.
4. processamento de administração oral de larvas e isolamento de RNA
- Trabalhar sob um capuz e óculos de segurança. Limpe o reagente de capuz e spray para impedir a contaminação de RNase.
- Snap-congelar as larvas vivas após incubação em nitrogênio líquido e homogeneizá-los. Use um almofariz e pistilo para homogeneização. Adicione nitrogênio líquido para a argamassa e grade cada indivíduo larval até homogenates em pó são produzidos.
- Despeje o homogeneizado para uma descartável pesando barco e esperar que o nitrogênio líquido evapore.
- Misture o líquido livre de nitrogênio congelado homogenates em pó com 1 mL de Trizol em um tubo de 2 mL e incubar a mistura à temperatura ambiente durante 1 h.
- Centrifugue a mistura a 8.000 x g durante 15 minutos à temperatura ambiente e transferir o sobrenadante para um tubo de fresco e descartar a pelota. Misture o sobrenadante com 200 µ l de 1-Bromo-3-cloropropano (BCP). Vórtex e incubar a mistura durante 5 min à temperatura ambiente e por 10 min no gelo.
- Centrifugar as reações BCP-adicionado a 18.000 x g durante 15 min a 4 ° C. Camada superior transparente de transferência para um novo tubo de 2 mL e descartar o resto. Precipitar o RNA da camada superior transferido com 500 µ l de isopropanol misturando e inversão do tubo por 5 min.
- Centrifugar o tubo a 18.000 x g durante 15 min a 4 ° C. Lave a pelota do RNA precipitada com 500 µ l de etanol a 75%.
- Secar a pelota do RNA durante 5-10 min à RT Tome cuidado para não secá-la pois será difícil de dissolver-se mais tarde.
- Diluir o inibidor do ribonuclease (1: 100) em água livre de nuclease e usar 100 µ l da solução para Ressuspender o RNA secas. Vórtice o tubo cuidadosamente até a pelota é completamente dissolvida.
- Medida do RNA qualitativo e quantitativo. Certifique-se de que a relação de 260/280 é aproximadamente 2.0 e 260/230 relação no intervalo de 2.0-2.2 (ver Tabela de materiais).
- Use 5 µ g de RNA isolado para a digestão de DNase. Mix 5 µ l de 10x buffer, 1 µ l da enzima de inibidor do ribonuclease, 2 µ l da enzima DNase, 5 µ g de RNA e encher-se com nuclease-livre de água até 50 µ l. Incubar durante 30 min à RT
- Adicione 6 µ l de reagente de inactivação e incubar por 2 min em reação de RT e vórtice ocasionalmente. Centrifugue a reação a 10.000 x g por 1 min. transferência sobrenadante no tubo fresco 1,5 mL.
Nota: O RNA contém o RNA larval, bem como o RNA bacteriano da respectiva estirpe usada para administração oral.
- Adicione 6 µ l de reagente de inactivação e incubar por 2 min em reação de RT e vórtice ocasionalmente. Centrifugue a reação a 10.000 x g por 1 min. transferência sobrenadante no tubo fresco 1,5 mL.
5. quantificação do número de cópias a bacteriano 16S após a alimentação forçada
Nota: O número de cópias do expresso 16S bacteriano foi determinado usando cDNA sintetizado a partir do RNA extraído na seção 4. Quantificação final é calculada com a ajuda de uma curva padrão do plasmídeo em que o fragmento PCR 16S de b. vulgatus ou Escherichia coli foi clonado.
- Elaboração de normas de plasmídeo
- Amplifica fragmentos 16S de Escherichia coli mpk ou b. vulgatus mpk genomic DNA por PCR. Mix 10 µ l de 5 x tampão, 1 µ l de solução de 10 mM dNTP, 2,5 µ l de primer para a frente de 10 µM e 2.5 µ l da diluição do reverso da primeira demão de 10 µM, 1 µ l de DMSO, 1 µ l do modelo de DNA genômico, 31,5 µ l de água livre de nuclease e 0,5 µ l da enzima prova de leitura.
- Executar o PCR (desnaturação inicial: 98 ° C por 30 s, desnaturação: 98 ° C por 10 s, recozendo: 60 ° C durante 30 anos, extensão: 72 ° C por 30 s, extensão final: 72 ° C por 5 min, repetir a desnaturação, recozimento e extensão para 30 ciclos).
- Use 16S Escherichia coli Cartilhas (p_forward: GTTAATACCTTTGCTCATTGA, p_reverse: ACCAGGGTATCTAATCCTGTT17, 320 bp) ou iniciadores de b. vulgatus 16S (p_forward: AACCTGCCGTCTACTCTT, p_reverse: CAACTGACTTAAACATCCAT18, 400 bp) para amplificação.
- Use os fragmentos PCR e. coli e b. vulgatus 16S para sem corte-extremidade clonagem em um vetor de clonagem. Configurar a ligadura e misture 10 µ l de 2 x tampão, 1 µ l de produto PCR não-purificada, 1 µ l de plasmídeo de clonagem sem corte-extremidade, 7 µ l de água livre de nuclease e 1 μL de T4 DNA Ligase. Incubar a ligadura durante 10 minutos a RT
- Prepare as células competentes de Escherichia coli DH5α.
- Semear em 100 mL de meio LB em um Erlenmeyer com 1 mL de uma cultura durante a noite. Cresce a cultura até OD 600 nm é entre 0,4-0,6. Dividir a cultura resultante em dois tubos de 50 mL e incubar as culturas no gelo por 10 min.
- Centrifugar as culturas a 1.700 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante e ressuspender cada cuidadosamente com 5 mL de solução RFI (30 mM CH3COOK, 100 mM KCl, 10 mM CaCl, 50mm MnCl2, ajustar pH 5,8 com ácido glacial, estéril filtrada). Encha cada tubo com adicional 45 mL de solução RFI.
- Centrifugar as culturas a 1.700 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante e ressuspender cada cuidadosamente com 6 mL de RFII (MOPS de 10 mM, 15 mM CaCl2, 10 mM KCl, 15% de glicerol, autoclavado) solução. Ambas as fracções do pool e incube a suspensão de 12 mL no gelo por 15 min. Prepare alíquotas de suspensão de células (200 µ l). Armazenar as alíquotas a-80 ° C.
- Transferir a reação da ligadura para uma alíquota de competentes de Escherichia coli DH5α células e deixar a reação no gelo por 15 min. calor choque as células para 45 s a 42 ° C e adicionar 1 mL de meio LB.
- Incubar a transformação por 45 min a 37 ° C. Adicione 100 µ l da transformação para uma placa de ágar LB contendo ampicilina e incubar durante uma noite a 37 ° C.
- Execute colônia PCR de 8 transformants resultantes da placa de ágar LB de passo 5.1.5. Escolher cada colônia com um palito, mergulhe-o em um prato LB fresco contendo ampicilina (prato principal) e depois mergulhe o palito mesmo um bem contendo µ 5,5 l de água livre de nuclease em uma faixa PCR.
- Adicione 7,5 µ l do mix de x PCR 2, 0,5 µ l de primer para a frente de 10 µM e 0,5 µ l da diluição de primer reverso 10 µM. Use os mesmos pares da primeira demão, mencionados na seção 5.1.1.
- Executar o PCR (desnaturação inicial: 95 ° C por 5 min, desnaturação: 95 ° C por 1 min, recozimento: 60 ° C durante 30 anos, extensão: 72 ° C por 1 min, extensão final: 72 ° C por 7 min, repetição da desnaturação, recozimento e extensão para 35 ciclos).
- Verifique se o tamanho dos fragmentos em um gel de agarose 1% 16S. Use o tampão de Tris-borato-EDTA (TBE) x 0,5 para dissolver 1 g de agarose e fervê-lo em um microondas. Adicione corante 1:50,000 para gel e derramá-lo. Adicionar as reações de PCR de colônia e uma escada de DNA bp 100 para o gel e execute o gel por 45 min em 110 V.
- Inocule uma cultura durante a noite de 5ml LB contendo ampicilina com um clone da placa de mestre (secção 5.1.6) para cada e. coli e b. vulgatus 16S de plasmídeo que contém o tamanho certo de inserir.
- Centrifugar as culturas bacterianas durante a noite em um tubo de 2 mL a 1.700 x g. Desprezar o sobrenadante e ressuspender o precipitado em água estéril de 600 µ l.
- Adicione 100 µ l de tampão de Lise e homogeneizar por inversão do tubo 6 vezes. Adicione 350 µ l de frio (4° C) solução de neutralização e homogeneizar cuidadosamente por inversão do tubo.
- Centrifugar a velocidade máxima em uma centrífuga para 3 min. Transfira o sobrenadante (~ 900 µ l) para uma coluna de rotação e centrifugar a velocidade máxima em uma centrífuga para 15 s.
- Descartar o flowthrough e adicionar 200 µ l de lavagem de remoção de endotoxinas e centrifugar a velocidade máxima em uma centrífuga para 15 s.
- Adicione 400 µ l da solução de lavagem para a coluna e centrifugar a velocidade máxima em uma centrífuga para transferência de s. 30 a coluna para um tubo limpo 1,5 mL, adicionar 30 µ l de tampão de eluição para a coluna incube durante 1 min à temperatura ambiente.
- Centrifugar a velocidade máxima em uma centrífuga para 30 s (consulte a Tabela de materiais).
- Determine a concentração de DNA de plasmídeo misturando 1 µ l de plasmídeo com 199 µ l da solução de trabalho (1 µ l de tintura fluorescente por 199 µ l de buffer para cada reação). Prepare dois padrões misturando-se 10 µ l de padrão 1 ou 10 µ l de padrão 2 com 190 µ l. Vortex a amostra e tubos padrão e incubar a reação de 2 min. medida da concentração (ver Tabela de materiais).
- Preparar padrão concentrações em diluições em série 10 vezes em um intervalo de 10-100.000 cópias: cálculo da massa do único plasmídeo (m = (n) x (1.096x10-21 g/bp), n = tamanho do plasmídeo, m = massa). Calcular a massa de Plasmideo DNA necessário para conter o número de cópias desejado de interesse (copiar número de interesse x massa do plasmídeo único = massa de Plasmideo DNA necessária).
- Preparação das amostras para quantificação
- Sintetiza o cDNA. Misture 2 µ l de tampão de 7x, 1 µ l de RNA DNase-digerido da seção 4 e 11 µ l de água livre de nuclease. Incubar durante 2 min a 42 ° C.
- Ocorrer reação imediatamente no gelo. Mix 4 µ l de 5x Buffer RT, 1 µ l do mix de cartilha RT (Transcriptase reversa), 1 µ l da enzima RT e a reação da etapa 5.2.1. Incube por 15 min a 42 ° C. Incube durante 3 min a 95° C para inativar a enzima RT.
- Quantificar o cDNA concentrações fluorometrically como descrito na etapa 5.1.9.
- Sintetiza o cDNA. Misture 2 µ l de tampão de 7x, 1 µ l de RNA DNase-digerido da seção 4 e 11 µ l de água livre de nuclease. Incubar durante 2 min a 42 ° C.
- Medição da carga bacteriana
- Ajustar as concentrações de cDNA para 5 ng por reação de 12 µ l para PCR quantitativo. Misture a mistura de RT-PCR 2 x, 0,25 µ l de primer para a frente de 100 µM, 0,25 µ l de primer reverso de 100 µM (5.1.1) e 12 µ l do cDNA ajustado. Executar qPCR (desnaturação inicial: 95 ° C por 5 min, desnaturação: 95 ° C por 10 s, recozimento: 60 ° C por 30 s, repetição de desnaturação e recozimento para 35 ciclos, derretendo: 95 ° C, cool até 4 ° C).
- Trace log10 concentrações plasmídeo da curva de calibração (10-100.000 cópias), ou seja, 1-5 (eixo x), contra os correspondentes valores de ct (eixo y). Realize a regressão linear para obter a equação de regressão. Resolva a equação para x (concentração). Use a fórmula para calcular o log10 dos números de cópia inserindo a fórmula ct-valor. Calcule o Antilogaritmo para obter o número de cópias.
6. determinação do gene marcador imune inata usando RT-PCR quantitativo
- Verifique primers para o gene-especificidade por PCR e subsequente agarose gel de electroforese para verificar o tamanho do fragmento correto. Realize o PCR como descrito na seção 5.1.5.
Bp Ubiquitin 130: TCAATGCAAGTAGTCCGGTTC da frente, reverse CCAGTCTGCTGCTGATAAACC19 (limpeza)
4-Nox 159 bp: encaminhar TGGCACGGCATCAGTTATCA, reverso ACAGCGACTGTCATGTGGAA8
N º s 76 bp: encaminhar ATGAAGGTGCTGAAGTCACAA, reverso GCCATTTTACAATCGCCACAA8
Bp Gst 156: encaminhar GACAGAAGTCCTCCGGTCAG, reverso TCCGTCTTCAAGCAAAGGCA8
ApoIII 265 bp: encaminhar AGACTTGCACGCCATCAAGA, reverso TGCATGCTGTTTGTCACTGC8
hemolin 267 bp: encaminhar CTCCCTCACGGAGGACAAAC, reverso GCCACGCACATGTATTCACC8
gallerimycin 161 bp: encaminhar GAAGTCTACAGAATCACACGA, reverso ATCGAAGACATTGACATCCA8
bp Cecropina 158: encaminhar CTGTTCGTGTTCGCTTGTGT, reverso GTAGCTGCTTCGCCTACCAC8
gloverin 101 bp: encaminhar GTGTTGAGCCCGTATGGGAA, reverso CCGTGCATCTGCTTGCTAAC8
bp moricin 124: encaminhar GCTGTACTCGCTGCACTGAT, reverso TGGCGATCATTGCCCTCTTT8) - Avaliar a eficiência da primeira demão para ser E = 2.
- Piscina 2 µ l de 5-10 amostras positivas diferentes (ou seja, os exemplos que estão expressando o gene para o qual o par de primer precisa ser investigado).
- Preparar uma série de diluição de 1:5 do grupo de amostra: 1 padrão (S1): sem diluir a piscina; S2:, 2 µ l de S1 + 8 µ l água nuclease-livre; S3:, 2 µ l de S2 + 8 µ l água nuclease-livre; S4: 2 µ l de S3 + água de nuclease livre 8 µ l.
- Aplica 1 µ l de S1-S4 e um controle de não-modelo (água livre de nuclease) para uma placa de 96 poços qPCR. Adicione 5 µ l de mistura de mestre RT, 0,1 µ l de cada 100 µM para diante e reverso da primeira demão, 3,7 µ l de água livre de nuclease e 0,1 µ l do mix de RT por bem.
- Executar a RT-PCR quantitativo (reverso transcrição: 50 ° C por 10 min, desnaturação inicial: 95 ° C por 5 min, desnaturação: 95 ° C por 10 s, recozimento: 60 ° C por 30 s, repetição de desnaturação e recozimento para 40 ciclos, derretendo: 95 ° C, cool até 4 ° C).
- Trama do log10 de unidades relativas para S1-S4 (1, 0,2, 0,04, 0.008) (eixo x) contra os correspondentes valores de ct (eixo y). Realize a regressão linear e determinar a inclinação da curva padrão. Calcule a eficiência e: E = 10-(1/slope). 20
Nota: Uma inclinação de-3.32 indica condições de reação ideal e eficiência da primeira demão de E = 2,00. Isto significa: a quantidade de produto do PCR dobra durante cada ciclo.
- Uso 100 ng do RNA digerido (100 ng / µ l) como um modelo para o RT-PCR. Reagentes Mix RT-PCR e execução RT-PCR, como referido no ponto 6.2. Medir todas as amostras de bactérias-DPBS-administrados e com limpeza par de primer e pares da primeira demão de alvo. Sempre executar as diluições de S1-S4 com o par de primer faxina e S1-S4 com o par de primer de destino no mesmo prato para determinação de eficiência.
- Calcule a relação (R) da expressão do gene do RNA de acordo com a fórmula a seguir usando a eficiência de determinado experimentalmente cartilha de ambos o serviço de limpeza e o par de primer do alvo. Normalizar as bactérias estimulada amostras para zombar de controles20.
R: relação
Edestino: eficiência de S1-4 medido com par de primer alvo
Elimpeza: eficiência de S1-4 medido com par de primer faxina
ΔCt-alvo(controle-amostra): Δct (CT da amostra DPBS-alimentados)-(ct da amostra de bactérias-alimentados) medido com par de primer alvo
ΔCtlimpezacontrole (amostra): Δct (CT da amostra DPBS-alimentados)-(ct da amostra de bactérias-alimentados) medido com par de primer faxina
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
O modelo de infecção de hemolinfa mellonella g. em amplamente utilizado para analisar os fatores de virulência de uma enorme variedade de agentes patogénicos. A maioria das medições incluem a análise da mortalidade de larvas, que é um método muito fácil. No entanto, esse método não permitem conclusões sobre respostas imunes em geral e vincular os resultados das respostas imunes de g. mellonella com vertebrados mecanismos imunes. O modelo de administração oral mellonella g. por outro lado só raramente é usado para infecção oral ou colonização das larvas devido às dificuldades para obter a infecção exata dosagem9. Além disso, apenas pouco é conhecido sobre mellonella g. respostas de imune inatas para bactérias não-patogênicas especialmente mamíferos comensais intestinais.
Em contraste com patógenos, comensais desafiam os anfitrião e desencadear respostas imunes, mas o sistema imunológico do hospedeiro é capaz de manter a homeostase imune. G. mellonella é capaz de limpar a carga bacteriana à força inicial até finalmente nenhuma bactéria foram detectável mais (Figura 2)8. As 16 número de cópias do gene de e. coli e b. vulgatus diminuiu substancialmente no prazo de 24 h.
Demonstrámos que o comensal-administrado mellonella g. larvas induzem a expressão do gene do RNA de genes marcadores de imunidade inata diferentes: moléculas LPS-reconhecimento - apolipophorin (ApoIII) e hemolin (Figura 3A, B) foram mostrados para ser geralmente mais altamente expressa em e. coli-administrado larvas em relação ao b. vulgatus-administrado larvas8. Ainda mais, a expressão do gene marcador de dois tipos de moléculas antimicrobianas pode ser monitorado. A produção de oxigênio reativo e espécies de nitrogênio (ROS/RNS) pode ser calculada através da medição sai e Nox-4 da expressão do gene que foram demonstrados ser fortemente upregulated em cima de e. coli alimentação forçada em comparação com B. vulgatus (Figura 4A, B)8. Além disso, a expressão do gene de antioxidante Gst poderia ser observado (Figura 4C). 8
Além disso, mostramos que expressão diferentes peptídeos antimicrobianos foi induzido mais forte após a administração de e. coli do que em resposta a alimentação forçada b. vulgatus . Observamos o upregulation de peptídeo defensina-como gallerimycin, LPS-interagindo gloverin peptídeo, Cecropina e moricin (Figura 5A, B, C, D)8.
Figura 1 : Alimentação forçada a instalação usando uma bomba de micro-seringa. Uma agulha sem corte-terminado é ajustada para bomba micro-seringa que permite a injeção precisa de bactérias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Persistência da carga bacteriana no Galleria mellonella larvas após alimentação forçada. Copiar os números de b. vulgatus- e e. coli-específico 16s rDNA genes foram determinados de 5 ng de cDNA em pontos diferentes de tempo usando RT-PCR. Pontos de dados são mostrados com indicação da mediana. Modificado da referência 8. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Reconhecimento de padrões diferenciais de bactérias por g. mellonella. As larvas foram administradas com dois diferentes comensais intestinais, RNA foi isolado após 16 h, e determinou-se a expressão de RNAm de LPS reconhecimento molécula apolipophorin (ApoIII) (A) e hemolin (B). Pontos de dados representam meios geométrica com erro padrão da média (SEM) (p > 0,05; *, p < 0,05; * *, p < 0,01; * * *, p < 0,001). 8 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Expressão de gene marcador ROS após desafio bacteriano. E. coli e b. vulgatus foram alimentados à força e expressão de gene de marcador de defesa ROS foi analisado ao longo do tempo. N º s (A), Nox-4 (B) e Gst (C) a expressão de RNAm foi medida em RNA larval isolado. Pontos de dados representam meios geométrica com erro padrão da média (SEM) (p > 0,05; *, p < 0,05; * *, p < 0,01; * * *, p < 0,001). Modificado da referência 8. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Expressão induzida por commensal defensina-como antimicrobiano do peptide mellonella g. larvas e em células epiteliais humanas. As larvas foram administradas por via oral com b. vulgatus ou e. coli, respostas imunes foram observadas ao longo do tempo e RNA foi isolado de indivíduos larvas. gallerimycin (A), Cecropina (B), gloverin (C), determinou-se a expressão de RNAm de moricin (D). Pontos de dados representam meios geométrica com erro padrão da média (SEM) (p > 0,05; *, p < 0,05; * *, p < 0,01; * * *, p < 0,001). Modificado da referência 8. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O modelo de g. mellonella é um modelo frequentemente usado para avaliar os fatores de virulência bacteriana em uma abordagem de infecção sistêmica21. Desde que muitos patógenos e bactérias entrarem o hospedeiro através da rota de colonização ou infecção oral, novos insights precisam ser encontrado para avaliar mellonella g. como um modelo para a colonização oral e infecção.
A possibilidade de traseira mellonella g. entre 15 e 37 ° C é uma grande vantagem, desde modelos mais mamíferos mantêm a temperatura de 37 ° C5. G. mellonella larvas podem ser compradas de fornecedores diferentes, mas o estabelecimento de uma população de reprodução própria oferece muitas vantagens tais como a ausência de antibióticos que interferem com os ensaios, melhor estimativa quando começar experiências desde que os fornecedores não fornecem sempre larvas em um palco de ready-to-use e respostas de estresse são evitadas devido a transporte ou mudanças de temperatura. Devido a tolerância de temperatura do mellonella g. a escala de temperatura em que a reprodução pode ser realizada é elevada. Temperaturas mais altas levam ao desenvolvimento mais rápido das larvas e de acordo com a temperatura de reprodução, podemos estimar o ciclo de vida do ovo para último ínstar larva. Quando as larvas foram selecionadas para experiências, apenas pálidos e velozes indivíduos foram escolhidos para evitar qualquer estresse e reações imunes a interferir com as experiências.
A fim de estabelecer o modelo engordo, ele precisa ter certeza de que a aplicação oral foi bem sucedida. Portanto, foi útil para configurar vários ensaios para os quais um corante de bromofenol forte foi adicionado à solução destinada a alimentação forçada. Isso ajuda a excluir qualquer larvas feridas e selecione para as larvas que possuem o corante azul somente dentro de suas entranhas22.
Usando este modelo, encontramos que g. mellonella larvas são úteis para investigar a cinética da resposta imune inata de certos genes marcadores. Durante a criação do modelo de administração oral e o estudo da cinética da resposta imune encontramos a expressão de gene não localmente expressos no intestino. Primeiros ensaios experimentais para extrair midgut RNA após a administração oral de bactérias comensais não forneceram resultados conclusivos. Portanto, as respostas imunes "globalmente" foram determinadas em indivíduos todo. Estes resultados suportam a hipótese de reconhecimento global via receptores intestinais, transmissão do sinal e desencadear a expressão do gene extra-intestinais. Geralmente, g. mellonella é capaz de induzir AMPs principalmente no corpo gordo, mas mais na hemócitos e o sistema intestinal9. Desde que não há nenhuma informação exata disponível sobre a produção de tecido-específica de moléculas antimicrobianas em larvas mellonella g. após a infecção, o RNA toda larval foi extraído de indivíduos completos e usado para análise do gene do RNA expressão. Uma vantagem adicional de extração de RNA toda larval é a contenção completa das bactérias vivas dentro do intestino e a possibilidade de quantificar a carga bacteriana. A dissecação do intestino pode levar à perda de bactérias devido a preparação.
Desde que a maioria das pesquisas de g. mellonella é executada sobre as características de virulência bacteriana estávamos especialmente interessado se e como as larvas desencadear respostas imunes para bactérias não-patogênicas que integram a microbiota dos mamíferos. Recentemente, mostramos que tanto mellonella g. e mamíferos compartilham semelhantes componentes da resposta imune inata, que são homólogas e conservada evolucionária. O oxid nítrico sintase (Nos) e genes de NADPH oxidase (Nox) compartilham um alto grau de similaridade8. G. mellonella portos mais um peptídeo antimicrobiano defensina-como gallerimycin que partilha semelhanças estruturais com mamíferos β-defensina 28.
Usando o modelo de administração oral foi possível demonstrar reconhecimento bacteriano diferencial de anti-inflamatórios simbiótica b. vulgatus ou pathobiotic pro-inflamatórios Escherichia coli. Além disso respostas a jusante de estresse oxidativo e produção de peptídeo antimicrobiano superior foram induzidas após a administração de Escherichia coli em comparação com b. vulgatus administração8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo DFG (SPP1656), o grupo de formação de pesquisa DFG 1708, o Bundesministerium für Bildung und pesquisa (BMBF) e o centro alemão para pesquisa de infecção (DZIF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030120086 | |
| 100 bp DNA ladder | Thermo Fisher Scientific | 15628019 | |
| 1-Bromo-3-Chloropropane (BCP) | Sigma-Aldrich | B9673 | |
| 2 mL tubes | Eppendorf | 0030120094 | |
| 2x Mangomix | Bioline | BIO-25033 | Colony PCR |
| 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 210 261 | |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Beeswax | Mixed-Store.de | - | |
| Brain heart infusion broth | Thermo Fisher Scientific | CM1135 | |
| CloneJET PCR Cloning Kit | Thermo Fisher Scientific | K1232 | Cloning vector for 16S fragments |
| Corn grits | Ostermühle Naturkost GmbH | 306 | Organic cultivation |
| Difco LB Agar, Miller (Luria-Bertani) | Becton Dickinson | BD | |
| Difoco LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Becton Dickinson | 244610 | |
| DNA-free DNA Removal Kit | Thermo Fisher Scientific | 244510 | Dnase digestion |
| Dried yeast | Rapunzel | - | Organic cultivation |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14040 | |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | W252506 | |
| Honey | Ostermühle Naturkost GmbH | 487 | |
| Isopropanol | VWR | 20842.330 | |
| Lightcycler 480 Instrument II | Roche Molecular Systems | 5015278001 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche Molecular Systems | 4729692001 | |
| Manual Microsyringe Pump with Digital Display | World Precision Instruments | DMP | |
| Micro-Fine+ U-100 insulin syringe 0.3 x 8 mm | Becton Dickinson | 324826 | Oral administration |
| Mortar, unglazed | VWR | 410-9327 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | 13-400-518 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | 10977035 | |
| Oxoid AnaeroGen sachets | Thermo Fisher Scientific | AN0025A | Quality and quantity of RNA |
| PCR stripes | Biozym | 710970 | |
| Pestle, unglazed grinding surface | VWR | 410-9324 | |
| Phusion proof-reading enzyme | Thermo Fisher Scientific | F553S | |
| Primers | Biomers | - | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1222 | |
| QuantiFast SYBR Green PCR kit | Qiagen | 204056 | qPCR for bacterial copy number measurment |
| QuantiFast SYBR Green RT-PCR Kit | Qiagen | 204156 | qRT-PCR for gene expression measurements |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205311 | cDNA synthesis |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit dsHS DNA kit | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | Quantification of plasmid and cDNA samples |
| Qubit fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33226 | Quantification of plasmid and cDNA samples |
| RNase-ExitusPlus | AppliChem | A7153 | |
| Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 | |
| Skimmed milk powder | Sucofin | - | |
| SYBR safe DNA Gel Stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | |
| TRI reagent | Sigma-Aldrich | T9424 | |
| Weighing boat | VWR | 10803-148 | |
| Wheat meal | Ostermühle Naturkost GmbH | 6462 | Organic cultivation |
References
- Nell, S., Suerbaum, S., Josenhans, C. The impact of the microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nature Reviews Microbiology. 8 (8), 564-577 (2010).
- Muniz, L. R., Knosp, C., Yeretssian, G. Intestinal antimicrobial peptides during homeostasis, infection, and disease. Frontiers in Immunology. 3, 310 (2012).
- Ivanov, I. I., Honda, K. Intestinal commensal microbes as immune modulators. Cell Host Microbe. 12 (4), 496-508 (2012).
- Ayres, J. S. Inflammasome-microbiota interplay in host physiologies. Cell Host Microbe. 14 (5), 491-497 (2013).
- Champion, O. L., Titball, R. W., Bates, S. Standardization of G. mellonella Larvae to Provide Reliable and Reproducible Results in the Study of Fungal Pathogens. Journal of Fungi (Basel). 4 (3), (2018).
- Wojda, I. Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella. Insect Science. , (2016).
- Buchmann, K. Evolution of Innate Immunity: Clues from Invertebrates via Fish to Mammals. Frontiers in Immunology. 5, 459 (2014).
- Lange, A., et al. Galleria mellonella: A Novel Invertebrate Model to Distinguish Intestinal Symbionts From Pathobionts. Frontiers in Immunology. 9 (2114), (2018).
- Tsai, C. J., Loh, J. M., Proft, T. Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing. Virulence. , 1-16 (2016).
- Bolouri Moghaddam, M. R., et al. The potential of the Galleria mellonella innate immune system is maximized by the co-presentation of diverse antimicrobial peptides. Biological Chemistry. 397 (9), 939-945 (2016).
- Casanova-Torres, A. M., Goodrich-Blair, H. Immune Signaling and Antimicrobial Peptide Expression in Lepidoptera. Insects. 4 (3), 320-338 (2013).
- Mukherjee, K., et al. Galleria mellonella as a model system for studying Listeria pathogenesis. Applied and Environmental Microbiology. 76 (1), 310-317 (2010).
- Brennan, M., Thomas, D. Y., Whiteway, M., Kavanagh, K. Correlation between virulence of Candida albicans mutants in mice and Galleria mellonella larvae. FEMS Immunological and Medical Microbiology. 34 (2), 153-157 (2002).
- Miyata, S., Casey, M., Frank, D. W., Ausubel, F. M., Drenkard, E. Use of the Galleria mellonella caterpillar as a model host to study the role of the type III secretion system in Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infection and Immunity. 71 (5), 2404-2413 (2003).
- Waidmann, M., et al. Bacteroides vulgatus protects against Escherichia coli-induced colitis in gnotobiotic interleukin-2-deficient mice. Gastroenterology. 125 (1), 162-177 (2003).
- Lange, A., et al. Extensive Mobilome-Driven Genome Diversification in Mouse Gut-Associated Bacteroides vulgatus mpk. Genome Biology and Evolution. 8 (4), 1197-1207 (2016).
- Hermann-Bank, M. L., Skovgaard, K., Stockmarr, A., Larsen, N., Molbak, L. The Gut Microbiotassay: a high-throughput qPCR approach combinable with next generation sequencing to study gut microbial diversity. BMC Genomics. 14, 788 (2013).
- Sato, K., et al. OmpA variants affecting the adherence of ulcerative colitis-derived Bacteroides vulgatus. Journal of Medical and Dental Science. 57 (1), 55-64 (2010).
- Freitak, D., et al. The maternal transfer of bacteria can mediate trans-generational immune priming in insects. Virulence. 5 (4), 547-554 (2014).
- Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Research. 29 (9), 45 (2001).
- Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).
- Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).
