Summary
Aquí proporcionamos un protocolo detallado para un modelo de administración oral con larvas de Galleria mellonella y cómo caracterizar inducido la respuesta inmune innata. Mediante este protocolo, investigadores sin experiencia práctica será capaces de usar la g. mellonella forzada método.
Abstract
La investigación del potencial inmunogénico de bacterias comensales en el sistema inmune de host es un componente esencial al estudiar las interacciones huésped-microbio intestinal. Está bien establecido que diversos comensales exhiben un potencial diferente para estimular el sistema inmune intestinal del host. Estas investigaciones involucran animales vertebrados, especialmente roedores. Puesto que cada vez más preocupaciones éticas están relacionadas con experimentos con vertebrados, hay una alta demanda para los modelos invertebrados reemplazos.
Aquí, ofrecemos un modelo de la administración oral de Galleria mellonella con bacterias no patógenas comensales y la posible evaluación del potencial inmunogénico de comensales en el sistema inmunológico de g. mellonella . Demostrar que g. mellonella es un modelo de reemplazo invertebrados alternativa útil que permite el análisis de comensales con diferente potencial inmunogénico como Bacteroides vulgatus y Escherichia coli. Curiosamente, las bacterias no exhiben ningún efecto de matar a las larvas, que es similar a los mamíferos. Las respuestas inmunes de g. mellonella eran comparables con vertebrados la respuesta inmune innata e implican el reconocimiento de las bacterias y la producción de moléculas antimicrobianas. Proponemos que g. mellonella fue capaz de restablecer el anterior equilibrio de la microbiota, que es bien conocido de individuos mamíferos sanos. Aunque proporcionando comparable respuesta inmune innata en g. mellonella y vertebrados, g. mellonella no albergan un sistema inmune adaptante. Puesto que los componentes investigados del sistema inmune innato son evolutivos conservado, el modelo permite un preselección y primer análisis de propiedades inmunogénicas bacterianas.
Introduction
El microbioma intestinal es un componente esencial para el mantenimiento de la homeostasis e involucra tanto las respuestas inmunes innata y adaptativa1,2. La comunidad de la microbiota comensal se caracteriza por diferentes componentes comensales: simbiontes que confieren efectos beneficiosos por funciones inmunomoduladoras importantes y pathobionts que puede tener efectos perjudiciales genéticamente predispuestos acoge y promover y provocar inflamación intestinal3,4. Muchos estudios de simbiontes y pathobionts y su influencia en el sistema de inmune del anfitrión han sido publicados principalmente estudio de respuestas inmunes adaptativas.
Puesto que estos estudios implican muchos animales para las investigaciones y la protección y reemplazo de los animales utilizados para experimentación es de creciente interés público, tratamos de encontrar un modelo de reemplazo para permitir la proyección de diferentes bacterias inmunogénica propiedades. Insectos, especialmente Galleria mellonella, son un modelo de reemplazo utilizados en la investigación de la infección. G. mellonella combina diversas ventajas como bajos costos y alto rendimiento; permite la administración oral de bacterias, que es la vía natural, y permite la infección sistémica5,6. G. mellonella más permite la incubación a 37 ° C, que es la temperatura fisiológica del cuerpo de los mamíferos y el óptimo para la virulencia bacteriana factor expresión5. La principal ventaja de g. mellonella es el conservado sistema inmune innato que permite la discriminación del yo del no yo y codifica una gran variedad de receptores de reconocimiento de patrón como apolipophorin o las opsoninas hemolin6, 7. a partir del reconocimiento del microbio, g. mellonella puede desencadenar diferentes inmunorespuestas humorales aguas abajo. Pueden inducir respuestas de estrés oxidativo y secretan especies reactivas de oxígeno (ROS) que implica la actividad de la NOS (sintasa de oxidasa nítrica) y NOX (NADPH oxidasa)6,8. Además, g. mellonella activa una respuesta potente péptido antimicrobianos (AMP), que se traduce en la secreción de una mezcla de diferentes amperios como gloverin, moricin, cecropina o la Defensina-como gallerimycin6, 8,9,10. En general, amperios tienen especificidad del hospedador bastante amplio contra las bacterias Gram-positivas y gram-negativas y hongos y dar una respuesta potente ya que los insectos carecen de cualquier respuesta adaptativa10. Gloverin es un amplificador activo contra bacterias y hongos e inhibe la formación de membrana externa6,11. Moricins exhiben su función antimicrobiana contra bacterias Gram positivas y gram negativas por penetrar en la membrana y la formación de un poro9,11. Cecropinas proporcionan actividad contra bacterias y hongos y permeabilizar la membrana semejantemente como moricins9,10. Gallerimycin es un péptido de Defensina-como con propiedades anti-hongos9. Curiosamente, se encontró que la combinación de la cecropina y gallerimycin tuvieron una actividad sinérgica contra e. coli10.
Debido a su carácter de fácil uso g. mellonella larvas son un modelo de infección utilizadas para evaluar la patogenicidad bacteriana. En particular, los estudios en que los datos obtenidos de g. mellonella correlacionaron con datos obtenidos de ratones soporte la fuerza de este modelo de host alternativo. Se encontró que los serotipos más patógenos de Listeria monocytogenes en un modelo murino de infección también conducen a mayores tasas de mortalidad en g. mellonella después de la infección sistémica. Además, menos serotipos virulentos resultaron para ser también menos virulenta en el modelo de g. mellonella 12. Observaciones similares se han hecho con los hongos patógenos humanos Candida albicans. Virulencia de C. albicans de diferentes cepas ha sido evaluado por la infección sistémica y posterior seguimiento de supervivencia larval. Cepas avirulentas de ratón fueron avirulentas o exhiben reducida virulencia en g. mellonella, mientras que las cepas virulentas de ratón conducen también a alta mortalidad larvaria13. El modelo de g. mellonella adicional podría utilizarse para identificar los factores de patogenicidad de sistema tipo 3 secreción de Pseudomonas aeruginosa14.
Puesto que la mayoría de las investigaciones que involucran g. mellonella se centraron en factores de virulencia utilizando el enfoque sistémico infección estábamos especialmente interesados en proporcionar un método adecuado para el análisis de los comensales intestinales en una alimentación oral forzada modelo en el que podemos aplicar una dosis distinta de las bacterias por las larvas y no sólo observar la tasa de mortalidad larval pero analizar diferentes características de inmunorespuestas naturales para mantener la homeostasis intestinal.
Nuestro método ayuda a aumentar el uso de g. mellonella como un modelo de reemplazo ya que combinamos la aplicación de bacterias y el análisis de expresión de RNA. No sólo es útil reforzar el significado de los estudios de la patogénesis bacteriana cuando se incluye el análisis de las respuestas inmunes después de la administración oral y no sólo la observación de las tasas de mortalidad después de la infección sistémica. Nuestros métodos permite el análisis de las propiedades inmunogénicas de bacterias no patógenas comensales puesto que es proporciona condiciones más complejas que el cultivo celular, ofreciendo una barrera intestinal en un organismo vivo.
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Protocol
1. cría de g. mellonella y preparación de las larvas de los experimentos
Nota: El ciclo de huevo al último estadio la larva tarda aproximadamente 5-6 semanas.
- La transferencia de los huevos de la polilla adulta a las cajas de 2 L que contiene sustrato de polilla de la cera (grits de maíz 22%, 22% harina de trigo, cera de 17,5%, 11% leche desnatada en polvo, miel de 11%, 11% glicerol, levadura secadas de 5,5%). Realizar toda la cría a 30 ° C en la oscuridad.
- Transferir 25 g del sustrato que contiene las larvas en sustrato fresco después de aproximadamente 1-2 semanas cuando se veían pequeñas y diminutas larvas. Sincronizar las larvas después de 2 semanas según su tamaño y mantener grupos de 30-40 larvas en recipientes de 2 L en el substrato de la polilla de la cera durante 2 semanas adicionales.
- Seleccionar las larvas para experimentos por peso. Utilizar larvas móviles sólo pálidas y rápidas con una masa de 180-200 mg.
2. cultivo y elaboración de Bacteroides vulgatus y Escherichia coli para administración oral
- Crecer la obligan bacterias anaerobias Bacteroides vulgatus mpk a 37 ° C anaeróbicamente usando frascos y sobres para crear un ambiente anaerobio (véase Tabla de materiales)15,16. Cultivar B. vulgatus durante 2 días y crecer un subcultivo durante la noche en caldo de cerebro corazón infusión (BHI).
- Crecer la bacteria anaerobia facultativa Escherichia coli mpk bajo condiciones aerobias en caldo Luria-Bertani (LB) a 37 ° C. Cultivar e. coli durante la noche en caldo LB y crecer subcultivo por 2 h a 37 ° C en el día del experimento.
- Cosecha los cultivos por centrifugación a 1.700 x g durante 5 min Resuspender el bacteriano de las pelotillas en DPBS (de Dulbecco Phosphate-Buffered solución salina). Determinar la densidad óptica (OD) de los cultivos bacterianos en OD 600 nm y calcular las concentraciones bacterianas. Las concentraciones bacterianas se ajustaron a 109/ml.
3. alimentación forzada de las larvas de g. mellonella con suspensiones bacterianas
- Force-feed cada larva con 10 μl de la suspensión bacteriana ajustada que contiene 107 bacterias por dosis. Utilice una jeringa de insulina con una aguja de punta Roma para uso oral de la suspensión bacteriana.
- Fijar la jeringa en la bomba (figura 1) para asegurar la exactitud del volumen de suspensión aplicado a cada larva de una microjeringa (véase Tabla de materiales). Inserte la jeringa cuidadosamente entre sus mandíbulas. No fuerce la jeringa entre las mandíbulas. Espere a que las larvas abren zonas bucales y luego inserte la jeringa.
- Incuban las larvas Force-FED en la oscuridad a 37 º C entre larvas de DPBS uso administrado 1-24 h. como falso fondo controles excluir posibles respuestas de estrés inducidas por la manipulación de las larvas durante la alimentación forzada.
4. proceso de larvas por vía oral y el aislamiento de RNA
- Trabajar bajo una capucha y gafas de seguridad. Limpiar la campana y spray reactivo para evitar contaminación con ARNasas.
- Rápido-congele las larvas de vida después de la incubación en nitrógeno líquido y homogeneizarlas. Utilice un mortero y pistilo de homogeneización. Añadir nitrógeno líquido al mortero y rejilla cada individuo larvario hasta homogenados en polvo se producen.
- Vierta el homogeneizado a una desechable peso barco y esperar a que el nitrógeno líquido se evapore.
- Mezclar el líquido libre de nitrógeno congelado homogenados en polvo con 1 mL de Trizol en un tubo de 2 mL e incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 1 h.
- Centrifugar la mezcla a 8.000 x g durante 15 min a temperatura ambiente y transferir el sobrenadante a un tubo nuevo y descartar el precipitado. El sobrenadante de la mezcla con 200 μL de 1-Bromo-3-cloropropano (BCP). Vortex e incubar la mezcla durante 5 minutos a temperatura ambiente y durante 10 minutos en hielo.
- Centrifugue las reacciones BCP agregó a 18.000 x g durante 15 min a 4 ° C. Transferir la capa superior transparente a un nuevo tubo de 2 mL y desechar el resto. Precipitar el ARN de la capa superior transferido con 500 de μl de isopropanol por mezcla e invertir el tubo durante 5 minutos.
- Centrifugar el tubo a 18.000 x g durante 15 min a 4 ° C. Lavar el pellet de RNA precipitado con 500 μl de etanol 75%.
- Secar el pellet de RNA durante 5-10 min a TA. Tenga cuidado de no secar ya que será difícil de disolver más tarde.
- Diluir el inhibidor de la ribonucleasa (1: 100) en agua libre de nucleasas y 100 μl de la solución para Resuspender el precipitado de RNA seco. Vórtice el tubo con cuidado hasta que el precipitado se haya disuelto completamente.
- Cantidad y calidad de medida RNA. Asegúrese de que la relación 260/280 es aproximadamente 2.0 y 260/230 la relación en el rango de 2.0-2.2 (véase Tabla de materiales).
- Uso 5 μg de RNA aislado para la digestión de la ADNsa. Mezcla 5 μl de 10 x buffer, 1 μl de enzima inhibidor de ribonucleasa, 2 μl de la enzima DNasa, 5 μg de RNA y se llenan con nucleasa agua hasta 50 μl. Incubar 30 min a TA.
- Añadir 6 μl de reactivo de inactivación e incubar durante 2 min a la reacción de RT y de vortex de vez en cuando. De centrífuga reacción a 10.000 x g durante 1 min transferencia sobrenadante en tubo de 1,5 mL fresco.
Nota: El RNA contiene el ARN larval, así como el ARN bacteriano de la cepa correspondiente utilizado para administración oral.
- Añadir 6 μl de reactivo de inactivación e incubar durante 2 min a la reacción de RT y de vortex de vez en cuando. De centrífuga reacción a 10.000 x g durante 1 min transferencia sobrenadante en tubo de 1,5 mL fresco.
5. cuantificación de los números de copia bacteriano 16S después de alimentación forzada
Nota: Los números de copia de la 16S bacteriano expresada se determinan utilizando el cDNA sintetizado a partir del RNA extraído en la sección 4. Cuantificación final se calcula con la ayuda de una curva estándar del plásmido en el que se clonó el fragmento PCR 16S de B. vulgatus o e. coli .
- Elaboración de normas de plásmido
- Amplificar fragmentos 16S de e. coli mpk o B. vulgatus mpk ADN genómico por PCR. Mezclar 10 μl de 5 x buffer, 1 μl de solución de dNTP 10 mM, 2.5 μl de cebador forward 10 μm y 2,5 μl de dilución de cebador inverso de 10 μm, 1 μl de DMSO, 1 μl de la plantilla de la DNA genomic, 31.5 μl de agua libre de nucleasas y 0,5 μl de enzima de la corrección de pruebas.
- Ejecutar el PCR (desnaturalización inicial: 98 ° C por 30 s, desnaturalización: 98 ° C por 10 s, recocido: 60 ° C durante 30 s, extensión: 72 ° C por 30 s, extensión final: 72 ° C por 5 min, repetir la desnaturalización, recocido y extensión por 30 ciclos).
- Usar primers de e. coli 16S (p_forward: GTTAATACCTTTGCTCATTGA, p_reverse: ACCAGGGTATCTAATCCTGTT17, 320 bp) o 16S B. vulgatus iniciadores (p_forward: AACCTGCCGTCTACTCTT, p_reverse: CAACTGACTTAAACATCCAT18, 400 bp) para amplificación.
- Utilice los fragmentos PCR 16S de e. coli y B. vulgatus de Roma-final clonado en un vector de clonación. Establecer la ligadura y mezclar 10 μl de 2 x de buffer, 1 μl del producto PCR no purificada, 1 μl del plásmido clonación Roma-final, 7 μl de agua libre de nucleasas y 1 μl de T4 ADN ligasa. Incubar la ligadura durante 10 min a TA.
- Preparar células competentes de e. coli DH5α.
- Inocular 100 mL de medio LB en un erlenmeyer con 1 mL de un cultivo durante la noche. Crezca la cultura hasta OD 600 nm es entre 0.4-0.6. Divide la cultura resultante en dos tubos de 50 mL e incubar los cultivos en hielo durante 10 minutos.
- Centrifugar los cultivos a 1.700 x g por 10 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante y resuspender cada precipitado con 5 mL de solución RFI (30 mM CH3COOK, 100 mM KCl, 10 mM CaCl, 50 mM MnCl2, ajustar el pH 5.8 con ácido glacial, estéril filtrada). Llenar cada tubo con 45 mL adicional de solución de RFI.
- Centrifugar los cultivos a 1.700 x g por 10 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante y resuspender cada precipitado con 6 mL de RFII (MOPS 10 mM, 15 mM CaCl2, 10 mM KCl, 15% de glicerol, autoclave) solución. Ambas fracciones de la piscina e incubar la suspensión de 12 mL en hielo para alícuotas de suspensión de celda 15 minutos Prepare (200 μL). Almacenar las alícuotas a-80 ° C.
- Transferencia de la reacción de la ligadura a una alícuota de competente e. coli DH5α células y dejar la reacción en hielo por 15 min calor del choque las células para 45 s a 42 ° C y añadir 1 mL de medio LB.
- Incubar transformación por 45 min a 37 ° C. Añadir 100 μl de la transformación a una placa de agar LB con ampicilina e incubar durante una noche a 37 ° C.
- De la placa de agar LB de paso 5.1.5 realizar la Colonia PCR de transformantes resultantes 8. Elija cada colonia con un palillo de dientes, introducirlo en un fresco plato LB conteniendo ampicilina (placa principal) y luego sumergir el mismo palillo de dientes en un bien que contiene 5.5 μl de agua libre de nucleasas en una franja PCR.
- Añadir 7,5 μl de mezcla de x PCR 2, 0,5 μl de cebador forward de 10 μm y 0,5 μl de dilución de cebador inverso de 10 μm. Utilice las mismas parejas de la cartilla mencionadas en la sección 5.1.1.
- Ejecutar PCR (desnaturalización inicial: 95 ° C por 5 min, desnaturalización: 95 ° C por 1 min, recocido: 60 ° C durante 30 s, extensión: 72 ° C por 1 min, extensión final: 72 ° C por 7 min, repetir la desnaturalización, recocido y extensión de 35 ciclos).
- Verifique el tamaño de los fragmentos 16S en un gel de agarosa 1%. Utilice tampón de borato-Tris-EDTA (TBE) x 0.5 para disolver 1 g de agarosa y hervir en el microondas. Añadir tinte 1: 50.000 para gel y verterlo. Añadir las reacciones de PCR de Colonia y una escalera de DNA 100 bp para el gel y correr el gel por 45 min a 110 V.
- Inocular una cultura noche de LB 5 mL que contienen ampicilina con un clon de la placa principal (sección 5.1.6) para cada plásmido 16S de e. coli y B. vulgatus que contiene el tamaño del inserto correcto.
- Centrifugar los cultivos bacterianos durante la noche en un tubo de 2 mL a 1.700 x g. Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado en 600 μl de agua estéril.
- Añada 100 μl de tampón de lisis y mezclar por inversión del tubo 6 veces. Añadir 350 μl de frío (4° C) solución de neutralización y mezclar bien invirtiendo el tubo.
- Centrifugar a máxima velocidad en una centrífuga para 3 minutos transferir el sobrenadante (~ 900 μL) a una columna de spin y centrifugar a máxima velocidad en una centrífuga para 15 s.
- Deseche el flujo y añadir 200 μL de endotoxina retiro lavar y centrifugar a máxima velocidad en una centrífuga para 15 s.
- Añadir 400 μL de solución de lavado a la columna y centrifugar a máxima velocidad en una centrífuga de transferencia s. 30 la columna a un tubo limpio de 1.5 mL, Añadir 30 μl de tampón de elución a la columna la incubar durante 1 min a temperatura ambiente.
- Centrifugar a máxima velocidad en una centrífuga para 30 s (véase Tabla de materiales).
- Determinar la concentración de DNA de plásmido mezclando 1 μl de ADN plásmido con 199 μl de solución de trabajo (1 μl de colorante fluorescente por 199 μl de tampón de cada reacción). Preparar dos estándares mezclando 10 μl del estándar 1 o 10 μl de estándar 2 con 190 μl. mezclar la muestra y tubos e incubar la reacción 2 min medida de la concentración (véase Tabla de materiales).
- Preparar concentraciones estándar en diluciones seriadas 10 veces en un rango de 10-100.000 copias: cálculo de la masa de los plásmidos solo (m = (n) x (1.096x10-21 g/bp), n = tamaño del plásmido, m = masa). Calcular la masa de plásmido ADN necesario para contener los números de copia deseado de interés (Copiar número de interés x masa del plásmido individual = masa del plásmido ADN necesitada).
- Preparación de muestras para la cuantificación
- Sintetizar el cDNA. Se mezclan 2 μl de buffer de 7 x, 1 μl de DNasa-digerido ARN de sección 4 y 11 μl de agua libre de nucleasa. Incubar durante 2 min a 42 ° C.
- Coloque inmediatamente la reacción en hielo. Mezcle 4 μL de 5 x Buffer de RT, 1 μl de la mezcla de la cartilla de RT (transcriptasa inversa), 1 μl de enzima de RT y la reacción de paso 5.2.1. Incubar 15 min a 42 ° C. Incubar 3 min a 95° C para inactivar la enzima RT.
- Cuantificar el cDNA concentraciones fluorometrically como se describe en el paso 5.1.9.
- Sintetizar el cDNA. Se mezclan 2 μl de buffer de 7 x, 1 μl de DNasa-digerido ARN de sección 4 y 11 μl de agua libre de nucleasa. Incubar durante 2 min a 42 ° C.
- Medición de la carga bacteriana
- Ajustar las concentraciones de cDNA 5 ng por reacción, 12 μl de PCR cuantitativa. De la mezcla mezcla de RT-PCR de x 2, 0.25 μl de cebador forward de 100 μm, 0.25 μl de cebador inverso de 100 μm (5.1.1) y 12 μl de cDNA ajustado. Ejecutar qPCR (desnaturalización inicial: 95 ° C por 5 min, desnaturalización: 95 ° C durante 10 s, recocido: 60 ° C durante 30 s, repita la desnaturalización y recocido de 35 ciclos de fusión: 95 ° C, enfriar a 4 ° C).
- Diagrama log10 concentraciones de la curva estándar de plásmido (10-100.000 copias), es decir, 1-5 (eje x), contra los valores de ct correspondientes (eje y). Realice regresión lineal para obtener la ecuación de regresión. Resolver la ecuación para x (concentración). Utilice la fórmula para calcular el log10 de los números de copia insertando ct-valor en la fórmula. Calcular el Antilogaritmo para obtener números de copia.
6. determinación del gen marcador inmunológico innato usando RT-PCR cuantitativa
- Ver cartillas para especificidad gen por PCR y posterior agarose gel electroforesis para verificar el tamaño del fragmento correcto. Realizar PCR como se describe en sección 5.1.5.
Ubiquitina 130 bp: delantero TCAATGCAAGTAGTCCGGTTC, marcha atrás CCAGTCTGCTGCTGATAAACC19 (limpieza)
Nox-4 159 bp: adelante TGGCACGGCATCAGTTATCA, ACAGCGACTGTCATGTGGAA inversa8
Bp Nº 76: adelante ATGAAGGTGCTGAAGTCACAA, GCCATTTTACAATCGCCACAA inversa8
Gst 156 bp: adelante GACAGAAGTCCTCCGGTCAG, TCCGTCTTCAAGCAAAGGCA inversa8
ApoIII 265 bp: adelante AGACTTGCACGCCATCAAGA, TGCATGCTGTTTGTCACTGC inversa8
hemolin 267 bp: adelante CTCCCTCACGGAGGACAAAC, GCCACGCACATGTATTCACC inversa8
gallerimycin 161 bp: adelante GAAGTCTACAGAATCACACGA, ATCGAAGACATTGACATCCA inversa8
cecropina 158 bp: adelante CTGTTCGTGTTCGCTTGTGT, GTAGCTGCTTCGCCTACCAC inversa8
gloverin 101 bp: adelante GTGTTGAGCCCGTATGGGAA, CCGTGCATCTGCTTGCTAAC inversa8
moricin 124 bp: adelante GCTGTACTCGCTGCACTGAT, TGGCGATCATTGCCCTCTTT inversa8) - Evaluar la eficiencia de la cartilla para ser E = 2.
- Piscina, 2 μl de 5-10 diferentes muestras positivas (es decir, muestras que están expresando el gen para que el par de la cartilla debe investigarse).
- Preparar una serie de diluciones de 1:5 de la piscina de la muestra: estándar 1 (S1): sin diluir piscina; S2: 2 μl de S1 + agua libre de nucleasa 8 de μl; S3: 2 μl S2 + agua libre de nucleasa 8 de μl; S4: 2 μl de S3 + 8 μl de agua libre de nucleasa.
- Aplicar 1 μl de S1-S4 y un control no es de plantilla (agua libre de nucleasas) a una placa de 96 pocillos qPCR. Añadir 5 μl de la mezcla principal de RT, 0.1 μl de cada cebador μm 100 de avance y retroceso, 3.7 μl de agua libre de nucleasas y 0.1 μl de mezcla de RT por pozo.
- Ejecutar la RT-PCR cuantitativa (transcripción reversa: 50 ° C durante 10 min, desnaturalización inicial: 95 ° C por 5 min, desnaturalización: 95 ° C durante 10 s, recocido: 60 ° C durante 30 s, repita la desnaturalización y recocido de 40 ciclos de fusión: 95 ° C, enfriar a 4 ° C).
- Diagrama log10 de unidades relativas de S1-S4 (1, 0.2, 0.04 0.008) (eje x) contra el ct-valores (eje y). Realice regresión lineal y determinar la pendiente de la curva estándar. Calcular la eficiencia E: E = 10-(1/slope). 20
Nota: Una pendiente de-3.32 indica las condiciones de reacción ideal y la eficiencia de la cartilla de E = 2.00. Esto significa: la cantidad de producto de PCR se duplica en cada ciclo.
- Uso 100 ng de ARN digerido (100 ng/μL) como una plantilla para RT-PCR. Reactivos de mezcla RT-PCR y RT-PCR ejecución como indica en la sección 6.2. Mida todas las muestras de bacterias y DPBS administrados con limpieza par primer y pares de primer destino. Siempre se ejecutan las diluciones de S1-S4 con la limpieza par primer y S1-S4 con el par del primer destino en la misma placa para la determinación de la eficiencia.
- Calcular la relación (R) de la expresión de genes de RNA según la siguiente fórmula utilizando la eficacia de determinado experimentalmente la cartilla de la economía doméstica y el par de primer destino. Normalizar las bacterias estimula muestras burlarse de controles20.
R: cociente
Eobjetivo: eficiencia de S1-4 mide con par de primer destino
Elimpieza: eficiencia de S1-4 mide con limpieza par de primer
Δctobjetivo(control-sample): Δct (CT de DPBS fed muestra)-(ct muestra bacterias alimentado) medido con par de primer destino
Limpiezade Δct(control-sample): Δct (CT de DPBS fed muestra)-(ct muestra bacterias alimentado) medido con limpieza par de primer
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Representative Results
El modelo de infección de g. mellonella hemolinfa en ampliamente utilizado para analizar los factores de virulencia de una gran variedad de patógenos. La mayoría las medidas incluyen el análisis de la mortalidad de las larvas, que es un método muy fácil. Sin embargo, este método no permite conclusiones sobre las respuestas inmunes en general y vincular los resultados de las respuestas inmunitarias de g. mellonella con mecanismos inmunes vertebrados. El modelo de la administración oral de g. mellonella por otro lado solamente raramente utiliza oral infección o colonización de las larvas debido a las dificultades para obtener infección exacta dosificación9. Además, solamente poco se sabe acerca de g. mellonella la respuesta inmune innata hacia las bacterias no patógenas comensales intestinales especialmente mamíferos.
En contraste con agentes patógenos, comensales desafían las inmunorespuestas del anfitrión y el gatillo pero el sistema inmune del host es capaz de mantener la homeostasis inmune. G. mellonella es capaz de borrar la Force-FED carga bacteriana inicial hasta que finalmente ya no eran perceptibles bacterias (figura 2)8. El 16s números de copia del gen de e. coli y B. vulgatus disminución sustancialmente dentro de 24 h.
Hemos demostrado que administrada de comensales larvas de g. mellonella inducen la expresión de genes de RNA de genes marcadores de inmunidad innata diferentes: moléculas de LPS-reconocimiento - apolipophorin (ApoIII) y hemolin (figura 3A, B) mostraron generalmente mayor expresados en e. coli-administrado larvas en comparación con B. vulgatus-administrado larvas8. Además, expresión del gen marcador de dos clases de moléculas antimicrobianas puede controlarse. La producción de oxígeno reactivo y especies de nitrógeno (ROS/RNS) puede ser estimada por la medición de no y Nox-4 expresión de gene que fueron demostrados ser fuertemente upregulated en e. coli forzada en comparación con B. vulgatus (figura 4A, B)8. Además, la expresión génica de antioxidantes Gst se pudo observar (figura 4C). 8
Además nos demostró que la expresión de péptidos antimicrobianos diferentes fue inducida más fuerte después de la administración de e. coli que en respuesta a la alimentación forzada B. vulgatus . Se observó un upregulation de gallerimycin como Defensina péptido péptido gloverin interacción con LPS, cecropina y moricin (figura 5A, B, C, D)8.
Figura 1 : Alimentación forzada instalación utilizando una microjeringa bomba. Una aguja de punta Roma se ajusta en la microjeringa bomba que permite inyección precisa de bacterias. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Persistencia de la carga bacteriana en larvas de Galleria mellonella después forzada. Copiar número de B. vulgatus- y e. coli-16s específica genes de ADNr se determinaron de 5 ng de cDNA en diferentes puntos temporales usando RT-PCR. Se muestran los puntos de datos con indicación de la media. Modificado de referencia 8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Reconocimiento de patrón diferencial de bacterias por g. mellonella. Las larvas fueron administradas con dos comensales intestinales diferentes RNA fue aislado después de 1-6 h y se determinó la expresión del mRNA de apolipophorin de la molécula de reconocimiento de LPS (ApoIII) (A) y hemolin (B). Puntos de datos representan medios geométrica con error estándar de la media (SEM) (p > 0.05; *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001). 8 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Expresión del gen ROS marcador después del desafío bacteriano. E. coli y B. vulgatus eran Force-FED y se analizó la expresión génica ROS defensa marcador con el tiempo. Nos (A), Nox-4 (B) y Gst (C) la expresión del mRNA se midió en el ARN aislado de larvas. Puntos de datos representan medios geométrica con error estándar de la media (SEM) (p > 0.05; *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001). Modificado de referencia 8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : Expresión inducida por comensal Defensina-como péptidos antimicrobianos en células epiteliales humanas y larvas de g. mellonella . Las larvas fueron administradas por vía oral con B. vulgatus o e. coli, las respuestas inmunitarias se observaron con el tiempo y RNA fue aislado de individuos larvarios. gallerimycin (A), cecropina (B), gloverin (C), se determinó la expresión del mRNA de moricin (D). Puntos de datos representan medios geométrica con error estándar de la media (SEM) (p > 0.05; *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001). Modificado de referencia 8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El modelo de g. mellonella es un modelo frecuentemente utilizado para evaluar los factores de la virulencia bacteriana en una infección sistémica enfoque21. Puesto que muchos agentes patógenos y bacterias entran al host vía oral infección o colonización, nuevos conocimientos hay que encontrar para evaluar g. mellonella como un modelo de colonización oral y la infección.
La posibilidad de posterior g. mellonella entre 15 y 37 ° C es una gran ventaja ya que modelos más mamíferos mantienen la temperatura corporal de 37 ° C5. Las larvas de g. mellonella pueden adquirirse de diferentes proveedores, pero el establecimiento de una población de crianza propia ofrece muchas ventajas como la ausencia de antibióticos que interfieren con los ensayos, mejor estimación cuando iniciar experimentos puesto que los proveedores no siempre proporcionan larvas en un escenario listo para su uso y evitar respuestas de estrés por transporte o cambios de temperatura. Debido a la tolerancia a la temperatura de g. mellonella el rango de temperatura en la cual se puede realizar cría es alta. Temperaturas más altas conducen a mayor desarrollo de las larvas y de acuerdo a la temperatura de cría, podemos estimar el ciclo de vida de huevo a último instar de la larva. Cuando las larvas fueron seleccionadas para los experimentos, solamente pálidos y rápido movimiento de individuos fueron escogidos para evitar cualquier estrés y reacciones inmunes a interferir con los experimentos.
Para establecer el modelo forzado, debe garantizarse que la aplicación oral fue exitosa. Por lo tanto, es útil configurar varios ensayos para que un colorante bromofenol fuerte se añade a la solución para la alimentación forzada. Esto ayuda a excluir cualquier lesionadas larvas y seleccionar para las larvas que tienen el tinte azul en su tripa22.
Usando este modelo, encontramos que las larvas de g. mellonella son útiles para investigar la cinética de la respuesta inmune innata de ciertos genes del marcador. Durante el establecimiento del modelo de administración oral y el estudio de la cinética de la respuesta inmune se encontraron genes no expresados localmente en el intestino medio. Primeros ensayos experimentales para extraer RNA del midgut después de la administración oral de bacterias comensales no proporcionó resultados concluyentes. Por lo tanto, las respuestas inmunitarias se determinaron "globalmente" todas personas. Estos resultados apoyan la hipótesis de reconocimiento mundial a través de los receptores intestinales, transmisión de la señal y activación de la expresión génica extraintestinal. En general, g. mellonella es capaz de inducir amperios principalmente en la grasa corporal, pero más en los hemocitos y el sistema intestinal9. Puesto que no se dispone de ninguna información precisa sobre la producción de tejidos específicos de moléculas antimicrobianas en larvas de g. mellonella después de la infección, el RNA toda larval fue extraído de individuos completos y utilizó para ensayo gene del ARN expresión. Otra ventaja de larva toda extracción de RNA es la contención completa de las bacterias de vida dentro de la tripa y la posibilidad de cuantificar la carga bacteriana. La disección del intestino puede conducir a la pérdida de bacterias debido a la preparación.
Ya que más de g. mellonella de investigación se realiza sobre las características de la virulencia bacteriana estábamos especialmente interesado si y cómo las larvas provocar respuestas inmunes a bacterias no patógenas que forman parte de la microbiota mamífera. Recientemente, demostró que g. mellonella y mamíferos comparten componentes similares de la respuesta inmunitaria innata, que son homólogos y conservado evolutivo. La óxido nítrico sintasa (Nos) y NADPH oxidasa (Nox) genes comparten un alto grado de similitud8. Puertos de g. mellonella más un gallerimycin como Defensina péptido antimicrobiano que comparte similitudes estructurales con mamíferos β-Defensina 28.
Utilizando el modelo de la administración oral es posible demostrar reconocimiento diferencial bacteriano simbiótica antiinflamatorio B. vulgatus o pro-inflamatoria pathobiotic e. coli. Además las respuestas de estrés oxidativo aguas abajo y la producción de péptidos antimicrobianos más alto fueron inducidos después de la administración de e. coli , en comparación con B. vulgatus administración8.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por el DFG (SPP1656), el grupo de entrenamiento de investigación DFG 1708, el Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) y el centro alemán de investigación de la infección (DZIF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030120086 | |
| 100 bp DNA ladder | Thermo Fisher Scientific | 15628019 | |
| 1-Bromo-3-Chloropropane (BCP) | Sigma-Aldrich | B9673 | |
| 2 mL tubes | Eppendorf | 0030120094 | |
| 2x Mangomix | Bioline | BIO-25033 | Colony PCR |
| 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 210 261 | |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Beeswax | Mixed-Store.de | - | |
| Brain heart infusion broth | Thermo Fisher Scientific | CM1135 | |
| CloneJET PCR Cloning Kit | Thermo Fisher Scientific | K1232 | Cloning vector for 16S fragments |
| Corn grits | Ostermühle Naturkost GmbH | 306 | Organic cultivation |
| Difco LB Agar, Miller (Luria-Bertani) | Becton Dickinson | BD | |
| Difoco LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Becton Dickinson | 244610 | |
| DNA-free DNA Removal Kit | Thermo Fisher Scientific | 244510 | Dnase digestion |
| Dried yeast | Rapunzel | - | Organic cultivation |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14040 | |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | W252506 | |
| Honey | Ostermühle Naturkost GmbH | 487 | |
| Isopropanol | VWR | 20842.330 | |
| Lightcycler 480 Instrument II | Roche Molecular Systems | 5015278001 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche Molecular Systems | 4729692001 | |
| Manual Microsyringe Pump with Digital Display | World Precision Instruments | DMP | |
| Micro-Fine+ U-100 insulin syringe 0.3 x 8 mm | Becton Dickinson | 324826 | Oral administration |
| Mortar, unglazed | VWR | 410-9327 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | 13-400-518 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | 10977035 | |
| Oxoid AnaeroGen sachets | Thermo Fisher Scientific | AN0025A | Quality and quantity of RNA |
| PCR stripes | Biozym | 710970 | |
| Pestle, unglazed grinding surface | VWR | 410-9324 | |
| Phusion proof-reading enzyme | Thermo Fisher Scientific | F553S | |
| Primers | Biomers | - | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1222 | |
| QuantiFast SYBR Green PCR kit | Qiagen | 204056 | qPCR for bacterial copy number measurment |
| QuantiFast SYBR Green RT-PCR Kit | Qiagen | 204156 | qRT-PCR for gene expression measurements |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205311 | cDNA synthesis |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit dsHS DNA kit | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | Quantification of plasmid and cDNA samples |
| Qubit fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33226 | Quantification of plasmid and cDNA samples |
| RNase-ExitusPlus | AppliChem | A7153 | |
| Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 | |
| Skimmed milk powder | Sucofin | - | |
| SYBR safe DNA Gel Stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | |
| TRI reagent | Sigma-Aldrich | T9424 | |
| Weighing boat | VWR | 10803-148 | |
| Wheat meal | Ostermühle Naturkost GmbH | 6462 | Organic cultivation |
References
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