Summary
在这里, 我们提供了一个详细的协议, 口服给药模型使用大肠杆菌 mellonella幼虫和如何表征诱导的先天免疫反应。使用该协议, 没有实际经验的研究人员将能够使用g. mellonella强制喂养方法。
Abstract
研究同源细菌对宿主免疫系统的免疫原学潜能是研究肠道宿主-微生物相互作用的重要组成部分。众所周知, 不同的配菜表现出不同的刺激宿主肠道免疫系统的潜力。这类调查涉及脊椎动物, 特别是啮齿类动物。由于越来越多的伦理问题与涉及脊椎动物的实验有关, 因此对无脊椎动物替代模型的需求很大。
在这里, 我们提供了一个利用共生菌的大肠杆菌口服给药模型, 并可能评估对g. mellonella免疫系统的免疫原学潜力。我们证明, g. mellonella是一个有用的替代无脊椎动物替代模型, 允许分析具有不同免疫原性潜力的相关物质, 如细菌硫化细菌和大肠杆菌。有趣的是, 这种细菌对幼虫没有杀灭作用, 而幼虫与哺乳动物相似。g. mellonella 的免疫反应与脊椎动物的先天免疫反应相当, 涉及细菌的识别和抗菌分子的产生。我们建议 g . mellonella 能够恢复以前的微生物群平衡, 这是众所周知的健康哺乳动物个人。虽然在g. mellonella和脊椎动物中都提供了类似的先天免疫反应,但 g. mellonella 并不具有适应性免疫系统。由于所研究的先天免疫系统的成分是进化保存的, 该模型允许预先创造和首次分析细菌免疫原性。
Introduction
肠道微生物群是维持体内平衡的重要组成部分, 涉及先天和适应性免疫反应1,2。共生组织的特征是不同的主要共生体成分: 通过重要的免疫调节功能产生有益作用的共生体, 以及对遗传倾向有有害影响的病理体主持、促进和引发肠道炎症3,4。许多关于共生体和病理及其对宿主免疫系统影响的研究已经发表, 主要研究适应性免疫反应。
由于这些研究涉及许多动物进行调查, 保护和更换用于实验的动物越来越引起公众的兴趣, 我们寻求找到一种替代模式, 以便对不同的细菌免疫原性进行筛查性能。昆虫, 特别是大肠杆菌, 是感染研究中广泛使用的替代模型。g. mellonella结合了不同的优势, 如低成本和高吞吐量;它允许口服细菌, 这是自然接触途径, 它允许全身感染5,6。在37°c 条件下进一步促进了培养, 而13°c 是哺乳动物的生理体温, 也是细菌毒力因子表达的最佳选择.g. mellonella 的主要优点是保守的先天免疫系统, 它能够区分自己从非自我和编码各种模式识别受体, 如阿波霍林或视黄素血肉 6, 7. 微生物识别后, g. mellonella 可引发不同的下游体液免疫反应。它能诱导氧化应激反应, 分泌活性氧 (ros), 涉及 nos (一氧化酶合酶) 和 nox (nadph 氧化酶)6,8的活性。此外, g. mellonella 激活了有效的抗菌肽 (amp) 反应, 从而导致不同的 amp 混合物的分泌, 如格列维素、莫利星、塞科品或防御素样的格列米星 6, 8,9,10。一般来说, Amp 具有相当广泛的宿主特异性, 以对抗革兰氏阳性和革兰氏阴性菌和真菌, 并必须提供一个强有力的反应, 因为昆虫缺乏任何适应性反应 10。格洛维林是一种对细菌和真菌具有活性的 AMP, 抑制膜外膜形成6,11。莫司菌素通过穿透膜并形成一个毛孔 9,11,显示出它们对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抗菌作用。cecropins 提供对细菌和真菌的活性, 并像莫利辛 9,10一样渗透膜。Gallerimycin 是一种具有抗真菌特性的防御素样肽9。有趣的是, 发现西罗平和金霉素联合对大肠杆菌10有协同作用。
由于其易于使用的性质g. mellonella 幼虫是一个经常使用的感染模型, 以评估细菌的致病性。特别是, 从g. mellonella 获得的数据与从小鼠获得的数据相关的研究支持了这一替代宿主模型的强度。研究发现, 小鼠感染模型中最致病性的单核细胞增生李斯特菌血清型也导致全身感染后g. mellonella死亡率较高。此外, 在12 型 g. mellonella中, 毒性较低的血清型也较少.对人类病原真菌白色念珠菌也进行了类似的观察。通过全身感染和随后对幼虫存活的监测, 对不同的白色念珠菌病类毒力进行了评估。小鼠无毒菌株也具有无毒性或毒性降低, 而小鼠毒株也可导致高幼虫死亡率 13.g. mellonella模型可进一步用于识别铜绿假单胞菌14的3型分泌系统致病性因素。
由于大多数涉及g. mellonella 的研究都集中在使用全身感染方法的毒力因素上, 因此我们特别感兴趣的是提供一种适合于口服强制喂养中的肠道同源物分析的方法模型, 我们可以应用不同剂量的细菌每幼虫, 不仅观察幼虫死亡率, 但分析先天免疫反应的不同标志, 以保持肠道稳态。
我们的方法有助于增加使用 g. mellonella 作为替代模型, 因为我们结合细菌的应用和 rna 表达的分析。在包括口服后免疫反应分析和全身感染后死亡率观察的同时, 加强细菌发病机制研究的意义不仅是有益的。我们的方法允许分析细菌非致病性共济会的免疫原性特性, 因为它通过在活生物体中提供肠道屏障, 提供了比细胞培养更复杂的条件。
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Protocol
1. g. mellonella 的饲养和幼虫的制备
注: 从卵到最后一次幼虫的周期大约需要5-6。
- 将成年飞蛾产下的卵转移到含有蜡蛾底物的2升箱 (22% 玉米磨碎、22% 小麦粉、17.5% 蜂蜡、11% 脱脂奶粉、11% 蜂蜜、11% 甘油、5.5% 干酵母)。在黑暗中在30°c 下进行整个繁殖。
- 在大约1-2周后, 当小幼虫可见时, 将含有幼虫的25克底物转移到新鲜的底物中。根据幼虫的大小在2周后同步幼虫, 并将30-40 个幼虫组保存在蜡蛾基板上的2升容器中, 再延长2周。
- 按重量选择幼虫进行实验。只使用质量为 180-200 毫克的苍白和快速移动的幼虫。
2.口服硫化细菌和大肠杆菌的培养和制备
- 在37°c 厌氧生长有义务的厌氧细菌-普氏菌, 使用罐子和小袋创造厌氧环境 (见材料表)15,16。培养抽搐2天, 并在脑心输液 (bhi) 肉汤中生长一夜亚培养。
- 在37°c 的 Luria-Bertani (LB) 肉汤中, 在有氧条件下生长活性厌氧菌大肠杆菌. 在实验当天, 在 LB 肉汤中培养一夜的大肠杆菌, 并在37°c 下生长2小时的亚培养。
- 以 1, 700 x克离心5分钟的离心法收获培养物, 在 Dpbs (dulbecco 的磷酸盐缓冲盐水) 中重新释放细菌颗粒。确定细菌培养物的光学密度 (OD) 在 OD 600 nm, 并计算细菌浓度。细菌浓度调整为 109/l。
3. 细菌悬浮液对g. mellonella幼虫的强制喂养
- 用10μl 的调整后细菌悬浮液喂养每个幼虫, 每剂含有 107个细菌。使用胰岛素注射器与一个直接结束的针口服细菌悬浮液。
- 将注射器固定在微注射器泵中 (图 1), 以确保每个幼虫应用悬浮液体积的准确性 (见材料表)。小心地将注射器插入它们的下颌骨之间。不要强迫注射器之间的下颌骨。等待幼虫打开它的嘴, 然后插入注射器。
- 在1-24小时之间在黑暗中培养强制喂养的幼虫, 使用 dpbs 给幼虫作为模拟背景控制, 以排除在强制喂养过程中处理幼虫所引起的潜在应激反应。
4. 口服幼虫的加工和 RNA 分离
- 在引擎盖下工作, 戴安全眼镜。清洁引擎盖和喷雾试剂, 以防止 RNase 污染。
- 在液氮中孵育活幼虫后, 将其冷冻并均匀化。使用砂浆和雌蕊进行均质化。在砂浆中加入液氮, 并将每个幼虫单独网格, 直到粉末均质体被产生。
- 将均质物倒在一次性称重船上, 等待液氮蒸发。
- 将无氮液体冷冻粉末均质物与1毫升的三唑混合在2毫升管中, 在室温下孵育混合物1小时。
- 在室温下以 8, 000 x克离心混合物 15分钟, 并将上清液转移到一个新鲜的管子中, 并丢弃颗粒。将上清液与 1-溴-3-氯丙烷 (BCP) 的200μl 混合。涡流和孵育混合物在室温下5分钟和10分钟在冰上。
- 在4°C 条件下, 以 18, 000 x g离心添加的 bcp 反应15分钟。将上层透明层转移到新的2毫升管中, 并丢弃其余的。用500μl 异丙醇混合和倒置管, 将转移的上层的 RNA 与500μl 异丙醇共沉淀5分钟。
- 在4°c 条件下, 以 18, 000 x g离心管15分钟。用500μl 的75% 乙醇清洗沉淀的 RNA 颗粒。
- 在 RT 干燥 RNA 颗粒5-10。注意不要过度干燥, 因为以后会很难溶解。
- 在无核酸酶水中稀释核糖核酸酶抑制剂 (1:100), 并使用100μl 的溶液重新悬浮干 RNA 颗粒。小心地将管子旋涡, 直到颗粒完全溶解。
- 测量 RNA 的质量和数量。确保26/280 的比率约为2.0 和26-230 比率, 在2.0-2.2 之间 (见材料表)。
- 使用5微克的分离 RNA 进行 DNase 消化。混合5μl 的10倍缓冲液, 1 微米的核糖核酸抑制剂酶, 2μl 的 DNase 酶, 5μg 的 RNA, 并在 RT 用无核酸酶的水填充30分钟。
- 偶尔加入6Μl 的失活试剂, 在 RT 和涡旋反应下孵育2分钟。以 10, 000 x g离心反应 1分钟, 将上清液转移到新鲜 1.5 ml 管中。
注: RNA 包含幼虫 RNA 以及用于口服的相应菌株的细菌 RNA。
- 偶尔加入6Μl 的失活试剂, 在 RT 和涡旋反应下孵育2分钟。以 10, 000 x g离心反应 1分钟, 将上清液转移到新鲜 1.5 ml 管中。
5. 强制喂食后细菌16S 拷贝数的定量
注: 表达的细菌16S 的拷贝数是使用从第4节中提取的 Rna 合成的 cDNA 确定的。最后定量是利用质粒的标准曲线进行的, 在该曲线中克隆了 b . vulgatus 或大肠杆菌的 16s pcr 片段。
- 质粒标准的制备
- 通过 PCR 扩增大肠杆菌或b. Vulgatus的16s 片段。混合10倍的5倍缓冲液, 1Μl 的 10mm dNTP 溶液, 2.5μl 的10μm 正向底漆和2.5μl 的10Μm 反向底漆稀释, 1Μl 的 dNTP, 1μl 的基因组 DNA 模板, 31.5 微米的无核水和0.5Μl 的校对酶。
- 运行 PCR (初始变性: 98°c 30秒, 变性: 98°c 为 10秒, 退火: 60°c 为 30秒, 延长: 72°c 为 30秒, 最终延长: 72°c 5分钟, 重复变性, 退火和延长30个周期)。
- 使用 16S大肠杆菌引物 (p _ 转发: gttatttctttttttga, p _ 反向: acagggttactttt17, 320 Bp) 或 16s b. vulgatus 引物 (p _ 而言: aacccgggtcatctcttt, p _ 反向: catactiacataccat18, 400 bp)放大。
- 使用大肠杆菌和b. VULGATUS 16s pcr 片段将钝器克隆转化为克隆载体。建立结扎和混合10Μl 的2x 缓冲液, 1μl 的非纯化 PCR 产品, 1μl 的钝端克隆质粒, 7μl 的无核酸酶水和1Μl 的 T4 Dna 连接酶。在 RT 进行10分钟的结扎。
- 制备大肠杆菌dh5α主管细胞。
- 在 Erlenmeyer 烧瓶中接种100毫升 lb 培养基, 培养1毫升。培养到 OD 600 纳米之间。将产生的培养物分成两个50毫升管, 在冰上孵育10分钟。
- 在4°c 条件下, 以 1 , 700 x g 离心培养物10分钟。丢弃上清液, 用5毫升 RFI 溶液 (30 mM CH 3 cook, 100 mM KCl, 10mm ccl, 50 mm Mmmncl2, 用冰川酸调整 ph 5.8, 无菌过滤) 仔细地重新悬浮每个颗粒。在每个管中加入额外的45毫升 RFI 溶液。
- 在4°c 条件下, 以 1 , 700 x g 离心培养物10分钟。丢弃上清液, 用6毫升 RFI (10 mM MMMOPS, 15 mM Ccl 2, 10 mM KCl,15% 甘油, 高压灭菌) 溶液仔细地重新悬浮每个颗粒。将两个组分和孵育12毫升悬浮液在冰上 15分钟. 准备细胞悬浮液 (200μl)。将等价物存放在-80°c。
- 将结扎反应转移到一个合格的大肠杆菌dh5α细胞, 使反应在冰上保持 15分钟, 在42°c 时热冲击细胞 45秒, 加入1毫升 lb 培养基。
- 在37°c 下进行45分钟的培养转变。将100μl 的转化加入含有氨匹西林的 LB 琼脂板, 在37°c 下孵育过夜。
- 从步进5.1.5 的 LB 琼脂板中对8个产生的变压器进行群体 PCR。用牙签选取每个菌落, 将其浸入含有氨匹西林 (主板) 的新鲜 LB 板上, 然后将同一牙签浸入 PCR 条纹中含有5.5 微米无核酸酶水的井中。
- 加入7.5Μl 的 2x PCR 混合, 0.5μl 的10μm 正向底漆和0.5Μl 的10Μm 反向底漆稀释。使用5.1.1 部分中提到的相同引物对。
- 运行 PCR (初始变性: 95°c 5分钟, 变性: 95°c 1分钟, 退火: 60°c 30度, 延长: 72°c 1分钟, 最终延长: 7°C 7分钟, 重复变性, 退火和延长35次周期)。
- 在1% 琼脂糖凝胶上验证16S 碎片的大小。使用 0.5 x 弗里斯-硼酸-edta (TBE) 缓冲液溶解1克琼脂糖, 并在微波炉中煮沸。加入1:500000 染料到凝胶中, 然后倒入。将菌落 PCR 反应和 100 bp DNA 阶梯添加到凝胶中, 并在 110 V 时运行凝胶45分钟。
- 为每一种大肠杆菌和含有正确插入尺寸的 b. vulgatus 16s 质粒接种含有氨匹西林的5毫升 lb 隔夜培养物, 并从主板 (截面 5.1.6) 中克隆一个。
- 在 1, 700 x g 的2毫升管中离心细菌过夜培养物。丢弃上清液, 在600μl 无菌水中重新悬浮颗粒。
- 加入100Μl 的裂解缓冲液, 并通过倒置管均匀均匀均匀。加入350μl 的冷 (4°C) 中和溶液, 通过倒置管彻底混合。
- 在离心机中以最大速度离心 3分钟. 将上清液 (~ 900μl) 转移到旋转柱, 并在离心机中以最大速度将离心机转移至旋转柱, 并以最大速度输送15秒。
- 丢弃流量, 并在离心机中以最高速度添加200μl 的内毒素去除清洗剂和离心机, 时间为15秒。
- 在该色谱柱上加入400Μl 洗液, 在离心机中以最高速度在30个月内, 将色谱柱转移到干净的 1.5 mL 管中, 在柱中加入30Μl 洗脱缓冲液, 在室温下孵育1分钟。
- 在离心机中以最大速度离心 30秒 (见材料表)。
- 通过将1微米的质粒 DNA 与199μl 的工作溶液 (每个反应的199Μl 荧光染料, 每 199μl) 混合, 确定质粒 DNA 浓度。通过将标准1或10μl 的标准2与 190μl. 涡流混合样品和标准管以及孵育反应2分钟来制备两个标准 (见材料表)。
- 在10-100000份的范围内准备10倍系列稀释剂中的标准浓度: 计算单个质粒 (m = (n) x (1.096x10-21 g/bp)、n = 质粒大小、m = 质量) 的质量。计算包含所需的感兴趣的复制数量所需的质粒 DNA 的质量 (单个质粒的感兴趣的拷贝数 x 质量 = 所需的质粒 DNA 质量)。
- 样品的制备用于定量
- 合成 cDNA。从第4节和11μl 无核酸水中混合2Μl 的7X 缓冲液、1μl 的 dnase 消化 RNA。在42°c 下孵化2分钟。
- 立即将反应放在冰上。混合4Μl 的 5x RT 缓冲, 1μl Rt (反向转录酶) 引物混合, 1Μl RT 酶和步进5.2.1 的反应。在42°c 下孵化15分钟。95°C 时培养3分钟以灭活 RT 酶。
- 像步骤5.1.9 中描述的那样对 cDNA 浓度进行荧光定量。
- 合成 cDNA。从第4节和11μl 无核酸水中混合2Μl 的7X 缓冲液、1μl 的 dnase 消化 RNA。在42°c 下孵化2分钟。
- 细菌负荷的测量
- 将 cDNA 浓度调整为每12Μl 反应5纳克, 以获得定量 PCR。混合 2x RT-PCR 混合, 0.25μl 的100μm 正向底漆, 0.25μl 的100Μm 反向引物 (5.1.1) 和12μl 的调整后 cDNA。运行 qPCR (初始变性: 95°c 5分钟, 变性: 95°c 10秒, 退火: 60°c 30秒, 重复变性和退火 35次, 熔化: 95°c, 冷却至 4°C)。
- 打印日志10 浓度的质粒标准曲线 (10-10000份), 即 1-5 (x 轴), 相对于相应的 ct 值 (y 轴)。执行线性回归以获得回归方程。求解 x (浓度) 的方程。使用公式通过在公式中插入 ct 值来计算复制编号的日志10 。计算反对数以获取复制数字。
6. 定量 RT-PCR 法测定先天免疫标志基因
- 通过 PCR 和随后的琼脂糖凝胶电泳检查引物的基因特异性, 以验证正确的片段大小。执行 PCR, 如5.1.5 部分所述。
Ubiquitin 130 bp:正向 tcaagtaggggtctc, 反向 cacgtgctgctggggtaaacc19 (家政)
Nos-4 159 bp:正向 tggggcagcattatca, 反向 ACGGGTGTAGGGGAA8
76 bp 号:正向 atgaagggtggagtaccaa, 反向 gccattatacacaccaa8
gst 156 bp:正向 gagagtccgggcag, 反向 tccgtctcacaaggca8
Apoiii 265 bp:正向 agacttgcccacccaccaga, 反向 tgcatgttcccctgc8
血红素 267 bp:正演 ctcccccaggggggcaaac, 反向 gccaccacagtatccc8
gallerimycin 161 bp:正向 gagttacatacacga, 反向 ATAGATTACACACACACAC8
cecropin 158 bp:正向 cttgtgtgtgtgtgtgtgt, 反向 gtgctcgcctcctcac8
gloverin 101 bp:gtgtgggtggaa, 反向 ccggcatctctctaac8
moricin 124 bp:gctgtactcctctgat, 反向 tgggattcctt8) - 评估底漆效率为 Echs2。
- 池2Μl 的5-10 不同的阳性样本 (即, 表示的基因, 引物对需要调查)。
- 制备样品池的 1: 5 稀释系列: 标准 1 (S1): 未稀释池;S2:2μl 的 S1 + 8μl 无核水;S3:2μl 的 S2 + 8μl 无核水;S4:2μl 的 S3 + 8Μl 无核酸酶水。
- 将 S1-s4 的1Μl 和非模板控制 (无核酸水) 应用到96井 qPCR 板上。加入5Μl 的 RT 主混合, 0.1μl 的每个100μm 正向和反向底漆, 3.7μl 的无核酸酶水和0.1μl 的 RT 混合体每口井。
- 运行定量 RT-PCR (逆转录酶: 50°c 10分钟, 初始变性: 95°c 5分钟, 变性: 95°c 10秒, 退火: 60°c 30秒, 重复变性和退火 40次, 熔融: 95°c, 冷却至 4°c)。
- 绘制 S1-s4 (1, 0.2, 0.04, 0.008) (x 轴) 相对于相应的 ct 值 (y 轴) 的相对单位的图日志10 。执行线性回归并确定标准曲线的斜率。计算效率 E:e = 10-(1.5 斜率)。20
注:-3.32 的斜率表示理想的反应条件和 eic 2.00 的底漆效率。这意味着: PCR 产物的数量在每个周期内翻倍。
- 使用100纳克消化 RNA (100 ngμl) 作为 RT-PCR 模板。混合 RT-PCR 试剂, 运行 RT-PCR, 如第6.2 节所述。用清洁引物对和目标引物对测量所有细菌和 dpbs 管理的样品。始终使用家政底漆对和 S1-s4, 将目标底漆对放在同一板上, 以确定效率。
- 根据以下公式计算 rna 基因表达的比率 (R), 使用实验确定的家政和目标引物对的引物效率。归一化细菌刺激样品模拟控制 20。
R:p-比率
E目标: 用目标引物对测量的 s1-4 效率
E内部管理: 使用内部管理底漆副测量的 s1-4 的效率
Ct靶 (对照样品 ) : ( dpbs 被喂养样品的 ct ) - ( 细菌被喂养的样品的 ct ) 用目标引物对测量
Ct家政( 对照样品 ): ( dpbs 被喂养的样品的 ct ) - ( 细菌被哺养的样品的 ct ) 用家政底漆对测量
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Representative Results
g. mellonella血淋巴感染模型在广泛应用中分析了多种病原菌的毒力因素。大多数测量包括对幼虫死亡率的分析, 这是一个相当容易的方法。然而, 这种方法不允许有关免疫反应的一般结论, 并将g. mellonella免疫反应的结果与脊椎动物免疫机制联系起来。另一方面,由于难以获得确切的感染剂量 9, 仅用于口腔感染或幼虫的定植.此外, 人们对g. mellonella对非致病性细菌, 尤其是哺乳动物的肠道共生菌的先天免疫反应了解甚少。
与病原体不同的是, 共生体对宿主和触发免疫反应的挑战, 但宿主免疫系统能够维持免疫稳态。g. mellonella能够清除最初的强制喂养细菌负荷, 直到最后再也没有细菌被检测到 (图 2)8。在24小时内, b. vulgatus和大肠杆菌的16s 基因拷贝数显著下降。
我们证明, 同源管理的g. mellonella幼虫诱导不同先天免疫标记基因的 rna 基因表达: lps 识别分子-apephorin (apooiii) 和血红素 (图 3a, b)与外阴 b 型幼虫8相比,大肠杆菌幼虫的表达率普遍较高.此外, 还可以监测两种抗菌分子的标记基因表达。通过测量 No-4 和 Nos-4 基因表达, 可以估计活性氧和氮种 (ros/rns ) 的产生, 与 b 相比, 这些基因表达对大肠杆菌的强制喂养有很强 的增强作用。( 图 4a、b)8。此外, 还可以观察到抗氧化Gst的基因表达 (图 4c)。8
此外, 我们还表明,不同的抗菌肽表达诱导比反应 b.强制喂养更强。我们观察到防御素样加里米霉素肽、lps 相互作用的格列内素肽、卡罗平和莫利星 (图 5a、b、c、d)8。
图 1: 使用微注射器泵的强制进料装置.将钝针调整到微注射器泵中, 从而可以精确注射细菌。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 强制喂养后, 霉菌幼虫细菌负荷持续存在.利用 RT-PCR 技术, 从 5 ng 的 cdna 中测定了不同时间点 b .vulgatus-和大肠杆菌特异性 16s Rdna 基因的拷贝数。数据点显示, 并显示中值。从参考8修改。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3:用 g. mellonella 对细菌进行差异模式识别.用两种不同的肠道配准体给幼虫, 1-6 后分离 rna, 测定 LPS 识别分子 apiphorin (Apoiiii) (a) 和半酚 (b) 的 mrna 表达。数据点表示平均标准误差的几何手段 (SEM) (p > 0.05; *, p < 0.05; * *, p < 0.01; * * *, p < 0.001)。8请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 细菌挑战后 ros 标记基因表达.强化喂大肠杆菌和b. vulgatus, 并对 ros 防御标记基因表达进行了分析。编号(a)、 nos-4 (b) 和gst (c) mrna 在分离幼虫 rna 中的表达进行了测定。数据点表示平均标准误差的几何手段 (SEM) (p > 0.05; *, p < 0.05; * *, p < 0.01; * * *, p < 0.001)。从参考8修改。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5常见诱导的防御样抗菌肽在g. mellonella 幼虫和人上皮细胞中的表达.用外阴 b或大肠杆菌对幼虫进行口服, 随着时间的推移观察到免疫反应, 从幼虫个体中分离出 rna。测定了加里利霉素 (a)、西罗品 (b)、格列维林 (c)、莫利钦 (d) mrna 表达。数据点表示平均标准误差的几何手段 (SEM) (p > 0.05; *, p < 0.05; * *, p < 0.01; * * *, p < 0.001)。从参考8修改。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
g. mellonella模型是一种常用的模型, 用于评估全身感染方法21中的细菌毒力因素。由于许多病原体和细菌通过口腔定植或感染途径进入宿主, 需要找到新的见解来评估g. mellonella 作为口腔定植和感染的模型。
在15-37°c 之间饲养g. mellonella 的可能性是一个很大的优势, 因为大多数哺乳动物模型的体温保持在 37°c 5。g. mellonella幼虫可以从不同的供应商购买, 但建立自己的繁殖种群提供了许多好处, 例如没有抗生素干扰检测, 在什么时候开始实验的时候更好地估计由于供应商并不总是在随时可用的阶段提供幼虫, 并且由于运输或温度变化而避免了应力响应。由于g. mellonella 的耐温性, 可以进行育种的温度范围很高。较高的温度导致幼虫的快速发育, 根据繁殖温度, 我们可以估计从卵到最后一次幼虫的生命周期。当选择幼虫进行实验时, 只选择苍白和快速移动的个体, 以避免任何压力和免疫反应干扰实验。
为了建立强制喂养模型, 需要保证口服应用是成功的。因此, 在用于强制喂养的溶液中添加了一种强溴酚染料的几项试验是有帮助的。这有助于排除任何受伤的幼虫, 并选择只有蓝色染料在他们的肠道22的幼虫。
利用该模型, 我们发现g. mellonella 幼虫对某些标记基因的先天免疫反应动力学有一定的研究价值。在口腔给药模型的建立和免疫反应动力学的研究中, 我们发现基因表达在中肠没有局部表达。口服同种细菌后提取中肠 RNA 的首次实验试验没有提供结论性结果。因此, 免疫反应是在整个个体中 "全球" 确定的。这些发现支持了通过肠道受体进行全球识别、信号传输和触发肠外基因表达的假设。一般情况下, g. mellonella主要在脂肪体中诱导 amp, 但在血细胞和肠道系统中进一步诱导 am 9。由于没有关于感染后 g . mellonella 幼虫中抗菌分子组织特异性产生的准确信息, 因此从完整的个体中提取了整个幼虫 rna, 用于检测 rna 基因表达。整个幼虫 RNA 提取的另一个优点是完全遏制肠道内的活细菌, 并有可能量化细菌的负荷。肠道的解剖可能会导致细菌因准备而流失。
由于大多数g. mellonella 研究是在细菌毒力性状上进行的, 因此我们特别感兴趣的是, 幼虫是否以及如何对作为哺乳动物微生物群一部分的非致病性细菌引发免疫反应。最近, 我们表明, g. mellonella 和哺乳动物都有相似的先天免疫反应成分, 这是同源的和进化的保守。一氧化氮合酶 (no) 和 nadph 氧化酶 (nox) 基因具有较高的相似性8。g. mellonella 进一步含有一种类似防御素的抗菌肽 gallerycin, 它与哺乳动物β-防御素 28 具有结构上的相似性。
使用口服给药模型, 可以证明不同的细菌识别抗炎共生 b . vulgatus或促炎症性病理生物大肠杆菌.此外,大肠杆菌给药后的下游氧化应激反应和抗菌肽的产生均高于外阴 8. .
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作由 DFG (SPP1656)、DFG 研究培训小组1708、Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) 和德国感染研究中心 (DZIF) 资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030120086 | |
| 100 bp DNA ladder | Thermo Fisher Scientific | 15628019 | |
| 1-Bromo-3-Chloropropane (BCP) | Sigma-Aldrich | B9673 | |
| 2 mL tubes | Eppendorf | 0030120094 | |
| 2x Mangomix | Bioline | BIO-25033 | Colony PCR |
| 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 210 261 | |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Beeswax | Mixed-Store.de | - | |
| Brain heart infusion broth | Thermo Fisher Scientific | CM1135 | |
| CloneJET PCR Cloning Kit | Thermo Fisher Scientific | K1232 | Cloning vector for 16S fragments |
| Corn grits | Ostermühle Naturkost GmbH | 306 | Organic cultivation |
| Difco LB Agar, Miller (Luria-Bertani) | Becton Dickinson | BD | |
| Difoco LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Becton Dickinson | 244610 | |
| DNA-free DNA Removal Kit | Thermo Fisher Scientific | 244510 | Dnase digestion |
| Dried yeast | Rapunzel | - | Organic cultivation |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14040 | |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | W252506 | |
| Honey | Ostermühle Naturkost GmbH | 487 | |
| Isopropanol | VWR | 20842.330 | |
| Lightcycler 480 Instrument II | Roche Molecular Systems | 5015278001 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche Molecular Systems | 4729692001 | |
| Manual Microsyringe Pump with Digital Display | World Precision Instruments | DMP | |
| Micro-Fine+ U-100 insulin syringe 0.3 x 8 mm | Becton Dickinson | 324826 | Oral administration |
| Mortar, unglazed | VWR | 410-9327 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | 13-400-518 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | 10977035 | |
| Oxoid AnaeroGen sachets | Thermo Fisher Scientific | AN0025A | Quality and quantity of RNA |
| PCR stripes | Biozym | 710970 | |
| Pestle, unglazed grinding surface | VWR | 410-9324 | |
| Phusion proof-reading enzyme | Thermo Fisher Scientific | F553S | |
| Primers | Biomers | - | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1222 | |
| QuantiFast SYBR Green PCR kit | Qiagen | 204056 | qPCR for bacterial copy number measurment |
| QuantiFast SYBR Green RT-PCR Kit | Qiagen | 204156 | qRT-PCR for gene expression measurements |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205311 | cDNA synthesis |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit dsHS DNA kit | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | Quantification of plasmid and cDNA samples |
| Qubit fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33226 | Quantification of plasmid and cDNA samples |
| RNase-ExitusPlus | AppliChem | A7153 | |
| Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 | |
| Skimmed milk powder | Sucofin | - | |
| SYBR safe DNA Gel Stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | |
| TRI reagent | Sigma-Aldrich | T9424 | |
| Weighing boat | VWR | 10803-148 | |
| Wheat meal | Ostermühle Naturkost GmbH | 6462 | Organic cultivation |
References
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