Summary
Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll für eine orale Verabreichung Modell mit Galleria Mellonella Larven und wie prägen angeborene Immunantwort induziert. Unter Verwendung dieses Protokolls, werden Forscher ohne praktische Erfahrung der G. Mellonella Zwangsfütterung Methode verwenden können.
Abstract
Die Untersuchung der immunogenen Potenzial der Kommensalen Bakterien auf das Immunsystem des Wirts ist ein wesentlicher Bestandteil, wenn Darm Host-Mikroben-Interaktionen zu studieren. Es ist allgemein bekannt, dass verschiedene Kommensalen ein unterschiedliches Potenzial zeigen, das intestinale Immunsystem des Wirts zu stimulieren. Diese Untersuchungen beinhalten Wirbeltiere, insbesondere Nagetiere. Da zunehmende ethische Bedenken mit Experimente mit Wirbeltieren verknüpft sind, gibt es eine hohe Nachfrage nach Wirbellosen Ersatz-Modellen.
Hier bieten wir ein Galleria Mellonella orale Verabreichung Modell mithilfe von Kommensalen nicht-pathogenen Bakterien und mögliche Einschätzung der immunogenen Potenzial der Kommensalen auf das Immunsystem G. Mellonella . Wir zeigen, dass G. Mellonella ist eine nützliche alternative Wirbellosen Ersatz-Modell, das ermöglicht die Analyse von Kommensalen mit verschiedenen immunogen Potenzial wie Bacteroides Vulgatus und Escherichia coli. Interessanterweise ausgestellt die Bakterien keine abtötende Wirkung auf die Larven, die ist ähnlich wie bei Säugetieren. Die Immunantwort von G. Mellonella waren vergleichbar mit fest gefügten angeborenen Immunantwort und Anerkennung der Bakterien und Produktion antimikrobielle Moleküle. Wir schlagen vor, dass G. Mellonella in der Lage war, frühere Mikrobiota Gleichgewicht wiederherzustellen, die aus gesunden Säugetieren bekannt ist. Obwohl vergleichbare angeborene Immunantwort in G. Mellonella und Wirbeltieren zu bieten, G. Mellonella keiner adaptiven Immunsystems Hafen. Da die untersuchten Komponenten des angeborenen Immunsystems evolutionären konserviert sind, kann das Modell eine Vorsortierung und erste Analyse der bakteriellen immunogenen Eigenschaften.
Introduction
Der Darm Microbiome ist ein wesentlicher Bestandteil zur Aufrechterhaltung der Homöostase und beinhaltet sowohl angeborene und adaptive Immunantworten1,2. Die Kommensale Mikrobiota Gemeinschaft zeichnet sich durch verschiedene Kommensale Hauptbestandteile: Symbionten, die wohltuende Wirkung von wichtigen immunmodulatorischen Funktionen und Pathobionts, auf die negativen Auswirkungen können genetisch prädisponiert zu verleihen beherbergt, zu fördern und auslösen Darmentzündung3,4. Viele Studien über Symbionten und Pathobionts und deren Einfluss auf das Immunsystem des Wirts wurden vor allem studieren adaptive Immunantworten veröffentlicht.
Da diese Studien viele Tiere für die Untersuchungen und den Schutz beinhalten und Ersatz der Versuchstiere für Experimente ist öffentliches Interesse zu erhöhen, versuchen wir, ein Ersatz-Modell ermöglicht eine Vorführung der verschiedenen bakteriellen immunogen zu finden Eigenschaften. Insekten, vor allem Galleria Mellonella, sind eine weit verbreitete Ersatz-Modell in der Infektionsforschung. G. Mellonella vereint verschiedene Vorteile wie niedrige Kosten und hohen Durchsatz; Es ermöglicht oralen Verabreichung von Bakterien, der die natürliche Expositionsweg, und für systemische Infektion5,6. G. Mellonella weiter ermöglicht Inkubation bei 37 ° C, was die physiologischen Körpertemperatur der Säugetiere und das Optimum für bakterielle Virulenz Faktor Ausdruck5ist. Der Hauptvorteil von G. Mellonella ist das erhaltene angeborene Immunsystem, das ermöglicht der Diskriminierung des selbst von nicht-selbst und kodiert eine Vielzahl von Muster-Erkennung-Rezeptoren wie Apolipophorin oder Opsonin Hemolin6, 7. auf Mikrobe Anerkennung, G. Mellonella verschiedenen nachgeschalteten humorale Immunantwort auslösen können. Es kann verursachen oxidativen Stress-Reaktionen und sezernieren reaktive Sauerstoffspezies (ROS), die die Tätigkeit der NOS (Salpetersäure Oxidase-Synthase) und NOX (NADPH Oxidase)6,8umfasst. Darüber hinaus aktiviert G. Mellonella eine potente antimikrobielle Peptide (AMP) Antwort, die Ergebnisse in der Sekretion aus einer Mischung von verschiedenen AMPs wie Gloverin, Moricin, Cecropin oder defensin-ähnliche Gallerimycin6, 8,9,10. In der Regel AMPs haben ziemlich breit Wirtsspezifität gegen grampositive und gramnegative Bakterien und Pilze und eine starke Antwort zu geben, da Insekten eine Anpassungsreaktion10fehlen. Gloverin ist ein AMP aktiv gegen Bakterien und Pilze und hemmt die Außenmembran Bildung6,11. Moricins zeigen ihre antimikrobielle Funktion gegen grampositive und gramnegative Bakterien durch die Membran durchdringen und bilden eine Pore9,11. Cecropins bieten Aktivität gegen Bakterien und Pilze und die Membran ähnlich wie Moricins9,10permeabilize. Gallerimycin ist ein defensin-Like-Peptid mit Anti-Pilz-Eigenschaften-9. Interessanterweise wurde festgestellt, dass die Kombination von Cecropin und Gallerimycin eine synergistische Wirkung gegen E. Coli10hatte.
Wegen des leicht zu bedienenden Charakters G. Mellonella sind Larven ein häufig verwendetes Infektionsmodell bakterielle Pathogenität zu beurteilen. Insbesondere korrelieren Studien in denen G. Mellonella gewonnenen Daten mit Daten aus Mäusen Unterstützung der Stärke dieses alternative Host-Modells. Es wurde festgestellt, dass die meisten pathogenen Serotypen von Listeria Monocytogenes in einem Mausmodell der Infektion auch zu einer höheren Sterblichkeit in G. Mellonella nach einer systemischen Infektion führen. Weitere, weniger virulenten Serotypen erwies sich auch weniger virulenten in G. Mellonella Modell12. Ähnliche Beobachtungen wurden mit den menschlichen Pathogene Pilze Candida Albicans. Virulenz der verschiedenen C. Albicans Stämme durch systemische Infektion und anschließende Überwachung der Larven Überleben bewertet wurde. Avirulent Mausstämme gab auch avirulent oder ausgestellten Virulenz in G. Mellonella, reduziert, während die Maus virulente Stämme auch zu hohe larval Sterblichkeit13führen. G. Mellonella Modell könnte weiter zum Typ 3 Sekretion Systemgrößen Pathogenität von Pseudomonas Aeruginosa14zu identifizieren.
Da die meisten Untersuchungen mit G. Mellonella auf Virulenzfaktoren mit dem systemischen Infektion Ansatz fokussiert waren, waren wir besonders daran interessiert, Bereitstellung einer Methode für die Analyse der intestinalen Kommensalen in einer mündlichen Zwangsfütterung geeignet Modell, in denen wir gelten unterschiedliche Dosierung von Bakterien pro Larven und beobachten nicht nur die Larven Sterblichkeit sondern analysieren verschiedene Kennzeichen der angeborenen Immunantwort zu intestinalen Homöostase.
Unsere Methode hilft, um die Verwendung von G. Mellonella als ein Ersatzmodell zu erhöhen, da wir die Anwendung von Bakterien und die Analyse der RNA Ausdruck kombinieren. Es ist nicht nur nützlich, die Bedeutung der bakterielle Pathogenese Studien zu stärken, wenn auch die Analyse von Immunreaktionen nach oraler Gabe und nicht nur die Beobachtung der Sterblichkeit nach einer systemischen Infektion. Unsere Methoden ermöglicht die Analyse der immunogenen Eigenschaften der bakteriellen apathogen Kommensale denn es bietet komplexere Bedingungen als Zellkultur, indem ein Darmbarriere in einem lebenden Organismus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. G. Mellonella Aufzucht und Vorbereitung der Larven für die Experimente
Hinweis: Der Zyklus vom Ei bis zum letzten Larve instar dauert ca. 5-6 Wochen.
- Die Eier von Erwachsenen Motten 2 L Kisten mit Wachsmotten Substrat (22 % Mais Grütze, 22 % Weizenmehl, 17,5 % Bienenwachs, 11 % Magermilchpulver, 11 % Honig, 11 % Glycerin, 5,5 % getrocknete Hefe) zu übertragen. Führen Sie die gesamte Zucht bei 30 ° C im Dunkeln.
- Übertragen Sie 25 g des Substrats mit den Larven in frisches Substrat nach ca. 1-2 Wochen als kleine und winzige Larven sichtbar waren. Synchronisieren Sie die Larven nach 2 Wochen nach ihrer Größe und behalten Sie Gruppen von 30-40 Larven im 2 L Container auf Wachsmotten Substrat für weitere 2 Wochen.
- Wählen Sie die Larven für Experimente nach Gewicht. Verwenden Sie nur blasse und schnellere bewegende Larven mit einer Masse von 180-200 mg.
2. Anbau und Vorbereitung von Bacteroides Vulgatus und Escherichia coli für die orale Verabreichung
- Wachsen die obligat anaerobe Bakterium Bacteroides Vulgatus Mpk bei 37 ° C anaerob mit Dosen und Beutel für eine anaerobe Umgebung schaffen (siehe Tabelle der Materialien)15,16. B. Vulgatus für 2 Tage zu kultivieren und eine Übernachtung Subkultur im Gehirn Herz Infusion (BHI) Brühe zu wachsen.
- Wachsen Sie die fakultative anaerobe Bakterium Escherichia coli Mpk unter aeroben Bedingungen in Brühe Luria-Bertani (LB) bei 37 ° C. E. Coli über Nacht in LB Brühe zu pflegen Sie und wachsen Sie Subkultur für 2 h bei 37 ° C am Tag des Experiments.
- Ernten Sie die Kulturen durch Zentrifugation bei 1.700 X g für 5 min. Aufschwemmen der Bakterien in DPBS (Dulbeccos Phosphate-Buffered Kochsalzlösung) Holzpellets. Bestimmen Sie die optische Dichte (OD) von Bakterienkulturen bei OD 600 nm und berechnen Sie die Bakterienkonzentration. Die Bakterienkonzentration wurden 109/mL angepasst.
(3) Zwangsfütterung von G. Mellonella Larven mit bakteriellen Suspensionen
- Jede Larve mit 10 µL der bereinigte Bakteriensuspension mit 107 Bakterien pro Dosis zu mästen. Verwenden Sie eine Insulin-Spritze mit einer Nadel stumpf endete für die orale Anwendung von der Bakteriensuspension.
- Fixieren Sie die Spritze in eine Microsyringe Pumpe (Abbildung 1), um die Richtigkeit des eingelegten Datenträgers angewandte Aussetzung jeder Larve (siehe Tabelle der Materialien). Legen Sie die Spritze vorsichtig zwischen ihre Mandibeln. Zwingen Sie sich nicht die Spritze zwischen den Mandibeln. Warten Sie, bis die Larven Mundwerkzeuge öffnen und fügen dann die Spritze.
- Inkubieren Sie zwangsernährt Larven im Dunkeln bei 37 ° C zwischen 1-24 h. Verwendung DPBS verabreicht Larven als mock Hintergrund Kontrollen, mögliche Stressreaktionen induziert durch die Handhabung der Larven bei Zwangsfütterung auszuschließen.
4. Verarbeitung von oral verabreichtes Larven und RNA-isolation
- Arbeiten unter einer Haube und Schutzbrille tragen. Reinigen Sie die Haube und Spray Reagenz um RNase-Kontamination zu verhindern.
- Snap-Freeze lebenden Larven nach der Inkubation in flüssigem Stickstoff und homogenisieren sie. Verwenden Sie einen Mörser und Stempel für Homogenisierung. Fügen Sie hinzu, flüssigem Stickstoff den Mörser und Raster einzelnen Larven bis pulverförmigen Homogenates hergestellt werden.
- Gießen Sie Homogenat um eine Einweg mit einem Gewicht von Boot und warten auf den flüssigen Stickstoff verdampft.
- Mischen Sie die Flüssigkeit frei von Stickstoff eingefroren pulverisierte Homogenates mit 1 mL Trizol in einer 2 mL-Tube und inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 1 h.
- Zentrifugieren Sie die Mischung bei 8.000 X g für 15 min bei Raumtemperatur und übertragen Sie den Überstand in ein frisches Gefäß zu und entsorgen Sie das Pellet. Den Überstand mit 200 µL 1-Bromo-3-Chloropropane (BCP) mischen. Wirbel und inkubieren Sie die Mischung für 5 min bei Raumtemperatur und für 10 min auf Eis.
- Zentrifugieren Sie die BCP-hinzugefügt Reaktionen bei 18.000 X g für 15 min bei 4 ° C. Die obere transparente Schicht in eine neue 2 mL Tube übertragen und den Rest verwerfen. Auszufällen Sie die RNA der übertragenen obere Schicht mit 500 µL Isopropanol durch Mischen und invertieren das Rohr für 5 min.
- Zentrifugieren Sie das Rohr auf 18.000 X g für 15 min bei 4 ° C. Waschen Sie die ausgefällte RNA-Pellet mit 500 µL 75 % Ethanol.
- Trocknen der RNA-Pellet für 5-10 min bei RT Achten Sie darauf, nicht über es trocknen, da es schwer löslich später sein wird.
- Verdünnen Sie Ribonuklease-Inhibitor (1: 100) in Nuklease-freies Wasser zu und verwenden Sie 100 µL der Lösung, um das getrocknete RNA-Pellet aufzuwirbeln. Vortex das Rohr sorgfältig, bis die Tablette komplett aufgelöst ist.
- Maßnahme RNA-Qualität und Quantität. Sicherstellen Sie, dass das 260/280 Verhältnis etwa 2,0 und 260/230 Verhältnis im Bereich von 2.0-2.2 (siehe Tabelle der Materialien).
- Verwenden Sie 5 µg der isolierten RNA für die DNase Verdauung. Mix 5 µL 10-fach Puffer, 1 µL Ribonuklease Inhibitor Enzym, 2 µL Enzym DNase, 5 µg RNA und füllen sich mit Nuklease-freie Wasser bis zu 50 µL. Inkubation für 30 min bei RT
- Fügen Sie 6 µL Reagenz Inaktivierung und inkubieren Sie gelegentlich für 2 min bei RT und Vortex Reaktion. Zentrifugieren Sie Reaktion bei 10.000 X g für 1 min. Transfer Überstand in frischen 1,5 mL Röhrchen.
Hinweis: Die RNA enthält die Larven RNA sowie die bakterielle RNA der jeweiligen Belastung für die orale Verabreichung verwendet.
- Fügen Sie 6 µL Reagenz Inaktivierung und inkubieren Sie gelegentlich für 2 min bei RT und Vortex Reaktion. Zentrifugieren Sie Reaktion bei 10.000 X g für 1 min. Transfer Überstand in frischen 1,5 mL Röhrchen.
(5) Quantifizierung der bakteriellen 16 s Kopie Zahlen nach Zwangsfütterung
Hinweis: Die Kopienzahl der zum Ausdruck gebrachten bakterielle 16 s wurde anhand cDNA synthetisiert aus der RNA, die in Abschnitt 4 extrahiert. Endgültige Quantifizierung errechnet sich mit Hilfe einer Standardkurve Plasmid in dem 16 s-PCR-Fragment von B. Vulgatus oder E. Coli geklont wurde.
- Erarbeitung von Plasmid-Normen
- 16 s Fragmente aus E. Coli Mpk oder B. Vulgatus Mpk genomischer DNA durch PCR zu verstärken. 5 x Puffer, 1 µL 10 mM dNTP-Lösung, 2,5 µL 10 µM vorwärts Grundierung und 2,5 µL 10 µM rückwärts-Primer Verdünnung, 1 µL DMSO, 1 µL der genomischen DNA Schablone, 31,5 µL Nuklease-freies Wasser und 0,5 µL Korrekturlesen Enzym-Mix 10 µL.
- Führen Sie die PCR (erste Denaturierung: 98 ° C für 30 s, Denaturierung: 98 ° C für 10 s, Glühen: 60 ° C für 30 Sekunden, Erweiterung: 72 ° C für 30 s, letzte Erweiterung: 72 ° C für 5 min, wiederholte Denaturierung, Glühen und Erweiterung für 30 Zyklen).
- 16 s E. Coli Primer verwenden (P_forward: GTTAATACCTTTGCTCATTGA, P_reverse: ACCAGGGTATCTAATCCTGTT17, 320 bp) oder 16 s B. Vulgatus Primer (P_forward: AACCTGCCGTCTACTCTT, P_reverse: CAACTGACTTAAACATCCAT18, 400 bp) für Verstärkung.
- Verwenden Sie die E. Coli und B. Vulgatus 16 s-PCR-Fragmente zum stumpfen Ende in einen Klonen Vektor klonen. Verbindung einrichten und 10 µL 2 x Puffer, 1 µL des PCR-Produkt nicht gereinigt, 1 µL Blunt-End Klonen Plasmid, 7 µL Nuklease-freies Wasser und 1 µL T4 DNA-Ligase mischen. Ligatur für 10 min bei RT inkubieren
- E. Coli DH5α kompetente Zellen vorbereiten.
- 100 mL LB-Medium in einen Erlenmeyerkolben mit 1 mL einer Übernacht-Kultur zu impfen. Wachsen Sie, die Kultur bis OD 600 nm zwischen 0,4-0,6. Die daraus resultierende Kultur in zwei 50 mL Röhrchen aufgeteilt und inkubieren Sie die Kulturen für 10 min auf Eis.
- Zentrifugieren Sie die Kulturen bei 1.700 X g für 10 min bei 4 ° C. Den Überstand verwerfen und Aufschwemmen jedes Pellet vorsichtig mit 5 mL der RFI-Lösung (30 mM CH3Koch, 100 mM KCl, 10 mM CaCl, 50 mM MnCl2, stellen Sie pH 5.8 mit glazialen Säure, steril gefiltert). Füllen Sie jedes Rohr mit zusätzlichen 45 mL RFI-Lösung.
- Zentrifugieren Sie die Kulturen bei 1.700 X g für 10 min bei 4 ° C. Den Überstand verwerfen und Aufschwemmen jedes Pellet vorsichtig mit 6 mL RFII (10 mM MOPS, 15 mM CaCl2, 10 mM KCl, 15 % Glycerin, autoklaviert) Lösung. Bündeln Sie beide Fraktionen zu und inkubieren Sie die 12 mL Suspension für 15 min. Vorbereitung Zelle Aussetzung Aliquote (200 µL) auf Eis. Speichern der Aliquote bei-80 ° C.
- Übertragen die Ligatur Reaktion auf eine Aliquote von kompetenten E. Coli DH5α Zellen und lassen die Reaktion auf Eis für 15 min. Hitze Schock die Zellen für 45 s bei 42 ° C und 1 mL LB-Medium.
- Inkubieren Sie Transformation für 45 min bei 37 ° c 100 µL der Transformation mit einer LB-Agar-Platte mit Ampicillin hinzufügen und über Nacht bei 37 ° c inkubieren
- Durchführen Sie Kolonie PCR 8 resultierende Transformanten aus der LB-Agar-Platte des Schrittes 5.1.5. Wählen Sie jede Kolonie mit einem Zahnstocher, Tauchen sie auf eine frische LB-Platte mit Ampicillin (master-Platte) und dann tauchen Sie die gleichen Zahnstocher in einem gut mit 5,5 µL Nuklease-freies Wasser in einem PCR-Streifen.
- Fügen Sie 7,5 µL 2 X PCR-Mix, 0,5 µL 10 µM vorwärts Grundierung und 0,5 µL 10 µM rückwärts-Primer Verdünnung. Verwenden Sie die gleichen Grundierung-Paare, die in Abschnitt 5.1.1 erwähnt.
- Führen Sie PCR (erste Denaturierung: 95 ° C für 5 min, Denaturierung: 95 ° C für 1 min glühen: 60 ° C für 30 Sekunden, Erweiterung: 72 ° C für 1 min, letzte Erweiterung: 72 ° C 7 min, wiederholte Denaturierung, Glühen und Verlängerung für 35 Zyklen).
- Überprüfen Sie die Größe der 16 s Fragmente auf einem 1 % Agarose-Gel. Verwenden Sie 0,5 X Tris-Borat-EDTA (TBE) Puffer 1 g Agarose aufzulösen und in der Mikrowelle kochen. Fügen Sie 1: 50,000 Farbstoff um gel und gießen sie hinzu. Das Gel der Kolonie-PCR-Reaktionen und eine 100 bp DNA-Leiter hinzu, und führen Sie das Gel für 45 Minuten bei 110 V.
- Impfen Sie eine 5 mL LB über Nacht Kultur mit Ampicillin mit einem Klon aus der master-Platte (Abschnitt 5.1.6) für jede E. Coli und B. Vulgatus 16 s-Plasmid, das die richtige Plattengröße enthält.
- Zentrifugieren Sie über Nacht Bakterienkulturen in einer 2 mL-Tube bei 1.700 X g. Den Überstand verwerfen und das Pellet in 600 µL steriles Wasser Aufschwemmen.
- Fügen Sie 100 µL der Lyse Puffer und Mix durch Umkehrung der Röhre 6 Mal hinzu. Fügen Sie 350 µL kalt (4° C) Neutralisation Lösung und Mischung gründlich durch Umdrehen der Röhre.
- Zentrifuge mit maximaler Geschwindigkeit in einer Zentrifuge für 3 min. Transfer den überstand (~ 900 µL) zu einem Spin Spalte und Zentrifuge mit maximaler Geschwindigkeit in einer Zentrifuge für 15 s.
- Verwerfen der Bestrahlungskammer und fügen Sie 200 µL Endotoxin Entfernung waschen und Zentrifuge mit maximaler Geschwindigkeit in einer Zentrifuge für 15 s.
- Hinzufügen der Spalte 400 µL der Waschlösung und Zentrifugieren bei maximaler Geschwindigkeit in einer Zentrifuge für 30 S. Übertragung der Spalte, um eine saubere 1,5 mL-Tube, fügen Sie 30 µL Elution Puffer in die Spalte inkubieren 1 min bei Raumtemperatur.
- Zentrifuge mit maximaler Geschwindigkeit in einer Zentrifuge für 30 s (siehe Tabelle der Materialien).
- Bestimmen Sie die Plasmid-DNA-Konzentration durch das Mischen von 1 µL Plasmid DNA mit 199 µL Arbeitslösung (1 µL Fluoreszenzfarbstoff pro 199 µL Puffer für jede Reaktion). Bereiten Sie zwei Standards durch Mischen von 10 µL standard 1 oder 10 µL standard 2 mit 190 µL. Wirbel der Probe und standard Röhren und inkubieren Sie Reaktion für 2 min. Maß der Konzentration (siehe Tabelle der Materialien).
- Bereiten Sie standard-Konzentrationen im 10-divisibel serielle Verdünnungen in einem Bereich von 10-100.000 Kopien: Berechnung der Masse des einzigen Plasmids (m = (n) x (1.096x10-21 g/bp), n = Plasmid Größe m = Masse). Berechnen Sie die Masse von Plasmid DNA benötigt, um die gewünschten Heftnummern des Interesses enthalten (Kopieren von Interesse verschiedener x Masse der einzelnen Plasmid = Masse des Plasmid DNA benötigt).
- Vorbereitung der Proben zur Quantifizierung
- CDNA zu synthetisieren. Mischen Sie 2 µL 7 X Puffer, 1 µL DNase verdaut RNA aus Abschnitt 4 und 11 µL Nuklease-freies Wasser. 2 min bei 42 ° c inkubieren
- Legen Sie Reaktion sofort auf Eis. Mix 4 µL 5 x RT Puffer, 1 µL RT (Reverse Transkriptase) Grundierung-Mix, 1 µL RT-Enzyms und der Reaktion der Schritt 5.2.1. 15 min bei 42 ° c inkubieren Inkubieren Sie für 3 min bei 95° C, RT Enzym zu inaktivieren.
- CDNA fluorimetrisch gefällt Konzentrationen im Schritt 5.1.9 beschrieben zu quantifizieren.
- CDNA zu synthetisieren. Mischen Sie 2 µL 7 X Puffer, 1 µL DNase verdaut RNA aus Abschnitt 4 und 11 µL Nuklease-freies Wasser. 2 min bei 42 ° c inkubieren
- Messung der bakteriellen Belastung
- Anpassen von cDNA-Konzentrationen bis 5 ng pro 12 µL Reaktion für die quantitative PCR. Mischen Sie 2 X RT-PCR-Mixes, 0,25 µL 100 µM vorwärts Grundierung, 0,25 µL 100 µM rückwärts-Primer (5.1.1) und 12 µL bereinigte cDNA. QPCR laufen (erste Denaturierung: 95 ° C für 5 min, Denaturierung: 95 ° C für 10 s, Glühen: 60 ° C für 30 s, wiederholte Denaturierung und glühen für 35 Zyklen, Schmelzen: 95 ° C auf 4 ° C abkühlen).
- Plot-Log10 Konzentrationen der Standardkurve Plasmid (10-100.000 Exemplare), d.h. 1-5 (x-Achse), gegen die entsprechenden ct-Werte (y-Achse). Führen Sie die lineare Regression um die Regressionsgleichung zu erhalten. Lösen Sie die Gleichung für x (Konzentration). Verwenden Sie die Formel, die Log10 der Kopie Zahlen berechnen von ct-Wert in die Formel einzufügen. Berechnen Sie die Antilogarithm um Kopie Zahlen zu erhalten.
6. Bestimmung des angeborenen Immunsystems Markergen mittels quantitativen RT-PCR
- Überprüfen Sie Zündkapseln für gen-Spezifität von PCR und nachfolgende Agarose gel Elektrophorese um die richtige Fragmentgröße zu überprüfen. Führen Sie PCR wie beschrieben in Abschnitt 5.1.5.
Ubiquitin 130 bp: TCAATGCAAGTAGTCCGGTTC vorwärts, rückwärts CCAGTCTGCTGCTGATAAACC19 (Zimmermädchen)
Nox-4 159 bp: TGGCACGGCATCAGTTATCA, umgekehrte ACAGCGACTGTCATGTGGAA8 weiterleiten
Nein 76 bp: ATGAAGGTGCTGAAGTCACAA, umgekehrte GCCATTTTACAATCGCCACAA8 weiterleiten
Gst 156 bp: GACAGAAGTCCTCCGGTCAG, umgekehrte TCCGTCTTCAAGCAAAGGCA8 weiterleiten
ApoIII 265 bp: AGACTTGCACGCCATCAAGA, umgekehrte TGCATGCTGTTTGTCACTGC8 weiterleiten
Hemolin 267 bp: CTCCCTCACGGAGGACAAAC, umgekehrte GCCACGCACATGTATTCACC8 weiterleiten
Gallerimycin 161 bp: GAAGTCTACAGAATCACACGA, umgekehrte ATCGAAGACATTGACATCCA8 weiterleiten
Cecropin 158 bp: CTGTTCGTGTTCGCTTGTGT, umgekehrte GTAGCTGCTTCGCCTACCAC8 weiterleiten
Gloverin 101-bp: GTGTTGAGCCCGTATGGGAA, umgekehrte CCGTGCATCTGCTTGCTAAC8 weiterleiten
Moricin 124 bp: GCTGTACTCGCTGCACTGAT, umgekehrte TGGCGATCATTGCCCTCTTT8weiterleiten) - Grundierung Effizienz um sein E = 2.
- Pool 2 µL 5-10 verschiedene positive Proben (z.B. Proben, die sind Ausdruck des Gens für die dem Primerpaar untersucht werden muss).
- Bereiten Sie eine 1:5 Verdünnungsreihe von der Probe-Pool: standard 1 (S1): unverdünnt Pool; S2: 2 µL der S1 + 8 µL Nuklease-freies Wasser; S3: 2 µL S2 + 8 µL Nuklease-freies Wasser; S4: 2 µL des S3 + 8 µL Nuklease-freies Wasser.
- Zuweisen einer 96-Well qPCR-Platte 1 µL des S1-S4 und eine nicht-Template-Kontrolle (Nuklease-freies Wasser). 5 µL RT-master-Mix, 0,1 µL jeder 100 µM Forward- und reverse-Grundierung, 3,7 µL Nuklease-freies Wasser und 0,1 µL RT-Mix pro Bohrloch hinzufügen.
- Führen Sie quantitative RT-PCR (reverse Transkription: 50 ° C für 10 min, erste Denaturierung: 95 ° C für 5 min, Denaturierung: 95 ° C für 10 s, Glühen: 60 ° C für 30 s, wiederholte Denaturierung und glühen für 40 Zyklen, Schmelzen: 95 ° C auf 4 ° C abkühlen).
- Grundstück10 der relativen Einheiten für S1-S4 (1, 0,2, 0,04, 0,008) anmelden (x-Achse) gegen die entsprechenden ct-Werte (y-Achse). Durchführen Sie linearen Regression und bestimmen Sie die Steigung der Standardkurve. Berechnen Sie den Wirkungsgrad E: E = 10-(1/slope). 20
: Hinweis eine Steigung von-3.32 idealen Reaktionsbedingungen und Grundierung Effizienz von E = 2,00. Das bedeutet: die Menge des PCR Produktes verdoppelt sich bei jedem Zyklus.
- Einsatz 100 ng verdaute RNA (100 ng/µL) als Vorlage für die RT-PCR. Mix-RT-PCR Reagenzien und laufen RT-PCR wie erwähnt im Abschnitt 6.2. Messen Sie alle Bakterien und DPBS verwaltet Proben mit Hauswirtschaft Primerpaar und Ziel-Primer-Paaren. Immer laufen die S1-S4-Verdünnungen mit dem Zimmermädchen Primerpaar und S1-S4 mit dem Ziel Primerpaar auf dieselbe Platte zur Bestimmung der Effizienz.
- Verhältnis (R) der RNA Genexpression nach folgender Formel mit den experimentell ermittelten Grundierung Effizienz die Zimmermädchen und das Ziel Primerpaar zu berechnen. Normalisieren von Bakterien stimuliert Proben, Kontrollen20zu verspotten.
R: Verhältnis
EZiel: Effizienz von S1-4 mit Ziel Primerpaar gemessen
EZimmermädchen: Effizienz von S1-4 mit Hauswirtschaft Primerpaar gemessen
ΔctZiel(Kontrollprobe): Δct (ct des DPBS gefütterten Probe)-(ct Bakterien gefüttert Probe) mit Ziel Primerpaar gemessen
ΔctHauswirtschaft(Kontrollprobe): Δct (ct des DPBS gefütterten Probe)-(ct Bakterien gefüttert Probe) mit Hauswirtschaft Primerpaar gemessen
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Die Hämolymphe Infektionsmodell G. Mellonella in allgemein verwendet, die Virulenzfaktoren von einer Vielzahl von Krankheitserregern zu analysieren. Die meisten Messungen umfassen die Analyse der Sterblichkeit der Larven, ist eine ganz einfache Methode. Dennoch ist diese Methode nicht Rückschlüsse über Immunantworten im allgemeinen und die Ergebnisse von G. Mellonella Immunantworten mit vertebrate Abwehrmechanismen zu verknüpfen. Die G. Mellonella orale Verabreichung Modell ist auf der anderen Seite nur selten für orale Infektion oder Kolonisation der Larven durch die Schwierigkeiten zur genauen Infektion Dosierung9zu erhalten. Darüber hinaus ist nur wenig bekannt über G. Mellonella angeborene Immunantwort gegenüber nicht-pathogenen Bakterien vor allem Säugetiere Darm Kommensalen.
Im Gegensatz zu Krankheitserregern Kommensalen fordern die Host und Trigger Immunantworten aber das Immunsystem des Wirts ist in der Lage, immun Homöostase. G. Mellonella ist in der Lage, die ersten zwangsernährt Keimbelastung zu löschen, bis schließlich keine Bakterien mehr nachweisbar waren (Abbildung 2)8. Die 16 s gen Heftnummern B. Vulgatus und E. Coli erheblich gesunken, innerhalb von 24 h.
Wir bewiesen, dass Kommensalen verabreicht G. Mellonella Larven induzieren RNA-gen-Expression von verschiedenen angeborenen Immunität Markergene: LPS-Anerkennung Moleküle - Apolipophorin (ApoIII) und Hemolin (Abb. 3A, B) zeigten sich in der Regel höher ausgedrückt in E. Coli-Larven im Vergleich zu B. Vulgatusverabreicht-Larven8verabreicht. Darüber hinaus kann Marker-gen-Expression von zwei Arten der antimikrobielle Moleküle überwacht werden. Die Produktion von reaktivem Sauerstoff und Stickstoff-Spezies (ROS/RNS) abgeschätzt werden durch die Messung der Nos und Nox-4 -gen-Expression, die gezeigt wurden stark hochreguliert auf E. Coli Zwangsfütterung werden im Vergleich zu B. Vulgatus (Abb. 4A, B)8. Darüber hinaus konnte Genexpression von antioxidativen Gst (Abb. 4C) beobachtet werden. 8
Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass verschiedene antimikrobielle Peptide Ausdruck nach der Verabreichung von E. Coli als Reaktion auf B. Vulgatus Zwangsfütterung stärker induziert wurde. Wir beobachteten Hochregulation defensin-ähnliche Gallerimycin Peptid, LPS-wechselwirkenden Gloverin Peptid, Cecropin und Moricin (Abb. 5A, B, C, D)8.
Abbildung 1 : Zwangsfütterung Setup mit einer Pumpe Microsyringe. Eine stumpfe endete Nadel richtet sich in Microsyringe Pumpe ermöglicht präzise Injektion von Bakterien. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Persistenz der bakteriellen Belastung in Galleria Mellonella Larven nach Zwangsernährung. Kopieren Sie Zahlen von B. Vulgatus- und E. Coli-spezifischen 16 s rDNA-Gene wurden bestimmt von 5 ng cDNA zu unterschiedlichen Zeitpunkten mittels RT-PCR. Datenpunkte werden mit Angabe des Medians angezeigt. Geändert von Referenz 8. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Differential Mustererkennung von Bakterien durch G. Mellonella. Die Larven wurden mit zwei verschiedenen Darm Kommensalen administriert, RNA wurde nach 1-6 h isoliert und mRNA Expression von LPS Anerkennung Molekül Apolipophorin (ApoIII) (A) und Hemolin (B) wurde ermittelt. Datenpunkte repräsentieren geometrische Mittel mit Standardfehler des Mittelwertes (SEM) (p > 0,05; *, p < 0,05; **, p < 0,01; ***, p < 0,001). 8 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : ROS-Marker-gen-Expression nach bakteriellen Herausforderung. E. Coli und B. Vulgatus waren zwangsernährt und ROS-Verteidigung-Marker-gen-Expression wurde im Laufe der Zeit analysiert. Nos (A), Nox-4 (B) und Gst (C) mRNA Expression in isolierten Larven RNA gemessen wurde. Datenpunkte repräsentieren geometrische Mittel mit Standardfehler des Mittelwertes (SEM) (p > 0,05; *, p < 0,05; **, p < 0,01; ***, p < 0,001). Geändert von Referenz 8. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 : Kommensalen-induzierte defensin-ähnliche antimikrobielle Peptid Ausdruck in G. Mellonella Larven und menschlichen Epithelzellen. Larven mit B. Vulgatus oder E. Colioral verabreicht wurden, Immunantworten wurden im Laufe der Zeit beobachtet und RNA isoliert von Larven Einzelpersonen. Gallerimycin (A), Cecropin (B), Gloverin (C), Moricin (D) mRNA Ausdruck bestimmt war. Datenpunkte repräsentieren geometrische Mittel mit Standardfehler des Mittelwertes (SEM) (p > 0,05; *, p < 0,05; **, p < 0,01; ***, p < 0,001). Geändert von Referenz 8. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
G. Mellonella -Modell ist eine häufig verwendete bakterielle Virulenzfaktoren in einer systemischen Infektion Ansatz21zu beurteilen. Da viele Krankheitserreger und Bakterien die Gastgeber über die mündlichen Kolonisation oder Infektion Route eingeben, müssen neue Erkenntnisse gefunden werden, um G. Mellonella als Modell für die mündliche Kolonisation und Infektion zu bewerten.
Die Möglichkeit, hinten G. Mellonella zwischen 15-37 ° C ist ein großer Vorteil, da die meisten Säugetier-Modelle Körpertemperatur von 37 ° C5pflegen. G. Mellonella Larven können von verschiedenen Anbietern gekauft werden, aber die Einrichtung einer eigenen Zucht Bevölkerung bietet viele Vorteile wie das Fehlen von Antibiotika, die stören die Assays, bessere Einschätzung, wenn Experimente zu starten Da die Lieferanten nicht immer Larven in eine Ready-to-Use-Bühne bieten und Stressreaktionen durch Transport oder Temperaturschwankungen vermieden werden. Aufgrund der Temperatur-Toleranz von G. Mellonella ist der Temperaturbereich bei dem Zucht erfolgen kann hoch. Höhere Temperaturen führen zu einer schnelleren Entwicklung der Larven und abhängig von der Temperatur der Zucht, schätzen wir den Lebenszyklus vom Ei bis zum letzten Larve instar. Als Larven für Experimente ausgewählt wurden, wurden nur blasse und sich schnell bewegenden Personen ausgewählt, um Stress und Immunreaktionen zu stören, die Experimente zu vermeiden.
Um die Zwangsfütterung Modell zu etablieren, muss es sicher sein, dass die orale Anwendung erfolgreich war. Daher war es hilfreich sein, mehrere Studien einrichten, für die die Lösung für die Zwangsfütterung ein starke Bromophenol Farbstoff hinzugefügt wurde. Dadurch verletzten Larven ausschließen und wählen für die Larven, die den blauen Farbstoff nur in ihren Darm22haben.
Mit diesem Modell fanden wir, dass G. Mellonella Larven sinnvoll, angeborene Immunantwort Kinetik bestimmter Marker-Gene zu untersuchen sind. Während der Einrichtung des Modells orale Verabreichung und das Studium der Immunantwort Kinetik fanden wir Genexpression nicht lokal in den Mitteldarm ausgedrückt werden. Erste experimentelle Versuche Mitteldarm RNA extrahieren nach oraler Verabreichung von Kommensalen Bakterien haben keine schlüssigen Ergebnisse vorgelegt. Daher wurden die Immunreaktionen "Global" im ganzen Personen bestimmt. Diese Befunde stützen die Hypothese der globalen Anerkennung über Darm-Rezeptoren, Übertragung des Signals und intestinalem Genexpression auslösen. Im Allgemeinen ist G. Mellonella AMPs vor allem in fetten Körper auslösen können, aber in Hemocytes und Darmsystem9weiter. Da gibt es keine genauen Angaben über die gewebespezifischen Produktion antimikrobielle Moleküle in G. Mellonella Larven nach der Infektion, wurde die ganzen Larven RNA von kompletten Individuen extrahiert und für RNA gen Prüfung verwendet Ausdruck. Ein weiterer Vorteil des ganzen Larven RNA-Extraktion ist die komplette Eindämmung der lebenden Bakterien in den Darm und die Möglichkeit, den Keimdruck zu quantifizieren. Die Zerlegung des Darms führen zum Verlust der Bakterien durch Vorbereitung.
Da die meisten G. Mellonella Forschung auf bakterielle Virulenz Merkmale erfolgt waren wir besonders daran interessiert, ob und wie die Larven Immunantworten gegen nicht-pathogenen Bakterien auslösen, die die Säugetier-Mikrobiota gehören. Vor kurzem haben wir gezeigt, dass G. Mellonella und Säugetieren teilen ähnliche Komponenten der angeborenen Immunantwort, die homolog sind und evolutionär konserviert. Die Salpetersäure Oxid Synthase (Nein) und NADPH Oxidase (Nox) Gene teilen ein hohes Maß an Ähnlichkeit8. G. Mellonella Häfen weiter ein defensin-ähnliche antimikrobielle Peptid-Gallerimycin die strukturelle Ähnlichkeiten mit Säugetieren β-defensin 2 teilt8.
Mit dem oralen Verabreichung Modell konnte es differenzielle bakterielle Anerkennung von entzündungshemmenden symbiotische B. Vulgatus oder Pro-inflammatorischen Pathobiotic E. Colinachgewiesen. Darüber hinaus waren nachgeschaltete oxidativen Stress-Reaktionen und antimikrobiellen Peptid Produktion höher nach E. Coli Verwaltung im Vergleich zu B. Vulgatus Verwaltung8veranlasst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der DFG (SPP1656), das DFG-Graduiertenkolleg 1708, der Bundesministeriums Für Bildung Und Forschung (BMBF) und das Deutsche Zentrum für Infektion Forschung (DZIF) finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030120086 | |
| 100 bp DNA ladder | Thermo Fisher Scientific | 15628019 | |
| 1-Bromo-3-Chloropropane (BCP) | Sigma-Aldrich | B9673 | |
| 2 mL tubes | Eppendorf | 0030120094 | |
| 2x Mangomix | Bioline | BIO-25033 | Colony PCR |
| 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 210 261 | |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Beeswax | Mixed-Store.de | - | |
| Brain heart infusion broth | Thermo Fisher Scientific | CM1135 | |
| CloneJET PCR Cloning Kit | Thermo Fisher Scientific | K1232 | Cloning vector for 16S fragments |
| Corn grits | Ostermühle Naturkost GmbH | 306 | Organic cultivation |
| Difco LB Agar, Miller (Luria-Bertani) | Becton Dickinson | BD | |
| Difoco LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Becton Dickinson | 244610 | |
| DNA-free DNA Removal Kit | Thermo Fisher Scientific | 244510 | Dnase digestion |
| Dried yeast | Rapunzel | - | Organic cultivation |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14040 | |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | W252506 | |
| Honey | Ostermühle Naturkost GmbH | 487 | |
| Isopropanol | VWR | 20842.330 | |
| Lightcycler 480 Instrument II | Roche Molecular Systems | 5015278001 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche Molecular Systems | 4729692001 | |
| Manual Microsyringe Pump with Digital Display | World Precision Instruments | DMP | |
| Micro-Fine+ U-100 insulin syringe 0.3 x 8 mm | Becton Dickinson | 324826 | Oral administration |
| Mortar, unglazed | VWR | 410-9327 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | 13-400-518 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | 10977035 | |
| Oxoid AnaeroGen sachets | Thermo Fisher Scientific | AN0025A | Quality and quantity of RNA |
| PCR stripes | Biozym | 710970 | |
| Pestle, unglazed grinding surface | VWR | 410-9324 | |
| Phusion proof-reading enzyme | Thermo Fisher Scientific | F553S | |
| Primers | Biomers | - | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1222 | |
| QuantiFast SYBR Green PCR kit | Qiagen | 204056 | qPCR for bacterial copy number measurment |
| QuantiFast SYBR Green RT-PCR Kit | Qiagen | 204156 | qRT-PCR for gene expression measurements |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205311 | cDNA synthesis |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit dsHS DNA kit | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | Quantification of plasmid and cDNA samples |
| Qubit fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33226 | Quantification of plasmid and cDNA samples |
| RNase-ExitusPlus | AppliChem | A7153 | |
| Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 | |
| Skimmed milk powder | Sucofin | - | |
| SYBR safe DNA Gel Stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | |
| TRI reagent | Sigma-Aldrich | T9424 | |
| Weighing boat | VWR | 10803-148 | |
| Wheat meal | Ostermühle Naturkost GmbH | 6462 | Organic cultivation |
References
- Nell, S., Suerbaum, S., Josenhans, C. The impact of the microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nature Reviews Microbiology. 8 (8), 564-577 (2010).
- Muniz, L. R., Knosp, C., Yeretssian, G. Intestinal antimicrobial peptides during homeostasis, infection, and disease. Frontiers in Immunology. 3, 310 (2012).
- Ivanov, I. I., Honda, K. Intestinal commensal microbes as immune modulators. Cell Host Microbe. 12 (4), 496-508 (2012).
- Ayres, J. S. Inflammasome-microbiota interplay in host physiologies. Cell Host Microbe. 14 (5), 491-497 (2013).
- Champion, O. L., Titball, R. W., Bates, S. Standardization of G. mellonella Larvae to Provide Reliable and Reproducible Results in the Study of Fungal Pathogens. Journal of Fungi (Basel). 4 (3), (2018).
- Wojda, I. Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella. Insect Science. , (2016).
- Buchmann, K. Evolution of Innate Immunity: Clues from Invertebrates via Fish to Mammals. Frontiers in Immunology. 5, 459 (2014).
- Lange, A., et al. Galleria mellonella: A Novel Invertebrate Model to Distinguish Intestinal Symbionts From Pathobionts. Frontiers in Immunology. 9 (2114), (2018).
- Tsai, C. J., Loh, J. M., Proft, T. Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing. Virulence. , 1-16 (2016).
- Bolouri Moghaddam, M. R., et al. The potential of the Galleria mellonella innate immune system is maximized by the co-presentation of diverse antimicrobial peptides. Biological Chemistry. 397 (9), 939-945 (2016).
- Casanova-Torres, A. M., Goodrich-Blair, H. Immune Signaling and Antimicrobial Peptide Expression in Lepidoptera. Insects. 4 (3), 320-338 (2013).
- Mukherjee, K., et al. Galleria mellonella as a model system for studying Listeria pathogenesis. Applied and Environmental Microbiology. 76 (1), 310-317 (2010).
- Brennan, M., Thomas, D. Y., Whiteway, M., Kavanagh, K. Correlation between virulence of Candida albicans mutants in mice and Galleria mellonella larvae. FEMS Immunological and Medical Microbiology. 34 (2), 153-157 (2002).
- Miyata, S., Casey, M., Frank, D. W., Ausubel, F. M., Drenkard, E. Use of the Galleria mellonella caterpillar as a model host to study the role of the type III secretion system in Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infection and Immunity. 71 (5), 2404-2413 (2003).
- Waidmann, M., et al. Bacteroides vulgatus protects against Escherichia coli-induced colitis in gnotobiotic interleukin-2-deficient mice. Gastroenterology. 125 (1), 162-177 (2003).
- Lange, A., et al. Extensive Mobilome-Driven Genome Diversification in Mouse Gut-Associated Bacteroides vulgatus mpk. Genome Biology and Evolution. 8 (4), 1197-1207 (2016).
- Hermann-Bank, M. L., Skovgaard, K., Stockmarr, A., Larsen, N., Molbak, L. The Gut Microbiotassay: a high-throughput qPCR approach combinable with next generation sequencing to study gut microbial diversity. BMC Genomics. 14, 788 (2013).
- Sato, K., et al. OmpA variants affecting the adherence of ulcerative colitis-derived Bacteroides vulgatus. Journal of Medical and Dental Science. 57 (1), 55-64 (2010).
- Freitak, D., et al. The maternal transfer of bacteria can mediate trans-generational immune priming in insects. Virulence. 5 (4), 547-554 (2014).
- Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Research. 29 (9), 45 (2001).
- Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).
- Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).
