Summary
Her gir vi en detaljert protokoll for en muntlig administrasjonsmodell bruker Galleria mellonella larver og hvordan å karakterisere indusert medfødte immunreaksjoner. Bruker denne protokollen, vil forskere uten praktisk erfaring kunne bruke G. mellonella kraft-mating metoden.
Abstract
Etterforskningen av immunogenic potensialet av commensal bakterier på verten immunsystem er en viktig komponent når studere intestinal vert-mikrobe interaksjoner. Det er godt etablert at ulike commensals ha en annen potensial til å stimulere vert intestinal immunforsvaret. Dette involverer vertebrate dyr, særlig gnagere. Siden økende Etiske bekymringene er knyttet til forsøk med virveldyr, er det en høy etterspørsel etter virvelløse erstatninger modeller.
Her gir vi en Galleria mellonella peroral administrering modell med commensal ikke-patogene bakterier og mulig vurdering av immunogenic potensialet i commensals på G. mellonella immunsystemet. Vi viser at G. mellonella er et nyttig alternativ virvelløse erstatning modell for analyse av commensals med forskjellige immunogenic potensial som Bacteroides vulgatus og Escherichia coli. Interessant, utstilt bakterier ingen drap virkning på larvene, som er lik for pattedyr. Immunreaksjoner av G. mellonella var sammenlignbart med virveldyr medfødte immunreaksjoner og anerkjennelse av bakterier og produksjon av antimikrobielle molekyler. Vi foreslår at G. mellonella kunne gjenopprette forrige bakterieflora saldo, som er kjent fra friske pattedyr individer. Selv om å gi sammenlignbare medfødte immunreaksjoner både G. mellonella og virveldyr, G. mellonella ikke havn en adaptive immunsystemet. Siden de undersøkte komponentene av det medfødte immunsystemet er evolusjonære bevart, tillater modellen en kvalifisering prescreening og første analyse av bakteriell immunogenic egenskaper.
Introduction
Den intestinal microbiome er en viktig komponent for vedlikehold av homeostase, og involverer både medfødte og adaptive immunreaksjoner1,2. Commensal bakterieflora fellesskapet er preget av ulike viktigste commensal bestanddeler: symbionter som gir gunstige effekter av viktige immunmodulerende funksjoner og pathobionts som kan ha skadelige effekter i genetisk predisposed vert og fremme og utløse intestinale betennelsen3,4. Mange studier på symbionter og pathobionts og deres innflytelse på verten immunsystemet er publisert hovedsakelig studere adaptive immunreaksjoner.
Siden disse studiene involverer mange dyr for undersøkelser og beskyttelse og utskifting av dyr som brukes til eksperimentering er økende offentlig interesse, søker vi å finne en erstatning modell å tillate en screening av ulike bakteriell immunogenic egenskaper. Insekter, spesielt Galleria mellonella, er en mye brukt erstatning modell i infeksjon forskning. G. mellonella kombinerer forskjellige fordeler som lave kostnader og høy gjennomstrømning; det tillater peroral administrering av bakterier, som er naturlig eksponering ruten, og det tillater systemisk infeksjon5,6. G. mellonella videre kan inkubasjonstiden ved 37 ° C, som er fysiologisk kroppstemperaturen av pattedyr og optimal for bakteriell virulens faktor uttrykk5. Den største fordelen med G. mellonella er det bevarte medfødte immunsystemet som muliggjør diskriminering av selvtillit fra ikke-selv og koder en rekke mønster anerkjennelse reseptorer som apolipophorin eller opsonin hemolin6, 7. på mikrobe anerkjennelse, G. mellonella kan utløse ulike nedstrøms humoral immunreaksjoner. Indusere oksidativt stress svar kan og skiller reaktive oksygen arter (ROS) som innebærer NOS (nitrat oksidase syntase) og NOX (NADPH oksidase)6,8. I tillegg G. mellonella aktiverer en potent antimikrobielle peptid (AMP) respons, som resulterer i utskillelsen av en blanding av forskjellige forsterkere som gloverin, moricin, cecropin eller defensin-lignende gallerimycin6, 8,9,10. Vanligvis forsterkere har ganske bred vert spesifisitet mot Gram-positive og Gram-negative bakterier og sopp og gi et potent svar siden insekter mangler noen adaptive responsen10. Gloverin er en forsterker aktiv mot bakterier og sopp og hemmer ytre membran formasjon6,11. Moricins viser sine antimikrobielle funksjon mot Gram-positive og Gram-negative bakterier av gjennomtrengende membranen og danner en pore9,11. Cecropins gir aktivitet mot bakterier og sopp og permeabilize membranen på samme måte som moricins9,10. Gallerimycin er et defensin som peptid med Antifungal egenskaper9. Interessant, ble det funnet at kombinasjonen av cecropin og gallerimycin hadde en samvirkningen mot E. coli10.
På grunn av deres lett-å-bruke karakter G. mellonella er Larvene en ofte brukt infeksjon modell å vurdere bakteriell virusets. Spesielt korrelerer studier i hvilke data fra G. mellonella med data fra mus støtte styrken på denne alternative vert modellen. Det ble funnet at de mest patogene serotypene av Listeria monocytogenes i en mus infeksjon modell også føre til høyere dødelighet i G. mellonella etter systemisk infeksjon. Videre mindre virulente serotyper viste seg for å være også mindre virulente i G. mellonella model12. Lignende observasjoner er gjort med den menneskelige patogene sopp Candida albicans. Virulens av ulike C. albicans stammer er vurdert av systemisk smitte og påfølgende overvåking av larver overlevelse. Mus avirulent stammer var også avirulent eller utstilt redusert virulens i G. mellonella, mens musen virulente stammene fører også til høy larver dødelighet13. G. mellonella modellen kan videre brukes til å identifisere typen 3 sekresjon systemet virusets faktorer Pseudomonas aeruginosa14.
Siden de fleste undersøkelser som involverer G. mellonella var fokusert på virulens faktorer ved hjelp av systemisk infeksjon tilnærming var vi spesielt interessert i å tilby en metode egnet for analyse av intestinal commensals i en muntlig kraft-mating modell som vi kan bruke en distinkt dosering av bakterier per larver og ikke bare observere larver dødelighet, men du kan analysere ulike kjennetegner medfødte immunreaksjoner å opprettholde intestinal homeostase.
Vår metode bidrar til å øke bruken av G. mellonella som erstatning modell siden vi kombinerer anvendelse av bakterier og analyse av RNA uttrykk. Det er ikke bare nyttig å styrke betydningen av bakteriell patogenesen studier inkludert analyse av immunreaksjoner etter peroral administrering og ikke bare observasjon av dødelighet etter systemisk infeksjon. Våre metoder kan for analyse av immunogenic egenskaper av bakteriell ikke-patogene commensals siden det gir mer komplisert forhold enn cellekultur ved å tilby en intestinal barriere i en levende organisme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. G. mellonella oppdrett og utarbeidelse av Larvene for eksperimenter
Merk: Syklus fra egg til siste skikkelsen Larven tar ca 5-6 uker.
- Overføre eggene lagt av voksen møll 2 L-boksene som inneholder voks møll substrat (22% korn grits, 22% hvete måltid, 17,5% bivoks, 11% skummet melkepulver, 11% honning, 11% glyserol, 5,5% tørket gjær). Utføre hele den oppdrettende på 30 ° C i mørket.
- Overføre 25 g substrat som inneholder Larvene i frisk substrat etter ca 1-2 uker når liten og lille Larvene var synlig. Synkronisere Larvene etter 2 uker avhengig av størrelse og holde grupper av 30-40 larver i 2 L containere på voks møll substrat for ytterligere 2 uker.
- Velg Larvene for eksperimenter av vekt. Bruk bare blek og rask bevegelse Larvene med masse 180-200 mg.
2. dyrking og forberedelse av Bacteroides vulgatus og Escherichia coli peroralt
- Vokse forplikte anaerob bakterien Bacteroides vulgatus modellene på 37 ° C anaerob bruker glass og poser for å skape en anaerob miljø (se Tabell for materiale)15,16. Dyrke B. vulgatus i 2 dager og vokse en overnatting subkultur i hjernen hjertet infusjon (BHI) buljong.
- Vokse facultative anaerob bakterien Escherichia coli modellene under aerobe forhold i Luria-Bertani (LB) buljong på 37 ° C. Dyrke E. coli overnatter i LB buljong og vokse subkultur 2 h på 37 ° C på dagen for eksperimentet.
- Høste kulturer av sentrifugering 1700 x g for 5 min. Resuspend bakteriell pellets i DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered saltvann). Fastslå bakteriekulturer på OD 600 nm optisk tetthet (OD) og beregne de bakterielle konsentrasjonene. Bakteriell konsentrasjonen ble justert til 109/mL.
3. kraft-mating av G. mellonella Larvene med bakteriell suspensjoner
- Force-feed hver Larven med 10 µL av justert bakteriell suspensjon som inneholder 107 bakterier per dose. Bruk en insulinsprøyte med en stump endte nål for oral applikasjon av bakteriell suspensjon.
- Fikse sprøyten til en microsyringe pumpe (figur 1) å sikre nøyaktigheten av anvendt suspensjon volumet til hver Larven (se Tabell for materiale). Sett inn sprøyten forsiktig mellom deres Accolade. Ikke press sprøyten mellom Accolade. Vent til Larvene åpne den munndeler og legg deretter sprøyten.
- Inkuber makt-innmatede Larvene i mørket på 37 ° C mellom 1-24 h. Bruk DPBS-administrert larver som uekte bakgrunn kontroller utelate potensiell stressresponser indusert på grunn av håndtering av Larvene under kraft-mating.
4. prosessering av muntlig-administrert larver og RNA isolasjon
- Arbeid under hette og ha vernebriller. Rengjør hetten og spray reagens for å hindre RNase forurensning.
- Snapin-frysing Larven lever etter inkubasjon i flytende nitrogen og homogenize dem. Bruke en morter og pistil for homogenisering. Legge flytende nitrogen til mørtel og rutenettet enkelte larver til pulverisert homogenates produseres.
- Hell homogenate til et engangskamera veier båt og vente på flytende nitrogen til å fordampe.
- Bland flytende nitrogen-fri frosset pulverisert homogenates med 1 mL av Trizol i en 2 mL tube og ruge blandingen ved romtemperatur 1t.
- Sentrifuge blandingen 8000 x g i 15 min ved romtemperatur og overføre nedbryting i en fersk rør og kast pellet. Bland nedbryting med 200 µL av 1-Bromo-3-Chloropropane (BCP). Vortex og Inkuber blandingen for 5 min ved romtemperatur og 10 min på is.
- Sentrifuge BCP-lagt reaksjonene på 18 000 x g i 15 min på 4 ° C. Overføre øvre gjennomsiktig laget til en ny 2 mL tube og kast resten. Utløse RNA av overførte øvre laget med 500 µL isopropanol ved å blande invertere røret i 5 min.
- Sentrifuge røret på 18 000 x g i 15 min på 4 ° C. Vask det utfelt RNA pellet med 500 µL av 75% etanol.
- Tørr RNA pellet for 5-10 minutter til RT. Ta vare å ikke over tørke den som det vil være vanskelig å oppløse senere.
- Fortynn ribonuclease hemmer (1: 100) i nuclease-fritt vann og bruk 100 µL av løsningen for å resuspend tørket RNA pellets. Vortex tube nøye før pellet er fullstendig oppløst.
- Mål RNA kvalitet og kvantitet. Kontroller at 260/280 forholdet er ca 2.0 og 260/230 forholdet mellom 2.0-2.2 (se Tabell for materiale).
- Bruke 5 µg av de isolerte DNase fordøyelsen. Mix 5 µL av 10 x buffer, 1 µL av ribonuclease hemmer enzym, 2 µL av DNase enzym, 5 µg RNA og fylle opp med nuclease-gratis vann opptil 50 µL. Incubate i 30 min på RT.
- Legg til 6 µL av inaktivering reagensen og ruge i 2 minutter på RT og vortex reaksjon ganger. Sentrifuge reaksjon på 10.000 x g for 1 min. overføring nedbryting i frisk 1,5 mL tube.
Merk: RNA inneholder larver RNA samt den bakterielle RNA i respektive påkjenningen brukes peroralt.
- Legg til 6 µL av inaktivering reagensen og ruge i 2 minutter på RT og vortex reaksjon ganger. Sentrifuge reaksjon på 10.000 x g for 1 min. overføring nedbryting i frisk 1,5 mL tube.
5. kvantifisering av bakteriell 16S kopi tallene etter kraft-mating
Merk: Kopier antall uttrykt bakteriell 16S identifiserte bruker cDNA fra RNA trukket ut i del 4. Siste kvantifisering beregnes ved hjelp av en standard kurve av plasmider der 16S PCR fragmentet B. vulgatus eller E. coli ble klonet.
- Utarbeidelse av plasmider standarder
- Forsterke 16S fragmenter fra E. coli modellene eller B. vulgatus modellene genomisk DNA av PCR. Bland 10 µL av 5 x buffer, 1 µL av 10 mM dNTP løsning, 2,5 µL av 10 µM frem primer og 2,5 µL av 10 µM bakover grunning fortynning, 1 µL av DMSO, 1 µL av genomisk DNA, 31,5 µL nuclease uten vann og 0,5 µL av språkvask enzym.
- Kjøre PCR (første rødsprit: 98 ° C for 30 s, rødsprit: 98 ° C for 10 s, annealing: 60 ° C i 30-årene, utvidelse: 72 ° C for 30 s, endelig utvidelse: 72 ° C i 5 min, gjenta rødsprit, annealing og utvidelse for 30 sykluser).
- Bruke 16S E. coli primere (p_forward: GTTAATACCTTTGCTCATTGA, p_reverse: ACCAGGGTATCTAATCCTGTT17, 320 bp) eller 16S B. vulgatus primer (p_forward: AACCTGCCGTCTACTCTT, p_reverse: CAACTGACTTAAACATCCAT18, 400 bp) for forsterkning.
- Bruk E. coli og B. vulgatus 16S PCR fragmenter for Butt-end kloning i en kloning vektor. Definere ligatur og bland 10 µL av 2 x buffer, 1 µL av ikke-renset PCR produkt, 1 µL av Butt-end kloning plasmider, 7 µL nuclease uten vann og 1 µL av T4 DNA Ligase. Inkuber hemorroider i 10 min på RT.
- Forberede E. coli DH5α kompetent celler.
- Vaksinere 100 mL LB medium i en Erlenmeyer kolbe med 1 mL av en over natten kultur. Vokse kulturen til OD 600 nm er mellom 0,4-0.6. Delt den resulterende kulturen i to 50 mL rør og ruge kulturer på is 10 min.
- Sentrifuge kulturer 1700 x g i 10 min på 4 ° C. Forkaste nedbryting og resuspend hver pellet nøye med 5 mL RFI (30 mM CH3COOK, 100 mM KCl, 10 mM CaCl, 50 mM MnCl2, justere pH 5,8 med glacial syre, sterile filtrert). Fyll hver rør med ekstra 45 mL RFI.
- Sentrifuge kulturer 1700 x g i 10 min på 4 ° C. Forkaste nedbryting og resuspend hver pellets med 6 mL av RFII (10 mM MOPPER, 15 mM CaCl2, 10 mM KCl, 15% glyserol, autoklaveres) løsning. Basseng både fraksjoner og ruge 12 mL suspensjon på is 15 min. forberede celle suspensjon dele (200 µL). Lagre dele på-80 ° C.
- Overføre ligation reaksjonen til en aliquot av kompetente E. coli DH5α celler og la reaksjonen på is 15 min. varme sjokk celler for 45 s på 42 ° C og legge 1 mL av LB medium.
- Inkuber transformasjon 45 min på 37 ° C. Legge til 100 µL av transformasjonen i en LB agar plate inneholder ampicillin og ruge over natten på 37 ° C.
- Utføre kolonien PCR av 8 resulterende transformants fra LB agar platen trinn 5.1.5. Velg hver kolonien med en tannpirker, dyppe den på en fersk LB plate inneholder ampicillin (master plate) og deretter dyppe samme tannpirker i en godt med 5,5 µL av nuclease-fritt vann PCR radstriper.
- Legg 7,5 µL av 2 x PCR, 0,5 µL av 10 µM frem primer og 0,5 µL av 10 µM bakover grunning fortynning. Bruk samme primer parene nevnt i delen 5.1.1.
- Kjøre PCR (første rødsprit: 95 ° C i 5 min, rødsprit: 95 ° C i 1 min, annealing: 60 ° C i 30-årene, utvidelse: 72 ° C i 1 min, endelig utvidelse: 72 ° C i 7 min, gjenta rødsprit, annealing og utvidelse for 35 sykluser).
- Kontroller størrelsen på 16S fragmenter på en 1% agarose gel. Bruk 0.5 x Tris Borate EDTA (TBE) buffer til å oppløse 1 g agarose og koke den i mikrobølgeovn. Legge til 1: 50,000 fargestoff gel og hell den. Legge til koloni PCR reaksjonene og en 100 bp DNA stige gel, og Kjør gel for 45 min på 110 V.
- Vaksinere en 5 mL LB natten kultur som inneholder ampicillin med en klone fra master platen (inndelingen 5.1.6) for hver E. coli og B. vulgatus 16S plasmider som inneholder riktig sett inn størrelsen.
- Sentrifuge bakteriell overnatting kulturer i en 2 mL tube 1700 x g. Forkast nedbryting og resuspend pellets i 600 µL sterilt vann.
- Legg 100 µL av lyseringsbuffer og bland ved å snu røret 6 ganger. Legge til 350 µL av kaldt (4° C) nøytralisering løsning og bland grundig ved å snu røret.
- Sentrifuge med maksimal hastighet i en centrifuge for 3 min. overføre nedbryting (~ 900 µL) til en spinn kolonne og sentrifuge med maksimal hastighet i en centrifuge for 15 s.
- Kaste flowthrough og legge til 200 µL endotoxin fjerning vask og sentrifuge med maksimal hastighet i en centrifuge for 15 s.
- Legge til 400 µL av vaskeløsning i kolonnen og sentrifuge med maksimal hastighet i en sentrifuge for 30 s. overføring kolonnen til en ren 1,5 mL tube, legge 30 µL av elueringsbufferen til kolonnen ruge det i 1 min i romtemperatur.
- Sentrifuge med maksimal hastighet i en centrifuge for 30 s (se Tabell for materiale).
- Bestemme plasmider DNA konsentrasjonen ved å blande 1 µL av plasmider DNA med 199 µL av fungerende løsning (1 µL fluorescerende fargestoff per 199 µL av bufferen for hver reaksjon). Forberede to standarder ved å blande 10 µL av standard 1 eller 10 µL av standard 2 med 190 µL. Vortex prøven og standard rør og Inkuber reaksjon for 2 min. mål konsentrasjonen (se Tabell for materiale).
- Forberede standard konsentrasjoner i 10 ganger føljetong fortynninger i en rekke 10-100 000 kopier: beregningen masse enkelt plasmider (m = (n) x (1.096x10-21 g/bp), n = plasmider størrelse, m = masse). Beregn massen av plasmider DNA for å inneholde ønskede kopien antall interesse (kopiere antall interesse x masse enkelt plasmider = masse plasmider DNA nødvendig).
- Forberedelse av prøver for kvantifisering
- Syntetisere cDNA. Bland 2 µL 7 x bufferen, 1 µL av DNase-fordøyd fra 4 og 11 µL nuclease uten vann. Inkuber i 2 minutter på 42 ° C.
- Plasser reaksjon umiddelbart på isen. Blanding 4 µL av 5 x RT Buffer, 1 µL RT (revers transkriptase) primer mix, 1 µL av RT enzym og reaksjonen av trinn 5.2.1 Oppgi. Inkuber i 15 min på 42 ° C. Inkuber i 3 minutter på 95° C å deaktivere RT enzym.
- Kvantifisere cDNA konsentrasjoner fluorometrically som beskrevet i trinn 5.1.9.
- Syntetisere cDNA. Bland 2 µL 7 x bufferen, 1 µL av DNase-fordøyd fra 4 og 11 µL nuclease uten vann. Inkuber i 2 minutter på 42 ° C.
- Måling av bakterielle belastningen
- Justere cDNA konsentrasjoner 5 ng per 12 µL reaksjon for kvantitative PCR. Bland 2 x RT PCR blanding, 0,25 µL av 100 µM frem primer, 0,25 µL av 100 µM omvendt primer (5.1.1) og 12 µL av justert cDNA. Løpe qPCR (første rødsprit: 95 ° C i 5 min, rødsprit: 95 ° C for 10 s, annealing: 60 ° C for 30 s, gjenta rødsprit og avspenning for 35 sykluser, smelter: 95 ° C, kjølig ned 4 ° C).
- Tegne inn Logg10 konsentrasjoner av plasmider standardkurve (10-100 000 eksemplarer), dvs 1-5 (x-aksen), mot de tilsvarende ct-verdiene (y-aksen). Utfør lineær regresjon for å få regresjonsligningen. Løse ligningen for x (konsentrasjon). Bruk formel for å beregne den Logg10 Kopier tallene ved å sette ct-verdien i formelen. Beregne antilogarithm for å få kopi tall.
6. fastsettelse av medfødte immunforsvaret markør genet bruker kvantitative RT PCR
- Sjekk primere for gen-spesifisitet av PCR og påfølgende agarose gel geleelektroforese for å bekrefte riktig fragment størrelsen. Utføre PCR som beskrevet i delen 5.1.5.
Ubiquitin 130 bp: frem TCAATGCAAGTAGTCCGGTTC, det omvendte CCAGTCTGCTGCTGATAAACC19 (housekeeping)
Nox-4 159 bp: frem TGGCACGGCATCAGTTATCA, omvendt ACAGCGACTGTCATGTGGAA8
Nos 76 bp: frem ATGAAGGTGCTGAAGTCACAA, omvendt GCCATTTTACAATCGCCACAA8
Gst 156 bp: frem GACAGAAGTCCTCCGGTCAG, omvendt TCCGTCTTCAAGCAAAGGCA8
ApoIII 265 bp: frem AGACTTGCACGCCATCAAGA, omvendt TGCATGCTGTTTGTCACTGC8
hemolin 267 bp: frem CTCCCTCACGGAGGACAAAC, omvendt GCCACGCACATGTATTCACC8
gallerimycin 161 bp: frem GAAGTCTACAGAATCACACGA, omvendt ATCGAAGACATTGACATCCA8
cecropin 158 bp: frem CTGTTCGTGTTCGCTTGTGT, omvendt GTAGCTGCTTCGCCTACCAC8
gloverin 101 bp: frem GTGTTGAGCCCGTATGGGAA, omvendt CCGTGCATCTGCTTGCTAAC8
moricin 124 bp: frem GCTGTACTCGCTGCACTGAT, omvendt TGGCGATCATTGCCCTCTTT8) - Vurdere primer-effektivitet skal E = 2.
- Basseng 2 µL av 5-10 forskjellige positiv prøver (dvs. eksempler som uttrykker genet som primer paret må).
- Forberede en 1:5 fortynning serie av eksempel: standard 1 (S1): ufortynnet bassenget. S2: 2 µL av S1 + 8 µL nuclease-fritt vann; S3: 2 µL av S2 + 8 µL nuclease-fritt vann; S4: 2 µL av S3 + 8 µL nuclease-fritt vann.
- Gjelde en 96-brønnen qPCR plate 1 µL av S1-S4 og en ikke-mal kontroll (nuclease-fritt vann). Legge til 5 µL RT master mix, 0.1 µL av hver 100 µM forover og bakover grunning, 3,7 µL nuclease uten vann og 0,1 µL av RT blanding per brønn.
- Kjøre kvantitative RT PCR (omvendt transkripsjon: 50 ° C i 10 min, første rødsprit: 95 ° C i 5 min, rødsprit: 95 ° C for 10 s, annealing: 60 ° C for 30 s, gjenta rødsprit og avspenning for 40 sykluser, smelter: 95 ° C, kjølig ned 4 ° C).
- Tomten logge10 av relative enheter for S1-S4 (1, 0,2, 0,04, 0.008) (x-aksen) mot tilsvarende ct-verdiene (y-aksen). Utfører lineær regresjon og bestemme skråningen av standardkurve. Beregne effektiviteten E: E = 10-(1/slope). 20
Merk: En skråning på-3.32 angir ideelle reaksjonen forhold og primer-effektivitet på E = 2.00. Dette betyr: mengden PCR produkt dobler under hver syklus.
- Bruk 100 ng av fordøyd (100 ng/µL) som en mal for RT PCR. Mix RT PCR reagenser og kjøre RT PCR som nevnt i Seksjon 6.2. Måle alle bakterier - og DPBS-administrert prøver både housekeeping primer par og målet primer par. Alltid kjøre S1-S4 fortynninger housekeeping primer par og S1-S4 med målet primer paret på samme plate for effektivitet vilje.
- Beregne forholdet (R) av RNA genuttrykk følgende formelen bruker eksperimentelt bestemt primer effektiviteten av både housekeeping og målet primer paret. Normalisere bakterier stimulert prøver å håne kontroller20.
R: forholdet
Emål: effektiviteten av S1-4 målt med målet primer par
Ehousekeeping: effektiviteten av S1-4 målt med renhold primer par
Δctmål(kontroll utvalg): Δct av (ct av DPBS-matet prøve)-(ct av bakterier-matet prøve) målt med målet primer par
Δcthousekeeping(kontroll utvalg): Δct av (ct av DPBS-matet prøve)-(ct av bakterier-matet prøve) målt med renhold primer par
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
G. mellonella hemolymph infeksjon modellen i mye brukt til å analysere virulens faktorer i et stort utvalg av patogener. De fleste målinger inkluderer analyse av Larvene dødelighet, som er en ganske enkel metode. Likevel, denne metoden ikke tillate konklusjoner om immunreaksjoner generelt og koble resultatene av G. mellonella immunreaksjoner med virveldyr immun mekanismer. G. mellonella peroral administrering modellen brukes derimot bare sjelden til muntlig infeksjon eller kolonisering av Larvene på grunn av vanskelighetene for å få eksakte infeksjon dosering9. Videre, bare lite er kjent om G. mellonella medfødte immunreaksjoner mot ikke-patogene bakterier spesielt pattedyr intestinal commensals.
I motsetning patogener, commensals utfordre immunreaksjoner vert og utløse men vert immunsystemet er kjøpedyktig vedlikeholde immun homeostase. G. mellonella er fjerne første makt-innmatede bakterielle belastningen til endelig ingen bakterier var synlig lenger (figur 2)8. 16s genet kopi tall B. vulgatus og E. coli betydelig redusert innen 24 timer.
Vi viste at commensal-administrert G. mellonella Larvene indusere RNA genuttrykk av ulike medfødt immunitet markør gener: LPS-anerkjennelse molekyler - apolipophorin (ApoIII) og hemolin (Figur 3A, B) ble vist å være generelt høyere uttrykt i E. coli-administrert Larvene sammenlignet B. vulgatus-administrert Larvene8. Videre kan markør genuttrykk av to typer antimikrobielle molekyler overvåkes. Produksjon av reaktive oksygen og nitrogen arter (ROS/RNS) kan estimeres ved måling av Nos og Nox-4 genuttrykk som ble vist å være sterkt upregulated på E. coli kraft-mating forhold til B. vulgatus (Figur 4A, B)8. Videre kunne genuttrykk av antioksidativ Gst observeres (Figur 4C). 8
I tillegg viste vi at ulike antimikrobielle peptid uttrykket ble indusert sterkere etter E. coli administrasjon enn svar på B. vulgatus kraft-mating. Vi observerte oppregulering av defensin-lignende gallerimycin peptid, LPS-samspill gloverin peptid, cecropin og moricin (figur 5A, B, C, D)8.
Figur 1 : Kraft-mating oppsett med en microsyringe pumpen. En butt-slutt nål justeres i microsyringe pumpe som tillater presis injeksjon av bakterier. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Utholdenhet av bakterielle belastningen i Galleria mellonella Larvene etter kraft-mating. Kopiere antall B. vulgatus- og E. coli-spesifikke 16s rDNA gener var bestemt fra 5 ng av cDNA på ulike tidspunkt bruker RT PCR. Datapunktene vises med indikasjon på medianen. Endret fra referanse 8. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Differensiell mønstergjenkjenning av bakterier av G. mellonella. Larvene var administreres med to forskjellige intestinal commensals RNA ble isolert etter 1-6 h og mRNA uttrykk for LPS anerkjennelse molekyl apolipophorin (ApoIII) (A) og hemolin (B) ble bestemt. Datapunkt representerer geometrisk gjennomsnitt med standard feil av gjsnitt (SEM) (p > 0,05; *, p < 0,05; **, p < 0.01; ***, p < 0,001). 8 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : ROS markør genuttrykk etter bakteriell utfordring. E. coli og B. vulgatus var makt-innmatede og ROS forsvar markør genuttrykk ble analysert over tid. NOS (A), Nox-4 (B) og Gst (C) mRNA uttrykket ble målt i isolerte larver RNA. Datapunkt representerer geometrisk gjennomsnitt med standard feil av gjsnitt (SEM) (p > 0,05; *, p < 0,05; **, p < 0.01; ***, p < 0,001). Endret fra referanse 8. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Commensal-indusert defensin-lignende antimikrobielle peptid uttrykk i G. mellonella larver og menneskelige epitelceller. Larvene var muntlig administreres med B. vulgatus eller E. coli, immunreaksjoner ble observert over tid og RNA ble isolert fra larver individer. gallerimycin (A), cecropin (B), gloverin (C), moricin (D) mRNA uttrykket ble bestemt. Datapunkt representerer geometrisk gjennomsnitt med standard feil av gjsnitt (SEM) (p > 0,05; *, p < 0,05; **, p < 0.01; ***, p < 0,001). Endret fra referanse 8. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
G. mellonella modellen er en brukte modell å vurdere bakteriell virulens faktorer i en systemisk infeksjon tilnærming21. Siden mange patogener og bakterier inn verten via muntlig kolonisering eller infeksjon rute, må ny innsikt finne evaluere G. mellonella som en modell for muntlig kolonisering og infeksjon.
Baksiden G. mellonella mellom 15-37 ° C er en stor fordel siden de fleste pattedyr modeller vedlikeholde kroppen temperaturer på 37 ° C5. G. mellonella Larvene kan kjøpes fra forskjellige leverandører, men etablering av et eget oppdrett befolkning gir mange fordeler som fravær av antibiotika som forstyrrer analyser, bedre estimering når starte eksperimenter siden leverandører ikke alltid gi larver i en klar-å-bruke fase og stressresponser unngås på grunn av transport eller temperaturendringer. På grunn av temperaturtoleranse av G. mellonella er temperaturområdet som avl kan utføres høy. Høyere temperaturer føre til raskere utvikling av larvene og i forhold til avl temperaturen, vi kan beregne livssyklus fra egg til siste skikkelsen larve. Når Larvene var valgt for eksperimenter, ble bare blek og raske enkeltpersoner valgt for å unngå stress og immunreaksjoner forstyrre eksperimenter.
For å etablere force-feeding modell, må det sikres at programmet muntlig var vellykket. Derfor var det nyttig å opprette flere studier som en sterk bromophenol fargestoff ble lagt til løsning ment for kraft-mating. Dette bidrar til å utelukke noen skadde larver og velger for Larvene som har blått fargestoff innenfor sine gut22.
Bruker denne modellen, fant vi at G. mellonella Larvene er nyttig å undersøke medfødte immunforsvaret kinetics av visse markør gener. Vi fant genuttrykk uttrykkes ikke lokalt i midttarmen og blir under etableringen av peroral administrering modellen og studiet av immunrespons kinetics. Første eksperimentelle studier for å trekke ut midttarmen RNA etter peroral administrering av commensal bakterier ikke gi konkluderende resultater. Derfor var immunreaksjoner bestemt "globalt" i hele individer. Disse funnene støtte hypotesen om global anerkjennelse via intestinal reseptorer, overføring av signalet og utløser extraintestinal genuttrykk. G. mellonella er generelt kan indusere forsterkere hovedsakelig i kroppen fett, men i hemocytes og tarm-system9. Siden det er ingen presis informasjon om vev-spesifikke produksjon av antimikrobielle molekyler i G. mellonella Larvene etter smitte, ble hele larver RNA Hentet fra komplett individer og brukes for assaying RNA genet uttrykk. Enda en fordel av hele larver RNA utvinning er fullstendig kontroll av levende bakterier i tarmen og muligheten til å kvantifisere bakterielle belastningen. Disseksjon av tarmen kan føre til tap av bakterier på grunn av forberedelser.
Siden de fleste G. mellonella forskning blir utført på bakteriell virulens trekk var vi spesielt interessert dersom og hvor larvene utløse immunreaksjoner mot ikke-patogene bakterier som er en del av pattedyr bakterieflora. Nylig viste vi at både G. mellonella og pattedyr dele lignende komponenter av medfødte immunforsvaret, som er homologe og evolusjonære bevart. Nitrat oxid syntase (Nos) og NADPH oxidase (Nox) gener dele en høy grad av likhet8. G. mellonella havner videre en defensin-lignende antimikrobielle peptid-gallerimycin som deler strukturelle likheter med pattedyr β-defensin 28.
Ved hjelp av peroral administrering modellen var det mulig å demonstrere differensial bakteriell anerkjennelse av anti-inflammatorisk symbiotiske B. vulgatus eller pro-inflammatoriske pathobiotic E. coli. I tillegg ble nedstrøms oksidativt stress svar og antimikrobielle peptid produksjon høyere indusert etter E. coli administrasjon sammenlignet B. vulgatus administrasjon8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av DFG (SPP1656), DFG trening forskningsgruppen 1708, Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) og tysk sentrum for infeksjon forskning (DZIF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030120086 | |
| 100 bp DNA ladder | Thermo Fisher Scientific | 15628019 | |
| 1-Bromo-3-Chloropropane (BCP) | Sigma-Aldrich | B9673 | |
| 2 mL tubes | Eppendorf | 0030120094 | |
| 2x Mangomix | Bioline | BIO-25033 | Colony PCR |
| 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 210 261 | |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Beeswax | Mixed-Store.de | - | |
| Brain heart infusion broth | Thermo Fisher Scientific | CM1135 | |
| CloneJET PCR Cloning Kit | Thermo Fisher Scientific | K1232 | Cloning vector for 16S fragments |
| Corn grits | Ostermühle Naturkost GmbH | 306 | Organic cultivation |
| Difco LB Agar, Miller (Luria-Bertani) | Becton Dickinson | BD | |
| Difoco LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Becton Dickinson | 244610 | |
| DNA-free DNA Removal Kit | Thermo Fisher Scientific | 244510 | Dnase digestion |
| Dried yeast | Rapunzel | - | Organic cultivation |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14040 | |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | W252506 | |
| Honey | Ostermühle Naturkost GmbH | 487 | |
| Isopropanol | VWR | 20842.330 | |
| Lightcycler 480 Instrument II | Roche Molecular Systems | 5015278001 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche Molecular Systems | 4729692001 | |
| Manual Microsyringe Pump with Digital Display | World Precision Instruments | DMP | |
| Micro-Fine+ U-100 insulin syringe 0.3 x 8 mm | Becton Dickinson | 324826 | Oral administration |
| Mortar, unglazed | VWR | 410-9327 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | 13-400-518 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | 10977035 | |
| Oxoid AnaeroGen sachets | Thermo Fisher Scientific | AN0025A | Quality and quantity of RNA |
| PCR stripes | Biozym | 710970 | |
| Pestle, unglazed grinding surface | VWR | 410-9324 | |
| Phusion proof-reading enzyme | Thermo Fisher Scientific | F553S | |
| Primers | Biomers | - | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1222 | |
| QuantiFast SYBR Green PCR kit | Qiagen | 204056 | qPCR for bacterial copy number measurment |
| QuantiFast SYBR Green RT-PCR Kit | Qiagen | 204156 | qRT-PCR for gene expression measurements |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205311 | cDNA synthesis |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit dsHS DNA kit | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | Quantification of plasmid and cDNA samples |
| Qubit fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33226 | Quantification of plasmid and cDNA samples |
| RNase-ExitusPlus | AppliChem | A7153 | |
| Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 | |
| Skimmed milk powder | Sucofin | - | |
| SYBR safe DNA Gel Stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | |
| TRI reagent | Sigma-Aldrich | T9424 | |
| Weighing boat | VWR | 10803-148 | |
| Wheat meal | Ostermühle Naturkost GmbH | 6462 | Organic cultivation |
References
- Nell, S., Suerbaum, S., Josenhans, C. The impact of the microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nature Reviews Microbiology. 8 (8), 564-577 (2010).
- Muniz, L. R., Knosp, C., Yeretssian, G. Intestinal antimicrobial peptides during homeostasis, infection, and disease. Frontiers in Immunology. 3, 310 (2012).
- Ivanov, I. I., Honda, K. Intestinal commensal microbes as immune modulators. Cell Host Microbe. 12 (4), 496-508 (2012).
- Ayres, J. S. Inflammasome-microbiota interplay in host physiologies. Cell Host Microbe. 14 (5), 491-497 (2013).
- Champion, O. L., Titball, R. W., Bates, S. Standardization of G. mellonella Larvae to Provide Reliable and Reproducible Results in the Study of Fungal Pathogens. Journal of Fungi (Basel). 4 (3), (2018).
- Wojda, I. Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella. Insect Science. , (2016).
- Buchmann, K. Evolution of Innate Immunity: Clues from Invertebrates via Fish to Mammals. Frontiers in Immunology. 5, 459 (2014).
- Lange, A., et al. Galleria mellonella: A Novel Invertebrate Model to Distinguish Intestinal Symbionts From Pathobionts. Frontiers in Immunology. 9 (2114), (2018).
- Tsai, C. J., Loh, J. M., Proft, T. Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing. Virulence. , 1-16 (2016).
- Bolouri Moghaddam, M. R., et al. The potential of the Galleria mellonella innate immune system is maximized by the co-presentation of diverse antimicrobial peptides. Biological Chemistry. 397 (9), 939-945 (2016).
- Casanova-Torres, A. M., Goodrich-Blair, H. Immune Signaling and Antimicrobial Peptide Expression in Lepidoptera. Insects. 4 (3), 320-338 (2013).
- Mukherjee, K., et al. Galleria mellonella as a model system for studying Listeria pathogenesis. Applied and Environmental Microbiology. 76 (1), 310-317 (2010).
- Brennan, M., Thomas, D. Y., Whiteway, M., Kavanagh, K. Correlation between virulence of Candida albicans mutants in mice and Galleria mellonella larvae. FEMS Immunological and Medical Microbiology. 34 (2), 153-157 (2002).
- Miyata, S., Casey, M., Frank, D. W., Ausubel, F. M., Drenkard, E. Use of the Galleria mellonella caterpillar as a model host to study the role of the type III secretion system in Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infection and Immunity. 71 (5), 2404-2413 (2003).
- Waidmann, M., et al. Bacteroides vulgatus protects against Escherichia coli-induced colitis in gnotobiotic interleukin-2-deficient mice. Gastroenterology. 125 (1), 162-177 (2003).
- Lange, A., et al. Extensive Mobilome-Driven Genome Diversification in Mouse Gut-Associated Bacteroides vulgatus mpk. Genome Biology and Evolution. 8 (4), 1197-1207 (2016).
- Hermann-Bank, M. L., Skovgaard, K., Stockmarr, A., Larsen, N., Molbak, L. The Gut Microbiotassay: a high-throughput qPCR approach combinable with next generation sequencing to study gut microbial diversity. BMC Genomics. 14, 788 (2013).
- Sato, K., et al. OmpA variants affecting the adherence of ulcerative colitis-derived Bacteroides vulgatus. Journal of Medical and Dental Science. 57 (1), 55-64 (2010).
- Freitak, D., et al. The maternal transfer of bacteria can mediate trans-generational immune priming in insects. Virulence. 5 (4), 547-554 (2014).
- Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Research. 29 (9), 45 (2001).
- Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).
- Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).
