Summary
ऑस्टियोसार्कोमा (ओएस) के लिए हड्डी extracellular मैट्रिक्स (BEM) मॉडल अच्छी तरह से स्थापित है और यहां दिखाया गया है । यह विट्रो में प्राथमिक ट्यूमर के विकास की नकल उतार के लिए एक उपयुक्त पाड़ के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है और ऊतकीय और cytogenic ओएस के विविधता के अध्ययन के लिए एक आदर्श मॉडल प्रदान करते हैं ।
Abstract
ऑटिसार्कोमा (ओएस) सबसे आम और एक अत्यधिक आक्रामक प्राथमिक अस्थि ट्यूमर है । यह नैदानिक या शकुन कठिनाइयों के साथ साथ अपरमाणुक और हिग्लॉजिक विविधताओं के साथ विशेषता है । ओएस जीनोआम और phenotypically विषम कैंसर कोशिकाओं शामिल हैं । हड्डी microenvironment तत्वों ट्यूमर विविधता और रोग प्रगति के लिए खाते में साबित कर रहे हैं । अस्थि कोशिकाबाह्य मैट्रिक्स (BEM) में माइक्रोस्ट्रक्चरल मैट्रिक्स और जैव रासायनिक घटकों का मूल कोशिकाकोशिकीय आव्यूह रहता है । इस ऊतक विशिष्ट आला ओएस सेल बोने और प्रसार के लिए एक अनुकूल और दीर्घकालिक पाड़ प्रदान करता है । यह लेख BEM मॉडल और इसके आगे प्रयोगात्मक आवेदन की तैयारी के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करता है । ओएस कोशिकाओं को विकसित करने और ओएस नैदानिक नमूनों की histopathological जटिलता के अनुरूप कई phenotypes में अंतर कर सकते हैं. मॉडल भी विविध morphologies के दृश्य और आनुवंशिक परिवर्तन और अंतर्निहित नियामक तंत्र के साथ उनके सहयोग की अनुमति देता है । मानव ओएस के लिए समजात के रूप में, इस BEM-ओएस मॉडल विकसित किया जा सकता है और ओएस के पैथोलॉजी और नैदानिक अनुसंधान के लिए लागू.
Introduction
ऑस्टियोसार्कोमा (ओएस) आमतौर पर सक्रिय रूप से बढ़ते क्षेत्रों में होता है, लंबे समय तक हड्डियों की metaphysis, किशोरावस्था के दौरान. ओएस के ८०% से अधिक प्रभावित साइटों समीपस् तिबिया और समीपस् थ प्रगंडिका के metaphysis के रूप में के रूप में अच्छी तरह से दोनों बाहर और समीपवर्ती femur, विकास प्लेट1के स्थान के लिए इसी के लिए वरीयता है । ओएस मध्योतक गुण और histologic सुविधाओं और ग्रेड में काफी विविधता के साथ कई सेल उपप्रकार शामिल हैं । असल्याचे समर्थन मध्योतक स्टेम सेल (mscs), osteoblasts प्रतिबद्ध पूर्ववर्ती और pericytes मूल2,3,4,5की कोशिकाओं के रूप में । इन कोशिकाओं आनुवंशिक या पश् चजात परिवर्तन जमा कर सकते है और कुछ हड्डी microपर्यावरणिक संकेतों के प्रभाव में ओएस को जंम दे । जीनोमिक अस्थिरता और ओएस की विषमजनन में दोनों आंतरिक और बाह्य तंत्र परिणाम, कई रूपात्मक और नैदानिक phenotypes के साथ6,7. Individualized चिकित्सा या नई दवाओं की स्क्रीनिंग के लिए, उपन्यास मॉडल विविधता या अन्य नैदानिक विकारों के खिलाफ करने के लिए उत्पन्न करने की जरूरत है ।
ओएस एक अंतर-अस्थिमय घातक ठोस ट्यूमर है । जटिलता और आसपास के microenvironment तत्वों की गतिविधि एक ट्यूमर के विभिंन स्थानों में ओएस कोशिकाओं पर लक्षणप्ररूपी और कार्यात्मक मतभेद प्रदान । अस्थि कोशिकाबाह्य मैट्रिक्स (BEM) खनिज जमाव और अस्थि remodeling के लिए एक संरचनात्मक और जैव रासायनिक पाड़ प्रदान करता है । Extracellular मैट्रिक्स (ECM) के कार्बनिक भाग मुख्य रूप से प्रकार मैं कोलेजन के होते है अस्थिब्लास्टी वंश कोशिकाओं द्वारा स्रावित, जबकि अपने mineralized भाग कैल्शियम फॉस्फेट से बना है hydroxyapatite8के रूप में । ECM नेटवर्क की गतिशील भूमिका के लिए सेल आसंजन, भेदभाव, क्रॉस टॉक और ऊतक समारोह रखरखाव9विनियमित है ।
विखनिजीकृत BEM और ECM hydrogels सफलतापूर्वक सेल संस्कृति में इस्तेमाल किया गया है और सेल प्रसार10,11में वृद्धि कर सकते हैं । संश्लेषित अस्थि की तरह ecm पूल आकार, भाग्य निर्णय और mscs12,13,14की वंश प्रगति को विनियमित कर सकते हैं । इसके अलावा, परिणाम सबूत अपने नैदानिक महत्व अस्थि गठन और उत्थान के दौरान सेलुलर प्रक्रियाओं उत्तेजक द्वारा osteogenic गतिविधि प्रदान करने के लिए15,16,17.
इस अनुच्छेद में, हमारे समूह के तीन आयामी दीर्घकालिक संस्कृति के लिए एक संशोधित मॉडल और अनुकूल विकल्प स्थापित करता है । ओएस कोशिकाओं ऊतक में इंजेक्ट व्युत्पंन bem एक heterogeneously मध्योतक phenotype आसानी से प्लास्टिक की तुलना में दो आयामी संस्कृतियों वर्तमान । साइट से प्राप्त BEM-विशिष्ट समजातीय ऊतक विट्रो में ओएस कोशिकाओं के लिए एक देशी आला होने के रूप में अपनी नाटकीय लाभ दिखाने के लिए और ओएस सैद्धांतिक और नैदानिक अनुसंधान में महान क्षमता है । इस विशेषता BEM मंच सरल लेकिन विट्रो अनुसंधान के लिए कुशल है और कई कैंसर मॉडलिंग में बढ़ाया जा सकता है ।
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Protocol
पशु देखभाल और उपयोग की देखभाल और प्रयोगशाला जानवरों के उपयोग के लिए स्वास्थ्य गाइड के राष्ट्रीय संस्थानों के अनुसार आयोजित कर रहे हैं (NIH प्रकाशन NO. 80-23, १९९६ में संशोधित) सूर्य यात्रा-सेन विश्वविद्यालय की पशु नैतिकता समिति से अनुमोदन के बाद.
1. अस्थि तैयारी
- 4 से 6 सप्ताह पुराने BALB/c चूहों (सेक्स विशिष्ट आवश्यकता के बिना) प्राप्त करें । गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा एक चूहे का काटना और बाँझ सर्जिकल कैंची के साथ एक हिंदलिंब से ताजा फिबुला, टिबिया और फीमूर काट । उपकला ऊतक छील और फिर संभव के रूप में कैंची और चिमटी का उपयोग कर के रूप में नरम ऊतक के ज्यादा निकालें ।
- एक 6 सेमी डिश में रक्त को हटाने के लिए दो बार बाँझ 10 मिमी फॉस्फेट buffered खारा (PBS) के साथ पैर की हड्डियों कुल्ला । 3 मिनट के लिए ७५% इथेनॉल में हड्डियों विसर्जित, तो दो बार PBS के साथ कुल्ला । स्वच्छ हड्डियों एक बाँझ ५० मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में बाँझ PBS के साथ-८० डिग्री सेल्सियस पर महीनों के लिए आवश्यक जब तक संग्रहित किया जा सकता है ।
नोट: निम्नलिखित सभी चरणों में प्रयुक्त पीबीएस 10 मिमी पीओ43 −है ।
2. अस्थि विखनिजीकरण और डिसेल्युलेराइजेशन
- कमरे के तापमान पर जमे हुए हड्डियों गल, और फिर 1 एच के लिए-८० डिग्री सेल्सियस पर फिर से फ्रीज-सेल lysis और ऊतक टूटने के लिए अधिक से अधिक 2-3 फ्रीज गल चक्र करने के लिए हड्डियों के विषय ।
- हड्डियों को पूर्ण और यहां तक कि कवरेज सुनिश्चित करने के लिए एक कमाल के मंच या कक्षीय शेखर के साथ एक रॉकिंग प्लेटफॉर्म या ऑर्बिटल शेकर पर रात में कमरे के तापमान पर रातोंरात ०.५ एन एचसीएल के साथ एक बाँझ ५० मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में हड्डियां सेते हैं ।
नोट: सुनिश्चित करें कि हड्डियों पूरी तरह से एसिड में गति के दौरान डूबे हुए हैं और प्रक्रिया के दौरान व्यवस्थित नहीं है । एचसीएल सॉल्यूशन की मात्रा हड्डियों के रूप में दस गुना से अधिक होनी चाहिए । - डिजलसिफिकेशन के बाद, एचसीएल सॉल्यूशन को पूरी तरह से और 1 एच के लिए रनिंग वॉटर के नीचे कुल्ला करें । फिर, हड्डियों को धोने के लिए 15 मिनट के लिए दो बार एक घोड़ा मंच या कक्षीय शेखर पर आसुत पानी से धो लें ।
नोट: पूरी तरह से समाधान या washes के बीच पानी और आसुत पानी के साथ अंतिम धोने के बाद हटाने के लिए सुनिश्चित करें । - एक ५० मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में एक 1:1 मिथेनॉल और क्लोरोफॉर्म के मिश्रण के साथ demineralized हड्डियों में लिपिड निकालने के कमरे के तापमान10पर 1 एच के लिए टिन पन्नी के साथ लिपटे ।
- फिर, 30 मिनट के लिए टिन पन्नी के साथ लिपटे मेथनॉल के एक और ट्यूब में हड्डियों को हस्तांतरण. मेथनॉल पूरी तरह से निकालें और आसुत पानी के साथ दो बार 15 मिनट के लिए धीरे मिलाते हुए के साथ कुल्ला । Decant अंतिम पानी धोने और बाँझ हालत के तहत निम्न चरणों के साथ आगे बढ़ना.
नोट: निष्कर्षण चरण के दौरान, क्लोरोफॉर्म अपघटन को रोकने के लिए प्रकाश से बचना चाहिए । मिश्रण प्रकाश प्रतिरोधी कंटेनर या टिन पन्नी के साथ लिपटे एक सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में संग्रहीत किया जा सकता है । सभी उपचार और धो कदम मामूली रोटेशन या कमाल गति के तहत प्रदर्शन करते हैं । - 3 मिनट के लिए बाँझ PBS के साथ एक 6 सेमी डिश में हड्डियों कुल्ला, और फिर एक नया ५० मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में हड्डियों हस्तांतरण । जोड़ें ४० मिलीलीटर ०.०५% trypsin-EDTA (ते) में ट्यूब और 23 एच के लिए एक सह2 इनकबेटर में ३७ डिग्री सेल्सियस18में सेते हड्डियों ।
- ते समाधान छोड़ें और दो बार बाँझ pbs के साथ कुल्ला ९० μg/ml एम्पीसिलीन और ९० μg/मिलीलीटर kanamycin के साथ पूरक । अंतिम धो pbs पूरी तरह decanting के बाद, ४० मिलीलीटर बाँझ pbs के साथ भरपाई । कोमल कमाल के साथ कमरे के तापमान पर 24 ज के लिए अच्छी तरह से धोने या एंटीबायोटिक भिगोने के लिए मिलाते हुए ।
नोट: सभी बाँझ PBS में उपयोग किया जाता है और निम्न चरणों में ९० μg/मिलीलीटर एम्पीसिलीन और ९० μg/मिलीलीटर kanamycin शामिल हैं । रात भर धोने रोटेशन या कमाल की गति के तहत लंबे समय के लिए एंटीबायोटिक्स के साथ पूरी तरह से विसर्जन के लिए किया जाता है ताकना रिक्त स्थान की नसबंदी को प्राप्त करने । - PBS निकालें और हड्डियों को बाँझ PBS से भरा एक ताजा ५० मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित । तैयार demineralized और demineralized हड्डियों अस्थि extracellular मैट्रिक्स (BEM) कहा जाता है और आवश्यकता होने तक 2 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है ।
3. सेल सीडिंग और कल्चर
- 4 ° c रेफ्रिजरेटर से BEM बाहर ले लो और 30 एस के लिए ७५% इथेनॉल में विसर्जित कर दिया, तो PBS के साथ दो बार कुल्ला । एक साफ 6-अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट पर BEM स्थानांतरण । 2 मिलीलीटर पूरा संस्कृति मध्यम जोड़ें (Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम/F12 (DF12) जिसमें 5% भ्रूण गोजातीय सीरम, ९० μg/एमएल एम्पीसिलीन और ९० μg/एमएल kanamycin) शामिल हैं । ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक सह2 इनक्यूबेटर में रात भर बेम सेते ।
- मानव ओएस सेल लाइनों (MNNG/होस और एमजी-६३) प्राप्त करें । निलंबित लगभग १.० x 105 ओएस कोशिकाओं के साथ १०० ΜL pbs सूचक के रूप में phenol लाल युक्त.
नोट: बेहतर ट्रैक और तीन आयामी BEM मॉडल के भीतर बहु-परत कोशिकाओं का पालन करने के लिए, MNNG/होस और एमजी-६३, फ्लोरोसेंट mCherry और ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) को व्यक्त करने वाले लेंटीवायरल वेक्टर से संक्रमित हैं । - बीआईएम पूरी तरह से मध्यम में भिगोने के बाद, सुई बीआईएम की मज्जा गुहा तक पहुँच जाता है जब समीपस् थ या बाहर एपिफाइसिस से BEM में ओएस कोशिकाओं सुई । इंजेक्शन कोशिकाओं को दृढ़ता से BEM का पालन सुनिश्चित करने के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक humidified 5% सह2 वातावरण में न्यूनतम 2 एच के लिए ओएस-bem मॉडल सेते ।
नोट: पूर्व सभी सेल संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया मीडिया गर्म । सेल संस्कृति के लिए प्रयुक्त इनकूबेटर में ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5% सह2 वायुमंडल है । - थाली में 1 मिलीलीटर पूरी संस्कृति मध्यम जोड़ें पूरी तरह से कोट BEM संस्कृति की सतह एक सह2 इनक्यूबेटर में रातोंरात ३७ डिग्री सेल्सियस पर ।
- धीरे एक बाँझ नोचना के साथ 6-well थाली के एक नए अच्छी तरह से ओएस-bem मॉडल हस्तांतरण और 1 मिलीलीटर ताजा संस्कृति मध्यम पुनः फ़ीड । संस्कृति एक सह में 14 दिनों के लिए मॉडल ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन और ओएस कोशिकाओं के प्रसार की स्थिति के अनुसार संस्कृति मध्यम ताज़ा ।
- संस्कृति प्रक्रिया के दौरान उल्टे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत मध्यम रंग और कोशिका स्थिति की निगरानी रखें । जब ओएस की कोशिकाओं को विस्तार करने के लिए थाली, धीरे से एक और नए अच्छी तरह से बाँझ tweezer के साथ ओएस BEM मॉडल हस्तांतरण ।
नोट: संस्कृति मध्यम पीएच ७.४, जो सबसे स्तनधारी कोशिका संस्कृति के लिए इष्टतम पीएच मूल्य है पर उज्ज्वल लाल है । मध्यम नारंगी या पीले रंग में बदल जाता है, तो तुरंत ओएस कोशिकाओं के लिए एक स्वस्थ वातावरण को बनाए रखने के माध्यम को ताज़ा । - एक नई चिमटी के साथ अच्छी तरह से में ओएस BEM मॉडल स्थानांतरण और धीरे PBS के साथ कुल्ला संस्कृति माध्यम को दूर करने के लिए । फिर, एक 15 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरण और ऊतकीय पहचान के लिए 10% buffered फार्मेलिन के साथ तय ।
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Representative Results
विखनिजीकरण और विखनिजीकरण के बाद, bem को मजबूत लचीलापन और देशी माउस की हड्डी की तुलना में दृढ़ता के साथ पारभासी प्रतीत होता है । थोड़ा मांसपेशी अवशेषों और मज्जा गुहा के स्थान स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है (चित्रा 1ए, बी) । BEM के प्रभावी decellularization निर्धारित करने के लिए, BEM निर्धारण के बाद पैराफिन में एम्बेडेड है, और फिर hematoxylin-eosin (एच & ई) धुंधला करने के लिए 3-5 μm वर्गों में कटा हुआ. सेल नाभिक को पूरी तरह से हटाने उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग द्वारा दिखाया गया है । प्राकृतिक झरवाला संरचना और कोलेजन नेटवर्क व्यवस्था अच्छी तरह से decellularized BEM में बनाए रखा है (चित्रा 1सी, डी) । इसके अतिरिक्त, immunohistochemical (IHC) हड्डी मैट्रिक्स के प्रमुख कार्बनिक घटकों के धुंधला करना, जैसे कोलेजन मैं और कोलेजन चतुर्थ decellularized बेम में ECM घटकों पर कोई नुकसान नहीं के रूप में प्रदर्शित देशी हड्डी (चित्रा 1ई) की तुलना में । इसलिए, BEM ओएस सेल बोने और प्रसार के लिए महान biocompatibility के साथ एक उपयुक्त और होनहार पाड़ प्रदान करता है ।
MNNG/HOS कोशिकाओं पतले vacuolated कोशिका द्रव्य के साथ एक उच्च atypical आकृति विज्ञान प्रदर्शन, जबकि एमजी-६३ कोशिकाओं monolayer संस्कृति में फाइब्रोब्लास्ट की तरह धुरी आकार (चित्रा 2ए, बी) है । एक ओएस रोगी से ऊतकीय अनुभाग गोल या बहुभुज कोशिकाओं, एनिसोन्यूक्लिओसिस और कई mitoses (चित्रा 2सी) के साथ महत्वपूर्ण सेलुलर बहुरूपता प्रदर्शित करता है । BEM मॉडल की व्यवहार्यता और गुणवत्ता की पुष्टि करने के लिए, दोनों सेल लाइनों BEM के मज्जा गुहा में इंजेक्ट कर रहे है और 14 दिन की संस्कृति के दौरान प्रतिदीप्ति इमेजिंग के माध्यम से निगरानी (चित्रा 3ए, बी) । एच & ई धुंधला करना के साथ Histological वर्गों पता चलता है कि ओएस कोशिकाओं मांसपेशी अवशेषों को देते है और मोटी बवासीर में बढ़ने या हड्डी मैट्रिक्स के साथ पालन और proliferate । दोनों periosteum और endosteum ओएस कोशिकाओं के विस्तार से घुसपैठ कर रहे हैं । Strikingly, ओएस-BEM मॉडल के सेल विकास पैटर्न दो आयामी थाली संस्कृति से अलग है । के रूप में चित्रा 3सीमें सचित्र, decellularized bem पर ओएस कोशिकाओं उच्च विषम एक ओएस अनुभाग के cytopathologic विशेषताओं के समान आकारिकी दिखाओ । कुछ कोशिकाओं को रद्द अस्थि में पता लगाने और मज्जा गुहा गोलाकार और आंशिक रूप से बाहर फैल रहे हैं, जबकि periosteum और endosteum के साथ आराम कर रहे कोशिकाओं बहुत बाहर परमाणु pleomorphism के साथ लंबी कोशिकाओं में फैले हुए हैं । सेल गतिविधि Ki67 immunostaining, जो भी दीर्घकालिक संस्कृतियों में महान लाभ से पता चलता है का उपयोग कर निर्धारित किया जाता है । इसके अलावा, bem संस्कृति में ओएस कोशिकाओं उच्च एक्सप्रेस अस्थि मैट्रिक्स ग्लाइकोप्रोटीन-स्रावित प्रोटीन अंलीय और सिस्टीन में अमीर (sparc/osteonectin)-जो osteoid मैट्रिक्स के लिए विशिष्ट है (चित्रा 3डी) ।
चित्रा 1 : माउस decellularized BEM के संरचनात्मक विशेषताओं । (क, ख) माउस का अवलोकन देशी (A) और decellularized (B) अस्थि । (ग, घ) डीसेल्युलेराइजेशन एच & ई माउस देशी टिबिया (सी) और decellularization हड्डी (डी) के धुंधला द्वारा मूल्यांकन किया गया । Hematoxylin के साथ दाग नाभिक देशी माउस टिबिया में मनाया जा सकता है, लेकिन BEM में नहीं. (ङ) डीसेल्युलेराइजेशन के बाद माउस टिबिया में संरक्षित ईएसएम के मुख्य घटकों का पता लगाने के लिए कोलेजन I और कोलेजन IV के लिए आईएचसी धुंधला होना । पीले तीर बताते है प्रचुर मात्रा में कोलेजन के भीतर मैं बाहर की हड्डी और नीले तीर अंक कॉंपैक्ट हड्डी के भीतर प्रचुर मात्रा में कोलेजन चतुर्थ । स्केल पट्टियां = ५० μm । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2 : ओएस के cyके मोलोफोलॉजिकल विशेषताओं । (क, ख) ह्यूमन ओएस सेल लाइंस MNNG/होस (A) और MG-६३ (B) प्लास्टिक फ्लास्क कल्चर में विस्तार । स्केल बार = १०० μm । (ग) एच & ई के साथ हिस्टोपैथोलॉजिक सेक्शन, ओएस रोगी का धुंधला होना । स्केल बार = ५० μm । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3 : Decellularized हड्डी में ओएस कोशिकाओं के लक्षण वर्णन कोशिकाबाह् य मैट्रिक्स मॉडल । (क, ख) प्रतिनिधि mcherry अभिव्यक्ति (लाल) एमएनजी की छवि/(क) और जीएफपी अभिव्यक्ति (हरा) एमजी की छवि-६३ (ख) प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा बीआईएम में सीडिंग और संवर्धन के बाद । स्केल बार = १०० μm । (ग) बीआईएम में संवर्धन के बाद एमएनजी/एनओएस और एमजी-६३ कक्षों की विशिष्ट आकारिकी को दर्शाने वाला एच & ई विश्लेषण । (घ) 14 दिनों के लिए बीआईएम मॉडल में संवर्धन के बाद एमएनजी/हॉस प्रकोष्ठों के KI67 और sparc अभिव्यक्ति स्तर पर आईएचसी विश्लेषण । प्रतिनिधि छवियों धारावाहिक Ki67 और SPARC के साथ दाग वर्गों के दो सेट कर रहे हैं । स्केल बार = ५० μm । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
आम तौर पर, ओएस ओटिओब्लास्टी, chondroblastic, और फाइब्रोब्लास्टी उपप्रकारों के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है इसके प्रमुख histologic घटक पर निर्भर करता है । इसका पूर्वानुमान न केवल हिलॉजिक मापदंडों पर निर्भर है बल्कि इसकी अपरमाणुक साइट पर भी है । यह हड्डियों के अंदर हो सकता है (intramlary या intramedullary डिब्बे में), हड्डियों की सतहों पर, और असाधारण साइटों में19। उद्भव और ओएस की विषमजनन अर्बुदीय घटनाओं और एक पर्याप्त microर्पावारणीा बढ़ावा देने के एक संयुग्मन के रूप में आविर्भाव किया जा सकता है, बढ़ती विकास और सुदूर अंगों को पलायन के बाद20,21,22 ,23. रहस्य ओएस विकास के दौरान एक उचित मॉडल के लिए नैदानिक ओएस पर्यावरण और आला लक्ष्यीकरण निहितार्थ रूपरेखा के साथ deciphered हो सकता है ।
या तो प्लास्टिक के व्यंजन पर या विट्रो में बोतल में खेती शायद ही गतिशील और जटिल जैविक microenvironment पुनर्पूंजीकरण कर सकते हैं । विभिंन पूर्व नैदानिक मॉडलों की महान प्रगति (जैसे, माउस, zebrafish और कुत्ता) ऑस्टासार्कोमा की नकल उतार घोषित किया गया है और रोगजनन जांच और नशीली दवाओं के विकास के लिए लागू4,24,25, 26 , 27 , 28. फिर भी, शोधकर्ताओं ने प्रयोगों के दौरान उनकी परेशानी और पीड़ा के कारण प्रायोगिक पशुओं के लिए चिंता का विषय है. इन विट्रो तीन आयामी मॉडल की तरह हमारे decellularized बेम मॉडल अपनी सुविधा, त्वरित संचालन और लागत की बचत के कारण लाभ है; यह व्यवहार्य कोशिकाओं या ऊतकों के दीर्घकालिक और आसान रखरखाव प्रदान करता है, और प्लास्टिक की संस्कृति से भी देशी जैविक स्थिति के करीब है । यह हमारे अनुसंधान में प्रयोग किया गया है लक्षणप्ररूपी विषमजनन और ओएस के नियामक तंत्र सफलता29के साथ विभेनीकरण का प्रदर्शन ।
इस प्रोटोकॉल ने व्यवहार्यता को स्पष्ट किया कि एक ऊतक से प्राप्त BEM माउस से उत्पंन और मानव, चूहे और कुत्ते से ऊतकों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । सफल स्थापना और BEM के आवेदन के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं: (i) सेल मलबे को पूरी तरह से हटाना; (ii) बाँझ, स्वस्थ संस्कृति की स्थिति का अनुरक्षण; (iii) ओएस-बीआईएम मॉडल के इंजेक्शन, अंतरण और संस्कृति के दौरान मैनुअल निपुणता और कोमल पाइपलाइन ।
अंय रिपोर्ट प्रोटोकॉल आम तौर पर दबाव या रासायनिक और एंजाइमी उपचार का एक संयोजन, जैसे triton एक्स-१००, सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) और dnase के रूप में रोजगार के लिए/ . कार्टिलेज ऊतक है कि डिटर्जेंट के साथ decellularization से गुजरती है glycosaminoglycans३२सहित ecm घटकों को दूर दिखाया गया है । को सबसे बड़ी हद तक एक और अधिक बरकरार BEM पुनर्पूंजीकरण, एक उदारवादी अभी तक शक्तिशाली decellularization विधि यहां किया जाता है के विघटन और प्रमुख घटकों और अस्थि पर्यावरण के मूल वास्तुकला के नुकसान से बचने के लिए ।
तथापि, यह उपेक्षित नहीं है कि इस ओएस-BEM मॉडल एक थाली में मध्यम बह बिना विश्राम किया, फलस्वरूप ऑक्सीजन और पोषक तत्वों का असमान वितरण करने के लिए अग्रणी । संवहनी नेटवर्क और अंय सेल उपप्रकार है कि संचार और microर्पावारणीा संकेतों और अस्थि homeostasis की बातचीत को विनियमित करने में मदद करने के लिए ध्यान में रखा जाना चाहिए24, ३३,३४, ३५. उंमीद है, इस मॉडल अंय उच्च तकनीक इंजीनियरिंग तकनीकों के साथ संयुक्त करने के लिए ओएस अनुसंधान और गाइड परिशुद्धता चिकित्सा पर प्रकाश डाला जाएगा ।
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Disclosures
लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है ।
Acknowledgments
लेखकों को उसकी प्रशासनिक सहायता और लंबे Zhao के लिए अपने उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए Liuying चेन का समर्थन मूल्य अस्थि extracellular मैट्रिक्स मचानों के निर्माण के दौरान । इस अध्ययन को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (३१८७१४१३) से अनुदान द्वारा समर्थित है ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL centrifuge tube | Greiner | 188271 | |
| 50 mL centrifuge tube | Greiner | 227270 | |
| 6 cm cell culture dish | Greiner | 628160 | |
| 6-well plate | Greiner | 657160 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393 | |
| C57-BL/6J mouse | Sun Yat-sen University Laboratory Animal Center | ||
| CO2 incubator | SHEL LAB | SCO5A | |
| Dibasic sodium phosphate | Guangzhou Chemical Reagent Factory | BE14-GR-500G | |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D0547 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30084.03 | |
| Hemocytometer | BLAU | 717805 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | PHR1487 | |
| MG-63 | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Human osteosarcoma cell line | |
| MNNG/HOS | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Human osteosarcoma cell line | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P4633 | A solution of phenol red is used as a pH indicator: its color exhibits a gradual transition from yellow to red over the pH range 6.6 to 8.0. |
| Potassium chloride | Sangon Biotech | A100395 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sangon Biotech | A501211 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A501218 |
References
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