Summary
O modelo de matriz extracelular (BEM) de osso de osteossarcoma (OS) é bem estabelecida e mostrado aqui. Ele pode ser usado como um andaime apropriado para simulando tumor primário crescimento em vitro e fornecendo um modelo ideal para o estudo da heterogeneidade de mutagénese e histológica do sistema operacional.
Abstract
Osteossarcoma (OS) é o mais comum e um tumor ósseo primário altamente agressivo. É caracterizado com variações anatômicas e histológicas, juntamente com as dificuldades de diagnósticos ou prognósticos. Sistema operacional é composto por células cancerosas Leishmania e fenotipicamente heterogêneas. Elementos do microambiente ósseo são provou conta para progressão de doença e heterogeneidade do tumor. Matriz extracelular óssea (BEM) retém a matrizes microestrutural e componentes bioquímicos do nativo da matriz extracelular. Este nicho de tecido-específica fornece um andaime favorável e a longo prazo para proliferação e célula OS semeadura. Este artigo fornece um protocolo para a preparação da modelo BEM e sua aplicação mais experimental. OS células podem crescer e se diferenciar em múltiplos fenótipos consistentes com a complexidade histopatológica das amostras clínicas OS. O modelo também permite a visualização de diversas morfologias e sua associação com alterações genéticas e mecanismos reguladores subjacentes. Como homólogo para OS humanos, este modelo BEM-OS pode ser desenvolvido e aplicado para a patologia e pesquisa clínica do sistema operacional.
Introduction
Osteossarcoma (OS) geralmente ocorre em áreas, a metáfise de ossos longos, um crescimento activo durante a adolescência. Mais de 80% dos sites OS afetados têm preferência para a metáfise da tíbia proximal proximal do úmero e fêmur distal e proximal, correspondente à posição do crescimento placa1. OS compreende vários subtipos de células com propriedades mesenquimais e considerável diversidade nas características histológicas e grau. Evidências suportam as células-tronco mesenquimais (MSCs), cometido precursores de osteoblastos e pericitos como as células de origem2,3,4,5. Estas células podem acumular alterações epigenéticas ou genéticas e dar origem a OS sob a influência de certos sinais microenvironmental de osso. Mecanismos intrínsecos e extrínsecos resultam na instabilidade genômica e heterogeneidade do sistema operacional, com vários fenótipos clínicos e morfológicos6,7. Para terapias individualizadas ou triagem de novas drogas, novos modelos precisam ser gerado para contra heterogeneidade ou outras desordens clínicas.
Sistema operacional é um tumor sólido maligno intra ósseo. A complexidade e a atividade ao redor de elementos do microambiente conferem diferenças fenotípicas e funcionais sobre células do sistema operacional em diferentes locais de um tumor. A matriz extracelular óssea (BEM) fornece um andaime estrutural e bioquímico para deposição mineral e remodelação óssea. A parte orgânica da matriz extracelular (ECM) consiste principalmente de tipo eu colágeno secretado pelas células da linhagem osteoblástica, enquanto sua porção mineralizada é composta de fosfato de cálcio sob a forma de hidroxiapatita8. O papel dinâmico das redes de ECM é regular a adesão celular, diferenciação, cross-talk e tecido função manutenção9.
Desmineralizada BEM e ECM hidrogel tem sido utilizado com sucesso na cultura de pilha e pode aumentar a proliferação de célula10,11. Sintetizado como osso ECM pode regular o tamanho do pool, decisões de destino e progressão da linhagem do MSCs12,13,14. Além disso, resultados provas de sua significância clínica para fornecer atividade osteogênica por processos celulares estimulantes durante o osso formação e regeneração15,16,17.
Neste artigo, o nosso grupo estabelece um modelo modificado e alternativa favorável para tridimensional cultura a longo prazo. OS células injetadas pelo BEM derivado de tecido apresentam um fenótipo de forma heterogénea mesenquimal prontamente em comparação com plásticos culturas bidimensionais. BEM derivado mostrar tecidos homólogos site-specific, sua vantagem dramática como sendo um nicho nativo para ósmio em vitro células e tem um grande potencial em pesquisas teóricas e clínicas de sistema operacional. Esta plataforma BEM caracterizada é simples mas eficiente para a investigação em vitro e pode ser prorrogada em modelagem de vários tipos de câncer.
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Protocol
Uso e cuidados com animais sejam realizadas de acordo com os institutos nacionais de saúde guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório (publicação de NIH NO.80-23, revisto em 1996) após aprovação do Animal ética Comissão de Sun Yat-sen da Universidade.
1. osso preparação
- Obter 4 de camundongos BALB/c de 6 semanas de idade (sem exigência de sexo-específico). Eutanásia em um rato assepticamente por deslocamento cervical e corte fresca fíbula, tíbia e fêmur de um membro posterior com tesoura cirúrgica estéril. Retire o tecido epitelial e em seguida retire o máximo de tecido mole quanto possível, usando uma tesoura e pinça.
- Lave os ossos da perna com soro fisiológico estéril 10mm tamponado fosfato (PBS) duas vezes para remover o sangue em um prato de 6 cm. Mergulhe os ossos em etanol a 75% por 3 min, em seguida, lave duas vezes com PBS. Os ossos limpos podem ser armazenados em um tubo de centrífuga de 50ml estéril com PBS estéril a-80 ° C durante meses até necessária.
Nota: PBS usado em todas as etapas a seguir tem 10 mM PO43−.
2. osso desmineralização e decellularization
- Descongelar os ossos congelados à temperatura ambiente e depois congelar novamente a-80 ° C por 1 h. submeta os ossos a mais de 2 – 3 ciclos de gelo-degelo por ataque de Lise e tecido celular.
- Incubar os ossos em um tubo de centrífuga de 50ml estéril com 0,5 N HCl durante a noite à temperatura ambiente num agitador de plataforma ou orbital balanço com balanço suave/vibração para assegurar uma cobertura completa e até mesmo dos ossos.
Nota: Certifique-se de que os ossos estão totalmente imersos durante o movimento no ácido e não se estabelecem durante o processo. O volume da solução de HCl deve ser mais de dez vezes mais que os ossos. - Após descalcificação, decantar a solução de HCl completamente e lave em água corrente por 1 h. Em seguida, lave os ossos duas vezes por 15 min por lavagem com água destilada num balanço agitador de plataforma ou orbital.
Nota: Certifique-se de remover completamente a solução ou água entre lavagens e após a última lavagem com água destilada. - Extrai os lipídios nos ossos desmineralizados com uma mistura 1:1 de metanol e clorofórmio em um tubo de centrífuga de 50 mL embrulhado com papel alumínio por 1h à temperatura ambiente10.
- Em seguida, transferência dos ossos em outro tubo de metanol embrulhado com papel alumínio por 30 min. Retire o metanol completamente e enxágue com água destilada água duas vezes durante 15 minutos, agitando suavemente. Decantar a água de lavagem final e prossiga com as etapas a seguir sob condição estéril.
Nota: Durante a etapa de extração, luz deve ser evitada para evitar a decomposição de clorofórmio. A mistura pode ser armazenada em recipiente resistente à luz, ou um tubo de centrifugação embrulhado com papel alumínio. Realizar todo o tratamento e lavar passos sob modesta rotação ou movimento de balanço. - Lavar os ossos em um prato de 6cm com PBS estéril por 3 min e depois transferir os ossos para um novo tubo de centrífuga de 50 mL. Adicionar 40 mL estéril 0,05% do trypsin-EDTA (TE) no tubo e incubar os ossos para 23 h numa incubadora de CO2 a 37 ° C18.
- Descartar a solução TE e lavar duas vezes com PBS estéril, suplementado com 90 μg/mL ampicilina e 90 canamicina μg/mL. Após decantação final lavar PBS completamente, reabastecer com 40 mL PBS estéril. Lave abundantemente durante 24 horas à temperatura ambiente com suave balançando ou agitando para embeber antibiótico.
Nota: Todos os PBS estéril usado nesta e as etapas a seguir contém 90 μg/mL ampicilina e 90 canamicina μg/mL. Lavagem da noite sob rotação ou movimento de balanço são executadas para imersão completa de longos períodos com antibióticos para alcançar a esterilização eficaz dos espaços de pore. - Remover a PBS e transfira os ossos para um tubo de centrifugação 50ml fresco cheio de PBS estéril. O preparado desmineralizada e ossos decellularized são chamados de matriz extracelular óssea (BEM) e podem ser armazenados a 4 ° C por 2 meses até necessária.
3. propagação e cultura de células
- Tirar o BEM do frigorífico de 4 ° C e mergulhe-a em 75% de etanol por 30 s, em seguida, enxaguar com PBS duas vezes. Transferi o BEM em uma placa de cultura de células limpo 6-poços. Adicione 2 mL meio de cultura completo (Dulbecco modificado médio/F12 da águia (DF12) contendo 5% de soro fetal bovino, 90 de μg/mL ampicilina e 90 canamicina μg/mL). Incubar o BEM durante a noite em uma incubadora de CO2 a 37 ° C.
- Obter linhas de célula OS humanas (MNNG/HOS e MG-63). Suspenda a aproximadamente 1.0 x 105 OS células com 100 μL PBS contendo vermelho de fenol como indicador.
Nota: Para melhor controlar e observar várias camadas células dentro do modelo tridimensional do BEM, MNNG/HOS e MG-63 estão infectadas com o vetor de Lentivirus expressando fluorescente mCherry e proteína verde fluorescente (GFP). - Depois que o BEM é totalmente embebido no meio, injete células OS BEM da epífise proximal ou distal quando a agulha atinge a cavidade medular do BEM. Incubar o modelo OS-BEM durante um período mínimo de 2 h em um umidificado 5% CO2 atmosfera a 37 ° C, para garantir que as células injetadas aderirem firmemente ao BEM.
Nota: Pré-aquecer todos os meios utilizados para cultura de células. A incubadora usada para cultura de células tem um umidificado 5% CO2 atmosfera a 37 ° C. - Adicionar 1 mL de meio de cultura completo na placa de revestir completamente a superfície da cultura BEM durante a noite em uma incubadora de CO2 a 37 ° C.
- Suavemente, transferi o modelo OS-BEM em um novo poço da placa de 6 com uma pinça estéril e refeed 1 mL de meio de cultura fresco. Cultura do modelo durante 14 dias, numa incubadora de CO2 a 37 ° C e refrescar o meio de cultura, de acordo com a situação de proliferação de células do sistema operacional.
- Continue monitorando o status médio de cor e células sob o microscópio de fluorescência invertido durante o processo de cultura. Quando as células OS expandem a placa, suavemente, transferi o modelo OS-BEM para outro novo bem com pinça estéril.
Nota: O meio de cultura é vermelho brilhante em pH 7,4, que é o valor de pH ideal para cultura de células de mamíferos mais. Se o meio se transforma em laranja ou até mesmo amarelo, atualize imediatamente o meio para manter um ambiente saudável para as células do sistema operacional. - Transferir o modelo BEM-OS em um novo poço com uma pinça e lavar suavemente com PBS para remover o meio de cultura. Em seguida, transferir para um tubo de centrífuga de 15 mL e corrigir com formalina 10% tamponada para identificação histológica.
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Representative Results
Após a desmineralização e decellularization, BEM parece ser translúcido com forte resistência e tenacidade em relação ao osso nativo do rato. Um pequeno resíduo de músculo e o espaço da cavidade medular podem ser claramente observadas (Figura 1A, B). Para determinar a decellularization eficaz do BEM, BEM é incorporado em parafina, após a fixação e em seguida cortado em seções de 3 – 5 μm para coloração de hematoxilina-eosina (H & E). A remoção completa do núcleo de células é mostrada pela brilhante-campo imagem. O natural porosa estrutura e colágeno rede arranjo é bem conservado em BEM decellularized (Figura 1C, D). Além disso, coloração imuno-histoquímica (IHC) de predominantes componentes orgânicos da matriz óssea, tais como colágeno que i e colágeno IV não demonstrar nenhum dano em componentes de ECM no decellularized BEM em comparação com o osso nativo (Figura 1E). Portanto, BEM fornece um andaime adequado e promissor com excelente biocompatibilidade para celular OS propagação e proliferação.
MNNG/HOS células apresentam uma morfologia altamente atípica, com citoplasma finamente vacuolated, enquanto MG-63 células têm formas espiculadas fibroblasto, como na cultura monocamada (Figura 2A, B). A seção histológica de um paciente OS exibe considerável pleomorfismo celular com células arredondadas ou poligonais, anisonucleosis e múltiplas mitoses (Figura 2C). Para verificar a viabilidade e a qualidade do modelo BEM, ambas as linhas de célula são injetadas na cavidade medular de BEM e monitoradas através de imagens de fluorescência durante a 14 dias de cultura (Figura 3A, B). Cortes histológicos com coloração H & E revelam que células OS anexar a resíduos de músculo e crescem em pilhas grossas ou aderirem ao longo da matriz óssea e proliferaram. Tanto o periósteo e o endósteo estão infiltrados pela expansão das células do sistema operacional. Surpreendentemente, os padrões de crescimento celular do modelo OS-BEM diferem de cultura placa bidimensional. Conforme ilustrado na Figura 3C, células OS pelo decellularized BEM mostram morfologia altamente heterogênea semelhantes para as características de cytopathologic de uma seção do sistema operacional. Algumas células de OS localizar em osso esponjoso e cavidade medular são esféricos e parcialmente espalhados para fora, enquanto as células descansando ao longo do periósteo e endósteo são extremamente espalhem-se em células alongadas, acompanhadas por pleomorfismo nuclear. Atividade das células é determinada usando Ki67 imunocoloração, que também mostra grandes vantagens em culturas a longo prazo. Além disso, OS as células em cultura BEM altamente expressam glicoproteína de matriz óssea — secretada proteína ácida e rica em cisteína (SPARC/osteonectin) — que é específico para matriz osteoide (Figura 3-D).
Figura 1 : As características estruturais do mouse decellularized BEM. (A, B) Visão geral de rato nativo (A) e decellularized (B) do osso. (C, D) Decellularization foi avaliada por H & E mancha do tibia nativo de rato (C) e decellularized óssea (D). Núcleos corados com hematoxilina podem ser observados no tibia nativo do rato, mas não pelo BEM. (E) IHC mancha para colágeno I e colágeno IV a detectar os principais componentes do ECM que são preservados no tibia do rato após decellularization. Seta amarela assinala o colágeno abundante eu dentro de osso esponjoso e seta azul assinala a abundante colágeno IV dentro de osso compacto. Barras de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : As características cytomorphological do sistema operacional. (A, B) OS humanos células linhas MNNG/HOS (A) e MG-63 (B) expandiu-se na cultura de frasco plástico. Barra de escala = 100 μm. (C) seção histopatológica com H & E mancha de paciente do sistema operacional. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Caracterização do sistema operacional em osso decellularized células modelo de matriz extracelular. (A, B) Representante mCherry expressão (vermelho) imagem de MNNG/HOS (A) e GFP expressão (verde) imagem de MG-63 (B) por microscopia de fluorescência após a semeadura e cultivo em BEM. Barra de escala = 100 μm. (C) H & E análise mostrando a morfologia típica das células injetadas MNNG/HOS e MG-63 após cultivo em BEM. (D), IHC análise no nível de expressão de Ki67 e SPARC de células MNNG/HOS após cultivo no modelo BEM durante 14 dias. As imagens representativas são dois conjuntos de série seções manchadas com Ki67 e SPARC. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Geralmente, OS podem ser classificados como osteoblástica, chondroblastic e fibroblastic subtipos dependendo de seu componente histológico dominante. Seu prognóstico é dependente não só parâmetros histológicos, mas também no seu sítio anatômico. Pode ocorrer no interior dos ossos (na haste intramedular ou compartimento intracortical), nas superfícies dos ossos e em sites extraosseous19. O surgimento e a heterogeneidade do sistema operacional podem ser elucidados como uma conjugação de eventos oncogênicos e um impulso microenvironmental adequado, seguido pelo crescente desenvolvimento e migração para órgãos distantes20,21,22 ,23. Mistério durante a evolução do sistema operacional pode ser decifrado com um modelo adequado para delinear as implicações clínicas, tendo como alvo o ambiente OS e nicho.
Cultivo em pratos de plástico ou em frascos em vitro dificilmente pode recapitular o microambiente biológica complexa e dinâmica. Grandes avanços de vários modelos pré-clínicos (por exemplo, mouse, zebrafish e cão) imitando o osteossarcoma foram declarados e aplicado a patogênese investigação e drogas desenvolvimento4,24,25, 26 , 27 , 28. ainda, os pesquisadores têm preocupação com animais experimentais devido ao seu desconforto e sofrimento durante as experiências. Em vitro modelos tridimensionais como nosso modelo BEM decellularized tem a vantagem devido à sua conveniência, operação rápida e poupança; Ele fornece a longo prazo e fácil manutenção de células viáveis ou de tecidos e também é mais perto a situação biológica nativa que cultura de plástico. Ela tem sido usada em nossa pesquisa, demonstrando a heterogeneidade fenotípica e mecanismo regulatório de quê OS com sucesso29.
Este protocolo esclareceu a viabilidade para gerar um BEM tecido derivado do mouse e pode ser usado para os tecidos de humano, rato e cão. Os passos mais críticos para o estabelecimento bem sucedido e aplicação do BEM são: (i) concluir a remoção dos restos celulares; (ii) a manutenção de uma condição de cultura estéril, saudável; (iii) manual destreza e pipetagem suave durante a injeção, a transferência e a cultura do modelo OS BEM.
Outros protocolos relatados geralmente empregam pressurização ou uma combinação de tratamentos químicos e enzimáticos, tais como a Triton X-100, sulfato dodecyl de sódio (SDS) e solução de DNase/RNase para alcançar potente decellularization30,31 . Demonstrou-se o tecido de cartilagem que sofre decellularization com detergentes para remover componentes de ECM incluindo glicosaminoglicanos32. Para recapitular um BEM mais intacta na maior medida, um método de decellularization moderada e potente é executado aqui para evitar a dissolução e danos dos principais componentes e arquitetura nativa do ambiente ósseo.
No entanto, não é a ser negligenciadas que este modelo de so-BEM descansado em uma placa sem fluxo médio, consequentemente levando a uma distribuição desigual de oxigênio e nutrientes. Rede vascular e outros subtipos de célula que ajudam a regulação da comunicação e interação de sinais microenvironmental e homeostase de ossos precisam ser tomadas em consideração24, 33,34, 35. espero que este modelo será combinado com outras técnicas de engenharia de alta tecnologia para lançar luz sobre OS pesquisa e guia de precisão medicina.
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Disclosures
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Acknowledgments
Os autores valorizam o apoio de Liuying Chen por sua assistência administrativa e Zhao longa por sua excelente assistência técnica durante a construção de andaimes de matriz extracelular do osso. Este estudo é suportado por concessões da Fundação Nacional de ciências naturais da China (31871413).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL centrifuge tube | Greiner | 188271 | |
| 50 mL centrifuge tube | Greiner | 227270 | |
| 6 cm cell culture dish | Greiner | 628160 | |
| 6-well plate | Greiner | 657160 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393 | |
| C57-BL/6J mouse | Sun Yat-sen University Laboratory Animal Center | ||
| CO2 incubator | SHEL LAB | SCO5A | |
| Dibasic sodium phosphate | Guangzhou Chemical Reagent Factory | BE14-GR-500G | |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D0547 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30084.03 | |
| Hemocytometer | BLAU | 717805 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | PHR1487 | |
| MG-63 | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Human osteosarcoma cell line | |
| MNNG/HOS | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Human osteosarcoma cell line | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P4633 | A solution of phenol red is used as a pH indicator: its color exhibits a gradual transition from yellow to red over the pH range 6.6 to 8.0. |
| Potassium chloride | Sangon Biotech | A100395 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sangon Biotech | A501211 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A501218 |
References
- Longhi, A., Errani, C., De Paolis, M., Mercuri, M., Bacci, G. Primary bone osteosarcoma in the pediatric age: State of the art. Cancer Treatment Reviews. 32, 423-436 (2006).
- Mohseny, A. B., et al. Osteosarcoma originates from mesenchymal stem cells in consequence of aneuploidization and genomic loss of Cdkn2. Journal of Pathology. 219, 294-305 (2009).
- Mutsaers, A. J., Walkley, C. R. Cells of origin in osteosarcoma: mesenchymal stem cells or osteoblast committed cells. Bone. 62, 56-63 (2014).
- Sato, S., et al. Mesenchymal tumors can derive from Ng2/Cspg4-Expressing pericytes with β-Catenin modulating the neoplastic phenotype. Cell Reports. 16, 917-927 (2016).
- Patane, S., et al. MET overexpression turns human primary osteoblasts into osteosarcomas. Cancer Research. 66, 4750-4757 (2006).
- Poos, K., et al. Genomic heterogeneity of osteosarcoma - shift from single candidates to functional modules. PLoS One. 10, 123082 (2015).
- Martin, J. W., Squire, J. A., Zielenska, M. The genetics of osteosarcoma. Sarcoma. 2012, 1-11 (2012).
- Alfranca, A., et al. Bone microenvironment signals in osteosarcoma development. Cellular and Molecular Life Sciences. 72, 3097-3113 (2015).
- Alford, A. I., Kozloff, K. M., Hankenson, K. D. Extracellular matrix networks in bone remodeling. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 65, 20-31 (2015).
- Sawkins, M. J., et al. Hydrogels derived from demineralized and decellularized bone extracellular matrix. Acta Biomaterialia. 9, 7865-7873 (2013).
- Alom, N., Peto, H., Kirkham, G. R., Shakesheff, K. M., Bone White, L. J. Bone extracellular matrix hydrogel enhances osteogenic differentiation of C2C12 myoblasts and mouse primary calvarial cells. Journal of Biomedical Materials Research Part B-Applied Biomaterials. 106, 900-908 (2018).
- Datta, N., Holtorf, H. L., Sikavitsas, V. I., Jansen, J. A., Mikos, A. G. Effect of bone extracellular matrix synthesized in vitro on the osteoblastic differentiation of marrow stromal cells. Biomaterials. 26, 971-977 (2005).
- Rubio, R., et al. Bone environment is essential for osteosarcoma development from transformed mesenchymal stem cells. Stem Cells. 32, 1136-1148 (2014).
- Sadr, N., et al. Enhancing the biological performance of synthetic polymeric materials by decoration with engineered, decellularized extracellular matrix. Biomaterials. 33, 5085-5093 (2012).
- Gautschi, O. P., Frey, S. P., Zellweger, R. Bone morphogenetic proteins in clinical applications. Anz Journal of Surgery. 77, 626-631 (2007).
- Rochet, N., et al. Modification of gene expression induced in human osteogenic and osteosarcoma cells by culture on a biphasic calcium phosphate bone substitute. Bone. 32, 602-610 (2003).
- Spang, M. T., Christman, K. L. Extracellular matrix hydrogel therapies: in vivo applications and development. Acta Biomaterialia. 68, 1-14 (2018).
- Schenke-Layland, K., et al. Impact of decellularization of xenogeneic tissue on extracellular matrix integrity for tissue engineering of heart valves. Journal of Structural Biology. 143, 201-208 (2003).
- Klein, M. J., Siegal, G. P. Osteosarcoma: anatomic and histologic variants. American Journal of Clinical Pathology. 125, 555-581 (2006).
- Lipinski, K. A., et al. Cancer evolution and the limits of predictability in precision cancer medicine. Trends in Cancer. 2, 49-63 (2016).
- McGranahan, N., Swanton, C. Clonal heterogeneity and tumor evolution: past, present, and the future. Cell. 168, 613-628 (2017).
- Brown, H. K., Schiavone, K., Gouin, F., Heymann, M., Heymann, D. Biology of bone sarcomas and new therapeutic developments. Calcified Tissue International. 102, 174-195 (2018).
- Abarrategi, A., et al. Osteosarcoma: cells-of-origin, cancer stem cells, and targeted therapies. Stem Cells International. 2016, 1-13 (2016).
- Tsukamoto, S., et al. Mesenchymal stem cells promote tumor engraftment and metastatic colonization in rat osteosarcoma model. International Journal of Oncology. 40, 163-169 (2012).
- Rodriguez, C. J., et al. Aerosol gemcitabine: preclinical safety and in vivo antitumor activity in osteosarcoma-bearing dogs. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 23, 197-206 (2010).
- Rodriguez, C. J. Using canine osteosarcoma as a model to assess efficacy of novel therapies: Can old dogs teach us new tricks. Advances in Experimental Medicine and Biology. 804, 237-256 (2014).
- Mohseny, A. B., et al. An osteosarcoma zebrafish model implicates Mmp-19 and Ets-1 as well as reduced host immune response in angiogenesis and migration. Journal of Pathology. 227, 245-253 (2012).
- Saalfrank, A., et al. A porcine model of osteosarcoma. Oncogenesis. 5, 210 (2016).
- Zhang, Y., Pan, Y., Xie, C., Zhang, Y. MiR-34a exerts as a key regulator in the dedifferentiation of osteosarcoma via PAI-1–Sox2 axis. Cell Death & Disease. 9, (2018).
- Hashimoto, Y., et al. The effect of decellularized bone/bone marrow produced by high-hydrostatic pressurization on the osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Biomaterials. 32, 7060-7067 (2011).
- Benders, K. E. M., et al. Extracellular matrix scaffolds for cartilage and bone regeneration. Trends in Biotechnology. 31, 169-176 (2013).
- Grayson, W. L., et al. Effects of initial seeding density and fluid perfusion rate on formation of tissue-engineered bone. Tissue Engineering Part A. 14, 1809-1820 (2008).
- Mikulic, D., et al. Tumor angiogenesis and outcome in osteosarcoma. Pediatric Hematology and Oncology. 21, 611-619 (2004).
- Ren, K., et al. Vasculogenic mimicry: a new prognostic sign of human osteosarcoma. Human Pathology. 45, 2120-2129 (2014).
- Bonuccelli, G., et al. Role of mesenchymal stem cells in osteosarcoma and metabolic reprogramming of tumor cells. Oncotarget. 5, 7575-7588 (2014).
