Summary
Кость внеклеточного матрикса (BEM) модель для остеосаркомы (ОС) является хорошо установленным и показано здесь. Он может использоваться как подходит леска подражая первичной опухоли роста в пробирке и предоставления идеальная модель для изучения гистологическое и цитогенетических неоднородность OS.
Abstract
Остеосаркома (ОС) является наиболее распространенным и высоко агрессивной первичной костной опухоли. Она характеризуется с анатомическими и гистологические варианты диагностических и прогностических трудности. OS включает в себя genotypically и фенотипически гетерогенных раковых клеток. Кость микроокружения элементы обоснованы с учетом неоднородности и болезнь прогрессии опухоли. Кость внеклеточного матрикса (BEM) сохраняет микроструктурных матрицы и биохимических компонентов родной внеклеточного матрикса. Ткани специфические ниши обеспечивает благоприятные и долгосрочные леску для OS ячейки посева и распространения. Эта статья предоставляет протокол для подготовки БЭМ модели и ее дальнейшее экспериментальное приложение. OS клетки могут расти и дифференцироваться в несколько фенотипы с гистопатологические сложности OS клинических образцов. Модель также позволяет визуализировать различные морфологии и их ассоциации с генетическими аномалиями и основные механизмы регулирования. Как гомологичных человека ОС эта модель БЭМ-OS может разработана и применяется к патологии и клинических исследований ОС.
Introduction
Остеосаркома (OS) обычно происходит в активно растущих областей, метафизе длинных костей, в подростковом возрасте. Более 80% пострадавших от OS сайты имеют предпочтение метафиз проксимального отдела голени и проксимального отдела плечевой кости, а также проксимальных и дистальных бедра, соответствующее расположение роста пластина1. OS включает в себя несколько подтипов клеток с мезенхимальных свойствами и значительное разнообразие в Гистологические особенности и класс. Свидетельства поддержки мезенхимальных стволовых клеток (МСК), остеобласты совершено прекурсоров и pericytes как клетки происхождения-2,-3,-4,-5. Эти клетки могут накапливаться генетических или эпигеномные изменения и привести к OS под влиянием некоторых костей microenvironmental сигналов. Внутренние и внешние механизмы в результате геномная нестабильность и неоднородность ОС, с несколько морфологических и клинических фенотипов6,7. Для индивидуальной терапии или скрининга новых лекарственных препаратов Роман модели должен быть сгенерирован для против неоднородность или других клинических расстройств.
OS-внутри костной злокачественная опухоль твердых. Сложность и активности окружающих микроокружения элементы предоставляют фенотипических и функциональные различия по OS клеток в разных местах опухоли. Кость внеклеточного матрикса (BEM) обеспечивает структурных и биохимические леску для осаждения минеральных и костного ремоделирования. Органической частью внеклеточного матрикса (ECM), главным образом состоит из типа я коллагена выделяется клетками osteoblastic линии, в то время как его минерализованных часть состоит из фосфата кальция в виде гидроксиапатита8. Динамическая роль ECM сетей заключается в регулировании клеточной адгезии, дифференциация, кросс talk и ткани функции обслуживания9.
Деминерализованная БЭМ и ECM гидрогели были успешно использованы в культуре клеток и может повысить клетки распространения10,11. Синтезированные кости как ECM может регулировать размер пула, судьба решения и линии прогрессирование MSCs12,,1314. Кроме того результаты свидетельствуют его клиническое значение для предоставления Остеогенные деятельности путем стимулирования клеточных процессов во время кости формирования и регенерации15,16,17.
В этой статье наша группа устанавливает модифицированная модель и благоприятной альтернативой для трехмерных долгосрочные культуры. OS клетки вводят в ткани производные БЭМ представляют гетерогенно мезенхимальных фенотип легко по сравнению с пластиковой двумерных культур. BEM производным от участкам гомологичной ткани показать его драматические преимущество как родной ниши для OS клетки в пробирке и имеет большой потенциал в OS теоретических и клинических исследованиях. Эта платформа характеризуется BEM является простой, но эффективный в vitro исследования и может быть продлен в моделировании нескольких видов рака.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Уход за животными и использования проводятся согласно национальных институтов здравоохранения руководство для ухода и использования лабораторных животных (публикация NO.80-23, пересмотренной в 1996 году низ) после утверждения от животных этики Комитета Sun Yat-sen University.
1. кость подготовки
- Получите 4-6 week-old мышей BALB/c (без конкретного пола требование). Усыпить мыши асептически, вывих шейного и отрезать свежие малоберцовой кости, голени и бедра от задних конечностей с стерильные хирургические ножницы. Отделите эпителиальной ткани и затем удалить как можно больше мягких тканей, как можно, используя ножницы и щипчики.
- Промывайте кости ноги с стерильные 10 мм-фосфатный буфер (PBS) дважды, чтобы удалить крови в 6 см блюдо. Погружать костей в 75% этанола на 3 мин, затем ополосните с PBS дважды. Чистой кости могут храниться в стерильных 50 мл пластиковых пробирок с стерильных PBS-80 ° c для месяцев, до тех пор, пока требуется.
Примечание: PBS, используются в следующих шагах имеет 10 мм PO43−.
2. кости деминерализации и decellularization
- Оттепель замороженных костей при комнатной температуре, а затем заморозить снова в-80 ° C, за 1 ч., подлежащих костей более чем 2-3 циклов замораживания оттаивания для клеток тканей и лизис пробоя.
- Инкубировать костей в стерильных 50 мл пластиковых пробирок с 0,5 N HCl на ночь при комнатной температуре на качания платформы или орбитальный шейкер с нежным качания/пожимая для обеспечения полной и даже костей.
Примечание: Убедитесь, что кости полностью погружен во время движения в кислоты и не соглашайтесь во время процесса. Объем раствора HCl должен быть более чем в десять раз, что из костей. - После декальцинации декантируют раствор HCl полностью и промойте под струей воды 1 ч. Затем вымойте кости дважды за 15 мин за промыть дистиллированной воды на качалки платформы или орбитальный шейкер.
Примечание: Убедитесь, чтобы полностью удалить раствора или воды между моет и после окончательной стирки с дистиллированной водой. - Извлечение липидов в деминерализованной кости с 1:1 смесь метанола и хлороформ в 50 мл пластиковых пробирок завернутый с фольгой олова для 1 ч при комнатной температуре10.
- Затем передачи костей в другую трубу метанола, завернутый с фольгой олова 30 мин полностью удалить метанола и смойте дистиллированной воды дважды за 15 мин с нежно тряска. Сцеживаться окончательный мыть водой и выполните следующие шаги в стерильных условиях.
Примечание: Во время извлечения шага, свет необходимо избегать предотвратить разложение хлороформ. Смесь может храниться в светостойкими контейнере или пластиковых пробирок завернутый с фольгой олова. Выполнить все обращения и мыть шаги под скромным вращение или качалки движения. - Промыть кости в 6 см блюдо с стерильных PBS на 3 мин, а затем передать кости в новых центрифуг Тюбик 50 мл. Добавьте 40 мл стерильного 0,05% трипсина ЭДТА (TE) в трубку и инкубировать кости для 23 h в инкубатор CO2 при 37 ° C18.
- Отменить решение TE и дважды промыть стерильной PBS, дополненная 90 мкг/мл Ампициллин и канамицин 90 мкг/мл. После декантирующие финал Вымойте PBS полностью, пополнить с 40 мл стерильного PBS. Вымойте тщательно за 24 ч при комнатной температуре с нежным тряся или тряска для антибиотиков замочить.
Примечание: Все стерильные PBS, используемый в этом и следующих шагов содержит 90 мкг/мл Ампициллин и канамицин 90 мкг/мл. Ночь мыть под вращение или качалки движения выполняются для длительных периодов тщательного погружения с помощью антибиотиков для достижения эффективной стерилизации поры. - Удаление PBS и передачи кости в свежий 50 мл пластиковых пробирок наполнены стерильный PBS. Приготовленные деминерализованной и decellularized костей, называются кости внеклеточного матрикса (BEM) и может храниться при температуре 4 ° C на 2 месяца, до тех пор, пока требуется.
3. сотовый посева и культура
- Возьмите БЭМ из 4 ° C холодильник и погрузите его в этанол 75% для 30 s, а затем промыть PBS дважды. Передача БЭМ на тарелку чистой 6-ну клетки культуры. Добавьте 2 мл полной питательной среды (Дульбекко изменение орла среднего/F12 (DF12) содержащий плода бычьим сывороточным 5%, 90 мкг/мл Ампициллин и канамицин 90 мкг/мл). Инкубировать БЭМ на ночь в инкубатор CO2 при 37 ° C.
- Получите людей OS клеточных линий (МННГ/HOS и мг-63). Приостановить приблизительно 1.0 x 105 OS клетки с PBS 100 мкл, содержащих фенол красный индикатор.
Примечание: Чтобы лучше отслеживать и наблюдать многослойных клетки внутри трехмерной модели BEM, МННГ/HOS и мг-63 заражены лентивирусные вектора выражения флуоресцентный mCherry и Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП). - После БЭМ полностью замачивают в среде, придать OS клетки БЭМ от проксимальный и дистальный эпифиз когда игла достигнет полости мозгового БЭМ. Инкубировать OS-BEM модель для минимум 2 ч в увлажненные 5% CO2 атмосфера при 37 ° C для обеспечения вводили клетки твердо придерживаться БЭМ.
Примечание: Предварительно теплой все средства массовой информации, используемые для клеточной культуры. Инкубатор для культуры клеток имеет увлажненные 5% CO2 атмосфера при 37 ° C. - Добавить 1 мл полной питательной среды в пластину, чтобы полностью покрыть поверхность БЭМ культуры на ночь в инкубатор CO2 при 37 ° C.
- Аккуратно перенесите ОС-BEM модель в новой скважины 6-ну пластины с стерильный пинцет и refeed 1 мл свежей питательной среды. Культура модели на 14 дней в инкубатор CO2 при 37 ° C и обновите питательной среды согласно ситуации распространения ОС клеток.
- Держите состоянием средний цвет и клеток под микроскопом Перевернутый флуоресценции во время процесса культуры. Когда OS клетки расширяться к пластине, аккуратно перенести ОС-BEM модель в другую новых хорошо с стерильный пинцет.
Примечание: Питательной среды является ярко-красный в рН 7,4, оптимальный рН для наиболее млекопитающих клеточной культуры. Если носитель превращается в желтый, оранжевый или даже, немедленно обновите средство для поддержания здоровой окружающей среды для OS клеток. - Передача ОС-BEM модель в новой скважины с помощью пинцета и осторожно промойте PBS для удаления питательной среды. Затем перевести в 15 мл пластиковых пробирок и исправить с формалина 10% буферизации для гистологической идентификации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После установки деминерализации и decellularization BEM, по-видимому, полупрозрачные, с сильной стойкость и упорство, по сравнению с родной мыши кости. Немного мышцы остатков и пространство медуллярного полости можно ясно наблюдать (рис. 1A, B). Чтобы определить эффективный decellularization BEM, Бэм заливали в парафин после фиксации и затем нарезанный в разделы 3-5 мкм для гематоксилином эозином (H & E) окрашивания. Тщательного удаления клеточных ядер показано светлые области изображения. Естественный пористой структуры и коллагена сети организация хорошо поддерживается в decellularized BEM (рис. 1C, D). Кроме того иммуногистохимический (IHC) пятная преобладающим органических компонентов костной матрицы, таких как коллаген, который я и коллаген IV демонстрируют никаких повреждений на компоненты ECM в decellularized BEM, по сравнению с родной кости (рис. 1E). Таким образом БЭМ обеспечивает подходящие и перспективным леску с большим биосовместимость для OS ячейки посева и распространения.
МННГ/HOS клетки обладают высоко атипичной морфологией с мелко vacuolated цитоплазмой, хотя мг-63 клетки имеют фибробластоподобных веретенообразных фигур в монослойном культивировании (рис. 2A, B). Гистологические раздел от пациента ОС отображает значительные сотовой плеоморфизм с закругленными или полигональное клетки, anisonucleosis и несколько митозов (рис. 2C). Чтобы проверить жизнеспособность и качество модели BEM, обе линии клетки вводят в полость медуллярного БЭМ и осуществляется через флуоресценции изображений во время 14-день культуры (рис. 3A, B). Гистологические срезы с H & E пятнать показывают, что OS клетки придают мышцы остатков и превращаются в густой сваи или следовать вдоль костной матрицы и размножаться. Надкостницы и Эндост проникли расширение OS клеток. Поразительно шаблонов роста клеток OS-BEM модели отличаются от двумерных плиты культуры. Как показано на рис. 3C, OS клетки на decellularized BEM показывают весьма разнородных морфология похож на Соотнесение функций Секции ОС. Некоторые ОС клетки в губчатой кости и Медуллярная полости сферических и частично распространяется вне, тогда как клетки отдыха вдоль надкостницы и Эндост чрезвычайно распространено в удлиненные клетки, в сопровождении ядерного плеоморфизм. Активность клеток определяется с помощью Ki67 иммуноокрашивания, который также показывает большие преимущества в долгосрочном культур. Кроме того, OS клеток в культуре БЭМ высоко Экспресс костной матрицы гликопротеин — выделяется белка кислой и богатые цистеином (SPARC/osteonectin) — который является специфическим для остеоид матрицы (рис. 3D).
Рисунок 1 : Структурные характеристики мыши decellularized BEM. (A, B) Обзор мыши родной (A) и decellularized (B) кости. (C, D) Decellularization был оценен H & E пятнать мыши родной голени (C) и decellularized кости (D). Ядер, окрашивали гематоксилином можно наблюдать в родной мыши голени, но не в БЭМ. (E) IHC пятная для коллагена I и коллаген IV выявлять основные компоненты от ECM, которые сохранились в мыши голени после decellularization. Желтая стрелка указывает обильные коллагена я в губчатой кости и синяя стрелка указывает, обильные коллаген IV в компактной кости. Масштаб баров = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Характеристики Цитоморфологическое ОС. (A, B) Человека OS мобильных линий в пластиковый флакон культура расширен МННГ/HOS (A) и мг-63 (B). Шкалы бар = 100 мкм. (C) гистопатологические секция с H & E пятнать OS пациента. Шкалы бар = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Характеристика OS клеток в decellularized кости модель внеклеточного матрикса. (A, B) Представитель mCherry выражение (красный) образ МННГ/HOS (A) и GFP образ выражение (зеленый) мг-63 (B) по микроскопии флуоресцирования после посева и культивирования в БЭМ. Шкалы бар = 100 мкм. (C) H & E анализ показаны типичные морфологию клеток вводили МННГ/HOS и мг-63 после культивирования в БЭМ. (D) IHC анализ Ki67 и SPARC уровень экспрессии МННГ/HOS клеток после культивирования в БЭМ модели на 14 дней. Представитель изображения являются два последовательных секций, окрашенных с Ki67 и SPARC. Шкалы бар = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Как правило ОС могут быть классифицированы как osteoblastic, chondroblastic и fibroblastic подтипов в зависимости от ее доминирующей гистологических компонента. Его прогноз зависит не только от гистологических параметров, но и на своем сайте анатомические. Это может произойти внутри костей (в Интрамедуллярные или intracortical отсека), на поверхности костей и в extraosseous сайты19. Появление и неоднородность ОС можно освещены как спряжение онкогенных событий и адекватной microenvironmental импульс, последовали все большее развитие и миграции в отдаленные органы20,21,22 ,23. Тайна в ходе эволюции ОС могут быть расшифрованы с надлежащей моделью наметить клинических проявлений, ориентированные на ОС и ниши.
Культивирование на пластиковые кухни или в колбы в vitro вряд ли можно резюмировать динамичных и сложных биологических микроокружения. Большие успехи различных доклинических моделей (например, мышь, данио рерио и собака) подражая остеосаркома были объявлены и применяется к патогенезу расследования и наркотиками развития4,24,25, 26 , 27 , 28. Тем не менее, исследователи имеют интерес для подопытных животных из-за их дискомфорт и страданий во время экспериментов. В vitro трехмерные модели как наша decellularized БЭМ-модель имеет преимущество из-за его удобства, быстрая операция и экономии; Он обеспечивает долгосрочные и легко поддержания жизнеспособных клеток или тканей, а также ближе к родной биологической ситуации, чем пластиковые культуры. Он был использован в наших исследованиях, демонстрируя фенотипической неоднородности и механизм регулирования дифференцировке ОС с успехом29.
Этот протокол уточнить возможности для создания БЭМ ткани производные от мыши и могут быть использованы для тканей от человека, крыс и собак. Наиболее важные шаги для успешного создания и применения БЭМ являются: (i) полное удаление мусора клеток; (ii) поддержание состояния стерильные, здоровой культуры; (iii) ловкости и нежный закупорить во время инъекции, передачи и культуру ОС-BEM модели.
Другие протоколы, сообщил, как правило, используют сочетание химических и ферментативные лечения, такие как Тритон X-100, додецилового сульфата натрия (SDS) и DNase/РНКазы решение для достижения мощным decellularization30,31 или сливом . Чтобы удалить компоненты ECM, включая гликозаминогликанов32было показано хрящевой ткани, которая подвергается decellularization с моющим средством. Резюмировать более нетронутыми БЭМ в максимальной степени, умеренный, но мощный метод decellularization выполняется здесь чтобы избежать распада и повреждение ключевых компонентов и родной архитектуры среды кости.
Однако это не следует забывать, что эта модель OS-BEM отдыхал в тарелку без проточной средний, следовательно приводит к неравномерному распределению кислорода и питательных веществ. Сосудистой сети и другие подтипы клеток, которые помогают регулирования коммуникации и взаимодействия microenvironmental сигналов и кости гомеостаза необходимо принимать во внимание24, 33,34, 35. надеюсь, эта модель будет сочетаться с другими методами высокотехнологичных инженерных пролить свет на OS исследования и руководства точности медицины.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.
Acknowledgments
Авторы значение поддержка Чэнь Liuying ее административной помощи и длинные Чжао за его прекрасную технической помощи при строительстве подмостей внеклеточного матрикса костной ткани. Это исследование поддерживается за счет субсидий из национального фонда Китая естественных наук (31871413).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL centrifuge tube | Greiner | 188271 | |
| 50 mL centrifuge tube | Greiner | 227270 | |
| 6 cm cell culture dish | Greiner | 628160 | |
| 6-well plate | Greiner | 657160 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393 | |
| C57-BL/6J mouse | Sun Yat-sen University Laboratory Animal Center | ||
| CO2 incubator | SHEL LAB | SCO5A | |
| Dibasic sodium phosphate | Guangzhou Chemical Reagent Factory | BE14-GR-500G | |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D0547 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30084.03 | |
| Hemocytometer | BLAU | 717805 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | PHR1487 | |
| MG-63 | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Human osteosarcoma cell line | |
| MNNG/HOS | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Human osteosarcoma cell line | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P4633 | A solution of phenol red is used as a pH indicator: its color exhibits a gradual transition from yellow to red over the pH range 6.6 to 8.0. |
| Potassium chloride | Sangon Biotech | A100395 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sangon Biotech | A501211 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A501218 |
References
- Longhi, A., Errani, C., De Paolis, M., Mercuri, M., Bacci, G. Primary bone osteosarcoma in the pediatric age: State of the art. Cancer Treatment Reviews. 32, 423-436 (2006).
- Mohseny, A. B., et al. Osteosarcoma originates from mesenchymal stem cells in consequence of aneuploidization and genomic loss of Cdkn2. Journal of Pathology. 219, 294-305 (2009).
- Mutsaers, A. J., Walkley, C. R. Cells of origin in osteosarcoma: mesenchymal stem cells or osteoblast committed cells. Bone. 62, 56-63 (2014).
- Sato, S., et al. Mesenchymal tumors can derive from Ng2/Cspg4-Expressing pericytes with β-Catenin modulating the neoplastic phenotype. Cell Reports. 16, 917-927 (2016).
- Patane, S., et al. MET overexpression turns human primary osteoblasts into osteosarcomas. Cancer Research. 66, 4750-4757 (2006).
- Poos, K., et al. Genomic heterogeneity of osteosarcoma - shift from single candidates to functional modules. PLoS One. 10, 123082 (2015).
- Martin, J. W., Squire, J. A., Zielenska, M. The genetics of osteosarcoma. Sarcoma. 2012, 1-11 (2012).
- Alfranca, A., et al. Bone microenvironment signals in osteosarcoma development. Cellular and Molecular Life Sciences. 72, 3097-3113 (2015).
- Alford, A. I., Kozloff, K. M., Hankenson, K. D. Extracellular matrix networks in bone remodeling. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 65, 20-31 (2015).
- Sawkins, M. J., et al. Hydrogels derived from demineralized and decellularized bone extracellular matrix. Acta Biomaterialia. 9, 7865-7873 (2013).
- Alom, N., Peto, H., Kirkham, G. R., Shakesheff, K. M., Bone White, L. J. Bone extracellular matrix hydrogel enhances osteogenic differentiation of C2C12 myoblasts and mouse primary calvarial cells. Journal of Biomedical Materials Research Part B-Applied Biomaterials. 106, 900-908 (2018).
- Datta, N., Holtorf, H. L., Sikavitsas, V. I., Jansen, J. A., Mikos, A. G. Effect of bone extracellular matrix synthesized in vitro on the osteoblastic differentiation of marrow stromal cells. Biomaterials. 26, 971-977 (2005).
- Rubio, R., et al. Bone environment is essential for osteosarcoma development from transformed mesenchymal stem cells. Stem Cells. 32, 1136-1148 (2014).
- Sadr, N., et al. Enhancing the biological performance of synthetic polymeric materials by decoration with engineered, decellularized extracellular matrix. Biomaterials. 33, 5085-5093 (2012).
- Gautschi, O. P., Frey, S. P., Zellweger, R. Bone morphogenetic proteins in clinical applications. Anz Journal of Surgery. 77, 626-631 (2007).
- Rochet, N., et al. Modification of gene expression induced in human osteogenic and osteosarcoma cells by culture on a biphasic calcium phosphate bone substitute. Bone. 32, 602-610 (2003).
- Spang, M. T., Christman, K. L. Extracellular matrix hydrogel therapies: in vivo applications and development. Acta Biomaterialia. 68, 1-14 (2018).
- Schenke-Layland, K., et al. Impact of decellularization of xenogeneic tissue on extracellular matrix integrity for tissue engineering of heart valves. Journal of Structural Biology. 143, 201-208 (2003).
- Klein, M. J., Siegal, G. P. Osteosarcoma: anatomic and histologic variants. American Journal of Clinical Pathology. 125, 555-581 (2006).
- Lipinski, K. A., et al. Cancer evolution and the limits of predictability in precision cancer medicine. Trends in Cancer. 2, 49-63 (2016).
- McGranahan, N., Swanton, C. Clonal heterogeneity and tumor evolution: past, present, and the future. Cell. 168, 613-628 (2017).
- Brown, H. K., Schiavone, K., Gouin, F., Heymann, M., Heymann, D. Biology of bone sarcomas and new therapeutic developments. Calcified Tissue International. 102, 174-195 (2018).
- Abarrategi, A., et al. Osteosarcoma: cells-of-origin, cancer stem cells, and targeted therapies. Stem Cells International. 2016, 1-13 (2016).
- Tsukamoto, S., et al. Mesenchymal stem cells promote tumor engraftment and metastatic colonization in rat osteosarcoma model. International Journal of Oncology. 40, 163-169 (2012).
- Rodriguez, C. J., et al. Aerosol gemcitabine: preclinical safety and in vivo antitumor activity in osteosarcoma-bearing dogs. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 23, 197-206 (2010).
- Rodriguez, C. J. Using canine osteosarcoma as a model to assess efficacy of novel therapies: Can old dogs teach us new tricks. Advances in Experimental Medicine and Biology. 804, 237-256 (2014).
- Mohseny, A. B., et al. An osteosarcoma zebrafish model implicates Mmp-19 and Ets-1 as well as reduced host immune response in angiogenesis and migration. Journal of Pathology. 227, 245-253 (2012).
- Saalfrank, A., et al. A porcine model of osteosarcoma. Oncogenesis. 5, 210 (2016).
- Zhang, Y., Pan, Y., Xie, C., Zhang, Y. MiR-34a exerts as a key regulator in the dedifferentiation of osteosarcoma via PAI-1–Sox2 axis. Cell Death & Disease. 9, (2018).
- Hashimoto, Y., et al. The effect of decellularized bone/bone marrow produced by high-hydrostatic pressurization on the osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Biomaterials. 32, 7060-7067 (2011).
- Benders, K. E. M., et al. Extracellular matrix scaffolds for cartilage and bone regeneration. Trends in Biotechnology. 31, 169-176 (2013).
- Grayson, W. L., et al. Effects of initial seeding density and fluid perfusion rate on formation of tissue-engineered bone. Tissue Engineering Part A. 14, 1809-1820 (2008).
- Mikulic, D., et al. Tumor angiogenesis and outcome in osteosarcoma. Pediatric Hematology and Oncology. 21, 611-619 (2004).
- Ren, K., et al. Vasculogenic mimicry: a new prognostic sign of human osteosarcoma. Human Pathology. 45, 2120-2129 (2014).
- Bonuccelli, G., et al. Role of mesenchymal stem cells in osteosarcoma and metabolic reprogramming of tumor cells. Oncotarget. 5, 7575-7588 (2014).
