Summary
El modelo de la matriz extracelular (BEM) de hueso para el osteosarcoma (OS) está bien establecida y se muestra aquí. Puede utilizarse como un andamio adecuado para mímico el tumor primario crecimiento en vitro y proporcionando un modelo ideal para el estudio de la heterogeneidad histologic y cytogenic de OS.
Abstract
Osteosarcoma (OS) es el más común y un tumor óseo primario altamente agresivos. Se caracteriza con variaciones anatómicas e histologic junto con dificultades en el diagnóstico o pronósticas. OS compone de las células cancerosas genotípicamente y fenotípicamente heterogéneas. Elementos del microambiente de hueso se han demostrado a cuenta de la heterogeneidad y la enfermedad la progresión del tumor. Matriz extracelular del hueso (BEM) conserva el microestructurales matrices y componentes bioquímicos de la matriz extracelular nativa. Este nicho específico de tejido proporciona un andamiaje favorable y a largo plazo para la proliferación y células OS siembra. Este artículo proporciona un protocolo para la preparación del modelo BEM y su aplicación experimental. OS células pueden crecer y diferenciarse en múltiples fenotipos compatibles con la complejidad histopatológica de los especímenes clínicos OS. El modelo también permite la visualización de diversas morfologías y su asociación con alteraciones genéticas y mecanismos subyacentes. Como homólogo a OS humanos, este modelo de BEM OS puede ser desarrollado y aplicado a la patología y la investigación clínica de OS.
Introduction
Osteosarcoma (OS) ocurre generalmente en áreas, la metáfisis de huesos largos, en pleno crecimiento durante la adolescencia. Más del 80% de los sitios afectados OS tienen preferencia por la metáfisis de la tibia proximal y húmero proximal como distal y proximal de fémur, correspondiente a la ubicación de la placa de crecimiento1. Sistema operativo consta de varios subtipos de células con propiedades mesenquimales y una considerable diversidad en las características histológicas y grado. Evidencias apoyan las células madre mesenquimales (MSCs), compromiso de precursores de osteoblastos y pericitos como las células de origen2,3,4,5. Estas células pueden acumularse alteraciones genéticas o epigenéticas y dar lugar a OS bajo la influencia de ciertas señales microambiental de hueso. Mecanismos intrínsecos y extrínsecos como resultado la inestabilidad genómica y heterogeneidad del sistema operativo, con múltiples fenotipos morfológicos y clínicos6,7. Terapias individualizadas o screening de nuevas drogas, nuevos modelos tiene que generarse a contra heterogeneidad u otros trastornos clínicos.
OS es un tumor sólido maligno intra óseo. La complejidad y la actividad de alrededor de elementos del microambiente confieren diferencias fenotípicas y funcionales en las células de sistema operativo en diferentes lugares de un tumor. Matriz extracelular del hueso (BEM) proporciona un andamiaje estructural y bioquímico para la deposición mineral y remodelado óseo. La porción orgánica de matriz extracelular (ECM) consiste en principalmente de tipo I colágeno secretada por las células de linaje osteoblástico, mientras que su porción mineralizada está compuesta de fosfato de calcio en forma de hidroxiapatita8. El papel dinámico de las redes de ECM es regular la adhesión celular, la diferenciación, la diafonía y tejido función mantenimiento9.
Desmineralizada hidrogeles BEM y ECM se han utilizado con éxito en cultivo de células y pueden mejorar la célula proliferación10,11. ECM como hueso sintetizado puede regular el tamaño, las decisiones del destino y progresión de linaje de MSCs12,13,14. Por otra parte, resultados prueba de su importancia clínica para proporcionar actividad osteogénica por estimulantes procesos celulares durante hueso formación y regeneración de15,16,17.
En este artículo, nuestro grupo establece una alternativa favorable para el cultivo a largo plazo tridimensional y modelo modificado. OS las células inyectadas en el tejido derivado de BEM presentan un fenotipo heterogéneo mesenquimal fácilmente en comparación con el plástico bidimensionales culturas. BEM deriva de mostrar tejido homólogo específica su ventaja dramática como siendo un nicho nativo para el sistema operativo en vitro de las células y tiene un gran potencial en investigación clínica y teórica de OS. Esta plataforma BEM caracterizada es simple pero eficaz para la investigación en vitro y podrá ampliarse en modelado a cánceres múltiples.
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Protocol
Uso y cuidado de los animales se llevan a cabo según los institutos nacionales de salud guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio (publicación de NIH NO.80-23, revisada en 1996) después de la aprobación de la Animal ética Comité de Sun Yat-sen la Universidad.
1. preparación de hueso
- Obtener 4 a ratones BALB/c de 6 semanas de edad (sin el requisito del sexo). Eutanasia a un ratón asépticamente por dislocación cervical y corte fresco del peroné, la tibia y el fémur de una trasera con tijeras quirúrgicas estériles. Retire el tejido epitelial y retire tanto del tejido suave como sea posible usando tijeras y pinzas.
- Lavar los huesos de la pierna con solución salina estéril 10 mM tamponada fosfato (PBS) dos veces para extraer sangre en un plato de 6 cm. Sumergir los huesos en etanol al 75% durante 3 minutos, luego enjuague dos veces con PBS. Los huesos limpios pueden almacenarse en un tubo de centrífuga estéril de 50 mL con PBS estéril a-80 ° C durante meses hasta que la necesite.
Nota: PBS utilizados en los siguientes pasos tiene 10 mM PO43−.
2. hueso desmineralización y descelularización
- Descongelar los huesos congelados a temperatura ambiente y luego congelar otra vez a-80 ° C por 1 h. tema los huesos a más de 2-3 ciclos de congelación y descongelación para desglose de lisis y el tejido celular.
- Incubar los huesos en un tubo de centrífuga estéril de 50 mL con 0.5 HCl N durante la noche a temperatura ambiente en un agitador oscilante plataforma o orbital con suave balanceo/agitación para asegurar una cobertura completa e incluso de huesos.
Nota: Asegúrese de que los huesos se sumergen completamente durante el movimiento en el ácido y no instalarse durante el proceso. El volumen de disolución de HCl debe ser diez veces más que el de los huesos. - Después de la descalcificación, decantar la solución de HCl completamente y enjuagar bajo el chorro de agua durante 1 hora. Luego, lave los huesos dos veces durante 15 min por lavado con agua destilada en un agitador oscilante plataforma o orbital.
Nota: Asegúrese de que eliminar completamente la solución o el agua entre los lavados y después del último lavado con agua destilada. - Extraer los lípidos en los huesos desmineralizados con una mezcla 1:1 de metanol y cloroformo en un tubo de centrífuga de 50 mL envuelto con papel de aluminio por 1 h a temperatura ambiente10.
- Entonces, transferencia de los huesos en otro tubo de metanol envuelto con papel de aluminio durante 30 minutos sacar el metanol completamente y enjuagar con agua destilada agua dos veces durante 15 min con suave agitación. Decantar el agua de lavado final y continúe con los pasos siguientes bajo condiciones de esterilidad.
Nota: Durante la etapa de extracción, debe evitarse la luz para evitar la descomposición de cloroformo. La mezcla puede guardarse en un recipiente resistente a la luz o un tubo de centrífuga envuelto con papel de aluminio. Realizar todo el tratamiento y lavar pasos modesto rotación o movimiento de mecedora. - Lave los huesos en un plato de 6 cm con PBS estéril por 3 min y luego transferir los huesos en un nuevo tubo de centrífuga de 50 mL. Añadir 40 mL estéril 0.05% tripsina-EDTA (TE) en el tubo e incubar huesos de 23 h en un incubador de CO2 a 37 º C18.
- Deseche la solución TE y enjuague dos veces con PBS estéril suplementada con 90 de μg/mL ampicilina y kanamicina μg/mL 90. Después de decantar la final de lavado PBS completamente, llenar con 40 mL PBS estéril. Lavado durante 24 h a temperatura ambiente con el suave balanceo o agitar para remojo antibiótico.
Nota: Todos lo PBS estéril en este y los siguientes pasos contiene 90 μg/mL ampicilina y kanamicina μg/mL 90. Lavado durante la noche en rotación o movimiento de balanceo se realizan por inmersión completa prolongado con antibióticos para lograr una esterilización efectiva de espacios de poro. - Retirar el PBS y transferir los huesos en un tubo de centrífuga de 50 mL fresco llenado de PBS estéril. Desmineralizado el preparado y huesos decellularized se llaman matriz extracelular del hueso (BEM) y pueden almacenarse a 4 ° C por 2 meses hasta que la necesite.
3. siembra y cultivo de células
- Sacar el BEM del refrigerador de 4 ° C y sumerja en etanol al 75% durante 30 s, luego enjuague con PBS dos veces. La transferencia del BEM en una placa de cultivo celular 6-bien limpio. Añadir 2 mL completo medio de cultivo (Dulbecco modificado Eagle medio/F12 (DF12) que contiene 5% de suero fetal bovino, 90 de μg/mL ampicilina y kanamicina μg/mL 90). Incubar el BEM durante la noche en un incubador de CO2 a 37 ° C.
- Obtener líneas celulares de humano OS (MNNG/HOS y MG-63). Suspender aproximadamente de 1.0 x 105 OS células con 100 μL PBS que contiene rojo de fenol como indicador.
Nota: Para mejor seguimiento y observar células de múltiples capas en el modelo tridimensional de BEM, MNNG/HOS y MG-63 infectan con vectores lentivirales expresando mCherry fluorescente y proteína fluorescente verde (GFP). - Después de que el BEM se sumerge completamente en el medio, inyectar células OS BEM de epífisis proximal o distal cuando la aguja llega a la cavidad medular de BEM. Incubar el modelo BEM OS para un mínimo de 2 h en un vapor 5% CO2 ambiente a 37 ° C para las células inyectadas se adhieren firmemente a BEM.
Nota: Caliente previamente todos los medios utilizados para el cultivo celular. La incubadora usada para el cultivo celular tiene un humidificado 5% CO2 ambiente a 37 ° C. - Añadir 1 mL medio de cultivo completo en la placa para cubrir totalmente la superficie de la cultura BEM durante la noche en un incubador de CO2 a 37 ° C.
- Modelo de transferencia el BEM OS suavemente en un nuevo pozo de placa de 6 pozos con una pinza estéril y realimentación 1 mL medio de cultivo fresco. El modelo de la cultura durante 14 días en una incubadora de CO2 a 37 ° C y refrescar el medio de cultivo según la situación de la proliferación de las células del sistema operativo.
- Mantener seguimiento medio estado de color y de la célula bajo el microscopio de fluorescencia invertido durante el proceso de la cultura. Cuando las células OS amplían a placa, suavemente transferir el modelo BEM OS a otro nuevo con pinzas estériles.
Nota: El medio de cultivo es rojo a pH 7.4, que es el valor de pH óptimo para el cultivo celular mamífero más. Si el medio se torna amarillo anaranjado o incluso, actualizar inmediatamente el medio para mantener un ambiente sano para las células del sistema operativo. - Transferir el modelo de BEM OS en un nuevo pozo con pinzas y enjuague suavemente con PBS para eliminar el medio de cultivo. A continuación, transferir a un tubo de centrífuga de 15 mL y fijar con formol al 10% tamponado para identificación histológica.
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Representative Results
Después de la desmineralización y descelularización, BEM parece ser translúcido con mayor resistencia y tenacidad en comparación con el hueso nativo del ratón. Un pequeño residuo de músculo y el espacio de la cavidad medular pueden observarse claramente (figura 1A, B). Para determinar la efectiva descelularización de BEM, BEM es embebido en parafina después de la fijación y luego cortado en secciones de 3 – 5 μm para coloración hematoxilina-eosina (H & E). La eliminación cuidadosa de núcleos de célula se muestra en proyección de imagen de campo claro. El natural porosa estructura y colágeno arreglo de red se mantiene bien en BEM decellularized (figura 1C, D). Además, la tinción inmunohistoquímica (IHC) de predominantes componentes orgánicos de la matriz ósea, como el colágeno que colágeno IV y ningún daño en los componentes de la ECM en demostrar decellularized BEM en comparación con el hueso nativo (figura 1E). Por lo tanto, BEM proporciona un andamio adecuado y prometedor gran biocompatibilidad para OS siembra y proliferación.
MNNG/HOS células exhiben una morfología altamente anormal con citoplasma vacuolated finamente, mientras que las células MG-63 tienen fibroblasto-como formas crecidas en cultivo monocapa (figura 2A, B). La sección histológica de un paciente OS muestra importante pleomorfismo celular con células redondeadas o poligonales, anisonucleosis y múltiples mitosis (figura 2C). Para verificar la viabilidad y la calidad del modelo BEM, ambas líneas celulares se inyecta en la cavidad medular de BEM y monitoreados a través de imágenes de fluorescencia durante la cultura de 14 días (figura 3A, B). Cortes histológicos con tinción H & E revelan que las células OS adjuntar a los residuos de músculo y crecen en montones gruesos o adhieran a lo largo de la matriz ósea y proliferan. Periostio y endostio están infiltrados por la expansión de las células del sistema operativo. Sorprendentemente, los patrones de crecimiento celular de modelo BEM OS difieren de la cultura de dos dimensiones de la placa. Como se ilustra en la figura 3C, células OS en el decellularized BEM muestran morfología altamente heterogénea similar a las características cytopathologic de una sección de OS. Algunas células de OS en hueso esponjoso y cavidad medular son esféricos y se extendió en parte hacia fuera, mientras que las células de reclinación en el periostio y el endostio se extienden muy en las células alargadas acompañadas por pleomorphism nuclear. Actividad de la célula se determina mediante inmunotinción de Ki67, que también presenta grandes ventajas en cultivos a largo plazo. También, OS células en cultura BEM muy expresa glicoproteína de matriz de hueso — secretado proteína acídica y rica en cisteína (SPARC/osteonectin) — que es específico de la matriz osteoide (figura 3D).
Figura 1 : Las características estructurales del ratón decellularized BEM. (A, B) Resumen de ratón nativo (A) y decellularized (B) del hueso. (C, D) Se evaluó la descelularización de H & E tinción de tibia nativo de ratón (C) y decellularized (D) del hueso. Núcleos teñidos con hematoxilina se pudieran observar en tibia de ratón nativo, pero no en el BEM. (E) IHC tinción de colágeno I y el colágeno IV para detectar los principales componentes del ECM que se conservan en tibia de ratón después de descelularización. Flecha amarilla señala el colágeno abundante I dentro de hueso esponjoso y la flecha azul señala el abundante colágeno IV dentro de hueso compacto. Barras de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Las características cytomorphological del sistema operativo. (A, B) OS humanos células MNNG/HOS (A) y MG-63 (B) ampliados en cultura del frasco de plástico. Barra de escala = 100 μm. (C) sección histopatológica con H & E tinción de paciente OS. Barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Caracterización del sistema operativo de las células en el hueso decellularized modelo de la matriz extracelular. (A, B) Imagen de expresión (rojo) mCherry representante de MNNG/HOS (A) y GFP expresión (verde) de la imagen del MG-63 (B) por microscopía de fluorescencia después de la siembra y cultivo en BEM. Barra de escala = 100 μm. (C) H & E análisis mostrando la morfología típica de las células inyectadas MNNG/HOS y MG-63 después de cultivo en BEM. (D) IHC análisis a nivel de expresión de Ki67 y SPARC de células MNNG/HOS después de 14 días de cultivo en modelo BEM. Las imágenes representativas son dos conjuntos de secciones seriadas con Ki67 y SPARC. Barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En general, OS pueden clasificarse como osteoblástico, condroblástico y fibroblastic subtipos dependiendo de su componente histológico dominante. Su pronóstico es dependiente no sólo de parámetros histologic sino también en su sitio anatómico. Puede ocurrir dentro de los huesos (en los intramedulares o compartimiento intracortical), en las superficies de los huesos y en sitios extraosseous19. La aparición y la heterogeneidad del sistema operativo pueden ser aclados como una conjugación de eventos oncogénicos y un adecuado impulso microambiental, seguido por el creciente desarrollo y migración a órganos distantes20,21,22 ,23. Misterio durante la evolución del sistema operativo podría ser descifrado con un modelo apropiado para esbozar implicaciones clínicas dirigidas al entorno de sistema operativo y el nicho.
Cultivo en platos de plástico o en frascos en vitro apenas puede recapitular el microambiente biológico dinámico e intrincado. Desarrollo de diversos modelos preclínicos (ratón, pez cebra y perro) mímico el osteosarcoma se han declarado y aplicado a patogenesia investigación y drogas desarrollo4,24,25, 26 , 27 , 28. sin embargo, los investigadores tienen preocupación por animales de experimentación debido a su malestar y sufrimiento durante los experimentos. In vitro modelos tridimensionales como nuestro modelo BEM decellularized tiene la ventaja debido a su conveniencia, operación rápida y de ahorro; proporciona el mantenimiento a largo plazo y fácil de células o tejidos viables y también está más cerca de la situación biológica nativa que cultura plástica. Se ha utilizado en nuestra investigación demostrando la heterogeneidad fenotípica y el mecanismo regulador del dedifferentiation OS con éxito29.
Este protocolo clarifica la viabilidad para generar un BEM derivados de tejidos de ratón y puede utilizarse para tejidos de humano, rata y perro. Los pasos más críticos para el establecimiento exitoso y aplicación de BEM son: () completar la eliminación de restos celulares; (ii) mantenimiento de una condición de cultura estéril, saludable; (iii) destreza manual y pipeteo suave durante la inyección, transferencia y cultura del modelo BEM OS.
Otros protocolos divulgados generalmente emplean presurización o una combinación de tratamientos químicos y enzimáticos, como el tritón X-100, dodecil sulfato de sodio (SDS) y DNasa/Rnasa solución para lograr la descelularización potente30,31 . El tejido de cartílago que se somete a descelularización con detergentes se ha demostrado para eliminar componentes de ECM, incluyendo glycosaminoglycans32. Para recapitular un BEM más intacto en la mayor medida, un moderado pero poderoso método de descelularización se realiza aquí para evitar la disolución y el daño de componentes clave y la arquitectura nativa del entorno de los huesos.
Sin embargo, no es olvidarse que este modelo OS-BEM se basaba en una placa sin medio que fluye, por lo tanto conduce a una desigual distribución de oxígeno y nutrientes. Red vascular y otros subtipos de células que ayudan a regular la comunicación y la interacción de señales microambiental y homeostasis del hueso deben tomarse en consideración24, 33,34, 35. que este modelo se combinarán con otras técnicas de ingeniería de alta tecnología para arrojar luz sobre medicina de OS investigación y guía de precisión.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Acknowledgments
Los autores valoran el apoyo del Liuying Chen por su asistencia y Zhao largo por su excelente asistencia técnica durante la construcción de andamios de matriz extracelular del hueso. Este estudio es apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (31871413).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL centrifuge tube | Greiner | 188271 | |
| 50 mL centrifuge tube | Greiner | 227270 | |
| 6 cm cell culture dish | Greiner | 628160 | |
| 6-well plate | Greiner | 657160 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393 | |
| C57-BL/6J mouse | Sun Yat-sen University Laboratory Animal Center | ||
| CO2 incubator | SHEL LAB | SCO5A | |
| Dibasic sodium phosphate | Guangzhou Chemical Reagent Factory | BE14-GR-500G | |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D0547 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30084.03 | |
| Hemocytometer | BLAU | 717805 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | PHR1487 | |
| MG-63 | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Human osteosarcoma cell line | |
| MNNG/HOS | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Human osteosarcoma cell line | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P4633 | A solution of phenol red is used as a pH indicator: its color exhibits a gradual transition from yellow to red over the pH range 6.6 to 8.0. |
| Potassium chloride | Sangon Biotech | A100395 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sangon Biotech | A501211 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A501218 |
References
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