Här beskriver vi en metod för högupplöst tid-lapse multiphoton Imaging av hjärntumör celler före och efter invasiv kirurgisk intervention (t. ex. biopsi) inom samma levande djur. Denna metod gör det möjligt att studera effekterna av dessa invasiva kirurgiska ingrepp på tumörcellernas flyttande, invasiva, och proliferativa beteende på en enda cellnivå.
Biopsier är standard för vård av cancerbehandling och är kliniskt fördelaktigt eftersom de tillåter fast tumör diagnos, prognos, och personlig behandling bestämning. Emellertid, störning av tumör arkitektur av biopsi och andra invasiva ingrepp har förknippats med oönskade effekter på tumörprogression, som måste studeras på djupet för att ytterligare förbättra den kliniska nyttan av dessa förfaranden. Konventionella statiska metoder, som endast ger en ögonblicksbild av tumören, är begränsade i sin förmåga att avslöja effekten av biopsi på tumör cell beteende såsom migration, en process nära besläktad med tumör malignitet. I synnerhet, tumör cell migration är nyckeln i mycket aggressiva hjärntumörer, där lokala tumör spridning gör total tumörresektion praktiskt taget omöjligt. Utvecklingen av multiphoton Imaging och kroniska Imaging Windows gör det möjligt för forskare att studera denna dynamiska process i levande djur över tid. Här beskriver vi en metod för högupplöst longitudinell avbildning av hjärntumör celler före och efter en biopsi i samma levande djur. Detta tillvägagångssätt gör det möjligt att studera effekten av detta förfarande på tumör cells beteende (migration, invasion, och proliferation). Dessutom diskuterar vi fördelarna och begränsningarna med denna teknik, liksom förmågan hos denna metod att studera förändringar i cancercellens beteende för andra kirurgiska ingrepp, inklusive tumörresektion eller implantation av kemoterapi Rån.
Standard av omsorg för de flesta solida tumörer inkluderar vävnadbiopsi för diagnos, prognos, och personlig behandling beslutsamhet1,2. Sammantaget ger dessa förfaranden klinisk nytta, men de senaste bevisen tyder på att biopsi och andra mer invasiva ingrepp, såsom tumörresektion, kan också negativt påverka tumörprogression3,4,5 , 6. även om dessa förfaranden förblir oumbärliga i vården och deras fördelar övervinner deras negativa effekter, är det nödvändigt att fullt ut förstå mekanismerna bakom dessa negativa effekter för att maximera patienternas säkerhet och positiva influenser av dessa förfaranden och göra dem ännu mer kliniskt fördelaktigt.
Biopsi-medierade oönskade effekter på tumörprogression utlöses av systemiska förändringar och förändringar i tumören mikromiljö som svar på vävnads störningar4,5. Därför är det nödvändigt att studera denna process i levande djur. De subtila konsekvenserna av dessa minimalt invasiva ingrepp kan dock ofta döljas av stora variationer mellan individer. Konventionella metoder baserade på immunohistokemi eller transkriptionella uttrycks analys kan förbise dessa effekter eller kräva ett stort antal djur för att identifiera dem. Dessutom, dessa statiska metoder saknar förmågan att identifiera förändringar i tumör cell beteende såsom migration och invasion, dynamiska processer som korrelerar med tumör malignitet. Dessa tumör cells funktioner är av särskild betydelse för mycket aggressiva hjärntumörer, såsom glioblastoma multiforme (GBM), där den lokala spridningen av tumörceller begränsar kirurgisk resektion och minskar patientens överlevnad7. För att till fullo förstå hur biopsier påverkar beteendet hos GBM-celler, behövs en longitudinell metod som möjliggör visualisering av dessa celler i fysiologiska sammanhang av levande organismer.
Den senaste utvecklingen av högupplöst intravital avbildning i kombination med kirurgiskt implanterade kroniska bildfönster tillåter forskare att studera det dynamiska beteendet hos tumörceller i levande möss över flera dagar8,9. Med hjälp av denna kraftfulla metod kan vi studera hur tumörcellernas proliferativa, flyttande och infiltrativa beteende förändras under flera dagar som svar på en biopsi i samma mus. Jämfört med andra tekniker som möjliggör flerdagsövervakning av tumörer i levande möss, såsom magnetisk resonanstomografi (MRI)10, positron emissions datortomografi/datortomografi (PET/CT)11, eller bioluminescerande Imaging12, detta tillvägagångssätt unikt erbjuder möjligheten att studera tumör cell beteende på enda cellnivå och reda ut subtila förändringar som sker inom tumören.
Här, vi beskriver en detaljerad metod för att utföra biopsi-liknande skada och pre-och postbiopsi längsgående intravital avbildning i hjärnan av tumör-bärande möss. Denna metod kan potentiellt tillämpas för att studera andra kirurgiska ingrepp, såsom partiell tumörresektion eller implantation av kemoterapi wafers.
Här beskriver vi en metod för att studera förändringar i tumör cells beteende på enstaka cellnivå som svar på invasiva kirurgiska ingrepp, såsom en biopsi, i hjärnan hos ett levande djur. Kombinationen av längsgående multiphoton Imaging med kirurgisk implantation av en kronisk CIW möjliggör kvantifiering av tumör cell migration, invasion, och proliferation före och efter biopsi i samma djur4. Jämfört med andra metoder som används för tumör Flerdagsaktivitet övervakning, såsom bioluminescerande Imaging12, MRI10, eller PET/CT11, denna metod visualiserar unikt tumörer på en enda cellnivå och därmed ger insikt i cellulära beteende underliggande tumörprogression.
För att kunna utföra den här metoden bör flera procedurer bemästras. De mest kritiska stegen i detta protokoll är CIW implantation och utbyte. Den tekniska komplexiteten i dessa steg kräver precision och kirurgiska färdigheter som kan förvärvas med stadig träning. Komplikationer under CIW kirurgi, såsom blödning som kan täcka hjärnans yta, kan vara utmanande för efterföljande avbildning. En brist på sterila verktyg eller miljö, samt underlåtenhet att helt täta hjärnans yta, kan orsaka en infektion på hjärnans yta (vit vätska under täckslip), vilket kommer att göra Imaging problematiska och starkt äventyra den resulterande Tolkning. En annan vanlig fråga i detta protokoll är djurens rörelse under tidsfördröjning Imaging. Alla XYZ -SKIFT kan korrigeras efter experimentet, men vi rekommenderar att du korrigerar koordinaten för varje position före varje tidspunkt för att förhindra förlust av information. Vävnads deformation är ett ytterligare problem som finns vid avbildning på ett inverterat Mikroskop. Hjärnvävnad lider av kompression när musen är placerad i liggande läge. Beroende på graden av vävnad deformation, tumör cell spårning kan leda till en felaktig kvantifiering av cell förskjutning. För att förhindra detta kan en programvara för stel och elastisk deformation användas14.
Även om detta förfarande erbjuder en bred ansökan för att studera förändringar i tumör beteende, vissa begränsningar bör övervägas. Denna metod gör det möjligt för forskare att bilden upp till ett djup av 1,6 mm (med användning av en optisk parametrisk oscillator); Detta innebär dock att Imaging är begränsad till ytliga hjärnbarken områden15. Sålunda, vissa hjärntumörer ligger i djupa hjärnstrukturer, inklusive diffus inneboende Pontine gliom ligger i hjärnstammen regionen, kan inte studeras i sin ursprungliga hjärn miljö med detta protokoll. En annan begränsning av detta protokoll är den volym av tumören som kan avbildas. Även om total tumör volym skanning önskas för att få maximal information, ofta, tumörstorlek och hastigheten på flytt celler kan vara begränsande faktorer. För varje tumörtyp måste en optimal tidsfördröjning för avbildning beaktas. Om tidsramen mellan bilderna är för lång kan det vara svårt att spåra tumörcellerna. Användningen av en resonant scanner kan kraftigt minska skanningstiden, vilket gör att Imaging av en större tumör16. Slutligen kan den manuella bildanalysen av detta protokoll vara mycket tidskrävande, så i stället kan program för automatiserad 3D-spårning användas. Dock bör resultatet av spårning alltid vara visuellt övervakas eftersom algoritmer för automatiserad cell spårning sällan är utformade för att recapitulate exakt migrering av cellerna av intresse.
Smärre anpassningar av det protokoll som beskrivs här kan möjliggöra ett ännu bredare spektrum av tillämpningar. Istället för att utföra biopsier, andra (kirurgiska) interventioner kan genomföras, såsom partiell tumörresektion eller leverans av kemoterapi wafers. Tillsats av föreningar genom ett kirurgiskt implanterat mikrorör kan kombineras med detta protokoll för att farmakologiskt rikta specifika molekyler av intresse. Vi förväntar oss att denna modell kommer att vara användbar i studier som syftar till att analysera effekterna av en viss intervention på tumör cells beteende. Möjligheten att utföra upprepade åtgärder i samma djur ger inte bara mer exakta uppgifter om förändringar som sker i tumören, men också kraftigt minskar antalet försöksdjur som behövs per studie.
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar ANKO de Graaff och Hubrecht Imaging Center för deras avbildning stöd och Ellen Wehrens och Hannah Johnson för korrekturläsning och redigering av manuskriptet.
25g x 16 mm hypodermic needles | BD Microlance | 300600 | |
701 RN 10uL SYR W/O NEEDLE | Hamilton | 7635-01 | |
Absorbable gelatin sponge | Pfizer | Gelfoam | |
Coverslips round 6 mm | VWR international | 631-0168 | |
Cyanoacrylate glue | Pattex | Pattex Ultra gel | |
Dental cement | Vertex Dental | Vertex Self-Curing | |
Drill | Dremel | Dremel 3000 (dental drill may be more convenient) + 105 Engraving Cutter | |
Fine curved Tweezers | Dumont | AGT508 | |
Hypnorm | VetaPharma Ltd | Hypnorm (Fentanyl citrate 0,315 mg/ml+ Fluanison 10 mg/ml) | |
Midazolam | Actavis | Midazolam Actavis 5mg/ml | |
Opthalmic ointment | Kela Veterinaria | Duodrops veter kela 10 m | |
Quintessential Stereotaxic Injector (QSI) | Stoelting | 53311 | |
Silicone Oil | Sigma Aldrich | 181838 | |
Stereotaxic frame | Stoelting | Lab standard stereotaxic, rat and mouse | |
Surgical stereo microscope | Olympus | ||
Temgesic (0.3 mg/ml) | BD Pharmaceuticals | 283732 | |
Vannas Tübingen Spring Scissors | Harvard Apparatus | 72-8508 | |
Xylocaine (Lidocaine 1% + Epinephrine 1:100,000) Local anesthetic | Astrazeneca | Xylocaine (Lidocaine 1% + Epinephrine 1:100,000) |