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Chemistry

डीएनए Origami टेम्पलेट्स का उपयोग कर चिरल plasmonic मेटामोलेक्सिक में सोने nanorods के विधानसभा

Published: March 5, 2019 doi: 10.3791/59280
Automatic Translation
1, 1,2, 1
1Department of Neuroscience and Biomedical Engineering, Aalto University School of Science, Aalto FI-00076, 2Faculty of Chemical Engineering, Ho Chi Minh City (HCMC) University of Technology, Vietnam National University - Ho Chi Minh City (VNU-HCM), Ho Chi Minh City 700000

Summary

हम डीएनए origami के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन-मजबूत chiroptical प्रतिक्रियाओं के साथ चिरल plasmonic मेटाअणु में सोने nanorods के आधार पर विधानसभा । प्रोटोकॉल चिरल विंयास तक ही सीमित नहीं है और आसानी से विभिंन plasmonic architectures के निर्माण के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

Abstract

डीएनए origami संरचनाओं की अंतर्निहित addressability उंहें आदर्श जटिल plasmonic नैनोकणों में धातु नैनोकणों की व्यवस्था के लिए टेंपलेट्स बनाता है । एक डीएनए origami-templated विधानसभा के उच्च स्थानिक परिशुद्धता व्यक्तिगत कणों के plasmonic अनुनादों के बीच युग्मन को नियंत्रित करने और निर्माण nanostructures के ऑप्टिकल संपत्तियों दर्जी सक्षम बनाता है की अनुमति देता है । हाल ही में, चिरल plasmonic प्रणालियों plasmonic विधानसभाओं और उनके ऑप्टिकल प्रतिक्रियाओं के स्थानिक विंयास के बीच मजबूत संबंध के कारण ध्यान की एक बहुत आकर्षित किया (जैसे, परिपत्र dichroism [सीडी]) । इस प्रोटोकॉल में, हम गोल्ड नैनोरोड्स (aunrs) के डीएनए origami आधारित चिरल विधानसभाओं की पीढ़ी के लिए पूरे कार्यप्रवाह का वर्णन । प्रोटोकॉल डिजाइन सिद्धांतों और डीएनए origami टेम्पलेट्स के निर्माण के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं का एक विस्तृत विवरण शामिल, aunrs के संश्लेषण, और origami के विधानसभा-aunrs संरचनाओं. इसके अलावा, संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM) और सीडी स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग संरचनाओं के लक्षण वर्णन शामिल है । वर्णित प्रोटोकॉल चिरल विंयास तक ही सीमित नहीं है और विभिंन plasmonic architectures के निर्माण के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

Introduction

डीएनए nanostructures, विशेष रूप से डीएनए origami, व्यापक रूप से अणुओं और अन्य nanostructures घटकों की व्यवस्था करने के लिए इस्तेमाल किया गया है (जैसे, प्रोटीन और नैनोकणों [एनपीएस]), नैनोमीटर परिशुद्धता के साथ लगभग मनमाने ढंग से geometries1,2 , 3 , 4 , 5. एक उच्च उपज और सटीकता के साथ डीएनए origami टेम्पलेट्स पर धातु एनपीए की व्यवस्था करने की क्षमता उपन्यास ऑप्टिकल गुण के साथ plasmonic संरचनाओं के निर्माण में सक्षम बनाता है6,7,8, 9 , 10. डीएनए origami तकनीक विशेष रूप से चिरल plasmonic संरचनाओं की पीढ़ी के लिए उपयोगी है, जो वास्तव में तीन आयामी आर्किटेक्चर की आवश्यकता11,12,13, 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20.

इस प्रोटोकॉल में विस्तार से डीएनए origami के निर्माण की पूरी प्रक्रिया का वर्णन है-aunrs के चिरल विधानसभाओं templated । डिजाइन21 और संरचना भविष्यवाणी22,डीएनए origami के23 के लिए इस्तेमाल किया सॉफ्टवेयर सहज और स्वतंत्र रूप से उपलब्ध है । origami निर्माण और aunr संश्लेषण आम जैव रसायन प्रयोगशाला उपकरण का उपयोग करें (जैसे, thermocyclers, जेल वैद्यरसंचलन, गर्म प्लेटें, centrifuges) । संरचनाओं मानक TEM और सीडी स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग कर विशेषता है ।

ऊपर से नीचे के तरीकों के साथ समान plasmonic nanostructures के निर्माण (जैसे, इलेक्ट्रॉन बीम लिथोग्राफी) बल्कि जटिल और महंगी उपकरणों की आवश्यकता होगी । इसके अलावा, डीएनए origami टेम्पलेट्स plasmonic विधानसभाओं में संरचनात्मक reconfigurability शामिल करने के लिए संभावना प्रदान करते हैं24,25,26,27,28,29 ,30,31,३२,३३, जो लिथोग्राफी तकनीकों के साथ निर्मित संरचनाओं के लिए अत्यंत चुनौतीपूर्ण है । अन्य आणविक-आधारित दृष्टिकोणों की तुलना में३४,३५,३६,३७, डीएनए origami आधारित निर्माण, स्थानिक परिशुद्धता और प्रोग्रामेबिलिटी का एक उच्च स्तर प्रदान करता है ।

Protocol

1. डीएनए origami के डिजाइन

  1. aunrs के वांछित रिश्तेदार स्थानिक व्यवस्था की पहचान और डीएनए origami टेम्पलेट के उपयुक्त आकार (चित्रा 1ए). aunrs और origami टेम्पलेट्स के संरचनात्मक मापदंडों का अनुमान है । स्टेपल कि आगे संशोधन की जरूरत है (चित्रा 1बी) के अनुमानित पदों की स्थिति जानें ।
  2. डाउनलोड और स्थापित करें cadnano18 एक डीएनए origami टेम्पलेट डिजाइन करने के लिए. cadnano में, मार्ग पाड़ और प्रधान किस्में टेम्पलेट के वांछित आकार के अनुसार और seq उपकरणपर क्लिक करके प्रधान किस्में अनुक्रम उत्पन्न. पेंट उपकरण क्लिक करें और प्रधान किस्में है कि आगे संशोधन (चित्रा 1सी) की आवश्यकता है निशान ।
  3. डीएनए स्टेपल अनुक्रम (चित्र 1C) को. csv फ़ाइल में निर्यात करने के लिए निर्यात उपकरण क्लिक करें ।
  4. दो origami बंडलों के बीच कोण Θ को ठीक करने के लिए दोहरे-असहाय तालों को डिज़ाइन करें । दो बंडलों के सापेक्ष अभिविन्यास के आधार पर, origami का निर्माण बाएँ या दाएँ हाथ (lh/RH) चिरल स्थानिक विन्यास (चित्रा 1बी) अनुकूलित कर सकते हैं ।
  5. एक स्प्रेडशीट अनुप्रयोग में staples '. csv फ़ाइल आयात करें । aunr विधानसभा (संभालती है) के लिए इस्तेमाल प्रधानों के अंत में एक polya10 अनुक्रम जोड़ें । ताला दृश्यों के साथ डिजाइन लॉक साइटों पर प्रधान किस्में संशोधित करें ।
    नोट: प्रतिनिधि परिणामों में विधानसभाओं ३६ मुख्य किस्में, प्रत्येक डीएनए origami बंडल पर समान रूप से दो समानांतर helices हर 21 nt पर वितरित की 3 ' अंत में फैला हुआ संभालती शामिल हैं । पहले और अंतिम हैंडल स्थिति के बीच की दूरी १६८ nt है, लगभग ५७ एनएम (संलग्न cadnano फ़ाइल देखें) ।

2. डीएनए origami टेम्पलेट्स के विधानसभा

  1. मुख्य किस्में (एस एम) के एक काम कर रहे हैं, संभालती है और ताले के साथ किस्में सहित, एकाग्रता के बराबर मात्रा में मिश्रण द्वारा तैयार-सामान्यीकृत प्रधान oligonucleotides (जैसे, १०० μm) ।
    नोट: Origami संरचनाओं आमतौर पर प्रधान किस्में के कई सैकड़ों होते हैं । स्टेपल आम तौर पर multiwell में डीएनए oligonucleotides के रासायनिक संश्लेषण में विशेषज्ञता विक्रेताओं से खरीदे जाते हैं (उदा., ९६-अच्छी तरह से) प्लेटें.
  2. 10 एनएम origami के ५०० μl के लिए, मिक्स ५० μl ट्रिस-एडटा (TE, 10x), १०० μl of mgcl2 (१०० मिमी), 25 μl of nacl (१०० मिमी), १७५ μl of H2O, १०० μl of SM (०.५ μm), 5 μl of lock किस्में (5 μm) , और एक ५० μl पाड़ (१०० एनएम) ।
  3. तालिका 1में वर्णित के रूप में ८० डिग्री सेल्सियस से 20 डिग्री सेल्सियस के लिए एक thermocycler में मिश्रण anneal.

3. डीएनए origami शुद्धि

नोट: यह खंड agarose जेल शुद्धि के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करता है । डीएनए origami टेंपलेट्स भी वैकल्पिक दृष्टिकोण३८,३९का उपयोग कर शुद्ध किया जा सकता है ।

  1. 1% जेल के लिए, एक माइक्रोवेव ओवन में मिश्रण हीटिंग द्वारा Tris-बोरेट-edta (tbe, 0.5 x) के १०० मिलीलीटर में agarose के 1 जी भंग । दाग विनिर्देश के अनुसार 10, 000x डीएनए दाग के 10 μl जोड़ें । निष्कर्षण कदम पर यूवी प्रकाश के लिए जोखिम को कम करने के लिए (चरण ३.६), एक डीएनए दाग है कि नीले उत्तेजना के तहत कल्पना जा सकता है का उपयोग करें.
  2. लगभग ४० ° c करने के लिए समाधान ठंडा और धीरे से मिलाते हुए mgcl2 (१.३ M) के 1 मिलीलीटर जोड़ें । कास्ट जेल और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते हैं ।
  3. इलेक्ट्रोफोरोसिस डिवाइस सेट और जेल बॉक्स में ठंड (4 डिग्री सेल्सियस) चल बफर (0.5 एक्स tbe 11 मिमी mgcl2के साथ) डाल दिया । एक बर्फ के पानी के स्नान में जेल बॉक्स रखें ।
  4. origami नमूनों के लिए लोड हो रहा है बफर जोड़ें (6x लोड हो रहा है बफर 15% पॉलीसुक्रोज ४०० और ०.२५% ब्रोमोफीनॉल पानी में नीला) शामिल हैं । उपयोग कंघी के अनुसार एक उचित मात्रा के साथ कुओं में नमूनों लोड (उदाहरण के लिए, ५० μl के लिए एक 8-अच्छी कंघी के लिए १.५ मिमी मोटाई में).
  5. ८० V पर 2 ज के लिए इलेक्ट्रोफोरेसिस चलाएं ।
    नोट: origami की विशेषताएँ और खुले और बंद संरचना अलग करने के लिए, 1% के बजाय 2% जेल का उपयोग करें और 4 ज करने के लिए चल रहे समय लम्बा.
  6. जेल imager (चित्रा 2) के साथ जेल छवि । बैंड कल्पना, origami बैंड में कटौती, एक parafilm पर जेल तोड़, और तरल निकालने के लिए एक नीली बत्ती transilluminator का प्रयोग करें । वसूली उपज लगभग ४०% है ।
  7. पिपेट एक केन्द्रापसारक फिल्टर इकाई में तरल और 5 मिनट के लिए ३,००० एक्स जी में स्पिन । यूवी-दृश्य (यूवी विज़) स्पेक्ट्रोमीटर के साथ २६० एनएम पर origami समाधान के अवशोषण को मापने । १.३ x 108 M-1· cm-1के विलुप्त होने के गुणांक का उपयोग करके origami की सांद्रता का अनुमान लगाएं ।
    नोट: agarose जेल शुद्धि के बाद origami समाधान की ठेठ एकाग्रता है 1-2 एनएम ।
  8. बाद में उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर शुद्ध origami टेम्पलेट्स स्टोर ।

4. गोल्ड नैनोरोड्स का संश्लेषण

नोट: aunr संश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल मामूली संशोधनों के साथ पिछले साहित्य४० से अनुकूलित है ।

  1. 5 मिनट के लिए एक्वा regia के साथ सभी कांच के बर्तन धोने, यह पानी के साथ कुल्ला, यह ultrapure पानी के साथ sonicate, और यह उपयोग करने से पहले सूखी ।
  2. तैयार ०.२ एम hexadecyltrimethylammonium ब्रोमाइड (ctab), 1 मिमी haucl4, 4 मिमी agno3, ६४ मिमी L (+)-एस्कॉर्बिक एसिड, और 6 मिमी नभ4. नभ4 को भंग करने के लिए ठंडे पानी (4 ° c) का प्रयोग करें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर फ्रिज में रखें । एस्कॉर्बिक एसिड समाधान के लिए नए सिरे से तैयार किया जाना है ।
    चेतावनी: ctab त्वचा संपर्क (अड़चन), आंख से संपर्क करें (अड़चन), घूस, और साँस लेना के मामले में खतरनाक है । उपयुक्त सुरक्षात्मक कपड़े पहनें । अपर्याप्त वेंटिलेशन के मामले में, उपयुक्त श्वसन उपकरण पहनें । त्वचा संपर्क (अड़चन), आंख से संपर्क (अड़चन), घूस, और साँस लेना के मामले में नभ4 अत्यंत खतरनाक है । छप काले चश्मे, एक प्रयोगशाला कोट, दस्ताने, और एक वाष्प और धूल श्वायक पहनें । किसी अनुमोदित/प्रमाणित श्श्एटर या समतुल्य का उपयोग करना सुनिश्चित करें ।
  3. Au बीज तैयार करें ।
    1. जोड़ें ५०० μl के ctab (०.२ M), २५० μl की ultrapure पानी, और २५० μl of haucl4 (1 मिमी) में एक गिलास शीशी । 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ४५० आरपीएम पर हलचल ।
    2. १,२०० आरपीएम के लिए सरगर्मी दर में वृद्धि. ठंडे नभ4 समाधान (6 मिमी, 4 डिग्री सेल्सियस) के १०० μl जोड़ें । 2 मिनट के बाद, सरगर्मी बंद करो और 30 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी स्नान में समाधान सेते का उपयोग करने से पहले ।
  4. aunrs तैयार करें ।
    1. एक गोल-नीचे फ्लास्क में 15 मिलीलीटर गर्म पानी (60-65 डिग्री सेल्सियस) में 2, 6-डाईहाइड्रोक्सीबेंजोइक एसिड के ०.५५ जी का ctab और ०.०३७ ग्राम भंग करें । 30 डिग्री सेल्सियस के लिए समाधान शांत हो जाओ, agno3 (4 मिमी) के ६०० μl जोड़ें, और 2 मिनट के लिए ४५० rpm पर हलचल । फिर, 30 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए समाधान अबाधित छोड़ दें ।
    2. समाधान करने के लिए haucl4 (1 मिमी) के 15 मिलीलीटर जोड़ें, और 15 मिनट के लिए ४५० rpm पर हलचल । L (+)-एस्कॉर्बिक एसिड (६४ मिमी) के १२० μl जोड़ें, और फिर, तुरंत, 30 एस के लिए १,२०० आरपीएम पर हलचल. Au बीजों की 12 μl जोड़ें, और 30 एस के लिए १,२०० आरपीएम पर सरगर्मी रखें ।
    3. 18 ज के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी स्नान में समाधान सेते । समाधान को परेशान न करें और फ्लास्क को बंद करने के लिए कैप का उपयोग करें ।
    4. परिणामी समाधान को अपकेंद्रिकी ट्यूबों में स्थानांतरित करें, और 20 डिग्री सेल्सियस पर 12 मिनट के लिए ९,५०० एक्स जी पर अपकेंद्रिप करें । supernatant त्याग, ultrapure पानी की 20 मिलीलीटर में गोली फैलाने, और एक और अधिक अपकेंद्रीकरण कदम प्रदर्शन ।
    5. आसुत जल के 3 मिलीलीटर में अंतिम गोली को तितर-बितर कर दें । अनुदैर्ध्य plasmon गूंज के लिए विलुप्त होने गुणांक का उपयोग कर एक यूवी तुलना अवशोषण माप से aunrs की एकाग्रता का अनुमान है । विलुप्त होने गुणांक aunr आकार मापदंडों४१का उपयोग कर भविष्यवाणी की जा सकती है । आगे उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर aunrs स्टोर ।

5. एकल-असहाय डीएनए के साथ गोल्ड नैनोरोड्स का कार्यीकरण

नोट: यह खंड पिछले साहित्य४२से अनुकूलित तथाकथित कम पीएच मार्ग का अनुसरण करते हुए एकल-असहाय डीएनए (ssdna) के साथ aunr कार्यीकरण के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करता है । डीएनए के साथ कवर किए गए aunrs को अपकेंद्रीकरण द्वारा शुद्ध किया जाता है; वैकल्पिक रूप से, अग्गोस जेल वैद्योत् संचलन का उपयोग करके शुद्धिकरण किया जा सकता है ।

  1. डिसल्फाइड बांड को कम करने के लिए 1 एच के लिए नए सिरे से तैयार की गई ट्रिस (2-कार्बोकेथाइल) फॉस्फिइन हाइड्रोक्लोराइड (tcep, 14 मिमी) के 20 μl के साथ थिओल-कार्टिलाइज्ड पॉलिट डीएनए किस्में (1 मिमी) के 20 μl को सेते हैं ।
    नोट: थियोल समूहों aunrs के साथ बांड फार्म, और polyt अनुक्रम origami पर polya10 संभाल के साथ संकर, जिसमें भी कई या बहुत कुछ आधार जोड़े एक खराबी या एक अस्थिर विधानसभा के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.
    सावधानी: tcep गंभीर त्वचा जलता है और आंख की क्षति का कारण बन सकता है । सुरक्षात्मक दस्ताने/सुरक्षा वस्त्र/आंख संरक्षण/चेहरा संरक्षण पहनें ।
  2. १५० μl के aunrs (10 एनएम) और tcep-इलाज थिओल-डीएनए (०.५ मिमी) के ४० μl मिलाएं । ०.०५% की अंतिम एसडीएस एकाग्रता तक पहुंचने के लिए aunr समाधान में 1% सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) जोड़ें । पीएच को 2.5-3 से ~ 1 μl के साथ एचसीएल (1 एम) में समायोजित करें ।
  3. 2 एच के लिए सेते जबकि ७० आरपीएम पर मिलाते हुए ।
    नोट: छड़ के आकार के आधार पर आऊंर-टू-डीएनए अनुपात 1:5000-15000 के क्रम में होना चाहिए । के लिए aunrs (७० एनएम x 30 एनएम) की धारा 4 में वर्णित प्रोटोकॉल के बाद तैयार, thiol की एक १३,००० अतिरिक्त-डीएनए की सिफारिश की है ।
  4. nacl को ०.५ मीटर के अंतिम nacl तक पहुँचने के लिए और कमरे के तापमान पर 4 एच के लिए सेते हुए ७० आरपीएम पर मिलाते हुए जोड़ें ।
    नोट: इस चरण में कोई रंग परिवर्तन एक विफल डीएनए कार्यीकरण का संकेत हो सकता है ।
  5. tbe बफर (10x) के साथ ~ ८.५ करने के लिए पीएच को समायोजित करें और रातोंरात सेते हैं ।
  6. डीएनए-aunrs 4x धोने बफर के 1 मिलीलीटर (०.१% sds के साथ 0.5 x tbe), और 30 मिनट के लिए ७,००० एक्स जी पर अपकेंद्रित्र के साथ नमूने मिश्रण से धोने । सतह पर तैरनेवाला निकालें और शेष तरल (~ ४० μl) में डीएनए-औंर resuspend । चरण 4.4.5 में वर्णित के रूप में एक यूवी तुलना अवशोषण माप से डीएनए-aunrs की एकाग्रता का अनुमान.
    नोट: समाधान थोड़ा ' बादल ' हो सकता है कदम पर 5.3-5.4 के कारण ctab के लिए की सतह से प्रतिस्थापन thiol-डीएनए द्वारा । समाधान 5 मिनट के लिए ~ ३५ डिग्री सेल्सियस तक वार्मिंग पर स्पष्ट हो जाना चाहिए ।

6. डीएनए origami टेंपलेट्स पर गोल्ड nanorods के विधानसभा

  1. mgcl2 जोड़ें शुद्ध डीएनए के समाधान के लिए-aunrs, 10 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए । शुद्ध डीएनए-aunrs और origami एक 10:1 अनुपात करने के लिए मिक्स ।
    नोट: एक कम अनुपात४३उत्पाद उपज कम हो सकती है ।
  2. ४० डिग्री सेल्सियस से 20 डिग्री सेल्सियस तापमान नियंत्रण के साथ एक मिक्सर में मिश्रण anneal जबकि ४०० आरपीएम पर मिलाते हुए, तालिका 2में प्रक्रिया का पालन.
    नोट: सीडी लक्षण वर्णन के लिए, नमूना आगे शुद्धि के बिना इस कदम के बाद मापा जा सकता है.
  3. अंतिम origami-aunr संरचनाओं को शुद्ध करने के लिए ०.७% agarose जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस (८० वी पर ३.५ एच) का उपयोग करें ।
  4. इमेजिंग के लिए एक श्वेत प्रकाश transilluminator का उपयोग करें । उत्पाद बैंड (origami-aunr डायमर) में कटौती (चित्रा 3), एक parafilm पर जेल तोड़, और तरल निकालने । पिपेट एक केन्द्रापसारक फिल्टर इकाई में तरल और 5 मिनट के लिए ३,००० एक्स जी में स्पिन । origami-औंर में समाधान में resuspend । जेल से वसूली उपज लगभग ५०% है ।
  5. कदम 4.4.5 में वर्णित के रूप में एक यूवी तुलना अवशोषण माप से origami-aunr संरचनाओं की एकाग्रता का अनुमान.

7. ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी इमेजिंग

नोट: यह यूरेनिल फोरमेट (उफौ) धुंधला प्रोटोकॉल पिछले साहित्य४४से अनुकूलित है ।

  1. मिक्स २०० μl यूएफओ समाधान (०.७५%) और 1 μl of naoh (5 M) और भंवर के लिए तुरंत 2-3 min. अपकेंद्रितक दाग समाधान के लिए 3-4 मिनट पर १४,००० एक्स जी. प्रकाश जोखिम से दाग को सुरक्षित रखें (जैसे, यह एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटकर).
    चेतावनी: उफौ विषाक्त अगर सांस या निगल लिया है और आंख में जलन पैदा कर सकता है । संक्षिप्त जोखिम या कम प्रदूषण के मामले में, एक श्वसन फिल्टर डिवाइस का उपयोग करें । गहन या लंबे समय तक प्रदर्शन के मामले में, एक आत्म निहित श्वसन सुरक्षात्मक उपकरण का उपयोग करें । दस्ताने पहनते हैं । दस्ताने सामग्री अभेद्य और उफौ और उसके समाधान के लिए प्रतिरोधी हो गया है । कसकर सील काले चश्मे पहनें ।
  2. चमक-निर्वहन कार्बन/formvar-लेपित उनि ग्रिड 6 एस के लिए सिर्फ हाइड्रोफिलिसिटी बढ़ाने के लिए उपयोग करने से पहले और संरचनाओं के चिपकने को बढ़ावा देने के । पिपेट 5 μl नमूना उनि ग्रिड पर गिरता है, 5-8 मिनट के लिए सेते, और धीरे ग्रिड के किनारे के साथ एक फिल्टर पेपर छू द्वारा ड्रॉप निकालें ।
  3. पिपेट एक बड़ा (~ 20 μl) और एक छोटे (~ 10 μl) एक parafilm पर दाग समाधान की बूंद । छोटे दाग समाधान ड्रॉप पर ग्रिड रखो और ग्रिड के किनारे के साथ फिल्टर पेपर छू द्वारा तुरंत सूखी । तो, यह 30 एस के लिए बड़ा दाग समाधान ड्रॉप पर डाल दिया ।
  4. ग्रिड के किनारे के साथ फिल्टर पेपर को छूकर ग्रिड पर तरल निकालें । ग्रिड होल्डर में ग्रिड लगाएं । ग्रिड के लिए प्रतीक्षा करने के लिए कम से 10 मिनट सूखी ।
  5. origami के नमूनों की विशेषता (चित्रा 4), aunrs (चित्रा 5), और origami-aunrs (चित्रा 6) द्वारा उनि ।

8. परिपत्र द्विचरोवाद मापन

  1. एन2 के साथ सीडी स्पेक्ट्रोमीटर 20 मिनट के लिए पुज ।
    नोट: अधिकांश CD स्पेक्ट्रोमीटर को लैंप प्रज्वलन से पहले N2 के साथ मिटाने की आवश्यकता होती है । सीडी स्पेक्ट्रोमीटर मैनुअल की जाँच करें.
  2. बैंडविड्थ, स्कैनिंग श्रेणी, और प्राप्ति चरण सेट करें ।
    नोट: स्कैनिंग रेंज aunrs के ऑप्टिकल गुणों पर निर्भर करता है, जो aunrs के आकार पर निर्भर करते हैं ।
  3. बफ़र के साथ रिक्त CD को मापने ।
  4. origami-aunr नमूनों की सीडी स्पेक्ट्रा उपाय (चित्रा 7).
    नोट: सीडी माप के लिए क्वार्ट्स या ग्लास cuvettes का उपयोग करें । प्लास्टिक cuvettes सीडी स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए अनुपयुक्त हैं । इसके अलावा, सबसे सीडी स्पेक्ट्रोमीटर अवशोषण और सीडी डेटा के एक साथ अधिग्रहण की अनुमति देते हैं ।

Representative Results

एन डी ए की छवियों डीएनए origami टेम्पलेट्स, aunrs, और अंतिम origami-aunrs विधानसभाओं चित्रा 4में दिखाया गया है, चित्रा 5, और चित्रा 6A, क्रमशः. उनके लिए उनि ग्रिड को बाध्यकारी वरीयता के कारण, origami-aunr विधानसभाओं आमतौर पर समानांतर origami बंडलों और छड़ (चित्रा 6ए) के रूप में देखा जाता है । थर्मल अनीलन origami टेम्पलेट्स पर aunrs के सही संरेखण के लिए आवश्यक है (चित्रा 6ए, बी). प्रोटोकॉल मजबूत plasmonic सीडी प्रतिक्रियाओं (चित्रा 7) के साथ चिरल मेटामॉलेक्सिक में aunrs के विधानसभा की उच्च पैदावार को सक्षम बनाता है ।

तापमान (° c) समय
८० 15 मिनट
७९-७१ 1 ° c/1 मिनट
७०-६६ 1 ° c/5 min
६५-६० 1 ° c/30 min
५९-३७ 1 ° c/६० मिनट
३६-30 1 ° c/15 मिनट
29-20 1 ° c/5 min
20 पकड़

तालिका 1: तापमान और डीएनए origami टेम्पलेट्स के थर्मल अनीलन के लिए दरें.

तापमान (° c) समय (min)
४० १३०
३६ १८०
३२ १८०
22 पकड़

तालिका 2: तापमान और aunrs और डीएनए origami टेम्पलेट्स के अनीलन के लिए समय धारण. चरणों के बीच शीतलन दर ०.१ डिग्री सेल्सियस पर सेट है/ डीएनए origami-aunr नमूने annealed जबकि ४०० rpm पर मिलाते हैं ।

Figure 1
चित्रा 1 : डीएनए की डिजाइन origami-templated चिरल metamolecules । (क) स्वर्ण नैनोरोड्स (aunrs) के वांछित सापेक्ष स्थानिक व्यवस्था की पहचान और डीएनए origami टेम्पलेट का एक उपयुक्त आकार । (ख) औंरों के संरचनात्मक मापदंडों का अनुमान लगाना (डीaunrs, launrs) और origami टेम्पलेट (Worigami, lorigami, Θ). स्टेपल कि आगे संशोधन की जरूरत के अनुमानित पदों की स्थिति जानें । (ग) कैडनैनो का उपयोग कर डीएनए origami टेम्पलेट्स के डिजाइन. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : ऑरगमी का एगैरोस जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस । (क) ८० पर 2 ज के लिए 1% एगारोस जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस के साथ शुद्धि (ख) 2% agarose जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस के साथ 4 एच के लिए ८० वी में लक्षण वर्णन कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : ऑरगस-औंर की एगैरोस जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस शुद्धिकरण । जेल (०.७%) अलग डीएनए के साथ विधानसभा प्रक्रिया के बाद तैयार नमूनों के लिए ८० V पर ३.५ h के लिए चलाया गया था-aunr-करने वाली origami अनुपात (20:1, 5:1) और नमूने (10:1 डीएनए-aunr-से-origami के लिए) के साथ/ 1, 2, और 3 बैंड में नमूनों की उनि छवियों के लिए, चित्रा 6देखें. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4 : डीएनए origami टेम्पलेट्स के प्रतिनिधि उनि छवि. origami संरचना २ १४ के होते हैं-हेलिक्स बंडलों (८० एनएम x 16 एनएम x 8 एनएम) पाड़ कतरा द्वारा एक साथ जुड़ा हुआ है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 : औंर के प्रतिनिधि उनि छवि । संश्लेषित aunrs के औसत आयाम हैं ७० x 30 एनएम. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6 : origami की उनि छवियां-aunr विधानसभाओं । (क) आन्लिंग के बाद ऑरगमी (बैंड 1 में चित्रा 3) पर आऊंर डायमर्स । (ख) आन्लन के बिना ऑरगमी पर औंर डायमर्स ( चित्रा 3में बैंड 2) । (ग) Origami-aunr समुच्चय (बैंड 3 में चित्रा 3) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7 : origami की सीडी स्पेक्ट्रा-aunr विधानसभाओं । बंद संरचनाओं की सीडी स्पेक्ट्रा (origami एक दाएँ हाथ विन्यास में ताला किस्में द्वारा तय टेम्पलेट्स, दो origami बंडलों के बीच ५० डिग्री के साथ) और खुला संरचना (ताला किस्में बिना origami टेम्पलेट्स). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Discussion

प्रोटोकॉल डिजाइन, विधानसभा, शुद्धिकरण, और aunrs के डीएनए origami आधारित चिरल विधानसभाओं के लक्षण वर्णन के पूरे कार्यप्रवाह का परिचय । प्रोटोकॉल में प्रयुक्त डीएनए origami टेम्पलेट्स उत्तेजकों के निर्माण के लिए विशेष रूप से उपयुक्त हैं-उत्तरदायी विधानसभाओं. प्रतिक्रियाओं के विभिन्न प्रकार और functionalizes ताला किस्में कि origami टेम्पलेट के चिरल राज्य को परिभाषित करने में शामिल किया जा सकता (चित्रा 1बी)24,25,26,31. स्थैतिक असेंबली के लिए, सरल ब्लॉक-आकार वाले टेंपलेट्स अक्सर पर्याप्त14,४५,४६,४७होते हैं ।

प्लास्मोनिक नैनोस्ट्रक्चर के निर्माण के लिए डीएनए origami-आधारित दृष्टिकोण डीएनए origami तकनीक४८की सीमाओं को इनहेरिट करता है । origami टेम्पलेट्स का आकार आमतौर पर पाड़ कतरा के आकार के द्वारा सीमित है. डीएनए संरचनाओं की स्थिरता कानून-नमक की स्थिति के तहत कम हो जाती है । सिंथेटिक स्टेपल किस्में की लागत नहीं बल्कि उच्च रहता है । हालांकि, संरचनात्मक डीएनए नैनो के क्षेत्र में हाल के घटनाक्रम इन सीमाओं को दूर करने की उम्मीद कर रहे हैं४९,५०,५१,५२,५३,५४ , ५५.

aunrs३४,३५,३६,३७के चिरल विधानसभाओं पैदा करने के लिए अन्य आणविक आधारित दृष्टिकोणों की तुलना में, डीएनए origami स्थानिक परिशुद्धता और प्रोग्रामेबिलिटी के एक उच्च स्तर प्रदान करता है ।

किरल असेंबलियों की विश्वसनीय और पुनरुत्पादनीय ऑप्टिकल प्रतिक्रियाओं को प्राप्त करने के लिए, हम दृढ़ता से aunr संश्लेषण४०के लिए प्रोटोकॉल्स को अनुकूल करने की अनुशंसा करते हैं, क्योंकि व्यावसायिक उत्पादों की गुणवत्ता और ऑप्टिकल गुण बैचेस के बीच भिन्न हो सकते हैं । अतिरिक्त अनीलन (चरण ६.२) को अक्सर डीएनए origami टेम्पलेट्स (चित्रा 6) के लिए aunrs की सही लगाव सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

अंत में, यहां वर्णित प्रोटोकॉल चिरल विधानसभाओं तक ही सीमित नहीं है । डीएनए origami जटिल plasmonic nanostructures9,10के निर्माण के लिए एक बहुत लचीला मंच प्रदान करता है ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक सीडी स्पेक्ट्रोमीटर के साथ उसकी सहायता के लिए एस voutilainen धन्यवाद. लेखकों ओटानानो-नैनोमिकरोस्कोपी सेंटर (aalto-nmc) में aalto विश्वविद्यालय द्वारा सुविधाओं और तकनीकी सहायता के प्रावधान को स्वीकार करते हैं । इस काम को फिनलैंड की अकादमी (ग्रांट ३०८९९२) और यूरोपियन यूनियन के क्षितिज २०२० अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम के तहत मैरी skłodowska-क्यूरी ग्रांट एग्रीमेंट No. ७१३६४ द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,6-Dihydroxybenzoic acid Sigma-Aldrich D109606-25 98+%
AgNO3 Alfa Aesar AA1141414 99.90%
Blue light transilluminator  Nippon Genetics FG-06 FastGene LED Transilluminator
Bromophenol Blue Acros Organics 403160050 For agarorose gel  loading buffer
Centrifugal filter units Merck Millipore 42600 DNA extraction from agarose
Chirascan CD spectrometer  Applied Photophysics
Cuvette  Hellma  105-202-85-40 Quartz SUPRASIL
DNA lobind tubes Eppendorf 30108051
Eppendorf Biospectrometer  Eppendorf 6135000904
Eppendorf ThermoMixer C Eppendorf 5382000015
Ficoll 400 Thermo Fisher Scientific  BP525-10 Polysucrose 400 (For agarorose gel  loading buffer)
Gel electrophoresis sets Thermo Fisher Scientific
Gel imager Bio-Rad Gel Doc XR+ System 
HAuCl4•3H2O Alfa Aesar AA3640006 99.99%
HCl  Scharlau AC07441000 1M
Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) Sigma-Aldrich H9151-100 BioXtra, 98+%
L(+)-ascorbic acid Acros Organics 401471000 99+%
M13p7560 scaffold strand Tilibit nanosystems
MgCl2•6H2O Sigma-Aldrich M2670-500 BioXtra, 99+%
NaBH4 Acros Organics 200050250 99%
NaCl Sigma-Aldrich S7653-500 BioXtra, 99.5+%
NaOH Sigma-Aldrich S8045-500 BioXtra, 98+%
Parafilm Sigma-Aldrich P7668-1EA PARAFILM M
PBS buffer (10X) Thermo Fisher Scientific BP3991 Molecular Biology
ProFlex PCR System Thermo Fisher Scientific 4484073
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich 74255-250 99+%
Staple strands Thermo Fisher Scientific
Sybr Safe Invitrogen  S33102 For DNA stain
TBE buffer (10X) Invitrogen 15581-044 Molecular Biology
TE buffer (10X) Thermo Fisher Scientific BP24771 Molecular Biology
TEM FEI FEI Tecnai F12
Thiol-functionalized  ssDNA  Biomers.net
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP-HCl) Thermo Fisher Scientific PI20491
UltraPure Agarose Invitrogen  16500-100
Ultrapure water (Type 1) Milli-Q Direct 8 system
Uranyl Formate Tebu-bio 24762-1
White light transilluminator UVP TW-26

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References

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डीएनए Origami टेम्पलेट्स का उपयोग कर चिरल plasmonic मेटामोलेक्सिक में सोने nanorods के विधानसभा
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Huang, Y., Nguyen, M. K., Kuzyk, A.… More

Huang, Y., Nguyen, M. K., Kuzyk, A. Assembly of Gold Nanorods into Chiral Plasmonic Metamolecules Using DNA Origami Templates. J. Vis. Exp. (145), e59280, doi:10.3791/59280 (2019).

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