Summary
本文提出了一种人类牙髓干细胞分离和繁殖的方案, 以评估神经元分化过程中的 prion 蛋白表达。
Abstract
与操纵胚胎干细胞有关的生物伦理问题阻碍了医学研究领域的进展。因此, 从脂肪、脐带、骨髓和血液等不同组织中获得成人干细胞是非常重要的。在可能的来源中, 牙髓特别有趣, 因为在生物伦理方面很容易获得。事实上, 人类牙髓干细胞 (Hdpsc) 是一种成人干细胞, 能够在神经元样细胞中进行分化, 可以从健康患者 (13-19) 的第三磨牙中获得。特别是, 牙髓被删除与挖掘机, 切成小片, 治疗胶原酶 IV 和培养在一个烧瓶。为诱导神经元分化, 用 Egf/bfgf 对 Hdpsc 进行了2周的刺激。此前, 我们已经证明, 在分化过程中, hDPSCs 中细胞蛋白 (prpc) 的含量增加。细胞荧光分析显示, 在神经元分化过程中, Prpc的早期表达增加。siRNA PrP 消融 PrP可防止 Egf/bfgf 诱导的神经元分化。本文说明, 随着我们通过几个简单的程序加强了 hDPSCs 的分离、分离和体外培养方法, 获得了更有效的细胞克隆, 并大规模扩展了间充质干细胞 (mscs)。被观察到。我们还展示了用协议中详细介绍的方法获得的 hDPSCs 是研究骨髓间充质干细胞神经元分化过程以及随后的细胞和分子过程的一个很好的实验模型。
Introduction
间充质干细胞已从几个组织中分离出来, 包括骨髓、脐带血、人牙髓、脂肪组织和血液1、2、 3、4、5,6. 正如一些作者所报告的, hDPSCs 显示出塑料粘附, 这是一种典型的成纤维细胞样形态。这些代表了一个高度异质的群体与独特的克隆和差异的增殖和分化能力7,8。Hdpsc 表达间充质干细胞的特定标记物 (即 CD44、CD90、CD73、CD105、STRO-1), 对某些造血标志物 (如 CD14 和 CD19) 呈阴性, 并能够在体外多系分化9, 10,11。
一些作者已经证明, 这些细胞能够分化为神经元样的细胞使用不同的协议, 其中包括添加 ngf, bfgf, egf 结合特定的媒体和补充7,12.此外, 许多蛋白质参与神经元分化过程中, 其中一些论文显示了相关的作用和重要的表达细胞 prion 蛋白 (Prpc), 无论是在胚胎和成人干细胞13,14. prpc是一种多向异性分子, 能够在细胞内发挥不同的功能, 如铜代谢、凋亡和抗氧化应激 15、16、17,18,19,20,21,22岁
在前面的论文23中, 我们研究了 Prpc在 Hdpsc 神经元分化过程中的作用。事实上, Hdpsc 在早熟的情况下表达 Prpc, 在神经元分化后, 有可能观察到额外的增加.其他作者推测Prpc在干细胞神经元分化过程中可能起到的作用。事实上, Prpc 推动人类胚胎干细胞分化为神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞24.本研究的目的是强调牙髓干细胞的获取方法、分化过程以及 Prpc 在神经元分化中的作用.
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Protocol
研究中使用的第三磨牙被切除给以前没有吸毒或饮酒史、所有不吸烟和适当口腔卫生的患者 (13-19)。在解释当天, 在罗马 "Sapienza" 大学科学牙科和颌面系, 获得了患者或家长的知情同意。知情的同意是根据道德考虑和道德操守委员会的批准获得的。
1. 牙齿和牙齿纸浆提取
-
为养护或运输准备适当的介质。
- 用 l-谷氨酰胺 (494.5 mL) 制备杜尔贝科的修正鹰的中低葡萄糖浓度 (dmm-l)。
- 加入青霉素/链霉素5毫升 (1%)两性霉素0.5 毫升 (0.1%)。
- 从患者身上取出第三个磨牙, 用 PBS 快速冲洗, 用培养基放入15毫升试管, 并在不到2小时的时间内将其转移到实验室。
- 在生物危害罩下, 通过冠状切割通过平行和切线穿过纸浆室的屋顶, 用切割机打开牙齿。
- 用小型挖掘机轻轻取出纸浆, 并将其放入试管中。
- 用 PBS 清洗三次, 离心机在 RT 以 2, 500 x克g 清洗10分钟。
2. 牙髓和干细胞释放的处理
- 取出上清液, 重新悬浮汉克溶液中的颗粒, 并将其放入培养皿中。在 5% CO2 中37°C 时孵化 2小时.
-
第四型胶原酶溶液的制备。
- 准备0.8 毫升的 DMM-L。
- 在 DMM-L 和涡旋 0.8 mL 中熔融1毫克的 IV 型胶原酶。
- 添加 DMM-L 至1毫升, 以获得最终浓度 1 Mg/ml。
- 使用0.22μm 滤光片过滤溶液。
- 通过 2, 500 x克离心10分钟的 rt, 取出 hank 的溶液, 用一次性手术刀将纸浆分成大约1毫米的小片。
- 将纸浆切片放入培养皿中, 在 5% co2 中, 在37°c 条件下, 用1毫升的 IV 型胶原酶孵育 15分钟.
-
培养基制剂 (500 毫升)。
- l-谷氨酰胺对445毫升。
- 加入50毫升的胎儿牛血清 (FBS) (10%)。
- 加入青霉素/链霉素5毫升 (1%)。
- 在 RT以2, 500 x 克离心样品 10分钟, 取出上清液, 重新悬浮培养基中的颗粒 (步骤 2.5), 并在 t25 烧瓶中培养 5% co2 中37°c 的干细胞.
3. 干细胞培养和繁殖
- 每天检查培养, 在生长3天后, 观察烧瓶内不同的粘附细胞克隆。
- 每3天改变一次培养基。
- 在7至12天之间, 一旦粘附细胞到达融合, 在37°c 下用1毫升色氨酸 edta 对细胞进行3分钟的分离, 或使用细胞刮刀轻轻分离。
- 添加4毫升 (比例 1:5) 的培养基 (第2.5 步), 以停止胰蛋白酶的作用。
- 在 259 x g 离心细胞悬浮液 6分钟, 取出上清液, 并将细胞放入 t25 瓶中繁殖。
请注意:每3天细胞到达融合。 - 传播细胞长达21天或 28天 (约6-8 个通道), 以避免培养中存在非干细胞样细胞。
- 在37°c 下, 用1毫升的胰蛋白酶 edta 分离细胞 3分钟, 或轻轻刮擦。离心细胞悬浮液 6分钟, 259xg。
- 取出上清液, 测试细胞荧光分析 (步骤 6)。
4. 瞬态 PrP c 沉默
- 培养 hDPSCsin 6 孔板 (2 x10 5细胞) 与2毫升培养基 (步骤 2.5) 为24小时。
-
第二天, 制备 siRNA PrP 培养基 (400Μl)。
- 在无菌试管中, 加入 384Μl DMM-L。
- 为每种类型的 siRNA PrP 添加1μl 到 DMEM-L 的最终浓度为 5 nM (供应商使用并验证了 4 sirna PrP, 以保证击倒效率≥70%)。
- 在 DMM-L 中加入12μl 的转化试剂。
- 在 RT 中产生混合物和孵育 10分钟, 以形成转染配合物。
- 在每个样品中加入 400μl Sirna PrP 培养基, 在37°c 孵育6小时。
- 在不丢弃 siRNA PrP 培养基的情况下, 加入 1.6 mL (比例为 1-5) 培养培养基 (第2.5 步)。
- 在37°c 下离开细胞72小时。
- 在 RT 用2毫升的 PBS 取出上清液并清洗3次。
- 加入2毫升的神经元培养基, 为期7天或 14天 (步骤 5.1)。
- 每3天改变一次神经元培养介质。
请注意:每次更换 siRNA PrP 溶液, 以取代神经元培养基。 - 最后, 用 Rt 中的2毫升 PBS 清洗 3次, 并通过西布分析检测神经元表面抗原。
5. hDPSCs 的神经诱导过程
-
神经培养基制备 (500 毫升)。
- 准备444.7 毫升的基部培养基配制到神经元细胞。
- 在培养基中加入50毫升的无血清补充剂, 用于支持胚胎和成人神经元干细胞的长期活力 (10%)。
- 在培养基 (最终浓度为 20μml) 中加入200μl 的碱性成纤维细胞生长因子 (BFGF) (最终浓度为 40 Ng/ml), 并加入100Μl 的表皮生长因子 (egf)。
- 加入青霉素/链霉素5毫升 (1%)到的媒介。
- 从牙髓分离开始, 在6孔板 (2 x10 5 细胞) 中培养 hdpsc, 并用2毫升的神经元培养基对其进行刺激。
- 每3天丢弃上清液, 在 RT 用2毫升的 PBS 清洗 3次, 并更换2毫升的神经元培养基。
- 在7分钟或14天后, 用1毫升的色氨酸 edta 在37°c 下分离细胞 3分钟, 或用刮刀轻轻分离。
- 添加4毫升 (比例 1:5) 培养基 (第2.5 步), 以停止胰蛋白酶的作用。
- 通过流式细胞仪分析测试神经元表面抗原 (步骤 6) 或 prion 蛋白表达 (步骤 7) 的存在。
6. 流式细胞仪表征 hDPSCs
- 选择间充质间质 (MSC) 特异性或神经元表面抗原。
- 用2毫升培养基 (步骤 2.5) 在6孔板 (2 x10 5细胞) 中培养 Hdpscc。
- 在37°c 或轻轻刮板的情况下, 用1毫升的胰蛋白酶 edta 在牙髓分离28天或14天的神经元培养基 (步骤 5.1) 后分离 Hdpsc 3分钟。
- 加入4毫升 (比例 1:5) 培养基 (步骤 2.5), 在 rt 中停止胰蛋白酶作用和离心剂, 在259xg处停留 6分钟, 再清洗 2次, 在 rt 中使用2毫升的 pbs。
- 在4°c 下, 用4% 的甲醛在 PBS 中固定未经处理或经过处理的 hDPSCs 10分钟。
- 在 PBS 中使用 0.1% (v/v) 的非离子表面活性剂进行额外的 hDPSCS, 在 RT 增加10分钟。
- 在 RT 用5% 的脱脂干奶在1毫升的 PBS 中进行1小时的封堵。
- 用1毫升的 PBS 清洗 3次, 并用抗 CD105 (1:100/5 x 10 细胞) 孵育细胞,抗 cd44 (1: 100/----或 10个细胞)、抗 stro-1 (1:100/5 x 10 5细胞)、抗 cd90 (1:100/5 x 10 5细胞)、抗 cd73 (1:100/5 x 10 5 5 细胞)细胞)、抗Β3-boulin (1:100/5 x10 5 细胞)、抗 nfh (1:100/5 x 10 5 细胞) 和抗 gap43 (1:100/5 x10个细胞) mab, rt 1小时。
- 用1毫升的 PBS 清洗细胞 3次, 用抗鼠 PE (1:50/5 x10 5 细胞) 或抗兔 cy5 (1:50/5 x10 5 细胞) 孵育, 在 rt 额外存活1小时。
- 使用辅助抗体对免疫阳性细胞 (抗小鼠 PE 或抗兔 CY5 mAb) 进行门控, 并使用流式细胞仪分析所有样本, 并获得至少 20, 000个事件。
7. 流式细胞术评价 hDPSCs 中 Prpc 的表达
- 用2毫升培养基培养 hDPSCsin 6 孔板 (2 x10 5 细胞) (步骤 2.5)。
- 在21天和28天内, 用神经元培养基 (步骤 5.1) 与1毫升的胰蛋白酶 edta 分离 Hdpsc, 并停止步骤6.4 所述的胰蛋白酶作用。在4°C 下, 用4% 的甲醛在 PBS 中固定10分钟。
- 在 rt 中使用 0.1% (v/v) 非离子表面抗酸 PBS 进行10分钟的渗透. 去除上清液, 用兔抗 prp mAb EP1802Y (1:50/5 x10 5 细胞) mab 染色 1小时, rt. 用抗兔 cy5 (1:505 x 5个细胞) Mab 进行培养, 用于额外1小时。
- 使用流式细胞仪分析所有样品, 并获得至少 20, 000个事件。
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Representative Results
从第三磨牙中获得的 hDPSCs 从牙髓中分离和分离的过程是复杂的过程, 在这个过程中, 微小的变化会导致毁灭性的结果。在本文中, 我们使用了亚瑟等人的协议.12与几个改进。图 1显示了一个具有代表性的过程方案。
hdpsc 代表了具有明显克隆和增殖和分化能力差异的异质细胞群7,8。在牙髓分离和播种牙髓的微小碎片后, 我们观察到周围的细胞群在膨胀。图 2显示了从牙髓分离开始的 1天 (左面板)、4天 (中央面板) 和 7天 (右面板) 的一小群细胞。一般来说, 这些细胞群生长到大约7至12天的汇合处。
这些细胞在 EGF/bFGF 诱导的神经元分化后, 会减少其生长, 两周后就有可能观察到细胞形态和神经元生长的显著变化 (图 3)。
在图 4中, 我们显示未经治疗的 hdpsc 表达多能间充质间质特异性表面抗原, 如 cd44、cd90、cd105、cd73 和 stro-15、9。否则, 在适当的神经元诱导刺激后, Hdpsc 会表达特定的神经元标记, 如Β-3-Bubul、NFH 和 GAP43。Hdpsc, 未经治疗或治疗神经元诱导刺激, 不表达造血标志物, 如 CD14 和 CD19。
在图 5中, 我们显示 Hdpsc 在早熟的 prpc (21天和 28天) 中表达, 在 Egf/bfgf 诱导的神经元分化过程后再增加7天和 14天, Prpc 含量增加 (图 5a)。由于有几位作者报告说, PrPc 参与了细胞神经元分化, 我们评估了内源性 prpc在这一过程中的作用。因此, 应用小干扰 RNA (siRNA PrP) 消融 Prpc 及其功能 。在 Egf/bfgf 刺激前, 用 siRNA 预处理 72小时, 可防止神经元标记 b3-tbulin 和 NHF 的表达 (图 5b)。结果表明, siRNA 对 Prpc 的沉默影响了 Egf/bfgf 2周后诱导的hdpsc 神经元分化过程。
图 1: 从第三磨牙分离牙髓的方案.通过牙髓室的屋顶, 用冠状切割平行和切线的切割机打开了牙齿, 在无菌条件下, 用一个小挖掘机轻轻取出牙髓, 并将其放置在试管中。该纸浆, 在汉克的溶液处理后, 被切割成切片, 用胶原酶 IV 处理 15分钟, 并在 T25 瓶中繁殖。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 采用相色对比显微镜观察牙髓分离后不同日的 Hdpsc 形态.牙髓分离不同日 (1, 4, 7) 牙髓中 hDPSCs 的形态。刻度条 = 100μm. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 用相色镜观察 hDPSCs 的神经母细胞生长.经 Egf/bfgf 处理14天的牙髓中 hDPSCs 的形态。刻度条 = 100μm. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: Hdpsc 表征.流式细胞仪分析 CD44、CD90、CD105、CD73、STRO-1、CD14、cd19、Β-TAUL、NFH 和 GAP43 在未经处理或经 egfcf 处理的 Hdpsc 中的表达14天。直方图表示对数荧光与细胞数, 在侧散射/向前散射 (ss/fs) 直方图的细胞群上进行门控。将每个面板与相应的二级抗体进行比较, 作为负对照。给出了3个有代表性的实验。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: Prpc 在 hDSPCs 神经元分化中的作用.(a) 使用神经元诱导培养基Egf/ Fgf 对 prpc 表达进行细胞荧光分析 (牙髓分离后21天和 28天), 并在增加7天和14天后进行。将每个面板与相应的 IgG 负同型控制进行了比较。给出了3个有代表性的实验。(b) 西方印迹分析神经元标记Β-3-BUBUL 和 NFH 表达 (28天从牙髓分离) 和额外14天后与神经元诱导介质 Egf/bfgf 在 Sirna prp 的存在或不存在。图 5 (A, b) 已从 "Prion 蛋白-egfr 多分子复合物在人类牙髓干细胞神经元分化中的作用" 23修改.请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
在这项工作中, 我们集中在分离和神经元分化的方法 hDPSCs;此外, 我们还评估了 Prpc在这一过程中的作用。有几种方法可以分离和区分神经元样细胞中的 Hdpsc, 也有几个方法可以在此过程中采取关键步骤。Hdpsc 能够在几个谱系中进行分化, 如软骨细胞、脂肪细胞、成骨细胞和神经元。本文研究了神经元分化的机制和 Prpc 的存在.如上文所述, 这些细胞表达典型的间充质结构特异性表面抗原, 如 cd44、cd90、cd105、cd73 和 stro-110、25、26.
在协议中, 几个关键步骤可能会导致分离过程失败。第一个关键的步骤是由患者27的选择所代表。根据我们的经验, 我们发现, 捐献者年龄的增加 (gt;20) 逐渐降低了干细胞的增殖和分化能力。在我们的实验中, 我们使用了从13-19 的患者身上切除的第三磨牙, 这些磨牙以前没有吸毒或饮酒史, 所有这些都是禁烟的, 并有适当的口腔卫生。
第二个关键步骤表现为选择酶将细胞从牙髓组织中分离出来, 这可能是干细胞分离过程的主要热点步骤。事实上, 我们意识到, 广泛使用胶原酶 i 和 II, 这些酶可能过于具有攻击性, 可能会损害在分离过程中存在于牙髓组织中的细胞。为此, 我们决定使用胶原酶 IV, 因为这种胶原酶的胰蛋白酶活性低于 i 型和 II 型胶原酶。按照这个过程, 有可能在90% 的治疗牙齿中获得干细胞。
分离后, 含有 hDPSCs 的溶液在适当的烧瓶中培养, 直到6°通道 (约 21-28), 以避免培养中存在非干细胞。28天时, 对它们进行了典型间充质抗原的检测 (如上文所述), 仅在阳性时用于实验。事实上, 尽管多年来在 Hdpscc 方面取得了进展, 但人口的极端异质性仍然存在着重要的局限性。
正如几个作者所显示的, 牙髓中有不同的细胞群类型, 到目前为止, 不知道什么是最好的表型能够区分成每个间充质谱系 (软骨细胞, 脂肪细胞, 成骨细胞或神经元)。为了避免目前的限制, 我们和其他程序, 下一步将选择具有特定表型的细胞群使用特定的单克隆抗体。
在前面的工作中, 我们展示了Prpc 是由 hDPSCs 表示的。事实上, 在21天可以观察到弱的阳性, 在28天时可以观察到 Prpc 含量的增加。此外, 我们还观察到, 在 Egf/bfgf 介导的神经元诱导过程中, Prpc含量进一步增加。此外, 我们还研究了内源性 Prpc 在 Hdpsc 神经元诱导过程中的作用.Prpc 的瞬态沉默阻碍了 Egf/bfgf23 诱导的 hdpsc 分化过程。
我们通过简单和通用的程序对 hDPSCs 的分离、分离和体外培养方法进行了微调和改进。这些创新可以获得更有效的细胞克隆和骨髓间充质干细胞的大规模扩张。此外, 我们认为 hDPSCs 是一个很好的实验模型, 研究细胞和分子机制的 msc 神经元分化过程。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了 "Fondazione Varrone" 和 Rieti 大学枢纽 "Sabina 大学" 对 Vincenzo Mattei 的支持。
图 5 (A, b) 经出版商泰勒 & Francis Ltd 的许可转载, 来自: Prion 蛋白 egfr 多分子复合体在人类牙齿浆源性干细胞神经元分化过程中的作用。Martellucci, S., Manganelli V., Santacroce C., Santellli f., Piccoli l., Sorice M., Mattei v. prion. 2018年3月4日Taylor & Francis Ltd。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B solution | Sigma-Aldrich | A2942 | It is use to supplement cell culture media, it is a polyene antifungal antibiotic from Streptomyce |
| Anti-B3tubulin | Cell Signaling Technology | #4466 | One of six B-tubulin isoform, it is expressed highly during fetal and postnatal development, remaining high in the peripheral nervous system |
| Anti-CD105 | BD Biosciences | 611314 | Endoglin (CD105), a major glycoprotein of human vascular endothelium, is a type I integral membrane protein with a large extracellular region, a hydrophobic transmembrane region, and a short cytoplasmic tail |
| Anti-CD44 | Millipore | CBL154-20ul | Positive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells |
| Anti-CD73 | Cell Signaling Technology | 13160 | CD73 is a 70 kDa glycosyl phosphatidylinositol-anchored, membrane-bound glycoprotein that catalyzes the hydrolysis of extracellular nucleoside monophosphates into bioactive nucleosides |
| Anti-CD90 | Millipore | CBL415-20ul | Positive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells |
| Anti-GAP43 | Cell Signaling Technology | #8945 | Is a nervous system specific, growth-associated protein in growth cones and areas of high plasticity |
| Anti-mouse PE | Abcam | ab7003 | Is an antibody used in in flow cytometry or FACS analysis |
| Anti-NFH | Cell Signaling Technology | #2836 | Is an antibody that detects endogenous levels of total Neurofilament-H protein |
| Anti-PrP mAb EP1802Y | Abcam | ab52604 | Rabbit monoclonal [EP 1802Y] to Prion protein PrP |
| Anti-rabbit CY5 | Abcam | ab6564 | Is an antibody used in in flow cytometry or FACS analysis |
| Anti-STRO 1 | Millipore | MAB4315-20ul | Positive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells |
| B27 Supp XF CTS | Gibco by life technologies | A14867-01 | B-27 can be used to support induction of human neural stem cells (hNSCs) from pluripotent stem cells (PSCs), expansion of hNSCs, differentiation of hNSCs, and maintenance of mature differentiated neurons in culture |
| BD Accuri C6 flow cytometer | BD Biosciences | AC6531180187 | Flow cytometer equipped with a blue laser (488 nm) and a red laser (640 nm) |
| BD Accuri C6 Software | BD Biosciences | Controls the BD Accuri C6 flow cytometer system in order to acquire data, generate statistics, and analyze results | |
| bFGF | PeproThec, DBA | 100-18B | basic Fibroblast Growth Factor |
| Centrifuge CL30R | Termo fisher Scientific | 11210908 | it is a device that is used for the separation of fluids,gas or liquid, based on density |
| CO2 Incubator 3541 | Termo fisher Scientific | 317527-185 | it ensures optimal and reproducible growth conditions for cell cultures |
| Collagenase, type IV | Life Technologies | 17104019 | Collagenase is a protease that cleaves the bond between a neutral amino acid (X) and glycine in the sequence Pro-X-Glyc-Pro, which is found with high frequency in collagen |
| Disposable scalpel | Swann-Morton | 501 | It is use to cut tissues |
| DMEM-L | Euroclone | ECM0060L | Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose with L-Glutamine with Sodium Pyruvate |
| EGF | PeproThec, DBA | AF-100-15 | Epidermal Growth Factor |
| Fetal Bovine Serum | Gibco by life technologies | 10270-106 | FBS is a popular media supplement because it provides a wide array of functions in cell culture. FBS delivers nutrients, growth and attachment factors and protects cells from oxidative damage and apoptosis by mechanisms that are difficult to reproduce in serum-free media (SFM) systems |
| Filtropur BT50 0.2,500 mL Bottle top filter | Sarstedt | 831,823,101 | it is a device that is used for filtration of solutions |
| Flexitube GeneSolution for PRNP | Qiagen | GS5621 | 4 siRNAs for Entrez gene 5621. Target sequence N.1 TAGAGATTTCATAGCTATTTA N.2 CAGCAAATAACCATTGGTTAA N.3. CTGAATCGTTTCATGTAAGAA N.4 CAGTGACTATGAGGACCGTTA |
| Hank's solution 1x | Gibco by life technologies | 240200083 | The essential function of Hanks′ Balanced Salt solution is to maintain pH as well as osmotic balance. It also provides water and essential inorganic ions to cells |
| HiPerFect Transfection Reagent | Qiagen | 301705 | HiPerFect Transfection Reagent is a unique blend of cationic and neutral lipids that enables effective siRNA uptake and efficient release of siRNA inside cells, resulting in high gene knockdown even when using low siRNA concentrations |
| Neurobasal A | Gibco by life technologies | 10888022 | Neurobasal-A Medium is a basal medium designed for long-term maintenance and maturation of pure post-natal and adult brain neurons |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | Paraformaldehyde has been used for fixing of cells and tissue sections during staining procedures |
| penicillin/streptomycin | Euroclone | ECB3001D | It is use to supplement cell culture media to control bacterial contamination |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Euroclone | ECB4004LX10 | PBS is a balanced salt solution used for the handling and culturing of mammalian cells. PBS is used to to irrigate, wash, and dilute mammalian cells. Phosphate buffering maintains the pH in the physiological range |
| TC-Platte 6 well, Cell+,F | Sarstedt | 833,920,300 | It is a growth surface for adherent cells |
| Tissue culture flask T-25,Cell+,Vented Cap | Sarstedt | 833,910,302 | Tissue culture flask T-25, polystyrene, Cell+ growth surface for sensitive adherent cells, e.g. primary cells, canted neck, ventilation cap, yellow, sterile, Pyrogen-free, non-cytotoxic, 10 pcs./bag |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | Widely used non-ionic surfactant for recovery of membrane components under mild non-denaturing conditions |
| Trypsin-EDTA | Euroclone | ECB3052D | Trypsin will cleave peptides on the C-terminal side of lysine and arginine amino acid residues. Trypsin is used to remove adherent cells from a culture surface |
| Tube | Sarstedt | 62,554,502 | Tube 15 mL, 120 mm x17 mm, PP |
| VBH 36 C2 Compact | Steril | ST-003009000 | Offers totally protection for the enviroment and worker |
| ZEISS Axio Vert.A1 – Inverted Microscope | Zeiss | 3849000962 | ZEISS Axio Vert.A1 provides a unique entry level price and can provide all contrasting techniques, including brightfield, phase contrast, PlasDIC, VAREL, improved Hoffman Modulation Contrast (iHMC), DIC and fluorescence. Incorporate LED illumination for gentle imaging for fluorescently-labeled cells. Axio Vert.A1 is ergonomically designed for routine work and compact enough to sit inside tissue culture hoods. |
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