Summary
Vi presenterar en optimerad lokal utmatning förfarande med hjälp av en glas mikro-pipett och en snabb två-Photon hyperstack Imaging metod, som möjliggör exakt mätning av kapillär diameter förändringar och utredning av dess reglering i tre dimensioner.
Abstract
Underhåll av normal hjärnfunktion kräver en tillräcklig och effektiv tillförsel av syre och näring genom ett komplext nätverk av fartyg. Emellertid, regleringen av cerebralt blodflöde (CBF) är ofullständigt förstås, särskilt på kapillär nivå. Två-Photon mikroskopi är ett kraftfullt verktyg som ofta används för att studera CBF och dess reglering. För närvarande är detta område begränsas av avsaknaden av in vivo två-Photon mikroskopi studier undersöker (1) CBF svar i tre dimensioner, (2) utfört vaskulära svar, och (3) lokaliserade interventioner inom det vaskulära nätverket. Här beskriver vi en 3D in vivo metod med hjälp av två-Photon mikroskopi att studera genomförda vaskulära svar framkallade av lokala utmatning av ATP med en glas mikro-pipett. Vår metod använder snabb och repetitiv hyperstack två-Photon Imaging ger exakta diameter mätningar av maximal intensitet projektion av de erhållna bilderna. Dessutom visar vi att denna metod kan också användas för att studera 3D astrocytic kalcium svar. Vi diskuterar också fördelar och begränsningar av glas mikro-pipett insättning och två-Photon hyperstack Imaging.
Introduction
Hjärnan har en hög energiförbruknings takt. Om 20% av syre och 25% av glukos som förbrukas av den mänskliga kroppen är dedikerade till hjärnans funktion, medan hjärnan bara upptar 2% av den totala kroppsmassan. Underhåll av normal hjärnfunktion kräver en tillräcklig och effektiv tillförsel av syre och näring genom blodflödet i ett komplext nätverk av fartyg. Lokal hjärnaktivitet och cerebralt blodflöde (CBF) är robust kopplade, beroende på de funktionella egenskaperna hos nervceller, astrocyter, pericyter, glatta muskelceller (SMCs) och endotelceller (ECs)1. Nyligen, de första order av kapillärer förgrening från penetrerande arterioler har dykt upp som en "hotspot"2, visar aktiv reglering av kapillär blodflöde. En långsam genomfört vaskulär respons (CVR) upptäcktes vid denna "hotspot" i mus somatosensorisk cortex under både morrhår stimulering och lokal ejektion (puffing) av ATP med ett glas mikro-pipett3.
Även in vivo Imaging av två-Photon laserskanning fluorescerande mikroskopi har använts i stor utsträckning för att studera neurovaskulära reaktioner i hjärnbarken, de flesta av studierna mätt blodkärlens diametrar och undersökte deras reglering i en tvådimensionellt (2D) x-y-plan. Utmaningarna är: för det första, cerebrala blodkärl och deras omfamna astrocyter, pericyter och SMCs konstruera grenar i tre dimensioner (3D). Det är därför viktigt att studera deras interaktioner i 3D. För det andra, även en liten mängd avdrift i fokus kommer att påverka den exakta mätningen av både fartygs diameter och cellulära fluorescerande signaler. Slutligen, CVRs är snabba och långtgående i tre dimensioner. 3D-volymskanning är optimalt för att upptäcka CVRs och avslöja deras mekanismer. Vi genomförde en piezo motor mål i en två-Photon Mikroskop för att studera mus somatosensorisk cortex in vivo, vilket gör exakta diameter mätningar av maximal intensitet projektioner av de erhållna bilderna.
Mikropipetter av glas har ofta använts för in vivo Hjärnstudier, till exempel för att bulk-load organiska färgämnen4, rekord EEGs5 och för patch fastspänning6. Icke desto mindre kvarstår begränsningarna. Vanligtvis är spetsen på glasmikropipetten exakt placerad, eller mikropipetten används inte för lokala ingrepp. Här har vi optimerat förfarandet för mikro-pipettinsättning och lokal utmatning.
Dessutom, kombinationen av 3D två-Photon mikroskopi och genetiskt kodade fluorescerande indikatorer ger en oöverträffad möjlighet att undersöka neurovaskulär koppling i en 3D-scope. I denna studie, vi drog fördel av detta och injicerade virala vektorer som transporterar astrocytmodell specifika genetiskt kodade kalcium indikatorer i musen somatosensoriska cortex. Astrocyter samt kärl diametrarna avbildades samtidigt genom att kombinera olika fluorescerande markörer.
Sammantaget presenterar vi en optimerad metod för lokal utmatning (puffing) med glas mikro-pipett och snabb två-Photon hyperstack Imaging, som möjliggör exakt mätning av kapillär diameter förändringar. Dessutom ger vår metod ett nytt verktyg för att samtidigt studera 3D-profiler av ca2 + svar i astrocyter och vaskulär diameter svar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden som inbegriper djur godkändes av den danska nationella etikkommittén enligt de riktlinjer som anges i Europeiska rådets konvention om skydd av ryggradsdjur som används för experimentella och andra vetenskapliga ändamål och i enlighet med riktlinjerna för ANLÄND. Detta är ett terminalförfarande med möss som euthanized före bedövningsmedel återhämtning.
1. pre-kirurgisk förberedelse
- Rengör operationsbordet och hela det omgivande området med 70% etanol. Noggrant rengöra och torka av Operations verktygen före operationen.
- Anesthetize en NG2DsRed mus (TG (Cspg4-DsRed. T1) 1Akik/J; båda könen; 4-8 månader gammal) genom en peritonealdialys injektion av ketamin + xylazin (60 mg/kg + 10 mg/kg) upplöst i steriliserat vatten, pH 7,4. Administrera ytterligare doser av ketamin (30 mg/kg) var 25 min tills det kirurgiska ingreppet slutförts. Kontrollera svans och tå nypa reflexer regelbundet för att kontrollera djupet av anestesi.
- Injicera saltlösning subkutant på fyra olika ställen på bak med musen för en total volym på 1 mL för att förhindra uttorkning under experimentet. För att skydda ögonen från uttorkning, applicera Eye smörjmedel. Upprätthålla kroppstemperaturen vid 37 ° c med hjälp av en rektal temperatur sond och värme filt.
2. kirurgiskt ingrepp
- Trakeotomi
- Placera musen på ryggen. Injicera 0,04 mL av 0,5% lidokain subkutant under det planerade snittet och vänta i 2 min. gör ett 10 mm långt snitt ovanför bröstbenet (manubrium). Separera submandibular körtlar och sternothyroid muskler, och sedan utsätta luftstrupen.
- Gör trakeostomi mellan två trakealringar med saxar. Sätt i ett litet metallrör med en längd av 16,2 mm och en diameter på 1 mm i luftstrupen. Anslut röret till en mekanisk ventilator och capnograph för att övervaka end-expiratory CO2 (figur 1a).
- Insättning av kateter
- Injicera 0,5% lidokain (0,04 mL) subkutant under det planerade snittet och vänta i 2 min.
- Med hjälp av fina spets pinps separera försiktigt artären från venen. Stoppa blodflödet uppströms med en mikrovaskulär klämma. Constrict blodflödet nedströms med en 10-0 nylon sutur ligating båda blodkärlen.
- Använd mikro-dissekera sax för att göra ett litet snitt i både artären och venen. Sätt in plast katetrar i båda blodkärlen. Säkra katetrar genom att dra åt suturer (8-0 eller 10-0 nylon suturer beroende på fartygets storlek) utan att kompromissa kateter lumen. Ta bort mikrovaskulära klämman och Stäng huden.
- Övervaka blodtrycket via arteriell kateter. Mät nivåerna av blodgaser i arteriella blodprov (50 μL) före och efter varje experiment (normalvärden: pO2, 90-120 mmHg; PCO2, 35-40 mmHg; pH, 7.25-7.45) med hjälp av en blodgasanalysator. Använd venkatetern för infusion av fluorescein och anestesi.
- Kraniotomi
- Raka pälsen av huvudet på musen mellan öronen. Injicera 0,04 mL av 0,5% lidokain subkutant under det planerade snittet och vänta i 2 min.
- Torka skallen med en 10% järn-klo RID lösning för att ta bort periostet. Skölj skallen grundligt med saltlösning. Limma en metall huvud bar till skallen med cyanoakrylat lim och aktivator (figur 1a).
Anmärkning: metall huvudets stång är 75 mm lång och 13,5 mm bred, med ett runt hål på 5 mm diameter i mitten. - Borra en 4-mm-diameter kraniotomi, centrerad på 0,5 mm bakom och 3 mm till höger om bregma över rätt sensoriska Barrel cortex. Ta bort Dura med en fin-Tip Vessel Dilator.
- Täck den exponerade cortex med 0,75% aguppstod gel, upplöst i artificiell cerebrospinalvätska (aCSF; pH = 7,4) och kyls till 35 ° c. Täck 80-90% av kraniotomi med en glastäckslip i en vinkel på 10-15 ° till metall huvudet bar (figur 1B) som medger införande och placering av glaset Micro-pipett.
- För att minimera hjärnans pulsering, limma de två hörnen av glaset täckglas på metall huvudet bar med cyanoakrylat lim och aktivator. Applicera aktivator noggrant för att förhindra att få på den exponerade hjärnan. Skölj det limmade glas täckglaset grundligt med saltlösning efteråt.
- Utför insättning av morrhår pad stimulering sond. Sätt in en uppsättning skräddarsydda bipolär elektroder (8 mm längd och 0,25 mm tjocklek) perkutant i vänster sida av ansiktet för att stimulera Ramus infraorbitalis av trigeminusnerven kontralateral till kraniotomi. Placera katoden nära paus infraorbitalis, och sätt in anoden i tuggmusklerna7. Utför stimulering med en elektrisk stimulator på en intensitet av 1,5 mA för 1 ms i tåg på 20 s vid 2 Hz.
- Efter avslutad kirurgi, administrera en bolus av 0,05 ml fluorescein isotiocyanat-dextran (FITC-dextran, 4% w/v, molekylvikt [MW] 50 000) i lår bens ven att märka blodplasman. Avbryt ketamin och Byt anestesi till kontinuerlig intravenös infusion av α-kloralos (17% w/v, slutkoncentration) blandat med FITC-dextran (2% w/v, slutlig koncentration) vid 0,02 mL/10 g/h. vänta i ungefär en halvtimme för att stabilisera den nya anestesi tillstånd.
Anmärkning: både FITC-dextran och α-kloralos löses i 0,9% saltlösning.
3. första två-Photon Imaging session
- Överför musen till stadiet av en kommersiell två-Photon Mikroskop (tabell över material). Enligt både rött fluorescerande protein (RFP, figur 1c) och grönt fluorescerande protein (GFP, figur 1c) lägen av EPI-fluorescerande belysning, ta en bild av den exponerade cortex med en 5x mål. Använd RFP-bilden som en "Map" för att infoga glasmikropipetten i nästa session.
Obs: den GFP "Map" används för att skilja vener/venules från artärer/arterioler. - Utför två-Photon Imaging med två-Photon Mikroskop och en 25x 1,0 numerisk bländare (NA) vatten-Immersion mål med piezo motor. Ställ in magnetiseringen våglängd till 900 nm. Sök i cortex och följ varje penetrerande arteriole och hitta dess horisontella grenar (1St ordning kapillärer).
- Bild penetrerande arterioler och deras 1St ordning kapillärer i vila och under morrhår pad stimulering. Se detaljerade avbildnings parametrar i avsnitt 5.
- Markera platser av 1St ordning kapillärer med > 5% vasodilatation under morrhår pad stimulering på RFP "Map" (figur 1C). Platser med < 5% vasodilatation anses vara utanför morrhår fat cortex regionen.
Anmärkning: om du använder Wild-typ möss i stället för NG2DsRed möss i experimentet, GFP bilden används som "Map" i stället.
4. införande av glasmikropipett
- Förbered Mikropipetter av glas för puffing med hjälp av en pipettavdragare (tabell över material). Mikropipetter av glas har ett motstånd på 3-3.5 MΩ och en Kona längd på 4,5-5 mm. Ladda en pipett med en blandning av 1 mM ATP och 10 μM Alexa 594 för att visualisera pipettspetsen under EPI-lysröret och två-Photon-mikroskopet.
- Montera glaset Micro-pipetten på en patch klämma hållare och Anslut den till en luftpump. Ställ in pumpens håll tryck på 0 psi.
- Med hjälp av röd EPI-fluorescerande belysning, fokusera på pipettspetsen med 5x-målet. Placera glaset Micro-pipetten i aCSF ovanför aguppstod. Justera luft pumpens håll tryck till 0,2 psi. Ett litet rött moln kan observeras utmatning av pipettspetsen i aCSF. Detta för att förhindra igensättning vid insättning av pipetten.
- Välj en av de markerade platserna i RFP ' Map ' som destination. Flytta pipettspetsen till täckglasets horisontella plan med 30 μm avstånd, vilket ungefär pekar mot destinationen i x-y-planet.
- Sänk försiktigt pipettspetsen i z-axeln under täckglasslip. Börja sedan framåt glaspipetten mot destinationen tills ~ 500 μm ovanför hjärn ytan. Växla fokus ofta mellan täckglaskanten, pipettspetsen och hjärn ytan, och se till att det finns tillräckligt med ledigt utrymme för att flytta pipetten.
- Byt mål till 25x. Centrera pipetten på nytt och för vidare pipettspetsen ytterligare mot destinationen på RFP-kartan. Förvara pipettspetsen i aguppstod-skiktet.
- När pipettspetsen är ~ 100 μm över hjärn ytan, växla bildläge till två-Photon mikroskopi. Fokusera på en mål plats där att flåsa. Anteckna x-, y-koordinaterna (x0, y0) och djupet under ytan (z0). Beräkna koordinaterna för insättningspunkten på hjärn ytan (xi, yi) enligt följande:
xi = x0 + z0 /Tan θ
yi = y0
där θ är vinkeln mellan pipetthållaren och horisontalplanet. - Placera pipettspetsen till koordinaterna (xi, yi) på hjärn ytan. Sätt försiktigt i pipetten tills den når (x0, y0, z0). Om ett fartyg är i vägen för en insättnings väg, dra upp pipetten och omberäkna andra införingskoordinater och bana; eller vridscen plattan något (som visas i figur 1A).
- Ställ in pumpens håll tryck vid 0 psi och ejektionstryck vid 10-15 psi. Puff ATP för 200-400 MS på målplatsen under två-Photon Imaging. Justera trycket och varaktigheten av puffing för varje pipett och med tiden som förklaras i diskussionsavsnittet.
5. hyperstack två-Photon Imaging
- Utföra experiment med två-Photon Mikroskop och en 25 x 1,0 NA vatten-Immersion mål med piezo motor. Ställ in magnetiseringen våglängd till 900 nm. Filtrera det avgivna ljuset för att samla rött ljus från DsRed (pericyter)/tetramethylrhodamine isothiocyanate-dextran (TRITC-dextran) färgning blodplasma och grönt ljus från FITC-dextran (blodplasma)/gcamp6 (GFP, astrocytic kalcium).
- Producera en högupplöst z-stack på platsen av intresse som innehåller en penetrerande arteriole, en 1St ordning kapillär, en 2nd för kapillär och möjligen angränsande fluorescerande celler (t. ex., pericyter, astrocyter). Bestäm x * y * z-volymen för hyperstack-avbildning genom att inkludera blodkärlens 3D-struktur så mycket som möjligt. Den totala höjden på varje stapel kan variera från 30-50 μm, medan x-y-planet grovt täcker en yta på 60 μm x 40 μm.
- Ställ in bildstapeln i bildhanteringsprogrammet så att den består av 8-10 flygplan med ett avstånd mellan flygplan på 4-5 μm. Piezo-motor målet stannar på varje nivå på z-axeln för att förvärva bilden av varje plan. Samplingsfrekvensen är 1 s per stapel och pixlars upplösning i x-y-planet är 0,2-0,3 μm (figur 2A). En inspelning innehåller normalt 10 pre-puff bild stackar och 150 post-puff bild stackar.
6. data behandling
- Bearbeta data med hjälp av skräddarsydd analytisk programvara. Plattar varje bildstapel till en bild med maximal intensitetsprojektion (figur 2B). Rita en rektangulär region av intresse (ROI) med en bredd av 3 μm vinkelrätt över fartyget av intresse (figur 2C).
- För att minimera störningar från skuggor av röda blodkroppar och från mindre vibrationer i cortex, genomsnittlig den rektangulära avkastningen genom att projicera den till en rad, som sedan representerar den genomsnittliga profilen för fartyget segmentet. Gör detta för varje maximal intensitet bild.
- Rita profil linjerna som en 2D-bild med x-axeln som representerar maximal intensitet bilder i kronologisk ordning (figur 2D, övre panelen). Använd en aktiv kontur algoritm (Chan-Vese segmentering) för att hitta kanterna på kärlet8,9 (indikeras av röda kurvor; Figur 2 D, övre panelen).
- Beräkna tidsförloppet för diametern ändras som skillnaden mellan kanterna på blodkärlet (vertikalt avstånd mellan de övre och nedre röda kurvor i figur 2D, nedre panelen). Normalisera diametern ändras till före puffing diameter baslinjen och rita kurvor av diameter förändras över tiden. Gör detta för varje ROI (figur 2E).
- Fartygets responsamplitud definieras som den högsta/lägsta toppamplituden efter puffing. Svars fördröjningen definieras som fördröjning av halv-Max amplitud (figur 2G). Spåra skeletterad vaskulär struktur manuellt genom att placera noder längs kärlen (figur 2F) och mäta geografiskt avstånd mellan varje ROI och penetrerande arteriole. Beräkna CVR-hastighet genom att dividera avstånd med latens skillnader.
7. viral Vector injektion
- För att samtidigt studera astrocytic kalcium svar, injicera en volym av 0,6 μL viral Vector (pZac 2,1 gfaABC1D-LCK-GCaMP6f, Addgene) i den somatosensoriska cortex av NG2DsRed möss, efter standard stereotaktisk viral Vector injektion förfarande 10.
- Efter tre veckor, astrocyter i mus somatosensorisk cortex uttrycka den genetiskt kodade kalcium indikatorn, GCaMP6f. Följ ovan nämnda kirurgiska ingrepp och två-Photon Imaging för möss. För att skilja mellan astrocyter och kärl lumina, TRITC-dextran i stället för FITC-dextran används för att färga kärlet lumina rött.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
När operationen var klar transporterades möss till två-Photon Mikroskop (figur 1a). En mikropipett av glas innehållande 1 mM ATP sattes in i närheten av destinations blodkärlet på målplatsen (figur 1B).
Vi utförde hyperstack Imaging samtidigt ge en puff på 1 mM ATP (figur 2a, kompletterande video 1). Varje bildstapel tillplattades till en bild genom maximal intensitetsprojektion (figur 2B). Rektangulära ROIs placerades vinkelrätt över fartyget för att mäta fartygets diameter förändring vid ATP puffing (figur 2C). Fartygs diametrarna mättes med hjälp av Chan-Vese segmentering (figur 2D). I Single puff inspelningar, normaliserade diameter förändringar vid varje ROI var överlagt att jämföra svaren från olika fartyg segment (figur 2E). Avståndet från varje ROI till penetrerande arteriole beräknades genom hand-ritning av vaskulära skelettet (figur 2F). Amplituder och latenser av dilatation och sammandragning vid varje ROI i Single puff inspelningar plottas över de beräknade avståndet från ROIs till penetrerande arteriole (figur 2H-K). Vasodilatation vid puffing försprids linjärt med en hastighet av 14,69 μm/s (uppströms) och 2,8 μm/s (nedströms), med början från korsningen av 1St och 2nd ordning kapillärer (figur 2H). Vasokonstriktion propagerade också linjärt på 3,92 μm/s, med början från penetrerande arteriole (figur 2I). Maximal amplitud av både vasodilatation och vasokonstriktion inträffade i 1St ordning kapillärer (figur 2J-K).
Dessutom, att kombinera astrocytspecifika viral vektor-redovisade fluorescerande kalcium indikatorer och två-Photon hyperstack Imaging, astrocytic kalcium svar på ATP puffing undersöktes (figur 3A, kompletterande video 2 ). Rektangulära ROIs placerades på astrocytic Somata och processer. ATP inducerade en ökning av intracellulära kalcium i astrocytiska processer men inte i astrocyt Somata (figur 3B).
Figur 1 : Diagram av in vivo två-Photon 3D Imaging och glass micropipett puffing. Aden sövda musen är i huvudet fastsatt på en metallstång och mekaniskt ventilerad. End-Tidal CO2 övervakas av en capnograph. Både morrhår pad stimulering och mikro-pipett puffing används för att inducera vaskulär diameter förändringar. Glas Micro-pipetthållaren monteras på scen plattan. Den femorala artären och ven är kateteriserad för att övervaka blodtryck och blodgaser, och att ingjuta anestesi och fluorescein, respektive. Bglas täckglaset täcker kraniotomi i en vinkel som medger fri förflyttning av pipetten. Den puffing Micro-pipett placeras i närheten av en genomträngande arteriole och dess kapillärer och innehåller en blandning av 10 μM Alexa 594 (röd färg i glas mikro-pipett) och 1 mM ATP. Den två-Photon Imaging är en snabb och repetitiv 3D-volym skanning som omfattar penetrerande arteriole och de första orden kapillärer, liksom angränsande astrocyter och pericyter. C) representativa bilder av rött fluorescerande protein (RFP) och grönt fluorescerande protein (GFP) med hjälp av EPI-fluorescerande belysning visas. De används som "kartor" vid insättning av pipetten. Röda cirklar Markera platser av 1St ordning kapillärer med > 5% vasodilatation under morrhår pad stimulering. Skalstapel: 50 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : ATP puffing av Micro-pipett inducerar kärldilatation, följt av sammandragning. (A) kaskad av flygplan i en representativ bildstapel inklusive penetrerande arteriole och 1St och 2nd för kapillärer. Pericyter är märkta med en röd fluorophore (NG2-DsRed) och fartyget lumen är märkt med FITC-dextran (grön). (B) maximal intensitet projektion av bildstapeln. (C) flera unikt färgade regioner av intresse (Rois) placerade vinkelrätt över vasulaturen för att mäta fartygets diameter. (D) topp, representativ fluorescerande intensitet över tid vid den mörkblå avkastningen från panel C. De två röda kurvorna definierar kanterna på kärlväggen. Det vertikala avståndet mellan de två röda kurvorna är fartygs diametern och visas som en funktion av tiden (nederst). (E) normaliserade diameter förändringar över tid vid varje ROI som svar på 1 mm ATP puffing. Mätningar baseras på ett enda experiment. F) det vaskulära skelettet spårades manuellt genom att placera noder längs kärlen. Gamplituder av dilatation eller sammandragning definierades som maximal positiv respektive negativ vaskulär respons under inspelningssessionen. Latensen av dilatation och sammandragningar rapporterades som tid till hälften positivt eller negativt maximum efter puffing debut. (H-K) Grafer visar latensen av dilatation (H), latensen av sammandragning (i), amplituden av dilatation (J), och amplituden av sammandragning (K) av alla Rois visas i panel C kontra avståndet för varje ROI från penetrerande arteriole. De streckade linjerna representerar den linjära monteringen av ledande svar uppströms och nedströms. p.a.: penetrerande arteriole. Skalbar: 10 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : ATP puffing med mikro-pipett inducerar astrocytic kalcium aktiviteter. (A) astrocytiska virala vektorer som transporterar en fluorescerande kalcium indikator injicerades i mus somatosensorisk cortex tre veckor före försöksförfarandet. Bild visar fartyget lumina märkta med TRITC-dextran (röd) och astrocytic kalcium i grönt. (B) flera Rois placeras på astrocytic Somata och processer. Vid 1 mM ATP-puffing, intracellulärt kalcium ökade i astrocytiska processer, men inte i Somata (prickade rutor), där kalciumnivåer större än medelvärdet plus 1,5 x standardavvikelsen definierades som signifikanta. Skalbar: 10 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande video 1: Time Series-film tillplattad från hyperstack avbildning av fartyg som svar på puffing av 1 mm ATP. Grön: FITC-dextran, Färgnings kärl lumen. Röd: NG2DsRed, färgning pericyter. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ned.)
Kompletterande video 2: Time-serien Movie tillplattad från hyperstack avbildning av astrocytic kalcium som svar på puffing av 1 mm ATP. Grön: astrocytic kalcium. Röd: TRITC-dextran, Färgnings kärl lumen. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ned.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En utmaning för vaskulära studier är den exakta mätningen av fartygs diametrarna. Den metod som vi beskriver här används en motoriserad piezo mål att göra snabba och repetitiva hyperstack Imaging av två-Photon mikroskopi. För det första, denna metod tillåter upprepade undersökningar av penetrerande arteriole, 1St ordning och 2nd order kapillärer utan förlust av fokus och ledde till upptäckten av långsamt genomförda vaskulära svar i kapillärer in vivo. För det andra, i kombination med en viral Vector injektion teknik, det gör det möjligt för oss att undersöka astrocytic kalcium svar i tre dimensioner, vilket är nödvändigt för studier av blod flödesreglering.
Denna metod är inte utan begränsningar. För det första är en smal rektangulär synfält definieras före 3D-avbildning för att uppnå hög temporala upplösning. Detta begränsar vanligtvis avbildning till första tre beställningar av kapillärer. För det andra måste lasrar av två-Photon Mikroskop vara perfekt inriktade. Laser förskjutning kommer falskt de-Center varje bildruta och öka kärlet diametermätning. För det tredje är samplingsfrekvensen för 3D-avbildning kan fånga långsamma CVRs och långsamma kalcium förändringar i astrocyter. 1-2 Hz per stapel är fortfarande inte tillräckligt snabb för att studera snabba cvrs11 eller snabb kalcium signaler i astrocyter12,13.
Dessutom, för att påverka fartyg av intresse lokalt, har vi optimerat förfarandet för exakt insättning av en glas mikro-pipett till en viss plats av mus hjärnbarken. Det finns flera kritiska steg för lyckad tillämpning av den här metoden. För det första måste vinkeln på glaset Micro-pipett innehavaren noggrant justeras. Det bör göra det möjligt för mikro-pipett att fritt manövrera under målet och glaset täckglas över den exponerade cortex. För det andra, under införandet av glaset Micro-pipett i aguppstod skiktet och cortex, ett litet tryck är nödvändigt för att hålla pipetten otilltäppta. Emellertid måste försiktighet utövas för att inte applicera för stort ett hållande tryck så att föreningen inte läcker före puffing. För det tredje, den puffing av pipetten bör testas i aguppstod skikt ovanför hjärnan för att hitta det optimala trycket och varaktighet frigöra tillräckligt puffing sammansatta på en puff samtidigt inte införa en uppenbar förskjutning av celler och fartyg på grund av mekaniska Tryck.
För att göra en mer exakt mätning av CVR-hastigheten bör volym skanningshastigheten förbättras. Det finns andra nyutvecklade Mikroskop för volymscanning, till exempel ett två-Photon Mikroskop med en akustisk optisk deflektor (AOD) skannar så snabbt som 5 volymer per sekund med samma rumsliga upplösning och volymstorlek (e-postkommunikation). Ljuskarms Mikroskop skannar även en större volymstorlek (350 μm x 800 μm x 100 μm) med 10 volymer per sekund14.
Vår mus förberedelse har också begränsningar. Akut mus kirurgi kan ha potentiella komplikationer. Smärtlindring medicin och anestesi kan påverka neurovaskulära reaktioner. Akut neuroinflammation kan också utlösas, vilket resulterar i mikroglial aktivering och leukocytos i kortikala vävnader och kärl. Även om spetsen storlek av glas mikro-pipetter är oftast mycket liten (< 1 μm), insättnings proceduren och ATP puffing kan också potentiellt utlösa mikroglial migration och embracement av insättningsstället inom 0.5-1 timme efter insättning.
Sammanfattningsvis, kombinationen av 3D-avbildning i två-Photon mikroskopi och lokaliserad puffing glass Micro-pipett är ett avancerat verktyg för att studera neurovaskulära aktiviteter och deras mekanism.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av Lundbecks stiftelse, NOVO-nordisk stiftelse, Danmarks oberoende forskningsråd | Medicinska vetenskaper och NORDEA Foundation Grant till centrum för hälsosamt åldrande.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma–Aldrich | A6138 | Apply upon exposed cortex for protection |
| Alexa 594 | Life Technologies | A-10438 | Stain puffing compound to red fluorescent color |
| ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Vasodilator and vasoconstrictor, puffing compound |
| Cyanoacrylate glue and activator | Loctite | Adhesives and SF7452 | Glue for metal piece and coverglass |
| Eye lubricant | Neutral Ophtha, Ophtha A/S, Denmark | Keep the mouse eyes moisterized | |
| FITC-dextran | Sigma-Aldrich | FD500S | Blood serum dye, green fluorescent color |
| NG2DsRed mice | Jackson Laboratory | 8241 | These transgenic mice express an red fluorescent protein variant (DsRed) under the control of the mouse NG2 (Cspg4) promoter |
| pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f | Addgene | 52924-AAV5 | Astrocyte specific viral vectors carrying genetically encoded calcium indicators |
| TRITC-dextran | Sigma-Aldrich | 52194 | Blood serum dye, red fluorescent color |
| List of Equipments | |||
| Air pump | WPI | PV830 | Give air pressure to pipette puffing |
| Blood gas analyzer | Radiometer | ABL 700 | Measure levels of blood gases |
| Blood pressure monitor | World Precision Instruments | BP-1 | Monitor aterial blood pressure |
| Body temperature controller | CWE | Model TC-1000 | Keep the mouse body temperature in physiological range |
| Capnograph | Harvard Apparatus | Type 340 | Monitor the end-expiratory CO2 from the mouse |
| Electrical stimulator | A.M.P.I. | ISO-flex | Apply whisker pad stimulation |
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | D-79232 | Mechanically ventilate the mouse in physiological range |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Two-photon microscope | Femtonics Ltd | Femto3D-RC | |
| List of Surgical Instruments | |||
| Anatomical tweezer | Lawton | 09-0007 | |
| Angled and balanced tweezer | S&T AG | 00595 FRAS-18 RM-8 | |
| Iris scissor | Lawton | 05-1450 | |
| Micro vascular clamp | S&T AG | 462 | |
| Mouse vascular catheters | Verutech | 100828 |
References
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and Function of the Blood-Brain Barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
- Hall, C. N., et al. Capillary Pericytes Regulate Cerebral Blood Flow in Health and Disease. Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).
- Cai, C., et al. Stimulation-Induced Increases in Cerebral Blood Flow and Local Capillary Vasoconstriction Depend on Conducted Vascular Responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (25), 5796-5804 (2018).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In Vivo Two-Photon Calcium Imaging of Neuronal Networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7319-7324 (2003).
- Mathiesen, C., et al. Activity-Dependent Increases in Local Oxygen Consumption Correlate with Postsynaptic Currents in the Mouse Cerebellum in Vivo. The Journal of Neuroscience. 31 (50), 18327-18337 (2011).
- Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Hausser, M. Targeted Patch-Clamp Recordings and Single-Cell Electroporation of Unlabeled Neurons in Vivo. Nature Methods. 5 (1), 61-67 (2008).
- Norup Nielsen, A., Lauritzen, M. Coupling and Uncoupling of Activity-Dependent Increases of Neuronal Activity and Blood Flow in Rat Somatosensory Cortex. The Journal of Physiology. 533 (3), 773-785 (2001).
- Wang, X. F., Huang, D. S., Xu, H. An Efficient Local Chan-Vese Model for Image Segmentation. Pattern Recognition. 43 (3), 603-618 (2010).
- Chan, T. E., Sandberg, B. Y., Vese, L. A. Active Contours without Edges for Vector-Valued Images. Journal of Visual Communication and Image Representation. 11 (2), 130-141 (2000).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic Gene Delivery in the Rodent Brain. Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2006).
- Chen, B. R., Kozberg, M. G., Bouchard, M. B., Shaik, M. A., Hillman, E. M. A Critical Role for the Vascular Endothelium in Functional Neurovascular Coupling in the Brain. Journal of the American Heart Association. 3 (3), 000787 (2014).
- Lind, B. L., Brazhe, A. R., Jessen, S. B., Tan, F. C., Lauritzen, M. J. Rapid Stimulus-Evoked Astrocyte Ca2+ Elevations and Hemodynamic Responses in Mouse Somatosensory Cortex in Vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (48), 4678-4687 (2013).
- Stobart, J. L., Ferrari, K. D., Barrett, M. J. P., Gluck, C., Stobart, M. J., Zuend, M., et al. Cortical Circuit Activity Evokes Rapid Astrocyte Calcium Signals on a Similar Timescale to Neurons. Neuron. 98 (4), 726 (2018).
- Bouchard, M. B., Voleti, V., Mendes, C. S., Lacefield, C., Grueber, W. B., Mann, R. S., et al. Swept Confocally-Aligned Planar Excitation (Scape) Microscopy for High Speed Volumetric Imaging of Behaving Organisms. Nature Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).
