Summary
우리는 photobleaching 실험 라이브 셀 후 형광 복구에 대 한 포괄적이 고 실용적인 프로토콜을 설명 합니다. 프로토콜은 aggresome 같은 유발된 구조에 노란색 형광 단백질 태그 p62의 이동성 측정 하는 데 사용 됩니다, 하지만 그것은 현미경 시스템 및 형광 단백질의 다양 한에 적용할 수 있습니다.
Abstract
Photobleaching (FRAP) 후 형광 복구 라이브 세포에서 단백질 이동성을 계량 하는 데 사용할 수 있는 현미경 기술 이다. 전형적인 FRAP 실험에서 정상 형광 반복된 이미징 낮은 강도 레이저 빛에 의해 관찰 된다. 그 후, 형광 분자는 고 강도 레이저 광에 짧은 노출을 통해 신속 하 고 irreversibly 장애인. 단백질 이동성에 대 한 정보는 형광의 복구를 모니터링 하 여 얻어진 다. 우리 사용 FRAP lipopolysaccharide (LPS)와 자극 후 p62 murine 세포에 aggresome 같은 유도 구조 (ALIS)에서 이동성을 확인 합니다. 많은 기존 FRAP 프로토콜 불완전 하거나 복잡 한 때문에, 우리의 목표 FRAP 실험 라이브 셀을 위한 포괄적인, 실용적인, 그리고 간단한 단계별 프로토콜을 제공 했다. 여기, 우리 RAW264.7 macrophage transfection 노란 형광 성 단백질-p62 (YFP-p62), 유도 ALIS의 LPS와 prebleach 및 postbleach FRAP 이미지 및 데이터 분석을 수집 하기 위한 단계적인 방법 셀을 노출 하 여 함께 설명 합니다. 마지막으로, 우리는 FRAP 실험을 실시 하는 때 고려해 야 할 중요 한 요소 토론.
Introduction
1,2세포를 형광 복구 후 photobleaching (FRAP) 라이브에서 단백질 역동성을 계량 하는 데 사용할 수 있는 현미경 기술 이다. FRAP의 인기와 높은 해상도, 속도, 감도, confocal 현미경 스캐닝 레이저의 광범위 한 상업적인 가용성 때문에 증가 하 고의 "무지개" 유전자 형광 단백질, 형광 녹색 같은 인코딩 단백질 (GFP) 고 노란 형광 성 단백질 (YFP)3. 인코딩된 유전자 형광 성 단백질 관심사의 단백질의 subcellular 지 방화에 대 한 허용 하는 관심사의 단백질에 융합 된다. 전형적인 FRAP 실험에서 관심 (ROI) 셀 내에서 수집 지역에서 정상 형광 낮은 강도 레이저 빛으로 그 투자 수익의 반복된 영상 통해 관찰 됩니다. 그 후, 형광 분자는 신속 하 고 irreversibly 나쁘게 라 함 표 백제 ROI, 고 강도 레이저 광에 짧은 노출에 의해 인수 투자 수익, 미리 정의 된 하위 집합에. 으로 새로운 표백된 단백질 시간이 지남에 표백된 단백질 보충, 형광 표 백제 ROI에에서 복구의 강도와 속도 단백질 이동성 (그림 1)4에 대 한 정보를 제공 합니다.
우리의 관심이 murine RAW264.7 세포에 aggresome 같은 유도 구조 (ALIS)에서 유비퀴틴 바인딩 단백질 p62 (sequestosome 1)의 이동성 lipopolysaccharide (LPS)와 자극 주도하는 FRAP 검토 후 결정 문학입니다. 불행히도, 많은 기존 FRAP 프로토콜의 불완전 하거나 지나치게 복잡 한5,6,7,,89입니다. 일부 레이저 설정, 빔 경로 구성 및 이미지 수집 매개 변수5,6,7,,89에 대 한 자세한 정보를 제공 하지 않습니다. 다른 표 백제 ROI 드리프트6,9 의 문제를 해결 하는 방법 또는 모바일 분수 (Mf), 움직이기 힘 드는 분수를 포함 하 여 중요 한 복구 매개 변수를 계산 하는 방법 등의 데이터 분석에 관한 주요 내용 생략 (나f), 그리고 복구 (t½)5,7의 하프 타임. 반대로, 다른 Mf, 계산 하는 데 사용 하는 복잡 한 수학 공식에 너무 많은 중점을 배치 나f및 t1/25,6,,89. 따라서, 우리의 목적은 라이브 셀 FRAP 실험에 대 한 포괄적인, 실용적인, 그리고 간단한 단계별 프로토콜을 제공 하는 것 이다.
Protocol
1. RAW264.7 Macrophage Transfection
- 완전 한 문화 매체 (Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM))에서 100000 RAW264.7 세포 (자료 테이블) 문화 (자료 테이블) 포함 4.5 g/L 포도 당 10% 태아 둔감 한 혈 청 (테이블의 자료 와 보충 ) 하 고 페니실린/스 (자료 테이블)에 35 m m 유리 하단 요리 (자료 테이블) 치료 배치 요리 37 °C/5% CO2 배양 기에서. 다음 날, 1 mg/mL polyethylenimine (페이) (자료 테이블)를 사용 하 여 셀 transfect.
- 믹스 1.5 μ g YFP p62의 혈 청 무료 DMEM (소 태아 혈 청 및 페니실린/스 없이 기본 매체)의 166 μ에 PEI의 8 μ와.
- Transfection 복잡 한 혼합물 혼합물 각 접시에 추가 하기 전에 15 분 동안 실내 온도에 앉아 보자.
- 세포와 락 접시 기존 매체에는 단지를 부드럽게 추가 합니다.
- 장소는 37 ° C /5% CO2 배양 기 하룻밤에 접시.
- 다음 아침, 접시, 떨어져 중간 발음 다음 완전 한 매체와 한 번 씻어. 접시에 완전 한 중간의 2 개 mL를 추가 하 고 날까지 복구 하는 세포를 허용.
2. 유도 ALIS Lipopolysaccharide (LPS)와
- 다음 날, 격판덮개에서 중간 발음 다음 완전 한 매체 포함 10 ng/mL의 LPS (자료 테이블) 1 mL를 추가 합니다. 37 °C/5% CO2 배양 기에서 5 h에 대 한 품 어 하 격판덮개를 허용 한다.
- LPS 치료 매체, 발음 후 감기, 메 마른 Tyrode의 버퍼 145 mM NaCl, 5mm KCl, 10mm 포도 당, 1.5 m m CaCl2, 1.0 m m MgCl2, 그리고 10 mM HEPES (pH 7.4)을 씻어 접시의 1 mL를 추가 합니다.
- 버퍼, 발음 다음 차가운, 살 균 Tyrode의 버퍼 10 μ g/mL nocodazole (테이블의 재료)와 보완의 1 mL를 추가 합니다. FRAP 이미징 및 분석 전에 15-20 분 동안 4 ° C에서 품 어 하 격판덮개를 허용 한다.
참고: HEPES 버퍼링 하는 화합물로 포함 하는 Tyrode의 버퍼를 사용 하 여 이미징 실내 온도에서 수행 될 수 있습니다. Nocodazole는 microtubules에 의해 ALIS 움직임 감소에 사용 되었다. 문화 매체 CO2 버퍼에 필요한 버퍼링 화합물으로 서 중 탄산염을 포함 합니다. 그렇지 않으면,는 중 탄산염 CO2의 부재에서 중간 변경 pH에 포함.
3. 관심의 영역을 선택 하는 Confocal 현미경의 설정
- 레이저 선택 및 빔 경로 구성
- 어떤 적당 한 confocal 현미경 (자료 테이블) 목표 또는 선 소프트웨어 (자료 테이블) 또는 어떤 적합 한 이미징 소프트웨어를 사용 합니다.
- 선택 아르곤/2 레이저의 514 nm 라인 YFP 527에서 512 및 피크 방출에서 피크 여기 있다 nm. 취득 버튼을 클릭 한 다음 레이저 버튼을 클릭 합니다. 레이저 컨트롤 창에서 클릭 아르곤/2 458, 477, 488, 514 nm, 다음 대기 버튼을 클릭 합니다. 워밍업을 레이저에 대 일 분 후, 에 버튼 (그림 2A)를 클릭 합니다.
- 100% (8.6 A) 514 nm 아르곤/2 레이저 라인의 레이저 파워를 설정 합니다. 취득 버튼을 클릭 한 다음 레이저 버튼을 클릭 합니다. 레이저 컨트롤 창에서 출력 [%] 필드에 100 을 입력 한 다음 Enter 단추 (그림 2A)를 누릅니다.
- 5%로 514 nm 아르곤/2 레이저 라인의 전송 설정. 취득 버튼, 채널 버튼 다음을 클릭 합니다. 검색 제어 창에서 채널 버튼을 클릭 한 다음 텍스트의 왼쪽에 사각 흰색 상자를 클릭 514 nm 라인 활성 열의 514 nm 레이저 라인 활성화. 514 nm 레이저 라인 (그림 2D)에 대 한 전송 [%] 필드에 5 를 입력 합니다.
- 이 밴드는 여기에 대 한 표본에 반사 되도록 HFT 458/514/561 위치로 기본 dichroic 빔 스플리터 (Haupt Farb Teiler (HFT))를 설정 합니다. 취득 버튼, 다음 구성 버튼을 클릭 합니다. 구성 제어 창에서 채널 모드 버튼, 다음 단일 트랙 버튼을 클릭 합니다. HFT 클릭 다음 드롭 다운 메뉴 (그림 2B)에서 HFT 458/514/561 를 선택 합니다.
- 두 번째 보조 dichroic 광속 분리기 (Neben Farb Teiler 2 (NFT2)) 빛의 100%를 편향 미러 위치를 첫 번째 보조 dichroic 빔 스플리터 (Neben Farb Teiler 1 (NFT1))을 설정 합니다. 취득 버튼, 다음 구성 버튼을 클릭 합니다. 구성 제어 창에서 채널 모드 버튼, 다음 단일 트랙 버튼을 클릭 합니다. NFT1 버튼을 클릭 합니다 다음 드롭 다운 메뉴 (그림 2B)에서 미러 를 선택 합니다.
- 되도록 NFT 515 위치로 두 번째 보조 dichroic 빔 스플리터 (NFT2)을 설정 그 파장 < 515 nm 반영 됩니다 및 파장 > 515 nm 전송 될 것입니다. 취득 버튼, 다음 구성 버튼을 클릭 합니다. 구성 제어 창에서 채널 모드 버튼, 다음 단일 트랙 버튼을 클릭 합니다. NFT2 버튼을 클릭 합니다 다음 드롭 다운 메뉴 (그림 2B)에서 노퍽 515 를 선택 합니다.
- Lp로 530, 긴 통과 (LP) 방출 필터 (EF) 설정 있도록 파장 > 530 nm 광 전 증폭 관 관 (PMT, 검출기)에 전송 됩니다. 취득 버튼, 다음 구성 버튼을 클릭 합니다. 구성 제어 창에서 채널 모드 버튼, 다음 단일 트랙 버튼을 클릭 합니다. 방출 필터 다음 드롭 다운 메뉴 (그림 2B)에서 LP 530 을 선택 합니다.
- 채널 3을선택 합니다. 취득 버튼, 다음 구성 버튼을 클릭 합니다. 구성 제어 창에서 채널 모드 버튼, 다음 단일 트랙 버튼을 클릭 합니다. Ch3 버튼의 왼쪽에 사각 흰색 상자를 클릭 하십시오.
- 이미지 수집 설정
- 선택 계획 Apochromat 63 x / 1.40 오일 목표 (자료 테이블). 현미경 접 안 렌즈를 통해 견본 보기 및 보기의 필드의 중앙에는 ALIS 장소. 취득 버튼, 마이크로 버튼 다음을 클릭 합니다. 현미경 제어 창에서 목표, 다음 선택 계획 Apochromat 63 x 클릭 / 1.40 오일 드롭-다운 메뉴에서 목표.
- 프레임 크기 512 x 512 픽셀, 8, 검사 속도 및 12 비트에 데이터 깊이를 설정. 취득 버튼, 다음 스캔 버튼을 클릭 합니다. 검색 제어 창에서 모드 단추 및 프레임 단추를 클릭 한 다음 512 버튼을 클릭. 입력 8 스캔 속도 필드에서 Enter키를 누릅니다 다음 12 비트 버튼 (그림 2C) 클릭 합니다.
- 1 과 3에 광학 줌 스캔 평균을 설정 합니다. 취득 버튼을 클릭 한 다음 검색 버튼을 클릭 합니다. 검색 제어 창에서 스캔 평균 숫자 필드의 아래쪽 화살표 단추를 클릭 하 다음 드롭 다운 메뉴에서 1 을 선택 합니다. 광학 줌 필드에 3 을 입력 한 다음 Enter (그림 2C) 키를 누릅니다.
- (바로 아래 채도) 582 1.95 공기 단위 및 검출기 이득을 pinhole를 설정 합니다. 취득 버튼, 다음 스캔 버튼을 클릭 합니다. 검색 제어 창에서 채널 단추를 클릭 하 다음 196 Pinhole 필드에 입력 한 Enter키를 누릅니다. 582 검출기 얻을 필드에 입력 한 다음 Enter (그림 2D) 키를 누릅니다.
- 514 nm 아르곤/2 레이저 라인 100% 전원 (8.6 A)로 설정 되어 있는지 확인 합니다. 취득 버튼, 다음 레이저 버튼을 클릭 합니다. 레이저 컨트롤 메뉴에서 출력 [%] 필드의 값에 100 (그림 2A) 해야 합니다.
- 514 nm 아르곤/2 레이저 라인 5% 전송으로 설정 되어 있는지 확인 합니다. 취득 버튼, 다음 스캔 버튼을 클릭 합니다. 검색 제어 창에서 514 nm 레이저 라인에 대 한 전송 [%] 필드의 값은 5 (그림 2D) 이어야 한다.
- 사각형 모양의 ROI (투자 수익 수집) 크기 150 x 150 픽셀 (194.6 µ m2)를 만듭니다. 취득 버튼, 다음 ROI 편집 버튼을 클릭 합니다. 투자 수익 편집 메뉴에서 사각형 아이콘을 클릭 다음 클릭 하 고 사각형 크기 150 x 150 픽셀 (194.6 µ m2)을 만드는 이미지 창에 드래그 (그림 1A).
참고: 수집 투자 수익의 관심 (b) 형광 ALIS (제어 ROI) 이며 최소 20 x 20 픽셀 (3.3 µ m2), 그의 영역 및 (c) 최소한 20 x 20 픽셀 (3.3 µ m 아무 형광 (배경 투자 수익)에 약간의 영역 (a)는 ALIS 포함 2) (그림 1A). 그것은 반복된 영상으로 발생할 수 있는 photobleaching를 제어할 수 있도록 제어 투자 수익 수집 투자 수익에에서 포함 해야 합니다. 여기 정의 된 투자 수익 수집 스캔 될 유일한 영역 될 것입니다. 반복된 레이저 인수 내 검색 투자 수익만 제한할 것 이다 photobleaching는 투자 수익 보다는, 예를 들어 photobleaching 전체 셀 또는 여러 셀, 그리고 PMT (검출기)에서 수집 된 픽셀의 수는 수 보다 큰 있을 것입니다. 픽셀 전체 셀 또는 여러 셀 후 PMT (검출기)에서 수집. - 설정 시간 시리즈 같은 일단 각 30 s. 취득 버튼을 클릭 후 시계열 단추를 수집 투자 수익 35 번 검사 했다. 시간 시리즈 제어 창에서 수동 시리즈 시작 버튼과 수동 시리즈 중지 버튼을 클릭 합니다. 수동 중지 시리즈 필드에 35 를 입력, Enter 키를 눌러 다음 30.0 초 주기 지연 버튼 (그림 2E)를 클릭 합니다.
- photobleaching 수집 수집 투자 수익의 5 prebleach 이미지를 스캔 수 5, 후 발생 되도록 표 백제 컨트롤을 설정 합니다. 취득 버튼, 다음 표 백제 편집 버튼을 클릭 합니다. 표 백제 제어 창에서 번호 검색 후 표 백제옆 흰색 사각형을 클릭 합니다. 검색 번호 필드에 5 를 입력 한 다음 Enter 키 (그림 2F).
참고: Prebleach 및 postbleach 이미지 같은 광학 깊이에 인수 한다. - 원형 모양의 표 백제를 10 픽셀 직경 ALIS는 내 투자 수익을 만들기 (지역 = 0.8 µ m2). 클릭 취득 | 표 백제를 편집 | 영역을 정의. 표 백제 지역 창에서 원 아이콘을 클릭 합니다. 클릭 하 고 만들 10 픽셀 직경을 가진 원형 이미지 창에 드래그 (지역 = 0.8 µ m2) (그림 2F).
- 300을 반복을 설정 합니다. 취득 버튼, 다음 표 백제 편집 버튼을 클릭 합니다. 표 백제 제어 창에서 반복 필드에 300 을 입력 한 다음 Enter 키 (그림 2F).
- 100% 전원 (8.6 A) 아르곤/2 514 nm 레이저 라인 및 표 백제 중 100% 전송 설정 합니다. 취득 버튼, 다음 표 백제 편집 버튼을 클릭 합니다. 표 백제 제어 창에서 왼쪽의 흰색 사각형 상자 클릭 514 nm. 514 nm 레이저 라인에 대 한 전송 [%] 필드에 100 을 입력 한 다음 Enter 단추 (그림 2F)를 누릅니다.
참고: 반복의 수는 실험적으로 결정 될 필요가 있다. 그것은 fluorophore, 표백, 구조체의 크기 및 레이저에 따라 달라 집니다.
- 데이터 컬렉션
- FRAP 실험을 시작 합니다. 처음 5 prebleach 이미지와 첫 번째 postbleach 이미지를 수집 다음 다음 방정식에 따라 표 백제 깊이 계산.
표 백제 깊이 경우 < 90, 실험을 중지 하 고 표 백제 깊이 충분 한 데이터를 삭제. 표 백제 깊이 ≥ 90 이면 이미지 처리 프로그램 및 스프레드시트 프로그램 (자료 테이블)와 분석에 대 한 데이터를 수집 합니다.
참고:는 ALIS의 드리프트 ≥3 µ m 인 실험을 중지 하 고으로 이미지의이 금액에 대 한 이미지 처리 소프트웨어 (자료 테이블)와 함께 분석 하 여 해결할 수 없는 데이터를 삭제. 언제는 ALIS의 드리프트는 < 3 µ m 이다, 이미지 처리 프로그램 및 스프레드시트 프로그램 (자료 테이블) 데이터 분석을 위한 데이터를 수집. - 드리프트는 ALIS의의 미만 3 µ m와 10 셀에서 10 ALIS에서 FRAP 데이터를 수집 합니다. 그런 다음 데이터 분석을 위한 개인용 컴퓨터에 목표.lsm 파일 전송.
- FRAP 실험을 시작 합니다. 처음 5 prebleach 이미지와 첫 번째 postbleach 이미지를 수집 다음 다음 방정식에 따라 표 백제 깊이 계산.
- 이미지 처리 프로그램에서 데이터 분석
- 정렬 또는 일치에 의해 이미지 드리프트에 대 한 올바른 (즉, 등록) 투자 수익 수집의 시간 시리즈 이미지의 스택. 이렇게 하려면 이미지 처리 프로그램 (자료 테이블), 각 목표.lsm 파일을 열고 다음 플러그인을 선택 | 등록 | StackReg | 번역. 다음 플러그인을 선택 | 등록 | StackReg | 강 체10.
- 투자 수익 표 백제에서 신호 강도 측정 하기 위해 설정 ROI 관리자. 선택 분석 | 도구 | 투자 수익 관리자. 타원형 도구를 선택, 10 픽셀의 직경을 가진 투자 수익 표 백제에 원을 그릴 다음 추가 단추를 클릭 합니다.
- 설정 투자 수익 관리자 제어 투자 수익에서에서 신호 강도 측정 하. 투자 수익 관리자에서 사각형 도구를 선택 제어 ROI 지역에서 20 x 20 픽셀의 사각형을 그릴 다음 추가 단추를 클릭 합니다.
- 설정 투자 수익 관리자 ROI 백그라운드에서 신호 강도 측정 하. 투자 수익 관리자에서 사각형 도구를 선택, 배경 ROI 지역에서 20 x 20 픽셀의 사각형을 그릴 다음 추가 단추를 클릭.
- ROIs를 이름을 바꿉니다. 투자 수익 관리자에서 분석할 ROIs를 추가한 후 이름을 그들 표 백제 투자 수익, 투자 수익 제어, 및 배경 ROI 따라.
- 측정 신호 강도 ROIs에. 표 백제 투자 수익, 투자 수익 제어, 및 배경 ROI, 더 를 선택한 다음 | 다중 측정. 모든 35 분할 영역을 측정 하 고 슬라이스 당 한 개의 행 선택 되어 있는지 확인 합니다. 설정 측정 창에서 회색 값 의미 에 선택 되어 있는지 확인 합니다.
참고: 이들은 원시 FRAP 데이터 (그림 1B)입니다. - 스프레드시트 프로그램 (자료 테이블)에 결과를 붙여넣습니다. 복사 표 백제 투자 수익, 투자 수익, 제어 그리고 배경 ROI 신호 강도 결과 붙여넣을 열 레이블이 표시 된 표 백제 투자 수익, 투자 수익 제어, 그리고 배경 ROI, 각각 스프레드시트 프로그램 (자료 테이블).
- 스프레드시트 프로그램에서 데이터 분석
- 배경 수정 표 백제 ROI에에서 신호 강도 및 컨트롤 (그림 1A, C) 투자 수익. 블리치 투자 수익을 표시 하는 열에 값에서 배경 투자 수익 을 표시 하는 열에 값을 뺄 스프레드시트 프로그램 (자료 테이블)에서 함수 도구를 사용 합니다. 제어 투자 수익을 표시 하는 열 값에서 배경 투자 수익 을 표시 하는 열에 있는 값을 뺍니다. 이러한 새로운 열 표 백제 ROI 수정 및 수정 제어 ROI를 레이블을 지정 합니다.
- 표 백제 ROI ROI (그림 1A, D) 제어의 배경-수정 신호를에서 신호를 정상화. 수정 제어 투자 수익을 표시 하는 열에는 값에 의해 수정 표 백제 투자 수익 을 표시 하는 열에 값을 스프레드시트 프로그램 (자료 테이블)에서 삽입 함수를 사용 합니다. 이 새로운 열 수정 표 백제 ROI 정규화레이블.
- 투자 수익 (그림 1A, E) 표 백제에서 5 prebleach 값의 평균을 수정 표 백제 ROI 정규화 열에 신호를 정상화. 투자 수익 표 백제에서 5 prebleach 값의 평균을 계산 합니다. 다음, 수정 표 백제 ROI 정규화 투자 수익 표 백제에서 5 prebleach 값의 평균으로 표시 된 열의 값을 나눕니다. 이 새로운 열 정규화 수정 Prebleach 평균 표 백제 ROI를 레이블을 지정 합니다.
- 모바일 분수와 커브 장착 데이터에서 복구의 하프 타임
- 곡선 맞춤 이미지 처리 프로그램 (자료 테이블)를 사용 하 여 정규화 및 수정 표 백제 투자 수익 데이터 이미지 처리 프로그램 (자료 테이블)에서 분석을 선택 | 도구 | 커브 피팅. 복사는 postbleach 정규화 및 수정 표 백제 ROI 값과 해당 시간 값은 다음 곡선 배관공 창으로 그들을 붙여 넣습니다. 곡선 배관공 드롭-다운 메뉴에서 선택 하는 지 수 회복 다음 에 맞게선택 합니다.
- 계산에 대 한 값을 제공 하는 복구 기능 매개 변수에서 Mf : '는,' 천천히 회복 분수; 'b', 회복 율; 그리고 'c,' 빠르게 확산 분수. 값 'a'와 'c' 방정식 Mf 에 연결 하 여 계산 Mf =는 c. 계산 If 방정식을 사용 하 여 + 난f = 1-Mf. T½ 을 계산 하는 방정식으로 'b'에 대 한 값을 대체 하 여
다음 t1/2에 대 한 해결. 11
다음 t1/2에 대 한 해결. 11
Representative Results
여기는 우리가 사용 FRAP p62 LPS와 RAW264.7 세포 치료에 ALIS에 3-5 h12의 이동성의 정도 검사 하는 일반적인 실험의 결과입니다. 그림 3 A 표시는 표 백제에서 얻은 원시 데이터 및 제어, 이미지의 스택 작은 금액에 대 한 올바른 정렬 했다 후 ROI를 배경 (< ~ 3 µ m)는 ALIS의 이미지의. Prebleach와 postbleach이이 ALIS에 YFP p62 형광 그림 3E 와 보조 비디오 1에 표시 됩니다. 그림 3 B 배경 보정 후 이러한 데이터를 보여줍니다. 그림 3 C 형광 제어 투자 수익에에서 대 한 수정 후 이러한 데이터를 보여줍니다. 그림 3 D 투자 수익 표 백제에서 5 prebleach 값의 평균 형광으로 정규화이 데이터를 보여줍니다. 표백의 학위는이 실험에 충분 한 (깊이 블리치 91.94 =). 이 ALIS 내 YFP p62 형광 복구 천천히, t1/2 = 128.27 s (2.14 분). YFP p62 아니었다이 실험에서 매우 모바일 단백질 Mf = 21.97 나f 78.03 =.
그림 1 : RAW264.7 세포 및 FRAP 이미지는 ALIS의 이미지 드리프트에 대 한 올바른 정렬 되었습니다 후 이미지 분석을 위한 단계 다이어그램. (A) 여러 ALIS 표 백제, 제어, 및 수집 투자 수익 내 배경 ROIs 묘사 RAW264.7 세포의 다이어그램. (B) 원시 FRAP의 이상 화 한 묘사 데이터 얻을 표 백제, 제어, 및 배경 ROIs 패널 A. (C)에서 배경 수정 되었습니다 원시 FRAP 데이터의 이상적인된 그래프. (D) 배경 수정 FRAP 제어 ROI에에서 형광으로 정규화 된 데이터의 이상적인된 그래프. (E)는 이상적인된 그래프 정규화 및 배경 수정 FRAP 데이터를 표 백제 투자 수익에에서 prebleach 형광으로 정규화 되었습니다. 약어: 콘 컨트롤; = BG 배경 =. 이 그림은 Rabut 및 Ellenberg4에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 레이저 선택 AIM 소프트웨어 (자료 테이블)에서 사용자 인터페이스의 이미지 경로 구성 및 FRAP 실험에 대 한 이미지 수집 매개 변수 빔. (A) 레이저 아르곤/2 레이저 라인, 출력, 및 사용 하는 관 전류를 보여주는 화면을 제어. (B) 구성 제어 화면 빔 스플리터 및 방출 필터 설정 사용. (C) 스캔 화면 이미지 취득에 사용 하는 설정을 제어 합니다. (D) 스캔 화면 pinhole, 감지기 이득, 오프셋 증폭기, 증폭기 이득, 및 아르곤/2 514 nm 레이저 라인에 대 한 전송 설정을 제어 합니다. (E) 시계열 사용 시간 시리즈 설정을 보여주는 화면을 제어. (F) 표 백제는 prebleach를 보여주는 화면을 제어 하 고 사용 된 매개 변수를 postbleach. 약어: HFT Haupt Farb Teiler (기본 dichroic beam splitter); = NT1 = Neben Farb Teiler 1 (첫 번째 보조 dichroic 광속 쪼개는 도구); NT2 = Neben Farb Teiler 2 (두 번째 보조 dichroic 빔 스플리터); EF = 방출 필터. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : RAW264.7 세포에 ALIS YFP p62 역학을 연구 하는 대표적인 FRAP 실험. (A) 표 백제, 제어, 및 배경 투자 수익에 대 한 원시 형광 강도 데이터입니다. (B) 데이터 패널 A에에서 주어진 후에 표 백제 및 제어 ROI ROI 배경에서 형광에 대 한 수정 되었습니다 했다. (C) 형광 배경-수정 제어 투자 수익에에서 대 한 계정에 표 백제 ROI의 형광 강도 정상화 후 패널 A와 B에에서 주어진 데이터. (D) 패널 A C에에서 정규화 및 배경 수정 표 백제 투자 수익 투자 수익 표 백제에서 처음 5 prebleach 값의 평균을의 형광 강도 정상화 후 주어진 데이터. Mf = 21.97, 난f 78.03, t1/2 = 128.27 = s (2.14 분), 그리고 표 백제 깊이 91.94 =. (E) prebleach (1.5 분)와 postbleach ALIS의 이미지 (0, 6, 및 16 분). 눈금 막대 = 5 µ m 이며 모든 패널에 대해 유효. 약어: 콘 컨트롤; = BG = 배경; Corr. = 수정; 규범입니다. = 정규화. 평균 = 평균. 이 그림에서 Cabe 외.12수정 된이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 비디오 1: photobleaching 전후 RAW264.7 macrophage에 전형적인 ALIS. YFP p62 형광 photobleach; 후 복구 하는 따라서, p62 매우 모바일 단백질 아니다. 이 실험, Mf = 25.62, 난f 74.38, t1/2 = 442.79 = s (7.38 분), 그리고 표 백제 깊이 = 90.19. 눈금 막대 5 µ m를 =. 이 비디오 수정 되었습니다 Cabe 외12하시기 바랍니다 여기를 클릭이이 비디오를 볼. (다운로드 오른쪽 클릭.)
Discussion
라이브 셀 FRAP 실험, 실용적인 포괄적이 고 간단한 단계별 프로토콜을 제공합니다. 여기, 프로토콜 RAW264.7 세포에 YFP-p62 ALIS에서의 이동성을 측정 하는 데 사용 했다 하지만 레이저 confocal 현미경 시스템을 스캔의 많은에 적용할 수 있는 유전자 인코딩 형광 단백질을 사용할 수 있습니다. 모든 현미경 시스템에 대 한 파일럿 실험이 photobleaching, 및 prebleach 및 postbleach 이미지 수집에 대 한 수집, 표 백제, 및 제어 ROI 크기, 레이저 강도 포함 한 최적의 FRAP 매개 변수를 결정 합니다. 그것은 각 유전자 인코딩된 형광 단백질 및 세포 라인에 대 한 다를 최적의 FRAP 기대 하입니다.
(A) 적합 한 달성 포함 FRAP 실험 실시 때 고려해 야 할 중요 한 요소는 깊이, (b) 간략 한 표백 단계, (c) 수 있도록 충분 한 시간 postbleach 전체 복구 기능, (d) photobleaching 효율성, 관찰의 사용 표 백제 (e). 반복 FRAP와 (f) 반복된 이미징 인해 형광 손실에 대 한 컨트롤의 포함 세포 독성. 3.3.1 섹션에 제공 된 공식에 따르면 산출 될 수 있다, 표 백제 깊이 ≥ 9013수 하는 것이 좋습니다. 때 표 백제 깊이 < 90, postbleach 형광 복구의 정도 과소평가 될 것입니다, 그리고 값의f, Mf, t1/2 것 이다 잘못 될. 기간 및 표 백제 유도 레이저 펄스의 강도 FRAP 실험 사이 다를 수 있습니다, 비록 photobleaching 단계 짧고 형광 복구 기능 보다 실질적으로 더 빠른 것이 중요 하다. 그것은, 상당한 양의 형광 복구 표백 단계 동안 발생할 수 있습니다. 긴 표 백제 시간, 형광 표백 단계에서 복구 하지 측정 것입니다, 그리고 그것은 나의 잘못 된 측정으로 이어질 것 이다f, Mf, 그리고t1/2. 또한,f, Mf, 나에 대 한 올바른 값을 얻을 수 및t1/2, 수집 투자 수익 관찰 해야 postbleach 표 백제 ROI에에서 형광 수준 고원에 도달 했습니다 때까지. 예를 들어 우리의 FRAP 실험에서 때 차이 If, Mf및 t1/2 값 32.2 분에 대 한 투자 수익 표 백제 때 우리가 투자 수익 표 백제 YFP-p62 관찰 대 postbleach의 YFP p62 형광 관찰에 대 한 15.1 분 postbleach; 따라서, 우리는 복구 기능 15.1 분 postbleach12에서 정점에 도달 하는 결론을 내렸다. Photobleaching 효율성, 관련 photobleaching 광학 줌 요인14의 제곱으로 증가 한다. 따라서, 높은 광학 줌 렌즈를 사용 하 여 신속한 photobleaching에 대 한 유리한 이지만; 중 바람직하지 않는 photobleaching 귀 착될 수 있다 후자 수 수 차지 제어 투자 수익을 이미징 하 여. 반복된 photobleaching 세포 독성 반응 산소 종 (ROS)의 발생으로 이어질 수 있습니다 피해 야 하는 것입니다. 그러나, 높은 강도 레이저에 노출으로 인해 선생님 세대의 정도 화학 fluorophores (예를 들어, 형광 항 체)15, 보다 유전자 인코딩된 형광 단백질에 대 한 낮은 그리고 생성 선생님 반응 더 높습니다. 내는 유전자 인코딩된 형광 단백질 보다 셀4에 다른 분자와. 생성 하는 세포 독성 선생님의 증가 가능성, 뿐만 아니라 반복된 photobleaching 그것은 제어 하기 어려운 피할 것입니다. 마지막으로, 낮은 레이저 전송은 모든 비 블리치 이미지 사용, 일부 photobleaching 변함없이 발생 합니다 하지,이 제어 해야 합니다. 이 가능한 컨트롤 포함 수집 투자 수익 내 컨트롤 ROI에에서 형광 모니터링, 이웃 표백된 셀에 컨트롤 이미지 획득 및 그 사용에 대 한 동일한 설정 제어 실험을 수행 합니다 photobleaching 실험 photobleaching 이벤트 없이.
Disclosures
저자는 공개 충돌의 관심 있다.
Acknowledgments
우리는에 대 한 그의 귀중 한 의견이이 원고 Loyola 대학 시카고 박사 세스 Robia을 감사합니다. 이 작품은 NIH 그랜트 1R01NS073967-01A1 조 안 나 C. Bakowska에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Hyclone | SH30022.01 | High Glucose (4.5 g/L) |
| Fetal bovine serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | 35 mm |
| ImageJ software | National Institutes of Health | N.A. | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L4391 | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| Penicillin-streptomycin solution | Corning | 30-002-Cl | 100× |
| Plan-Apochromat 63×/1.40 Oil objective | Carl Zeiss MicroImaging, Inc | 4407629904000000 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Polysciences | 23966-1 | linear (MW 25,000) |
| RAW 264.7 murine macrophages | ATCC | TIB-71 | |
| Zeiss confocal microscope | Carl Zeiss MicroImaging, Inc | LSM 510 |
References
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