Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Photobleaching, sarı floresan Protein etiketli p62 indüklenen Aggresome benzeri yapılarda sonra Floresans kurtarma

Published: March 26, 2019 doi: 10.3791/59288
Automatic Translation
1, 2, 2
1Core Imaging Facility and Department of Microbiology and Immunology, Loyola University Chicago, 2Department of Molecular Pharmacology and Therapeutics, Loyola University Chicago

Summary

Sonra hücreleri ile photobleaching deneyler canlı Floresans kurtarma için kapsamlı ve pratik iletişim kuralı açıklar. Her ne kadar sarı floresan protein etiketli p62 aggresome benzeri indüklenen yapılarda hareketliliğini ölçmek için kullanılan protokol, çeşitli mikroskobu sistemleri ve floresan proteinler için uygulanabilir.

Abstract

Floresans kurtarma photobleaching (sıkı BAĞLAMAK) sonra canlı hücrelerdeki protein hareketlilik ölçmek için kullanılan bir mikroskobu tekniktir. Tipik bir sıkı BAĞLAMAK deneyde, kararlı durum Floresans yanında düşük yoğunluktaki lazer ışık ile tekrarlanan düşsel görülmektedir. Daha sonra floresan molekülleri kısa ışığa maruz kalma yüksek yoğunluktaki lazer ile hızla ve geri dönüşümsüz zarar görür. Protein hareketlilik hakkında bilgi Floresans kurtarılması izleyerek elde edilir. Sıkı BAĞLAMAK stimülasyon ile lipopolysaccharide (LPS) sonra p62 aggresome benzeri indüklenen yapıları (alış) fare makrofajlar içinde hareketliliğini belirlemek için kullanılır. Birçok varolan sıkı BAĞLAMAK iletişim kuralları eksik veya karmaşık olduğundan, hedefimiz bir kapsamlı, pratik ve basit adım adım protokol canlı hücreleri ile sıkı BAĞLAMAK deneyler için sağlamaktı. Burada, RAW264.7 makrofaj transfection sarı floresan protein-p62 (YFP-p62), LPS ve prebleach ve postbleach sıkı BAĞLAMAK görüntüleri ve veri analizi toplamak için bir adım-adım yöntemi hücrelere açığa tarafından alış indüksiyon ile açıklayın. Son olarak, biz bir sıkı BAĞLAMAK deney zaman dikkat edilmesi gereken önemli faktör tartışıyorlar.

Introduction

Photobleaching (sıkı BAĞLAMAK) protein dinamiklerini canlı ölçmek için kullanılan bir mikroskobu tekniktir sonra Floresans kurtarma1,2hücreleri. Sıkı BAĞLAMAK popülaritesi yüksek kararlılık, hız ve hassasiyet ile confocal mikroskoplar tarama lazer yaygın ticari durumu nedeniyle artmış ve bir "Gökkuşağı" genetik olarak flüoresan proteinler, yeşil flüoresan gibi kodlanmış protein (GFP) ve sarı floresan protein (YFP)3. Genetik olarak kodlanmış floresan proteinler bir protein ilgi proteinin hücre altı yerelleştirme için izin ilgi erimiş. Tipik bir sıkı BAĞLAMAK deneyde, kararlı durum Floresans ilgi (ROI) bir hücre içinde bir alım bölgesinde ki ROI düşük yoğunluktaki lazer ışık ile tekrarlanan görüntüleme ile görülmektedir. Daha sonra floresan molekülleri hızla geri dönüşümsüz bundan sonra yatırım Getirisi, çamaşır suyu kısa yoğun lazer ışık maruz anılacaktır edinme yatırım Getirisi, önceden tanımlanmış alt kümesinde engelliler ve. Yeni Ryslampa protein ağartılmış proteinler zamanla doldurmak gibi çamaşır suyu ROI toparlanmanın floresan yoğunluğu ve hız protein hareketlilik (şekil 1)4hakkında bilgi sağlar.

Stimülasyon lipopolysaccharide (LPS) ile sıkı BAĞLAMAK gözden geçirmek için bize yol sonra yapılarda aggresome benzeri indüklenen (alış) fare RAW264.7 makrofajlar içinde Ubikuitin bağlayıcı protein p62 (olarak da bilinen sequestosome-1) hareketliliğini belirlemede bizim ilgi Edebiyat. Ne yazık ki, mevcut sıkı BAĞLAMAK iletişim kuralları eksik veya haddinden fazla karmaşık5,6,7,8,9çoğu. Bazı görüntü edinme parametreleri5,6,7,8,9, ışın yolu yapılandırma ve lazer ayarlar hakkında ayrıntılı bilgi sağlar. Diğerleri çamaşır suyu ROI drift6,9 sorunu gidermek veya mobil kesir (Mf), hareketsiz kesir dahil olmak üzere önemli kurtarma parametreleri hesaplamak gibi veri analizi ile ilgili önemli ayrıntılar atlandı (Benf) ve yarı-zamanlı kurtarma (t½)5,7. Bunun tersi olarak, diğerleri Mf, hesaplamak için kullanılan karmaşık matematiksel formüller üzerinde çok fazla vurgu benfve t1/25,6,8,9. Böylece, bizim amacımız bir kapsamlı, pratik ve basit adım adım protokol canlı hücreleri ile sıkı BAĞLAMAK deneyler için sağlamaktır.

Protocol

1. RAW264.7 makrofaj Transfection

  1. 100.000 RAW264.7 hücreleri (Tablo reçetesi) tam kültür orta (Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM)) kültür (Malzemeler tablo) içeren 4,5 g/M glikoz % 10 fetal sığır serum ile (Tablo reçetesi desteklenmiş ) ve penisilin/streptomisin (Tablo reçetesi) üzerine tedavi edilmezse 35-mm cam alt yemekleri (Malzemeler tablo) ve bulaşıkları 37 °C/5% CO2 kuluçka makinesine koyun. İzleyen günde 1 mg/mL polyethylenimine (PEI) (Tablo reçetesi) kullanarak hücreleri transfect.
  2. Mix 1.5 μg PEI 8 μL serum serbest DMEM (fetal sığır serum ve penisilin/streptomisin olmadan temel orta) 166 μL içine ile YFP-p62.
  3. Her plaka karışımı eklemeden önce 15 dakika oda sıcaklığında oturup transfection karmaşık karışım izin.
  4. Kompleksleri hücreleri ve rock plaka mevcut Orta yavaşça ekleyin.
  5. Plaka bir 37 ° C /5% CO2 kuluçka gecede bir yer.
  6. Ertesi sabah, orta plaka kapalı Aspire edin sonra bir kez tam orta ile durulayın. 2 mL tam orta yerine ekleyin ve ertesi güne kadar kurtarmak hücreleri.

2. indüksiyon alış ile Lipopolysaccharide (LPS)

  1. Ertesi gün, tabakları ortamından Aspire edin, sonra tam orta içeren 10 ng/mL LPS (Tablo reçetesi) 1 mL ekleyin. 5 h 37 °C/5% CO2 kuluçka için kuluçkaya plakaları izin.
  2. LPS tedaviden sonra orta Aspire edin sonra soğuk, çorak Tyrode'nın arabellek 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM glikoz, 1.5 mM CaCl2, 1.0 mM MgCl2ve 10 mM plaka durulama HEPES (pH 7,4) içeren 1 mL ekleyin.
  3. Arabellek Aspire edin, sonra 10 μg/mL nocodazole (Malzeme tablo) ile desteklenmiş soğuk, çorak Tyrode'nın arabellek 1 mL ekleyin. 15-20 dk önce sıkı BAĞLAMAK görüntüleme ve çözümleme için 4 ° C'de kuluçkaya plakaları izin.
    Not: Bileşik tampon olarak HEPES içeren Tyrode'nın arabellek kullanımı oda sıcaklığında gerçekleştirilmesi için görüntüleme için sağlar. Nocodazole tarafından mikrotübüller alış hareketi azaltmak için kullanıldı. Kültür orta bikarbonat CO2 arabelleğine gerektiren bir arabelleğe alma bileşik içerir. Aksi takdirde, bikarbonat bulunan orta değişiklikler pH CO2yokluğunda içinde.

3. Kurulum Confocal mikroskop ve faiz bölge seçme

  1. Lazer seçimi ve ışın yolu yapılandırma
    1. Nişan almak ya da ZEN yazılım (Tablo reçetesi) veya herhangi bir uygun görüntüleme yazılımı ile donatılmış herhangi bir confocal uygun mikroskop (Tablo reçetesi) kullanın.
    2. 527, 512 nm ve en yüksek emisyon, en yüksek uyarma YFP olduğu gibi Argon/2 lazer 514 nm satırını seçin nm. Ele geçirme düğmesini tıklatın, sonra lazer düğmesini tıklatın. Lazer denetimi penceresinde tıklatın Argon/2 458, 477, 488, 514 nm, ayakta durmak düğme'yi tıklatın. Isınmak lazer ~ 3 dakika bekledikten sonra tıkırtı üstünde düğme (Şekil 2A).
    3. 514 nm Argon/2 lazer çizgi lazer gücü (a 8.6) % 100 olarak ayarlarsanız. Ele geçirme düğmesini tıklatın, sonra lazer düğmesini tıklatın. Lazer denetimi penceresinde 100 çıktı [%] alanına girin sonra (Şekil 2A) Enter tuşuna basın.
    4. 514 nm Argon/2 lazer çizgi %5 için ayarlamak. Edinme düğmesini, sonra kanal düğmesini tıklatın. Tarama denetimi penceresinde kanalları düğmesini tıklatın ve sonra metnin solundaki kare beyaz kutusunu tıklatın 514 nm 514 nm lazer çizgi etkinleştirmek için Etkin satırı sütunundaki. 5 514 nm lazer çizgi (Şekil 2D) iletim [%] alanına girin.
    5. Birincil dikroik ışın ayırıcı (Haupt Farb Teiler (HFT)) bu grup için uyarma için numune bükülmesi HFT 458/514/561 konumuna ayarlayın. Al düğmesini, sonra Config düğmesine tıklatın. Yapılandırma denetimi penceresinde Kanal modu düğmesini, sonra Tek parça düğmesini tıklatın. HFT düğmesini tıklatın ve sonra HFT 458/514/561 aþaðý açýlan menüsünden (Şekil 2B) seçin.
    6. İlk ikincil dikroik ışın ayırıcı (Neben Farb Teiler 1 (NFT1)) ikinci ikincil dikroik ışın ayırıcı (Neben Farb Teiler 2 (NFT2)) için ışığın % 100 saptırmak ayna konumuna ayarlayın. Al düğmesini, sonra Config düğmesine tıklatın. Yapılandırma denetimi penceresinde Kanal modu düğmesini, sonra Tek parça düğmesini tıklatın. NFT1 düğmesini tıklatın ve sonra ayna (Şekil 2B) açılır menüsünden seçin.
    7. İkinci ikincil dikroik ışın ayırıcı (NFT2) sağlamak için NFT 515 konumuna getirin o dalga boylarında < 515 nm yansıyan ve dalga boylarında > 515 nm aktarılan. Al düğmesini, sonra Config düğmesine tıklatın. Yapılandırma denetimi penceresinde Kanal modu düğmesini, sonra Tek parça düğmesini tıklatın. NFT2 düğmesini tıklatın ve sonra NFT 515 aþaðý açýlan menüsünden (Şekil 2B) seçin.
    8. Uzun pas (LP) emisyon filtre (EF) LP 530için ayarla böylece dalga boylarında > 530 nm (devresel_ödeme, Dedektör) photomultiplier tüp aktarılan. Al düğmesini, sonra Config düğmesine tıklatın. Yapılandırma denetimi penceresinde Kanal modu düğmesini, sonra Tek parça düğmesini tıklatın. Emisyon filtre düğmesini tıklatın, ardından LP 530 aþaðý açýlan menüsünden (Şekil 2B) seçin.
    9. Kanal 3seçin. Al düğmesini, sonra Config düğmesine tıklatın. Yapılandırma denetimi penceresinde Kanal modu düğmesini, sonra Tek parça düğmesini tıklatın. Ch3 düğmesinin solundaki kare beyaz kutuyu tıklayın.
  2. Görüntü alma ayarı
    1. Planı-Apochromat 63 seçin x / 1.40 petrol amaç (Malzemeler tablo). Numune mikroskop mercek aracılığıyla görüntüleyebilir ve alış görüş alanı ortasına yerleştirin. Edinme düğmesini, sonra mikro düğmesini tıklatın. Amaç, sonra select planı-Apochromat 63 x Mikroskop kontrol penceresinde tıklatın / 1.40 petrol amaç--dan damla-aşağı yemek listesi.
    2. Çerçeve boyutu 512 x 512 piksel, tarama hızı 8ve 12bit veri derinlik için ayarlayın. O zaman inceden inceye gözden geçirmek düğme Al düğmesini tıklatın. Tarama denetimi penceresinde modu düğmesi ve kare düğmesini tıklatın, sonra 512 butonuna tıklayın. ENTER 8 İnceden inceye gözden geçirmek hız alanında Entertuşuna basın, sonra 12 Bit düğmesini (Şekil 2C).
    3. Tarama ortalama 1 ve 3görme duyusuyla ilgili vınlamak için ayarlayın. Ele geçirme düğmesini tıklatın sonra Scan düğmesini tıklatın. Tarama denetimi penceresinde tarama ortalama sayı alanının aşağı ok düğmesini tıklatın, ardından 1 aþaðý açýlan menüsünden seçin. 3 optik zoom alanına girin ve Enter (Şekil 2C) tuşuna basın.
    4. İğne deliği ve sondaj 1,95 havadar birimleri ve Dedektör kazanç 582 (hemen altında doygunluk) için ayarlayın. O zaman inceden inceye gözden geçirmek düğme Al düğmesini tıklatın. Tarama denetimi penceresinde kanalları düğmesini tıklatın, 196 iğne deliği alanına girin, sonra Entertuşuna basın. 582 dedektörü kazanç alanına girin ve Enter (Şekil 2D) tuşuna basın.
    5. 514 nm Argon/2 lazer çizgi % 100 güç (a 8.6) ayarlandığından emin olun. Al düğmesini, sonra lazer düğmesini tıklatın. Lazer denetim menüsü çıktı [%] alanındaki değer 100 (Şekil 2A) olmalıdır.
    6. 514 nm Argon/2 lazer çizgi %5 iletim için ayarlandığından emin olun. O zaman inceden inceye gözden geçirmek düğme Al düğmesini tıklatın. Tarama denetimi penceresinde, 514 nm lazer çizgi için iletim [%] alanındaki değer 5 (Şekil 2D) olmalıdır.
    7. Boyutları 150 x 150 piksel (194.6 µm2) olan bir kare şeklinde yatırım Getirisi (ROI satın alma) oluşturun. Edinme düğmesini, sonra YG Düzenle düğmesini tıklatın. ROI Düzenle menüsünde, dikdörtgen simgesini tıklatın sonra tıklatın ve boyutları 150 x 150 piksel (194.6 µm2) sahip bir kare oluşturmak için görüntü penceresinde sürükleyin (şekil 1A).
      Not: Edinme ROI (a) bir alış faiz, (b) bir alış (Denetim ROI) olmayan ve en az 20 x 20 piksel (3,3 µm2) floresan yüzölçümü ve (c) yüzölçümü az en az 20 x 20 piksel (3,3 µm yok floresan (arka plan yatırım Getirisi) içerir 2) (Resim 1A). Böylece ile tekrarlanan görüntülemede oluşabilir photobleaching kontrol edilebilir edinme yatırım Getirisi yatırım Getirisi denetim eklemek önemlidir. Burada tanımlanan ROI edinme taranır sadece alan olacaktır. Bir satın alma içinde tarama yatırım Getirisi sadece photobleaching yatırım Getirisi yerine, örneğin, photobleaching tüm hücre veya birkaç hücreyi sınırlar ve piksel sayısını Devresel_ödeme (Dedektör) toplanan tekrarlanan lazer sayısından daha büyük olacak piksel Devresel_ödeme (Dedektör) tüm bir hücrenin veya birden fazla hücre taramadan sonra toplanan.
    8. Kurulum zaman serisi böyle ele geçirme düğmesini tıklatın ve ardından Saat serisi butonuna her 30 s. bir kez satın yatırım Getirisi 35 kez taranır. Zaman serisi kontrol penceresinde Kılavuzu serisi Başlat düğmesi ve manuel serisi stop düğmesine tıklatın. 35 el ile durdurma serisi alanına girin, Enter tuşuna basın ve ardından 30,0 sn döngüsü gecikme düğmesini (Şekil 2E) tıklatın.
    9. Photobleaching Alım yatırım Getirisi 5 prebleach resim toplamak için tarama numarasından sonra 5, ortaya çıkar çamaşır suyu denetimi ayarlayın. Edinme düğmesini, sonra Bleach Düzenle düğmesini tıklatın. Bleach denetimi penceresinde numarasını inceden inceye gözden geçirmek sonra çamaşır suyuyanında beyaz kareyi tıklatın. 5 tarama numara alanına girin ve Enter tuşuna (Şekil 2F) tuşuna basın.
      Not: Prebleach ve postbleach görüntüleri aynı optik derinlikte elde.
    10. Daire şeklindeki çamaşır suyu 10 piksel çapında yatırım Getirisi alış içinde oluşturmak (alan = 0.8 µm2). Tıklayın elde etmek | Çamaşır suyu Düzenle | Bölgeleri tanımlamak. Bleach bölgeleri penceresinde daire simgesini tıklatın. Tıklayın ve sürükleyin görüntü penceresinde 10 piksel çapında bir daire oluşturmak için (alan = 0.8 µm2) (Şekil 2F).
    11. Yineleme 300' e ayarlayın. Edinme düğmesini, sonra Bleach Düzenle düğmesini tıklatın. Bleach denetim penceresi içinde 300 yineleme alanına girin, sonra (Şekil 2F) Enter tuşuna basın.
    12. Argon/2 514-nm lazer çizgi % 100 güç (a 8.6) ve % 100 iletim sırasında çamaşır suyu ayarla. Edinme düğmesini, sonra Bleach Düzenle düğmesini tıklatın. Çamaşır suyu kontrol penceresinde, beyaz kare kutusunun soluna doğru tıklatın 514 nm. 100 514 nm lazer çizgi için iletim [%] alanına girin ve Enter düğmesini (Şekil 2F) tuşuna basın.
      Not: Yinelemelerin sayısı ne kadar ampirik olarak belirlenmesi gerekir. Fluorophore, ağartılmış yapısı boyutunu ve lazer bağlı olarak değişir.
  3. Veri toplama
    1. Sıkı BAĞLAMAK deneme başlayın. İlk 5 prebleach resim ve ilk postbleach görüntü toplamak sonra çamaşır suyu derinlik göre aşağıdaki denklemi hesaplamak.
      Equation 1
      Çamaşır suyu derinliği ise < 90, denemeyi durdurup çamaşır suyu derinlik yeterli değildi gibi verileri atmak. Çamaşır suyu derinlik ≥90 olduğunda, veri analizi için bir görüntü işleme programı ve bir elektronik tablo programına (Malzemeler tablo) ile toplamak.
      Not: Alış drift ≥3 µm olduğunda, denemeyi durdurmak ve bu miktarı görüntü drift için görüntü işleme yazılımı (Malzemeler tablo) ile analiz tarafından düzeltilemez gibi verileri, atın. Ne zaman alış sürüklenme < 3 µm, bir görüntü işleme programı ve bir elektronik tablo programına (Malzemeler tablo) ile veri analizleri için veri toplamak.
    2. Sıkı BAĞLAMAK veri alış sürüklenme fazla 3 µm ile 10 hücrelerden 10 alış toplamak. Ardından, amaç .lsm dosyaları veri analizi için kişisel bilgisayara aktarın.
  4. Bir görüntü işleme programında veri analizi
    1. Doğru hizalama veya eşleştirme tarafından görüntü drift için (yani, kayıt) edinme ROI görüntülerini zaman serileri yığını. Bunu yapmak için her amaç .lsm dosya bir görüntü işleme programı (Malzemeler tablo) ile açın sonra eklentileri seçin | Kayıt | StackReg | Çeviri. Sonra eklentileri seçin | Kayıt | StackReg | Katı vücut10.
    2. Kurulumu ROI Yöneticisi sinyal şiddeti çamaşır suyu ROI ölçmek için. Seçin analiz | Araçlar | ROI Yöneticisi. Oval aracını seçin sonra çamaşır suyu yatırım Getirisi 10 piksel çapında bir daire çizin, sonra Ekle düğmesini tıklatın.
    3. Kurulumu ROI Yöneticisi sinyal şiddeti kontrol ROI ölçmek için. ROI Yöneticisi ' nde Dikdörtgen aracını seçin sonra Denetim yatırım Getirisi bölgede 20 x 20 piksel bir kare çizin, sonra Ekle düğmesini tıklatın.
    4. Kurulumu ROI Yöneticisi sinyal yoğunluğu içinde belgili tanımlık geçmiş ROI ölçmek için. ROI Yöneticisi ' nde Dikdörtgen aracını seçin, arka plan yatırım Getirisi bölgede 20 x 20 piksel bir kare çizin, sonra Ekle düğmesini tıklatın.
    5. ROIs yeniden adlandırın. ROI Yöneticisiiçinde analiz edilecek ROIs ekledikten sonra onları çamaşır suyu yatırım Getirisi, denetim yatırım Getirisive Arka plan yatırım Getirisi buna göre yeniden adlandırın.
    6. ROIs ölçü sinyal şiddeti. Bleach yatırım Getirisi, denetim yatırım Getirisive Arka plan yatırım Getirisi, ardından daha seçin | Multi ölçü. Tüm 35 dilimler ölçmek ve dilim başına bir satır seçili olduğuna emin olun. Ölçümler ayarla penceresinde sadece gri değeri demek seçildiğinden emin olun.
      Not: Bu ham sıkı BAĞLAMAK veri (şekil 1B) vardır.
    7. Sonuçları bir elektronik tablo programına (Tablo reçetesi) yapıştırın. Kopya yatırım Getirisi, çamaşır suyu kontrol yatırım Getirisi ve arka plan yatırım Getirisi sinyal şiddeti sonuçları daha sonra bunları Bleach yatırım Getirisi, denetim yatırım Getirisive Arka plan yatırım Getirisi, sırasıyla bir elektronik tablo programına (Tablo reçetesi) etiketli sütunlar için yapıştırabilirsiniz.
  5. Bir elektronik tablo programına veri analizi
    1. Arka plan düzeltmek çamaşır suyu ROI sinyal şiddeti ve denetim ROI (şekil 1A, C). Bleach ROIetiketli sütunda Arka plan yatırım Getirisi değerleri'etiketli sütunda değerleri çıkarmak için bir elektronik tablo programında (Tablo reçetesi) İşlev Ekle aracını kullanın. Denetim ROIetiketli sütunda değerlerinden Arka plan yatırım Getirisi etiketli sütunda değerler çıkarma. Bu yeni sütunlar Bleach ROI düzeltilmiş ve Düzeltilmiş denetimi ROIetiketleyin.
    2. Çamaşır suyu yatırım Getirisi yatırım Getirisi (şekil 1A, D) denetiminde arka plan-düzeltilmiş sinyal için sinyal normalleştirmek. Bir elektronik tablo programında (Tablo reçetesi) fonksiyon Ekle Düzeltilmiş denetimi ROIetiketli sütun değerleri Bleach ROI düzeltilmiş etiketli sütun değerlere göre bölmek için kullanın. Bu yeni bir sütun Düzeltilmiş Bleach ROI normalleştirilmişetiketleyin.
    3. Çamaşır suyu ROI (şekil 1A, E) 5 prebleach değerleri ortalama Düzeltilmiş Bleach ROI normalleştirilmiş sütunundaki sinyal normalleştirmek. Çamaşır suyu ROI içinde 5 prebleach değerlerin ortalamasını hesaplar. Daha sonra değerleri Normalleştirilmiş düzeltilmiş Bleach yatırım Getirisi yatırım Getirisi çamaşır suyu içinde 5 prebleach değerlerin ortalamasını tarafından etiketli sütunda bölün. Bu yeni bir sütun Normalleştirilmiş düzeltilmiş Prebleach ortalama Bleach ROIetiketleyin.
  6. Mobil kesir ve yarı eğri ile donatılmış veri kurtarma
    1. Bir görüntü işleme programı (Tablo reçetesi) kullanarak normalleştirilmiş ve düzeltilmiş çamaşır suyu ROI veri eğri sığdırma. Görüntü işleme programında (Tablo malzemeler), analiz seçin | Araçlar | Eğri uydurma. Postbleach normalleştirilmiş ve çamaşır suyu ROI değerleri ve karşılık gelen saat değerleri, düzeltilmiş kopya onları Eğrisi tesisatçısı penceresine yapıştırın. Üstel kurtarma Eğrisi tesisatçısı aþaðý açýlan menüsünden seçin ve sonra Sığdır' ı.
    2. Hesaplamak için değerleri sağlar kurtarma fonksiyon parametreleri üzerinden Mf : 'a,' yavaş yavaş kurtarma bir kısmını; "b," kurtarma oranı; ve 'c' hızla akışkanın kesir. Değerleri için 'a' ve 'c' denklemi Mf içine takarak Calculate Mf = bir + c. hesaplamak ben denklemi kullanarakf benf = 1 - Mf. T½ 'b' için değer denklemi içine yerine kullanarak hesaplamak Equation 2 t1/2için çözme. 11

Representative Results

Burada hangi biz sıkı BAĞLAMAK LPS ile tedavi RAW264.7 hücrelerdeki alış içinde p62 3-5 h12hareketliliğini derecesini incelemek için kullanılan tipik bir denemenin sonuçları gösterilmiştir. Şekil 3 A gösterir bir çamaşır suyu elde edilen ham veri kontrol ve görüntü yığını için küçük miktarlarda düzeltmek için hizalı sonra yatırım Getirisi arka plan (< ~ 3 µm) görüntü sürüklenme alış bir. Bu alış prebleach ve postbleach YFP-p62 Floresan şekil 3E ve ek Video 1' de gösterilmiştir. Şekil 3 B arka plan-düzeltme sonra bu verileri gösterir. Şekil 3 C yatırım Getirisi denetimindeki floresan için düzelttikten sonra bu verileri gösterir. Şekil 3 D çamaşır suyu yatırım Getirisi 5 prebleach değerleri ortalama Floresans için normalleştirilmiş bu verileri gösterir. Ağartma derecesi bu deneyde yeterli (çamaşır suyu derinlik 91.94 =). YFP-p62 floresan bu alış içinde yeniden elde etmek yavaş yavaş, t1/2 128.27 = s (2.14 dk). YFP-p62 bu denemede çok mobil bir protein değildi = Mf 21,97 vef 78.03 =.

Figure 1
Resim 1 : RAW264.7 hücre ve sıkı BAĞLAMAK görüntüleri alış görüntü drift için düzeltmek için hizalı sonra görüntü analizi için adımları bir diyagram. (A)diyagram birkaç alış ve çamaşır suyu, kontrol ve arka plan ROIs edinme ROI içinde tasvir eden bir RAW264.7 hücre. (B) ham sıkı BAĞLAMAK idealize edilmiş bir tasviri çamaşır suyu, kontrol ve arka plan ROIs A. (C) panelinde bir idealize grafik arka plan-düzeltilmiş olmuştur ham sıkı BAĞLAMAK veri elde edilen veriler. (D) floresan ROI denetimindeki normalleştirilmiş arka plan-düzeltilmiş sıkı BAĞLAMAK veri idealize edilmiş bir grafik. (E) bir idealize ROI çamaşır suyu prebleach floresan için normalleştirilmiş normalleştirilmiş ve arka plan-düzeltilmiş sıkı BAĞLAMAK veri grafiği. Kısaltmalar: Con kontrol; = BG = arka plan. Bu rakam Rabut ve Ellenberg4güncellenmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2: Lazer seçimi, amaç yazılımı (malzemeler tablo) kullanıcı arabiriminde görüntülerini ışınla yolu yapılandırma ve görüntü edinme parametreleri sıkı BAĞLAMAK deneyler için. (A)lazer kontrol ekran Argon/2 lazer çizgileri, çıkış ve tüp akım kullanılan gösterilen. (B) yapılandırma kontrol ışın gösterilen ekran kırık ve emisyon filtre kullanılan ayarlar. (C) tarama resim alma için kullanılan ayarı gösterilen ekran kontrol. (D) tarama iğne deliği, Dedektör kazanç, amplifikatör uzaklık, amplifikatör kazancı ve iletim ayarlarını Argon/2 514 nm lazer çizgi için gösterilen ekran kontrol. (E) saat serisi kontrol kullanılan zaman dizi ayarları gösterilen ekran. (F) çamaşır suyu prebleach gösterilen ekran kontrol ve kullanılan parametreleri postbleach. Kısaltmalar: HFT Haupt Farb Teiler (birincil dikroik ışın ayırıcı); = NT1 = Neben Farb Teiler 1 (ilk orta dikroik ışınla splitter); NT2 = Neben Farb Teiler 2 (ikinci ikincil dikroik ışın ayırıcı); EF = emisyon filtresi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : YFP-p62 dynamics alış RAW264.7 hücrelerdeki içinde çalışmaya temsilcisi bir sıkı BAĞLAMAK deney. Çamaşır suyu, kontrol ve arka plan yatırım Getirisi için(a)ham floresan yoğunluğu verileri. (B) çamaşır suyu ve denetim yatırım Getirisi için yatırım Getirisi arka planda Floresans düzeltilip sonra Masası'A verilen veriler. (C) paneller A ve B floresan arka plan düzeltildi kontrol yatırım Getirisi için hesabına çamaşır suyu ROI floresan yoğunluğu normalize sonra verilen veriler. (D) paneller A-C normalleştirilmiş ve arka plan-düzeltilmiş çamaşır suyu yatırım Getirisi yatırım Getirisi çamaşır suyu ilk 5 prebleach değerleri ortalama Floresans şiddeti normalize sonra verilen veriler. Mf = 21,97, benf 78.03, t1/2 = 128.27 = s (2.14 dk) ve çamaşır suyu derinlik 91.94 =. (E) prebleach (1,5 dk) ve postbleach bir alış görüntüsünü (0, 6 ve 16 dk.). Ölçek çubuğu 5 mikron = ve tüm panelleri için geçerlidir. Kısaltmalar: Con kontrol; = BG = arka plan; Corr = düzeltildi; Norm. = Normalleştirilmiş; Ortalama = ortalama. Bu rakam Cabe vd.12' den güncellenmiştirBu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Supplementary Video 1
Ek Video 1: önce ve sonra photobleaching RAW264.7 makrofaj olarak tipik bir alış. YFP-p62 floresan photobleach sonra kurtarmak yavaş; Bu nedenle, p62 bir çok mobil protein değil. Bu deneme için Mf = 25.62, benf 74.38, t1/2 = 442.79 = s (7.38 dk) ve çamaşır suyu derinlik 90.19 =. Ölçek çubuğu 5 mikron =. Bu video Cabe ve ark.12denBu videoyu izlemek için buraya tıklayın lütfen güncellenmiştir. (İndirmek için sağ tıklatın.)

Discussion

Biz canlı hücreleri ile sıkı BAĞLAMAK deneyler için kapsamlı, pratik ve basit adım adım Protokolü sağlar. Burada, protokol YFP-p62 içinde alış hareketlilik RAW264.7 makrofajlar ölçmek için kullanılan, ancak birçok confocal mikroskop sistemler taranıyor lazer için uygulanabilir ve are şimdi elde edilebilir floresan proteinler genetik olarak kodlanmış. Herhangi bir mikroskobu sistemi için pilot deneyler edinme, çamaşır suyu ve denetim yatırım Getirisi boyutları, lazer yoğunluk photobleaching ve prebleach ve postbleach resim alma dahil olmak üzere en uygun sıkı BAĞLAMAK parametreleri belirlemek için kritik öneme sahiptir. Her genetik olarak kodlanmış floresan protein ve hücre satırı için farklı için en uygun sıkı BAĞLAMAK parametreleri beklemek uygun olur.

Ne zaman bir sıkı BAĞLAMAK deney dahil elde (a) uygun dikkat edilmesi gereken önemli faktör derinlik, (b) kısa bir beyazlatma adım tam kurtarma işlevi, (d) photobleaching verimlilik gözlemlemek için (c) izin yeterli zaman postbleach kullanımı bleach (e). sitotoksisite tekrarlanan sıkı BAĞLAMAK ve (f) floresan kaybı nedeniyle tekrarlanan görüntüleme için bir denetimi eklenmesi ile. 3.3.1 sağlanan denklem göre hesaplanabilir, çamaşır suyu derinlik ≥9013olmasını öneririz. Ne zaman çamaşır suyu derinlik < 90, postbleach floresan kurtarma ölçüde hafife almışım ve değerleri,f, Mfve t1/2 hatalı olur. Her ne kadar süre ve çamaşır suyu-inducing lazer bakliyat yoğunluğunu sıkı BAĞLAMAK deneyler arasında değişebilir, photobleaching adım kısa ve önemli ölçüde daha hızlı Floresans kurtarma işlevi daha önemlidir. Yoksa, Floresans kurtarma önemli miktarda beyazlatma adımı sırasında meydana gelebilir. Uzun çamaşır suyu vakit geçirmek, Floresans kurtarma beyazlatma adım sırasında değil ölçülen ve ben hatalı ölçümlerden yol açacakf, Mf, vet1/2. Doğru değerler ben içinf, Mf, elde etmek için ek olarak, vet1/2, yatırım Getirisi edinme gözlenen postbleach çamaşır suyu ROI Floresans kademede bir plato ulaşmıştır kadar. Örneğin, bizim sıkı BAĞLAMAK deneylerde vardı ben arasında bir fark yokturf, Mfve t1/2 değerlerini biz ne zaman biz YFP-p62 çamaşır suyu ROI gözlenen karşı postbleach YFP-p62 floresan 32.2 min için yatırım Getirisi çamaşır suyu içinde gözlenen için 15.1 min postbleach; Böylece, biz kurtarma işlevi 15.1 min postbleach12bir plato ulaşmış sonucuna vardı. Photobleaching verimliliği ile ilgili olarak, photobleaching optik zoom faktörü14Meydanı ile artar. Böylece, yüksek optik zoom lens kullanımı için hızlı photobleaching olumlu ama istenmeyen photobleaching Alım sırasında neden olabilir; ikinci için bir denetim yatırım Getirisi Imaging tarafından muhasebesi. Tekrarlanan photobleaching sitotoksik Reaktif oksijen türleri (ROS) üretimi için yol açabilir gibi var olmak kaçmak etmektir. Ancak, ROS üretimi yüksek yoğunluktaki lazer maruz derecesi için genetik olarak kodlanmış floresan proteinlerin kimyasal fluorophores (örneğin, floresan antikor)15düşüktür ve oluşturulan ROS tepki olasılığı daha yüksektir genetik olarak kodlanmış floresan protein içinde diğer moleküller hücre4ile. Sitotoksik ROS üretme artan ek olarak, tekrarlanan photobleaching kontrol etmek zor olduğu gibi kaçınılması gereken olasılıktır. Ne kadar düşük lazer iletim tüm çamaşır suyu olmayan görüntüleri elde etmek için kullanılır, son olarak, bazı photobleaching her zaman, hangi kontrol altına alınmalı ortaya çıkar. Bunun için mümkün denetimler içerir Floresans edinme yatırım Getirisi bir denetiminde ROI izleme, komşu Ryslampa hücrede kontrol görüntüleri elde etme ve bu kullanılan kontrol deneyleri aynı ayarları ile gerçekleştirme photobleaching deneyler ama photobleaching olay olmadan.

Disclosures

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

Acknowledgments

Biz Dr Seth Robia Chicago Loyola Üniversitesi bu el yazması onun değerli yorumlar için teşekkür ederim. Bu eser NIH grant 1R01NS073967-01A1 için Joanna C. Bakowska tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium Hyclone SH30022.01 High Glucose (4.5 g/L)
Fetal bovine serum Gemini Bio-Products 100-106
Glass bottom dishes MatTek P35G-1.5-14-C 35 mm
ImageJ software National Institutes of Health N.A.
Lipopolysaccharide (LPS) Sigma L4391
Nocodazole Sigma M1404
Penicillin-streptomycin solution Corning 30-002-Cl 100×
Plan-Apochromat 63×/1.40 Oil objective Carl Zeiss MicroImaging, Inc 4407629904000000
Polyethylenimine (PEI) Polysciences 23966-1 linear (MW 25,000)
RAW 264.7 murine macrophages ATCC TIB-71
Zeiss confocal microscope Carl Zeiss MicroImaging, Inc LSM 510

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophysical Journal. 16 (9), 1055-1069 (1976).
  2. Peters, R., Peters, J., Tews, K. H., Bahr, W. A microfluorimetric study of translational diffusion in erythrocyte membranes. Biochimica et Biophysica Acta. 367 (3), 282-294 (1974).
  3. Patterson, G., Day, R. N., Piston, D. Fluorescent protein spectra. Journal of Cell Science. 114, Pt 5 837-838 (2001).
  4. Rabut, G., Ellenberg, J. Photobleaching techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, iFRAP, and FLIP. Live Cell Imaging: A Laboratory Manual (1st ed). , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 101-126 (2004).
  5. Fritzsche, M., Charras, G. Dissecting protein reaction dynamics in living cells by fluorescence recovery after photobleaching. Nature Protocols. 10 (5), 660-680 (2015).
  6. Goodwin, J. S., Kentworthy, A. K. Photobleaching approaches to investigate diffusional mobility and trafficking of Ras in living cells. Methods. 37 (2), 154-164 (2005).
  7. Hildick, K. L., Gonzàlez-Gonzàlez, I. M., Jaskolski, F., Henley, J. M. Lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching. Journal of Visualized Experiments. (60), e3747 (2012).
  8. Nissim-Rafinia, M., Meshorer, E. Photobleaching assays (FRAP & FLIP) to measure chromatin protein dynamics in living embryonic stem cells. Journal of Visualized Experiments. (52), e2696 (2011).
  9. Zheng, C., Petralia, R. S., Wang, Y., Kachar, B. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) of fluorescence tagged proteins in dendritic spines of cultured hippocampal neurons. Journal of Visualized Experiments. (50), e2568 (2011).
  10. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
  11. Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).
  12. Cabe, M., Rademacher, D. J., Karlsson, A. B., Cherukuri, S., Bakowska, J. C. PB1 and UBA domains of p62 are essential for aggresome-like induced structure formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (4), 2306-2311 (2018).
  13. Brown, E. B., Wu, E. S., Zipfel, W., Webb, W. W. Measurement of molecular diffusion in solution by multiphoton fluorescence photobleaching recovery. Biophysical Journal. 77 (5), 2837-2849 (1999).
  14. Centonze, V., Pawley, J. Tutorial on practical confocal microscopy and the use of the confocal test specimen. Handbook of biological confocal microscopy. , Plenum Press. New York. 549-570 (1995).
  15. Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. Physiological Reviews. 90 (3), 1103-1163 (2010).

Tags

Biyoloji sayı: 145 Floresans kurtarma photobleaching sıkı BAĞLAMAK sarı floresan protein sonra canlı görüntüleme protein hareketlilik fare makrofajlar p62 sequestosome-1 aggresome cep
Photobleaching, sarı floresan Protein etiketli p62 indüklenen Aggresome benzeri yapılarda sonra Floresans kurtarma
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rademacher, D. J., Cabe, M.,… More

Rademacher, D. J., Cabe, M., Bakowska, J. C. Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures. J. Vis. Exp. (145), e59288, doi:10.3791/59288 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter