Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

الأسفار الانتعاش بعد p62 "فوتوبليتشينج من الأصفر فلوري البروتين معلم" في "الهياكل التي يسببها" مثل أجريسومي

Published: March 26, 2019 doi: 10.3791/59288
Automatic Translation
1, 2, 2
1Core Imaging Facility and Department of Microbiology and Immunology, Loyola University Chicago, 2Department of Molecular Pharmacology and Therapeutics, Loyola University Chicago

Summary

يصف لنا بروتوكول شامل وعملي للأسفار الانتعاش بعد تجارب فوتوبليتشينج مع العيش الخلايا. على الرغم من أن البروتوكول استخدمت لقياس تنقل الأصفر p62 نيون معلم البروتين في هياكل المستحث أجريسومي، فإنه يمكن تطبيقها على مجموعة متنوعة من نظم الفحص المجهري والبروتينات الفلورية.

Abstract

الأسفار الانتعاش بعد فوتوبليتشينج (فراب) وهو أسلوب الفحص المجهري التي يمكن استخدامها لتحديد حجم التنقل البروتين في الخلايا الحية. في تجربة فراب نموذجي، لوحظ fluorescence الحالة المستقرة بالتصوير المتكرر مع ضوء الليزر المنخفضة الكثافة. وفي وقت لاحق، جزيئات الفلورسنت البصر بسرعة وبلا رجعة عن طريق مختصر من التعرض لضوء الليزر عالية الكثافة. يتم الحصول على المعلومات حول التنقل البروتين عن طريق رصد انتعاش الأسفار. كنا فراب لتحديد حركة p62 في هياكل المستحث (ALIS) مثل أجريسومي في الضامة مورين بعد التحفيز مع lipopolysaccharide (LPS). نظراً للعديد من البروتوكولات الموجودة في فراب أما غير مكتملة أو المعقدة، كان هدفنا تقديم بروتوكول خطوة بخطوة شامل وعملي ومباشر للتجارب فراب مع الخلايا الحية. وهنا يصف لنا RAW264.7 بلعم تعداء مع الأصفر فلوري البروتين-p62 (يفب-p62)، تحريض ALIS وذلك بتعريض الخلايا للبس، وأسلوب خطوة بخطوة لجمع بريبليتش وبوستبليتش فراب الصور وتحليل البيانات. وأخيراً، نحن نناقش العوامل الهامة في الاعتبار عند إجراء تجربة فراب.

Introduction

الأسفار الانتعاش بعد فوتوبليتشينج (فراب) وهو أسلوب الفحص المجهري التي يمكن استخدامها لتحديد كمية البروتين الديناميات في العيش الخلايا1،2. زادت شعبية فراب بسبب التوافر التجاري على نطاق واسع لليزر المسح مجاهر [كنفوكل] مع عالية الدقة والسرعة، والحساسية، ووراثيا ترميز "قوس قزح" من البروتينات الفلورية، مثل أخضر نيون البروتين (التجارة والنقل) وبروتين فلوري الصفراء (يفب)3. تنصهر فيها البروتينات الفلورية وراثيا المشفر وتين فائدة للسماح للتعريب سوبسيلولار من بروتين الفائدة. في تجربة فراب نموذجي، لوحظ fluorescence الحالة المستقرة في منطقة اقتناء من الفائدة (ROI) داخل خلية عن طريق التصوير المتكرر لأن العائد على الاستثمار مع ضوء الليزر المنخفضة الكثافة. وفي وقت لاحق، الجزيئات الفلورسنت هي سريعاً ولا رجعة فيه ضعاف في مجموعة فرعية محددة مسبقاً للحصول على عائد الاستثمار، يشار إليه التبييض العائد على الاستثمار، موجز التعرض لضوء الليزر عالية الكثافة. كما البروتينات غير مقصور الجديدة تجديد البروتينات المبيضة على مر الزمن، بسرعة وكثافة الانتعاش fluorescence في بليتش دوروا يوفر معلومات حول البروتين التنقل (الشكل 1)4.

لدينا مصلحة في تحديد تنقل p62 البروتين ملزمة أوبيكويتين (يعرف أيضا باسم سيكويستوسومي-1) في هياكل المستحث (ALIS) مثل أجريسومي في مورين RAW264.7 الضامة بعد التحفيز مع lipopolysaccharide (لبس) أدت بنا إلى إعادة النظر في فراب الأدب. لسوء الحظ، العديد من البروتوكولات فراب الحالية هي غير مكتملة أو مفرطة التعقيد5،،من67،،من89. بعض لا توفر معلومات تفصيلية حول إعدادات الليزر، وتكوين مسار الشعاع واكتساب صورة معلمات6،5،7،،من89. آخرون حذف التفاصيل الرئيسية فيما يتعلق بتحليل البيانات، مثل كيفية معالجة مسألة التبييض دوروا الانجراف6،9 أو كيفية حساب معلمات استرداد الهامة، منها كسر الجوال (مو)، وكسر غير متحرك (أناو)، ونصف الوقت لاسترداد (t½)5،7. على العكس من ذلك، البعض الآخر وضع الكثير من التركيز على الصيغ الرياضية المعقدة المستخدمة لحساب مو، أناو t1/25،6،،من89. وهكذا، هدفنا تقديم بروتوكول خطوة بخطوة شامل وعملي ومباشر للتجارب فراب مع الخلايا الحية.

Protocol

1-RAW264.7 بلعم تعداء

  1. الثقافة 100,000 RAW264.7 الخلايا (جدول المواد) في إكمال الثقافة المتوسطة (تعديل النسر المتوسطة (دميم دولبيكو)) (جدول المواد) التي تحتوي على 4.5 غرام/لتر جلوكوز تستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (الجدول للمواد ) والبنسلين/ستربتوميسين (جدول المواد) على دون علاج 35 ملم الزجاج-أسفل الأطباق (جدول المواد) ووضع الأطباق في 37 °C/5% CO2 حاضنة. اليوم التالي، ترانسفيكت الخلايا باستخدام بولييثيلينيميني 1 ملغ/مل (بي) (جدول المواد).
  2. ميكس 1.5 ميكروغرام من يفب-p62 مع 8 ميكروليتر من بي إلى 166 ميكروليتر من دميم خالية من المصل (المتوسطة قاعدة دون المصل البقري الجنين والبنسلين/ستربتوميسين).
  3. واسمحوا المخلوط المعقدة تعداء الجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة قبل إضافة الخليط في كل لوحة.
  4. إضافة المجمعات إلى الوسائط الموجودة مع الخلايا والصخور اللوحة بلطف.
  5. ضع اللوحة في 37 درجة مئوية 5% CO2 حاضنة بين عشية وضحاها.
  6. في صباح اليوم التالي، نضح المتوسط قبالة اللوحة، ثم يشطف مرة واحدة بالكامل المتوسطة. إضافة 2 مل متوسطة كاملة اللوحة وتسمح للخلايا لاسترداد حتى اليوم التالي.

2-تحريض ALIS مع Lipopolysaccharide (LPS)

  1. وفي اليوم التالي نضح المتوسطة من اللوحات، ثم أضف 1 مل كاملة متوسطة الحجم تحتوي على 10 نانوغرام/مل لبس (جدول المواد). السماح اللوحات احتضانها ح 5 في 37 °C/5% CO2 حاضنة.
  2. بعد العلاج، ولبس نضح المتوسطة، ثم أضف 1 مل من المخزن المؤقت تيرودي الباردة والعقيمة التي تحتوي على 145 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملم بوكل والجلوكوز 10 ملم، 1.5 مم كاكل2، مجكل 1.0 مم2و 10 ملم حبيس (درجة الحموضة 7.4) شطف اللوحة.
  3. نضح المخزن المؤقت، ثم أضف 1 مل من المخزن المؤقت تيرودي الباردة والعقيمة وتستكمل مع 10 ميكروغرام/مل نوكودازولي (جدول المواد). السماح لوحات لاحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 15-20 دقيقة قبل التصوير فراب والتحليل.
    ملاحظة: يسمح استخدام المخزن المؤقت في تيرودي الذي يحتوي على هيبيس كمجمع التخزين المؤقت للتصوير يجب القيام بها في درجة حرارة الغرفة. استخدمت نوكودازولي لتقليل حركة ALIS microtubules. مستنبت يحتوي على بيكربونات كمجمع التخزين مؤقت التي تتطلب CO2 إلى المخزن المؤقت. وبخلاف ذلك، البيكربونات الواردة في الأس الهيدروجيني التغييرات متوسطة في غياب CO2.

3-تركيب المجهر [كنفوكل] واختيار المنطقة للفائدة

  1. اختيار الليزر وتكوين مسار الشعاع
    1. استخدام أي مجهر [كنفوكل] مناسبة ال (جدول المواد) مزودة ببرنامج الهدف أو زن (جدول المواد) أو أي برنامج التصوير مناسبة.
    2. حدد الخط نانومتر 514 ليزر الأرجون/2، كما قد يفب الإثارة الذروة في الانبعاثات نانومتر وذروة 512 في 527 نيوتن متر. انقر فوق الزر الحصول على ، ثم انقر على زر الليزر . في إطار "مكافحة الليزر"، انقر فوق 458 الأرجون/2، 477، 488، 514 nm، ثم انقر على زر وضع الاستعداد . بعد الانتظار دقيقة ~ 3 الليزر من الاحماء، انقر فوق الزر في (الشكل 2أ).
    3. تعيين السلطة الليزر 514 خط ليزر الأرجون/2 نانومتر إلى 100% (8.6 ألف). انقر فوق الزر الحصول على ، ثم انقر على زر الليزر . في إطار "مكافحة الليزر"، أدخل 100 في حقل الإخراج [%] ، ثم اضغط على الزر Enter (الشكل 2أ).
    4. تعيين انتقال خط ليزر الأرجون/2 نانومتر 514 إلى 5%. انقر فوق الزر الحصول على ، ثم الزر القنوات . في إطار مراقبة المسح الضوئي ، انقر فوق الزر القنوات ، ثم انقر فوق مربع أبيض مربعة إلى يسار النص 514 nm في العمود الخط النشط لتنشيط خط الليزر 514 nm. أدخل 5 في مجال انتقال [%] للسطر الليزر 514 nm (الشكل 2د).
    5. تعيين التقسيم شعاع مزدوج اللون الأساسي (هوبت النمساوية تيلر (HFT)) إلى موقف HFT 458/514/561 أن هذه العصابات هي تحرف للعينة للإثارة. انقر فوق الزر الحصول على ، ثم الزر Config . في إطار تكوين عنصر التحكم ، انقر فوق الزر وضع القناة ، ثم الزر مسار واحد . انقر فوق الزر HFT ، ثم حدد HFT 458/514/561 من القائمة المنسدلة (الشكل 2ب).
    6. تعيين الفاصل شعاع مزدوج اللون الثانوي الأول (نيبن النمساوية تيلر 1 (NFT1)) إلى موقف مرآة ، الذي سوف يصرف 100% الضوء إلى التقسيم شعاع مزدوج اللون الثانوي الثاني (نيبن النمساوية تيلر 2 (NFT2)). انقر فوق الزر الحصول على ، ثم الزر Config . في إطار تكوين عنصر التحكم ، انقر فوق الزر وضع القناة ، ثم الزر مسار واحد . انقر فوق الزر NFT1 ، ثم حدد مرآة من القائمة المنسدلة (الشكل 2ب).
    7. تعيين الفاصل شعاع مزدوج اللون الثانوي الثاني (NFT2) إلى موقف NFT 515 لضمان أن أطوال موجية < 515 نانومتر سوف تنعكس وأطوال موجية > 515 ستحال شمال البحر الأبيض المتوسط. انقر فوق الزر الحصول على ، ثم الزر Config . في إطار تكوين عنصر التحكم ، انقر فوق الزر وضع القناة ، ثم الزر مسار واحد . انقر فوق الزر NFT2 ، ثم حدد NFT 515 من القائمة المنسدلة (الشكل 2ب).
    8. تعيين عامل تصفية الانبعاثات ممر طويل (ليرة لبنانية) (الإنكليزية والفرنسية) إلى 530 ليرة لبنانية، حيث أن أطوال موجية > 530 نانومتر وسوف تحال إلى أنبوب ضوئي (PMT، كاشف). انقر فوق الزر الحصول على ، ثم الزر Config . في إطار تكوين عنصر التحكم ، انقر فوق الزر وضع القناة ، ثم الزر مسار واحد . انقر فوق الزر تصفية الانبعاثات ، ثم حدد 530 ليرة لبنانية من القائمة المنسدلة (الشكل 2ب).
    9. حدد القناة 3. انقر فوق الزر الحصول على ، ثم الزر Config . في إطار تكوين عنصر التحكم ، انقر فوق الزر وضع القناة ، ثم الزر مسار واحد . انقر فوق مربع مربع أبيض على يسار الزر Ch3 .
  2. صورة اقتناء الإعداد
    1. حدد الخطة-أبوتشرومات 63 x/1.40 نفط الهدف (جدول المواد). عرض العينة من خلال العدسة مجهر ومكان في ALIS في مركز مجال الرؤية. انقر فوق الزر الحصول على ، ثم الزر الصغير . في إطار التحكم المجهر ، انقر على الهدف، ثم حدد الخطة-أبوتشرومات x 63/1.40 نفط الهدف من القائمة المنسدلة.
    2. تعيين حجم الإطار إلى 512 × 512 بكسلوسرعة المسح الضوئي إلى 8، وعمق البيانات إلى 12 بت. انقر فوق الزر الحصول على ، ثم على زر المسح الضوئي . في إطار مراقبة المسح الضوئي ، انقر فوق زر Mode والزر الإطار ، ثم انقر فوق الزر 512 . أدخل 8 في مجال سرعة المسح الضوئي ، اضغط Enter، ثم انقر فوق الزر 12 بت (الشكل 2-ج).
    3. تعيين متوسط المسح الضوئي إلى 1 والتكبير/التصغير البصري إلى 3. انقر فوق الزر الحصول على ، ثم انقر على زر المسح الضوئي . في إطار مراقبة المسح الضوئي ، انقر فوق زر السهم إلى أسفل لحقل رقم متوسط المسح الضوئي، ثم حدد 1 من القائمة المنسدلة. أدخل 3 في الحقل زوم بصري، ثم اضغط مفتاح الإدخال Enter (الشكل 2-ج).
    4. تعيين الثقب إلى كسب وحدات مهواة 1.95 وكاشف إلى 582 (فقط أقل من التشبع). انقر فوق الزر الحصول على ، ثم على زر المسح الضوئي . في إطار مراقبة المسح الضوئي ، انقر فوق الزر القنوات ، أدخل 196 في ميدان الثقب، ثم اضغط Enter. أدخل 582 في مجال "اكتساب الكاشف"، ثم اضغط مفتاح الإدخال Enter (الشكل 2د).
    5. تأكد من تعيين خط ليزر الأرجون/2 نانومتر 514 بقوة 100% (8.6 ألف). انقر فوق الزر الحصول على ، ثم على زر الليزر . في القائمة عنصر التحكم الليزر ، ينبغي أن تكون القيمة الموجودة في حقل الإخراج [%] 100 (الشكل 2أ).
    6. تأكد من تعيين خط ليزر الأرجون/2 نانومتر 514 لنقل 5%. انقر فوق الزر الحصول على ، ثم على زر المسح الضوئي . في إطار مراقبة المسح الضوئي ، ينبغي أن تكون القيمة الموجودة في الحقل انتقال [%] لخط الليزر نانومتر 514 5 (الشكل 2د).
    7. قم بإنشاء مربع الشكل عائد (الحصول على عائد الاستثمار) التي تحتوي أبعاد 150 × 150 بكسل (194.6 ميكرومتر2). انقر فوق الزر الحصول على ، ثم الزر تحرير عائدات الاستثمار . في القائمة تحرير دوروا ، انقر فوق رمز المستطيل، ثم انقر واسحب في نافذة الصورة لإنشاء مربع يحتوي أبعاد 150 × 150 بكسل (194.6 ميكرومتر2) (الشكل 1أ).
      ملاحظة: الحصول على عائد الاستثمار وتشمل (أ) ALIS من الفائدة و (ب) منطقة من الأسفار التي ليست ALIS (مراقبة عائد الاستثمار) وهو مالا يقل عن 20 × 20 بكسل (3.3 ميكرون2) (ج) منطقة ليتل لا الأسفار (خلفية ROI) الذي على الأقل 20 x 20 بكسل (3.3 ميكرون 2) (الشكل 1أ). من المهم تضمين عنصر تحكم عائد الاستثمار في الحصول على عائد الاستثمار حيث أنه يمكن التحكم في فوتوبليتشينج التي قد تحدث مع التصوير المتكرر. وسيكون الحصول على عائدات الاستثمار التي يتم تعريفها هنا هي المنطقة الوحيدة التي سيتم فحصها. الليزر المتكررة المسح داخل احتياز دوروا فقط سوف تحد من فوتوبليتشينج إلى العائد على الاستثمار بدلاً من، على سبيل المثال، فوتوبليتشينج الخلية بأكملها أو عدة خلايا، وعدد وحدات البكسل التي يتم جمعها في PMT (كاشف) سيكون أكبر من عدد بكسل التي تم جمعها في PMT (كاشف) بعد المسح خلية بأكملها أو عدة خلايا.
    8. إنشاء السلسلة الزمنية هذه أن الحصول على عائد الاستثمار يتم تفحص 35 مرة، مرة واحدة كل 30 س. انقر فوق الزر الحصول على ، ثم الزر السلاسل الزمنية . في إطار سلسلة الوقت التحكم ، انقر فوق الزر دليل بدء سلسلة والزر إيقاف دليل سلسلة . أدخل 35 في حقل سلسلة التوقف اليدوي، اضغط المفتاح Enter ، ثم انقر فوق الزر تأخير دورة ثانية 30.0 (الشكل 2ه).
    9. تعيين عنصر التحكم التبييض مثل أنه سيحدث فوتوبليتشينج بعد المسح الضوئي رقم 5، لجمع الصور بريبلياتش 5 للحصول على عائد الاستثمار. انقر فوق الزر الحصول على ، ثم الزر تحرير التبييض . في إطار مكافحة التبييض ، انقر فوق المربع الأبيض بجوار التبييض بعد فحص رقم. أدخل 5 في حقل رقم المسح الضوئي، ثم اضغط على المفتاح Enter (الشكل 2و).
      ملاحظة: ينبغي الحصول على صور بريبليتش وبوستبليتش في نفس العمق البصري.
    10. إنشاء التبييض العائد على الاستثمار داخل ALIS التي يبلغ قطرها 10 بكسل على شكل دائري (منطقة = 0.8 ميكرومتر2). انقر فوق اكتساب | تحرير التبييض | تعريف المناطق. في إطار المناطق التبييض ، انقر أيقونة دائرة . انقر واسحب في نافذة الصورة لإنشاء دائرة التي قد يبلغ قطرها 10 بكسل (منطقة = 0.8 ميكرومتر2) (الشكل 2و).
    11. تعيين التكرار إلى 300. انقر فوق الزر الحصول على ، ثم الزر تحرير التبييض . في إطار مكافحة التبييض ، أدخل 300 في تكرارات الحقل، ثم اضغط على المفتاح Enter (الشكل 2و).
    12. تعيين خط 514-نانومتر ليزر الأرجون/2 للطاقة 100% (8.6 A) ونقل 100% خلال المبيض. انقر فوق الزر الحصول على ، ثم الزر تحرير التبييض . في إطار مكافحة التبييض ، انقر فوق مربع مربع أبيض على اليسار 514 nm. أدخل 100 في مجال انتقال [%] للسطر الليزر 514 nm، ثم اضغط على الزر Enter (الشكل 2و).
      ملاحظة: عدد مرات التكرار يجب أن يتحدد تجريبيا. ستختلف في فلوروفوري وحجم الهيكل الذي سوف يكون أبيض والليزر.
  3. جمع البيانات
    1. بدء التجربة فراب. جمع الصور بريبليتش أول 5 والصورة بوستبليتش الأولى، ثم حساب عمق التبييض وفقا للمعادلة التالية.
      Equation 1
      إذا كان عمق التبييض < 90، إيقاف التجربة وتجاهل البيانات، كما عمق التبييض ليس كافياً. عندما يكون عمق التبييض إيه ناين زيرو، جمع البيانات للتحليل بصورة تجهيز البرنامج وبرنامج جداول بيانات (جدول المواد).
      ملاحظة: عندما يكون الانجراف ALIS مكم إيه ثري، إيقاف التجربة وتجاهل البيانات، كما لا يمكن تصحيح هذا المبلغ من الانجراف الصورة لتحليل مع برامج معالجة الصورة (جدول المواد). عندما يكون الانجراف ALIS < 3 ميكرومتر، جمع البيانات لتحليل البيانات بصورة تجهيز البرنامج وبرنامج جداول بيانات (جدول المواد).
    2. جمع البيانات فراب من ALIS 10 من 10 خلايا بأقل من 3 ميكرومتر من الانجراف ALIS. بعد ذلك، نقل الملفات.lsm الهدف على جهاز كمبيوتر شخصي لتحليل البيانات.
  4. تحليل البيانات في برنامج معالجة الصور
    1. الصحيح للصورة الانجراف بمحاذاة أو مطابقة (أي، تسجيل) كومة الصور متسلسلة زمنياً للحصول على العائد على الاستثمار. للقيام بذلك، افتح كل ملف.lsm الهدف باستخدام برنامج معالجة صور (جدول المواد)، ثم حدد الإضافات | التسجيل | ستاكريج | ترجمة. كخطوة تالية، حدد الإضافات | التسجيل | ستاكريج | هيئة جامدة10.
    2. إنشاء مدير دوروا لقياس كثافة إشارة في بليتش العائد على الاستثمار. تحليل حدد | أدوات | مدير دوروا. حدد أداة البيضاوي ، ثم رسم دائرة في التبييض عائدات الاستثمار التي يبلغ قطرها 10 بكسل، ثم انقر فوق الزر إضافة .
    3. إنشاء إدارة دوروا لقياس كثافة إشارة في مراقبة عائدات الاستثمار. حدد أداة المستطيل ، في إدارة العائد على الاستثمار، ثم رسم مربع 20 × 20 بكسل في منطقة دوروا عنصر التحكم، ثم انقر فوق الزر إضافة .
    4. إنشاء إدارة دوروا لقياس كثافة إشارة في الخلفية العائد على الاستثمار. في إدارة العائد على الاستثمار، حدد أداة المستطيل ، رسم مربع 20 × 20 بكسل في منطقة دوروا الخلفية، ثم انقر فوق الزر إضافة .
    5. إعادة تسمية في رويس. بعد إضافة رويس يتم تحليلها في إدارة العائد على الاستثمار، إعادة تسمية لهم دوروا التبييض ومراقبة عائد الاستثمار، و دوروا الخلفية تبعاً لذلك.
    6. قياس كثافة إشارة في رويس. اختر دوروا التبييض ومراقبة عائد الاستثمار، و دوروا الخلفية، ثم حدد أكثر | مقياس متعدد. تأكد من تحديد قياس جميع شرائح 35 وصف واحد لكل شريحة . في الإطار تعيين قياسات ، تأكد من تحديد فقط يعني قيمة الرمادي .
      ملاحظة: هذه هي البيانات الخام فراب (الشكل 1ب).
    7. لصق النتائج في برنامج جداول بيانات (جدول المواد). التحكم نسخة التبييض العائد على الاستثمار، العائد على الاستثمار، وكثافة إشارة دوروا خلفية النتائج ثم لصقها في الأعمدة المسمى التبييض دوروا، مراقبة عائدات الاستثمار، و دوروا الخلفية، على التوالي في برنامج جداول بيانات (جدول المواد).
  5. تحليل البيانات في برنامج جدول بيانات
    1. تصحيح الخلفية بكثافة إشارة في بليتش العائد على الاستثمار ومراقبة عائد الاستثمار (الشكل 1أ، ج). استخدام أداة إدراج دالة في برنامج جداول بيانات (جدول المواد) لطرح القيم في العمود المسمى دوروا الخلفية من القيم في العمود المسمى دوروا التبييض. طرح القيم الموجودة في العمود المسمى دوروا الخلفية من القيم الموجودة في العمود المسمى مراقبة عائد الاستثمار. قم بتسمية هذه الأعمدة الجديدة تصحيح دوروا التبييض و تصحيح التحكم العائد على الاستثمار.
    2. تطبيع الإشارات في المبيض دوروا للإشارة لتصحيح معلومات أساسية في مراقبة عائد الاستثمار (الشكل 1أ، د). استخدام إدراج دالة في برنامج جداول بيانات (جدول المواد) لتقسيم القيم الموجودة في العمود المسمى دوروا التبييض تصحيح القيم في العمود المسمى تصحيح التحكم العائد على الاستثمار. قم بتسمية هذا العمود الجديد تطبيع دوروا التبييض تصحيحه.
    3. تطبيع الإشارات في العمود تطبيع دوروا التبييض المصوبة إلى متوسط قيم بريبليتش 5 في بليتش عائد الاستثمار (الشكل 1أ، ه). حساب متوسط القيم بريبلياتش 5 في بليتش العائد على الاستثمار. بعد ذلك، تقسيم القيم الموجودة في العمود المسمى تطبيع دوروا التبييض المصوبة بمتوسط القيم بريبليتش 5 في بليتش العائد على الاستثمار. قم بتسمية هذا العمود الجديد تطبيع تصحيح بريبليتش متوسط التبييض العائد على الاستثمار.
  6. كسر الجوال ونصف الوقت للتعافي من البيانات مزودة منحنى
    1. منحنى--تناسب البيانات دوروا التبييض طبيعية وتصحيحها باستخدام برنامج معالجة صور (جدول المواد). في برنامج معالجة الصور (جدول المواد)، حدد تحليل | أدوات | المنحنى المناسب. نسخ بوستبليتش تطبيع وتصحيح القيم دوروا التبييض والقيم المناظرة في الوقت، ثم لصقها في النافذة مجرب المنحنى . حدد استرداد الأسى من القائمة المنسدلة مجرب المنحنى ، ثم حدد صالح.
    2. مو من معلمات الدالة الانتعاش، الذي يوفر القيم لحساب: 'أ،' كسر يتعافى ببطء؛ 'ب' معدل الانتعاش؛ و 'ج' كسر سرعة نشرها. حساب مو عن طريق توصيل في قيم 'أ' و 'ج' في المعادلة Mو = + جيم حساب Iو باستخدام المعادلة أناf = 1-Mو. حساب t½ باستبدال القيمة ل 'ب' في المعادلة Equation 2 ثم حل ل t1/2. 11

Representative Results

يظهر هنا هي نتائج التجربة النموذجية التي كنا فراب لفحص درجة تنقل p62 في ALIS في RAW264.7 الخلايا تعامل مع لبس ل 3-5 ح12. الشكل 3 أ تظهر البيانات الأولية التي تم الحصول عليها من التبييض، والسيطرة، والخلفية دوروا بعد قد تم مواءمة كومة الصور لتصحيح لكميات صغيرة (< ~ 3 ميكرومتر) من الانجراف الصورة ALIS. ويرد fluorescence يفب-p62 في هذا ALIS في بريبليتش وبوستبليتش في الشكل 3ه و التكميلي فيديو 1. الشكل 3 ب إظهار هذه البيانات بعد تصحيح الخلفية. الشكل 3 ج يوضح هذه البيانات بعد تصحيح للأسفار في مراقبة عائدات الاستثمار. الشكل 3 د تظهر هذه البيانات تطبيع للأسفار متوسط القيم بريبليتش 5 في بليتش العائد على الاستثمار. وكانت درجة تبيض كافية في هذه التجربة (التبييض عمق = 91.94). يفب-p62 الأسفار داخل هذه ALIS تعافي ببطء، كما t1/2 = 128.27 s (2.14 دقيقة). ولم يفب-p62 بروتين جداً المحمول في هذه التجربة، مو = 21.97، وواو = 78.03.

Figure 1
الشكل 1 : رسم تخطيطي لخلية RAW264.7 والخطوات اللازمة لتحليل الصورة بعد قد تم محاذاة الصور فراب لتصحيح الصورة الانجراف ALIS. (أ) رسم تخطيطي لخلية RAW264.7 ALIS عدة والتبييض والتحكم، والخلفية رويس في الحصول على عائد الاستثمار. الحصول على البيانات (ب) تصوير مثالي من فراب الخام في التبييض والتحكم، والخلفية رويس في الفريق ألف (ج) على الرسم بياني مثالية للبيانات فراب الخام التي تم تصحيحها الخلفية. (د) رسم مثالية الخلفية لتصحيح البيانات فراب التي قد تم تطبيع للأسفار في مراقبة عائدات الاستثمار. (ﻫ) المثالية الرسم البياني للبيانات فراب طبيعية وتصحيح الخلفية قد تم تطبيع للأسفار بريبليتش في المبيض العائد على الاستثمار. المختصرات: = يخدع الرقابة؛ جي = الخلفية. تم تعديل هذا الرقم من رابوت و Ellenberg4. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: صور واجهة المستخدم في البرنامج الهدف (جدول المواد) لاختيار الليزر وشعاع مسار التكوين، وصورة اكتساب المعلمات للتجارب فراب. ليزر (A) التحكم في الشاشة التي تظهر خطوط ليزر الأرجون/2 والإخراج، وأنبوب الحالية المستخدمة. (ب) تكوين التحكم بشاشة عرض الشعاع الخائن والانبعاثات تصفية الإعدادات المستخدمة. المسح الضوئي (ج) التحكم في شاشة عرض الإعداد المستخدمة للحصول على الصور. (د) فحص التحكم الشاشة تظهر الثقب ومكسب للكشف عن، وإزاحة مكبر للصوت، وكسب مكبر للصوت، وإعدادات الإرسال لخط الليزر نانومتر 514 الأرجون/2. (ﻫ) السلسلة الزمنية التحكم بشاشة عرض إعدادات سلسلة الوقت المستخدمة. التحكم في شاشة عرض بريبليتش التبييض (F) وبوستبليتش المعلمات المستخدمة. المختصرات: HFT = هوبت النمساوية تيلر (الخائن شعاع مزدوج اللون الأساسي)؛ NT1 = نيبين النمساوية تيلير 1 (الثانوية الأولى مزدوج اللون شعاع الخائن)؛ NT2 = نيبن النمساوية تيلر 2 (الخائن شعاع مزدوج اللون الثانوي الثاني)؛ EF = تصفية الانبعاثات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : تجربة فراب ممثل لدراسة ديناميات يفب-p62 في ALIS في الخلايا RAW264.7- (أ) البيانات كثافة الفلورية الخام للتبييض والتحكم، والخلفية العائد على الاستثمار. (ب) أن البيانات المقدمة في الفريق A بعد التبييض ومراقبة عائد الاستثمار قد تم تصحيحه للأسفار في الخلفية العائد على الاستثمار. (ج) البيانات الواردة في الألواح A و B بعد تطبيع كثافة fluorescence في المبيض عائد الاستثمار إلى حساب لصف في عنصر التحكم خلفية لتصحيح العائد على الاستثمار. (د) البيانات الواردة في الألواح A-C بعد تطبيع كثافة fluorescence في التبييض طبيعية وأساسية لتصحيح عائد الاستثمار إلى متوسط قيم بريبليتش 5 أولاً في بليتش العائد على الاستثمار. مو = 21.97، أناf = 78.03، t1/2 = 128.27 s (2.14 دقيقة)، وعمق التبييض = 91.94. (ﻫ) صورة ALIS في بريبليتش (1.5 دقيقة) وبوستبليتش (0, 6 و 16 دقيقة). شريط المقياس = 5 ميكرومتر وصالحة لكل اللوحات. المختصرات: = يخدع الرقابة؛ جي = الخلفية؛ Corr. = تصحيحها؛ القواعد والمعايير. = تطبيع؛ متوسط = متوسط. تم تعديل هذا الرقم من كاب et al.12الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Supplementary Video 1
التكميلي فيديو 1: ALIS نموذجية في بلعم RAW264.7 قبل وبعد فوتوبليتشينج- ومضان يفب-p62 بطيء للتعافي بعد فوتوبليتش؛ ومن ثم، لا p62 بروتين جداً المحمول. لهذه التجربة، مو = 25.62، أناو 74.38، t1/2 = = 442.79 s (7.38 دقيقة)، وعمق التبييض = 90.19. شريط المقياس = 5 ميكرومتر. هذا الفيديو تم تعديل من كاب et al.12الرجاء انقر هنا لعرض هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)

Discussion

نحن نقدم بروتوكول خطوة بخطوة شاملة وعملية وبسيطة للتجارب فراب مع الخلايا الحية. وهنا، البروتوكول المستخدم لقياس حركة يفب-p62 في ALIS في الضامة RAW264.7، ولكن يمكن تطبيقها على العديد من المسح مجهر [كنفوكل] نظم الليزر ووراثيا ترميز البروتينات الفلورية التي أصبحت الآن متاحة. لأي نظام الفحص المجهري، وتجارب رائدة ذات أهمية حاسمة لتحديد معلمات فراب الأمثل، بما في ذلك كثافة الليزر اقتناء والتبييض، وأحجام عنصر التحكم العائد على الاستثمار، فوتوبليتشينج، والحصول على الصور بريبليتش وبوستبليتش. فإنه من المعقول أن نتوقع المعلمات فراب الأمثل تختلف عن كل سطر البروتين وخلية الفلورسنت وراثيا المرمزة.

العوامل الهامة في الاعتبار عند إجراء تجربة فراب وتشمل (أ) تحقيق مناسب التبييض العمق، (ب) استخدام الخطوة تبيض موجزة، (ج) السماح بوستبليتش الوقت الكافي لمراقبة وظيفة الاسترداد الكامل، (د) فوتوبليتشينج الكفاءة، (ه). سيتوتوكسيسيتي مع فراب المتكررة، و (و) إدراج عنصر تحكم لفقدان الأسفار بسبب تصوير المتكررة. نوصي بأن يكون عمق التبييض، التي يمكن أن تحسب وفقا للمعادلة المنصوص عليها في قسم 3.3.1, إيه ناين زيرو13. عندما يكون عمق التبييض < 90، سيتم التقليل من درجة الانتعاش بوستبليتش الأسفار، والقيم من أناوو Mوو t1/2 تكون غير صحيحة. على الرغم من أن مدة وكثافة من نبضات الليزر يحفز التبييض قد تختلف بين تجارب فراب، من المهم أن الخطوة فوتوبليتشينج تكون قصيرة وأسرع كثيرا من الدالة استرداد الأسفار. إذا لم يكن كذلك، يمكن أن تحدث قدرا كبيرا من الأسفار الانتعاش خلال الخطوة تبيض. مع وقت التبييض طويلة، لا يمكن قياسها fluorescence الانتعاش خلال الخطوة تبيض، وأنها ستؤدي إلى قياسات غير صحيحة أناfو Mووt1/2. وبالإضافة إلى ذلك، للحصول على القيم الصحيحة لاناوMf، وt1/2، الحصول على عائد الاستثمار ينبغي أن تراعي بوستبلياتش حتى وصلت إلى مستوى الأسفار في بليتش دوروا هضبة. على سبيل المثال، في تجاربنا فراب، لم يكن هناك فرق بين أناوMووقيم t1/2 عندما لاحظنا fluorescence يفب-p62 في المبيض دوروا لدقيقة 32.2 بوستبليتش مقابل عندما لاحظنا يفب-p62 في بليتش دوروا على بوستبليتش 15.1 دقيقة؛ هكذا، خلصنا أن الدالة استرداد التوصل إلى هضبة في دقيقة 15.1 بوستبليتش12. وفيما يتعلق بكفاءة فوتوبليتشينج، يزيد فوتوبليتشينج مع مربع عامل التكبير/التصغير البصري14. وهكذا، استخدام عدسات التكبير الضوئية عالية مواتية فوتوبليتشينج السريع ولكن يمكن أن تؤدي إلى فوتوبليتشينج غير مرغوب فيه أثناء اقتناء؛ هذه الأخيرة يمكن أن يعزى للتصوير عنصر تحكم العائد على الاستثمار. فوتوبليتشينج المتكررة أمر ينبغي تجنبه كما أنها يمكن أن تؤدي إلى توليد أنواع الأكسجين التفاعلية السامة للخلايا (روس). بيد أن درجة توليد روس بسبب التعرض لليزر عالية الكثافة أقل بالنسبة للبروتينات الفلورية المرمزة وراثيا من فلوروفوريس الكيميائية (مثل الأجسام المضادة الفلورسنت)15وروس المتولدة من المرجح أن الرد إطار المرمزة وراثيا بروتين فلوري من جزيئات أخرى في الخلية4. بالإضافة إلى احتمال زيادة توليد روس السامة للخلايا، فوتوبليتشينج المتكررة تجنب نظراً لأنه من الصعب التحكم. أخيرا، على الرغم من أن انتقال الليزر منخفض يستخدم للحصول على جميع الصور غير التبييض، بعض فوتوبليتشينج دائماً سيحدث، التي يجب أن تخضع للرقابة. وتشمل الضوابط الممكنة لهذا رصد الأسفار في عنصر تحكم عائد الاستثمار في الحصول على عائد الاستثمار، والحصول على صور التحكم في خلية مجاورة غير مقصور وإجراء تجارب التحكم في إعدادات مماثلة لتلك التي استخدمت في تجارب فوتوبليتشينج ولكن من دون هذا الحدث فوتوبليتشينج.

Disclosures

الكتاب قد لا يوجد تضارب في الكشف عن.

Acknowledgments

ونشكر الدكتور سيث ربيع في "جامعة لويولا شيكاغو" على تعليقاته القيمة على هذه المخطوطة. وأيد هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة منحة 1R01NS073967-01A1 إلى جوانا باكووسكا جيم.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium Hyclone SH30022.01 High Glucose (4.5 g/L)
Fetal bovine serum Gemini Bio-Products 100-106
Glass bottom dishes MatTek P35G-1.5-14-C 35 mm
ImageJ software National Institutes of Health N.A.
Lipopolysaccharide (LPS) Sigma L4391
Nocodazole Sigma M1404
Penicillin-streptomycin solution Corning 30-002-Cl 100×
Plan-Apochromat 63×/1.40 Oil objective Carl Zeiss MicroImaging, Inc 4407629904000000
Polyethylenimine (PEI) Polysciences 23966-1 linear (MW 25,000)
RAW 264.7 murine macrophages ATCC TIB-71
Zeiss confocal microscope Carl Zeiss MicroImaging, Inc LSM 510

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophysical Journal. 16 (9), 1055-1069 (1976).
  2. Peters, R., Peters, J., Tews, K. H., Bahr, W. A microfluorimetric study of translational diffusion in erythrocyte membranes. Biochimica et Biophysica Acta. 367 (3), 282-294 (1974).
  3. Patterson, G., Day, R. N., Piston, D. Fluorescent protein spectra. Journal of Cell Science. 114, Pt 5 837-838 (2001).
  4. Rabut, G., Ellenberg, J. Photobleaching techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, iFRAP, and FLIP. Live Cell Imaging: A Laboratory Manual (1st ed). , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 101-126 (2004).
  5. Fritzsche, M., Charras, G. Dissecting protein reaction dynamics in living cells by fluorescence recovery after photobleaching. Nature Protocols. 10 (5), 660-680 (2015).
  6. Goodwin, J. S., Kentworthy, A. K. Photobleaching approaches to investigate diffusional mobility and trafficking of Ras in living cells. Methods. 37 (2), 154-164 (2005).
  7. Hildick, K. L., Gonzàlez-Gonzàlez, I. M., Jaskolski, F., Henley, J. M. Lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching. Journal of Visualized Experiments. (60), e3747 (2012).
  8. Nissim-Rafinia, M., Meshorer, E. Photobleaching assays (FRAP & FLIP) to measure chromatin protein dynamics in living embryonic stem cells. Journal of Visualized Experiments. (52), e2696 (2011).
  9. Zheng, C., Petralia, R. S., Wang, Y., Kachar, B. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) of fluorescence tagged proteins in dendritic spines of cultured hippocampal neurons. Journal of Visualized Experiments. (50), e2568 (2011).
  10. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
  11. Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).
  12. Cabe, M., Rademacher, D. J., Karlsson, A. B., Cherukuri, S., Bakowska, J. C. PB1 and UBA domains of p62 are essential for aggresome-like induced structure formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (4), 2306-2311 (2018).
  13. Brown, E. B., Wu, E. S., Zipfel, W., Webb, W. W. Measurement of molecular diffusion in solution by multiphoton fluorescence photobleaching recovery. Biophysical Journal. 77 (5), 2837-2849 (1999).
  14. Centonze, V., Pawley, J. Tutorial on practical confocal microscopy and the use of the confocal test specimen. Handbook of biological confocal microscopy. , Plenum Press. New York. 549-570 (1995).
  15. Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. Physiological Reviews. 90 (3), 1103-1163 (2010).

Tags

علم الأحياء، العدد 145، الأسفار الانتعاش بعد فوتوبليتشينج، فراب، بروتين فلورسنت صفراء، يعيش خلية التصوير، التنقل البروتين، الضامة مورين، p62، سيكويستوسومي-1، أجريسومي
الأسفار الانتعاش بعد p62 "فوتوبليتشينج من الأصفر فلوري البروتين معلم" في "الهياكل التي يسببها" مثل أجريسومي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rademacher, D. J., Cabe, M.,… More

Rademacher, D. J., Cabe, M., Bakowska, J. C. Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures. J. Vis. Exp. (145), e59288, doi:10.3791/59288 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter