Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Fluorescentie herstel na Photobleaching van gele fluorescerende eiwit Tagged p62 in Aggresome-achtige geïnduceerde structuren

Published: March 26, 2019 doi: 10.3791/59288
Automatic Translation
1, 2, 2
1Core Imaging Facility and Department of Microbiology and Immunology, Loyola University Chicago, 2Department of Molecular Pharmacology and Therapeutics, Loyola University Chicago

Summary

We beschrijven een uitgebreide en praktische protocol voor fluorescentie herstel na photobleaching experimenten met cellen levende. Hoewel het protocol werd gebruikt voor het meten van de mobiliteit van gele fluorescerende eiwit-gelabeld p62 in aggresome-achtige geïnduceerde structuren, kan het worden toegepast op een verscheidenheid van microscopie systemen en fluorescente proteïnen.

Abstract

Fluorescentie herstel na photobleaching (FRAP) is een microscopie techniek die kan worden gebruikt voor het kwantificeren van eiwit mobiliteit in levende cellen. In een typische FRAP-experiment, is door herhaalde beeldbewerking met laserlicht van lage-intensiteit steady-state fluorescentie waargenomen. Vervolgens zijn de fluorescerende moleculen snel en onherroepelijk aangetast via korte blootstelling aan hoge-intensiteit laserlicht. Informatie over eiwit mobiliteit wordt verkregen door het toezicht op het herstel van de fluorescentie. We FRAP gebruikt om te bepalen van de mobiliteit van p62 in aggresome-achtige geïnduceerde structuren (ALIS) in lymfkliertest macrofagen na stimulatie met lipopolysaccharide (LPS). Omdat vele bestaande FRAP protocollen onvolledig of complexe zijn, was ons doel om een complete, praktische en eenvoudige stapsgewijze protocol voor FRAP experimenten met levende cellen. Hier beschrijven we RAW264.7 macrofaag transfectie met gele fluorescerende eiwit-p62 (YFP-p62), inductie van ALIS door de cellen aan LPS en een stapsgewijze methode voor het verzamelen van prebleach en postbleach FRAP beelden en gegevens analyse bloot te leggen. Tot slot bespreken we belangrijke factoren te overwegen bij het uitvoeren van een FRAP-experiment.

Introduction

Fluorescentie herstel na photobleaching (FRAP) een microscopie techniek die kan worden gebruikt is voor het kwantificeren van de dynamiek van de eiwitten in levende cellen1,2. De populariteit van FRAP gestegen vanwege het wijdverspreide commerciële beschikbaarheid van laser scannen confocal microscopen met hoge resolutie, snelheid en gevoeligheid, en een "regenboog" van genetisch gecodeerd fluorescerende eiwitten, zoals groen fluorescerend proteïne (GFP) en gele fluorescerende eiwit (YFP)3. Genetisch gecodeerde fluorescente proteïnen worden gesmolten tot een proteïne van belang te voorzien in de subcellular localisatie van het eiwit van belang. In een typische FRAP-experiment, wordt de steady-state-fluorescentie in een regio van de acquisitie van belang (ROI) binnen een cel waargenomen via herhaalde beeldvorming van dat ROI met lage intensiteit laserlicht. Vervolgens zijn de fluorescerende moleculen snel en onherroepelijk aangetast in een vooraf gedefinieerde subset van de overname ROI, hierna te noemen het bleekmiddel ROI, door korte blootstelling aan hoge-intensiteit laserlicht. Als nieuwe ongebleekte eiwitten vullen gebleekte eiwitten na verloop van tijd, bevat de snelheid en de intensiteit van de fluorescentie herstel in het bleekmiddel ROI informatie over eiwit mobiliteit (Figuur 1)4.

Ons belang bij het bepalen van de mobiliteit van de ubiquitin bindende eiwitten p62 (ook bekend als sequestosome-1) in aggresome-achtige geïnduceerde structuren (ALIS) in lymfkliertest RAW264.7 macrofagen na stimulatie met lipopolysaccharide (LPS) ons leidde te herzien de FRAP literatuur. Helaas, veel van de bestaande FRAP-protocollen zijn onvolledig of buitensporig complex5,6,,7,,8,9. Sommige bieden geen gedetailleerde informatie over de instellingen van de laser, lichtbundel pad configuratie en afbeelding overname parameters5,6,7,8,9. Andere belangrijke details met betrekking tot de analyse van de gegevens, zoals hoe de kwestie van bleekmiddel ROI drift6,9 of hoe Bereken belangrijk herstel parameters, met inbegrip van de mobiele breuk (Mf), onbeweeglijke gedeelte weggelaten (Ikf), en de helft van de tijd van herstel (t½)5,7. Omgekeerd, anderen teveel nadruk gelegd op complexe wiskundige formules voor de berekening van Mf, ikfen t1/25,6,8,9. Ons doel is dus om een complete, praktische en eenvoudige stapsgewijze protocol voor FRAP experimenten met levende cellen.

Protocol

1. RAW264.7 Macrophage transfectie

  1. Cultuur van 100.000 RAW264.7 cellen (Tabel van materialen) in volledige kweekmedium (Dulbecco van bewerkt Eagle Medium (DMEM)) (Tabel of Materials) met 4,5 g/L glucose aangevuld met 10% foetale runderserum (Tabel van materialen ) en penicilline/streptomycine (Tabel of Materials) op onbehandeld 35-mm glazen-bodem gerechten (Tabel van materialen) en plaatsen van de gerechten in een 37 °C/5% CO2 incubator. Transfect op de volgende dag, de cellen met behulp van 1 mg/mL polyethylenimine (PEI) (Tabel van materialen).
  2. Mix-1.5 μg YFP-p62 met 8 μL van PEI in 166 μL van serumvrij DMEM (basis medium zonder foetale runderserum en penicilline/streptomycine).
  3. Laat het complexe mengsel van transfectie zitten bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten voorafgaand aan het mengsel toe te voegen in elke plaat.
  4. De complexen zachtjes aan het bestaande medium met cellen en rock de plaat toevoegen.
  5. Plaats de plaat in een 37 ° C /5% CO2 incubator's nachts.
  6. De volgende ochtend, gecombineerd het medium uit de plaat, dan eens spoelen met volledige medium. Voeg 2 mL volledige voedingsbodem aan de plaat en laat van de cellen te herstellen tot de volgende dag.

2. de inductie van ALIS met Lipopolysaccharide (LPS)

  1. De volgende dag, gecombineerd het medium van de platen, voeg vervolgens 1 mL van volledige middellange met 10 ng/mL LPS (Tabel van materialen). Laat de platen aan Incubeer gedurende 5 h in een 37 °C/5% CO2 incubator.
  2. Na de LPS-behandeling, gecombineerd het medium, voeg vervolgens 1 mL van koude, steriele Tyrode buffer met 145 mM NaCl, 5 mM KCl, glucose van 10 mM, 1.5 mM CaCl2, 1,0 mM MgCl2en 10 mM HEPES (pH 7.4) te spoelen van de plaat.
  3. De buffer gecombineerd, en voeg daarna 1 mL koude, steriele Tyrode buffer aangevuld met 10 μg/mL nocodazole (Tabel van materialen). Laat de platen aan het broeden bij 4 ° C gedurende 15-20 min vóór FRAP beeldvorming en analyse.
    Opmerking: Het gebruik van Tyrode de buffer met HEPES als de buffering samengestelde voorziet imaging om te worden uitgevoerd bij kamertemperatuur. Nocodazole werd gebruikt om te verlagen van ALIS verkeer door microtubuli. Kweekmedium bevat bicarbonaat als een buffer verbinding vereisen CO2 aan buffer. Anders, het bicarbonaat in middelgrote wijzigingen pH in de afwezigheid van CO2opgenomen.

3. opzet van de Confocal Microscoop en het selecteren van de regio van belang

  1. Laser selectie en Beam pad configuratie
    1. Gebruik geschikte confocal microscoop (Tabel of Materials) uitgerust met AIM- of ZEN software (Tabel of Materials) of een geschikt imaging software.
    2. Kiesderegel 514 nm van de laser van Argon/2, als YFP piek excitatie op 512 nm en piek emissie bij 527 heeft nm. De ophaal -knop, klik op de knop van de Laser . Klik in het venster controle van de Laser op Argon/2 458, 477, 488, 514 nm, klik vervolgens op de knop stand-by . Na een wachttijd van ~ 3 min voor de laser om op te warmen, klikt u op (Figuur 2).
    3. De kracht van de laser van de 514 nm Argon/2 laser lijn ingesteld op 100% (8.6 A). De ophaal -knop, klik op de knop van de Laser . In het venster Laser Control Voer 100 in het veld Output [%] en druk op de Enter -knop(Figuur 2).
    4. De overdracht van de 514 nm Argon/2 laser lijn ingesteld op 5%. Klik op de knop van de ophaal , vervolgens de knop kanalen . In het besturingsvenster die door de Scan , klik op de knop kanalen , klik dan het vierkant witte vak aan de linkerkant van de tekst 514 nm in de kolom regel actief te activeren van de 514 nm laser lijn. Geef 5 op het gebied van Transmission [%] voor de 514 nm laser lijn (Figuur 2D).
    5. Stel de primaire dichroïde balk splitter (Haupt Farb teilig (HFT)) op de positie van de HFT 458/514/561 zodanig dat deze banden zijn met het model voor excitatie afgebogen. Klik op de knop van de ophaal , vervolgens de Config knop. In het Configuratie venster, klikt u op het Kanaal modus knop, vervolgens de Single Track . Klik op de knop van de HFT , en selecteer vervolgens HFT 458/514/561 in het drop-down menu (Figuur 2B).
    6. Stel de eerste secundaire dichroïde balk splitter (Neben Farb teilig 1 (NFT1)) op de positie van de spiegel , die 100% van het licht aan de tweede secundaire dichroïde balk splitter (Neben Farb teilig 2 (NFT2)) zal afbuigen. Klik op de knop van de ophaal , vervolgens de Config knop. In het Configuratie venster, klikt u op het Kanaal modus knop, vervolgens de Single Track . Klik op de NFT1 knop en selecteer vervolgens spiegel uit de drop-down menu (Figuur 2B).
    7. De tweede secundaire dichroïde balk splitter (NFT2) ingesteld op de positie van de NFT 515 om ervoor te zorgen dat golflengten < 515 nm zal blijken en golflengten > 515 nm zal worden toegezonden. Klik op de knop van de ophaal , vervolgens de Config knop. In het Configuratie venster, klikt u op het Kanaal modus knop, vervolgens de Single Track . Klik op de NFT2 knop en selecteer vervolgens NFT 515 uit de drop-down menu (Figuur 2B).
    8. De lange pass (LP) emissie filter (EF) ingesteld op LP 530, zodat golflengten > 530 nm zal worden toegezonden aan de fotomultiplicator (bet, detector). Klik op de knop van de ophaal , vervolgens de Config knop. In het Configuratie venster, klikt u op het Kanaal modus knop, vervolgens de Single Track . Klik op de knop van de emissie filter en selecteer vervolgens LP 530 uit de drop-down menu (Figuur 2B).
    9. Selecteer kanaal 3. Klik op de knop van de ophaal , vervolgens de Config knop. In het Configuratie venster, klikt u op het Kanaal modus knop, vervolgens de Single Track . Klik op het vierkante witte vak aan de linkerkant van de Ch3 -knop.
  2. Afbeelding overname Set-Up
    1. Selecteer de Plan-Apochromat 63 x / 1.40 olie doelstelling (Tabel van materialen). Het model door het oculair Microscoop bekijken en plaats het ALIS in het midden van het gezichtsveld. Klik op de knop van de ophaal , vervolgens de Micro knop. In de Controle van de Microscoop venster, klik op doelen selecteer de Plan-Apochromat 63 x / 1.40 olie doelstelling uit het drop-down menu.
    2. Stel de framegrootte op 512 x 512 pixels, de snelheid van de scan tot en met 8en de diepte van de gegevens naar 12 bits. Klik op de knop van de ophaal , vervolgens de scannen knop. In het besturingsvenster die door de Scan , de Mode -knop en de knop van het Frame , klik op de knop 512 . Enter 8 op het gebied van Scan snelheid , druk op Enteren klik vervolgens op de knop van de 12 bits (Figuur 2C).
    3. Het gemiddelde van de scan instelt op 1 en de optische zoom tot en met 3. De ophaal -knop, klik op de knop scannen . In het venster Scannen controle klikt u op de pijlknop-omlaag van de scan gemiddelde getallenlichaam, en selecteer vervolgens 1 in het drop-down menu. Geef 3 op in het veld van de optische zoom, en druk op Enter (Figuur 2C).
    4. Stel het gaatje op 1.95 luchtige eenheden en detector winst voor de 582 (net onder de verzadiging). Klik op de knop van de ophaal , vervolgens de scannen knop. In het besturingsvenster die door de Scan , klik op de knop kanalen , 196 in het gaatje veld invoeren, vervolgens pers steken. 582 invoeren in het veld Detector krijgen, en druk op Enter (Figuur 2D).
    5. Ervoor zorgen dat de 514 nm Argon/2 laser lijn is ingesteld op 100% vermogen (8.6 A). Klik op de knop van de ophaal , vervolgens de knop van de Laser . In het systeemmenu van Laser moet de waarde in het veld Output [%] 100 (Figuur 2).
    6. Ervoor zorgen dat de 514 nm Argon/2 laser lijn is ingesteld op 5% transmissie. Klik op de knop van de ophaal , vervolgens de scannen knop. In het besturingsvenster die door de Scan moet de waarde in het veld van de overdracht [%] voor de 514 nm laser lijn 5 (Figuur 2D).
    7. Maak een vierkant-vormige ROI (acquisitie ROI) die de afmetingen 150 x 150 pixels (194.6 µm2 heeft). Klik op de knop van de ophaal , vervolgens de knop Bewerken ROI . In het menu Bewerken ROI , klikt u op het pictogram rechthoek, dan klik en sleep in het afbeeldingsvenster om te maken van een plein met de afmetingen 150 x 150 pixels (194.6 µm2)(Figuur 1).
      Opmerking: De overname ROI omvat (a) een ALIS van belang, (b) een oppervlakte van fluorescentie die is niet een ALIS (control ROI) en ten minste 20 x 20 pixels (3.3 µm2) en (c) een oppervlak van weinig tot geen fluorescentie (achtergrond ROI) die ten minste 20 x 20 pixels (3.3 µm 2) (Figuur 1A). Het is belangrijk om een besturingselement ROI onder met de overname ROI, zodat de photobleaching die bij herhaalde beeldvorming optreden kan kan worden gecontroleerd. De overname ROI die hier is gedefinieerd zal worden het enige gebied dat wordt gescand. Herhaalde laser scannen binnen een overname ROI alleen zal beperken photobleaching tot de ROI in plaats van, bijvoorbeeld, photobleaching de gehele cel of meerdere cellen, en het aantal pixels op de bet (detector) verzameld zullen groter zijn dan het aantal pixels verzameld op de bet (detector) na het scannen van een hele cel of meerdere cellen.
    8. Set-up de tijdreeksen van dergelijke dat de overname ROI 35 keer, wordt gescand zodra elke 30 s. Klik de ophaal -knop, en vervolgens de Tijdreeksen knop. In de Serie tijdcontrole venster, klikt u op de knop Manual start serie en de knop handmatig stoppen serie . 35 invoeren in het veld van de serie handmatig stoppen, druk op de Enter toets, en klik vervolgens de 30.0 sec cyclus vertraging(Figuur 2).
    9. Het bleekmiddel besturingselement zo ingesteld dat de photobleaching na scan nummer 5 treedt, voor het verzamelen van 5 prebleach beelden van de overname ROI. Klik op de knop van de ophaal , vervolgens de knop Bewerken bleekmiddel . Klik in het venster Controle bleken op het witte vierkantje naast de bleken na een aantal scans. Typ 5 in het nummerveld scan en druk op de Enter -toets (Figuur 2F).
      Opmerking: Prebleach en postbleach beelden moeten worden verworven op de dezelfde optische diepte.
    10. Maken van een circulaire-vormige bleekmiddel ROI binnen het ALIS die een diameter van 10 pixels heeft (gebied = 0.8 µm2). Klik verwerven | Bewerken van bleekmiddel | Definiëren van de regio's. Klik in het venster Bleekmiddel regio's op het pictogram van de cirkel . Klik en sleep in het afbeeldingsvenster om te maken een cirkel met een diameter van 10 pixels (gebied = 0.8 µm2) (Figuur 2F).
    11. Iteraties ingesteld op 300. Klik op de knop van de ophaal , vervolgens de knop Bewerken bleekmiddel . In het venster Controle bleekmiddel 300 invoeren in het veld iteraties en druk op de Enter -toets (Figuur 2F).
    12. Stel de Argon/2 514-nm laser lijn naar 100% stroom (8.6 A) en 100% transmissie tijdens het bleekmiddel. Klik op de knop van de ophaal , vervolgens de knop Bewerken bleekmiddel . Klik in het venster Controle bleekmiddel op de witte vierkante doos aan de linkerkant van 514 nm. Voer 100 in het veld transmissie [%] voor de 514 nm laser regel en druk op de Enter -knop (Figuur 2F).
      Opmerking: Het aantal iteraties moet empirisch worden bepaald. Het hangt af van de fluorophore, de grootte van de structuur die zullen worden gebleekt, en de laser.
  3. Gegevensverzameling
    1. Start het FRAP-experiment. Verzamelen van de eerste 5 prebleach beelden en de eerste postbleach afbeelding en vervolgens wordt bleekmiddel diepte volgens de volgende vergelijking berekend.
      Equation 1
      Als bleekmiddel diepte is < 90, stoppen van het experiment en negeren van de gegevens, zoals de diepte bleekmiddel niet toereikend was. Wanneer bleekmiddel diepte ≥90 is, verzamelen van gegevens voor de analyse met een beeldverwerking programma en een spreadsheet-programma (Tabel van materialen).
      Opmerking: Wanneer drift van het ALIS ≥3 µm is, stoppen van het experiment en negeren van de gegevens, zoals dit bedrag voor afbeelding drift niet kan worden gecorrigeerd voor door analyse met beeld processing software (Tabel van materialen). Wanneer de uitwassen van het ALIS is < 3 µm, verzamelen van de gegevens voor data-analyse met een beeldverwerking programma en een spreadsheet-programma (Tabel van materialen).
    2. FRAP gegevens verzamelen van 10 ALIS uit 10 cellen met minder dan 3 µm voor drift van het ALIS. Volgende, overdrachtdossiers het doel .lsm op een personal computer voor data-analyse.
  4. Data-analyse in een programma voor beeldverwerking
    1. Juiste voor afbeelding drift door uitlijnen of matching (dat wil zeggen, registreren) de stack van tijd-serie beelden van de overname ROI. Om dit te doen, elk doel .lsm bestand openen met een beeld processing programma (Tabel van materialen) en selecteer vervolgens Plugins | Registratie | StackReg | Vertaling. Selecteer vervolgens Plugins | Registratie | StackReg | Vastlichaam10.
    2. Set-up ROI Manager voor het meten van de signaalsterkte in het bleekmiddel ROI. Selecteer analyseren | Tools | ROI Manager. Selecteer het gereedschap ovaal , dan teken een cirkel in het bleekmiddel ROI met een diameter van 10 pixels en klik op de knop toevoegen .
    3. Set-up ROI Manager voor het meten van de signaalsterkte in het besturingselement ROI. In de Manager van de ROI, selecteer het gereedschap rechthoek , teken een vierkant 20 x 20 pixels in de controle ROI regio, vervolgens klikt u op de knop toevoegen .
    4. Set-up ROI Manager voor het meten van de signaalsterkte op de achtergrond ROI. In de Manager van de ROI, selecteer het gereedschap rechthoek , teken een vierkant 20 x 20 pixels in het gebied op de achtergrond ROI, dan klik op de knop toevoegen .
    5. Wijzig de naam van de ROI. Na het toevoegen van de ROI te worden geanalyseerd in ROI Manager, hernoemen bleekmiddel ROI controle ROIen Achtergrond ROI dienovereenkomstig.
    6. Signaalsterkte van de maatregel in de ROIs. Bleach ROI controle ROIen Achtergrond ROISelecteer meer | Multi maatregel. Zorg ervoor dat alle 35 segmenten meten en één rij per segment zijn ingeschakeld. Zorg dat alleen Grijswaarde bedoel is geselecteerd in het venster Instellen van metingen .
      Opmerking: Dit zijn de ruwe FRAP-gegevens (Figuur 1B).
    7. Plak de resultaten in een spreadsheet-programma (Tabel van materialen). Kopie het bleekmiddel ROI, beheren ROI en achtergrond ROI signaal intensiteit resultaten en deze vervolgens plakken naar kolommen aangeduid met Bleekmiddel ROI, controle ROIen Achtergrond ROI, respectievelijk in een spreadsheet-programma (Tabel van materialen).
  5. Analyse van de gegevens in een Spreadsheet-programma
    1. Achtergrond-correct de signaalsterkte in het bleekmiddel ROI en de controle ROI (Figuur 1A, C). Gebruik het hulpprogramma van de Functie invoegen in een spreadsheet-programma (Tabel of Materials) aftrekken van de waarden in de kolom met de label ROI van de achtergrond van de waarden in de kolom met de naam Bleekmiddel ROI. Aftrekken van de waarden in de kolom met de label ROI van de achtergrond van de waarden in de kolom met de naam Besturingselement ROI. Label deze nieuwe kolommen Bleekmiddel ROI gecorrigeerd en Rechtgezet controle ROI.
    2. Normaliseren van het signaal in het bleekmiddel ROI op de achtergrond-gecorrigeerde signaal in het besturingselement ROI (Figuur 1A, D). De functie Invoegen in een spreadsheet-programma (Tabel of Materials) delen van de waarden in de kolom met de naam Bleekmiddel ROI gecorrigeerd door de waarden in de kolom met de naam Gecorrigeerd controle ROI. Label deze nieuwe kolom Genormaliseerd gecorrigeerd bleekmiddel ROI.
    3. Normaliseren van het signaal in de kolom Genormaliseerd gecorrigeerd bleekmiddel ROI berekend als het gemiddelde van de 5 prebleach waarden in het bleekmiddel ROI (Figuur 1A, E). Het gemiddelde berekenen van de 5 prebleach waarden in het bleekmiddel ROI. Vervolgens deelt u de waarden in de kolom met de naam Genormaliseerd gecorrigeerd bleekmiddel ROI door het gemiddelde van de 5 prebleach waarden in het bleekmiddel ROI. Label deze nieuwe kolom Genormaliseerd gecorrigeerd Prebleach gemiddelde bleekmiddel ROI.
  6. Mobiele breuk en de helft van de tijd van de terugwinning van gegevens Curve-gemonteerd
    1. Kromme-fit de genormaliseerde en gecorrigeerde bleekmiddel ROI gegevens met behulp van een beeld processing programma (Tabel van materialen). Selecteer in het grafische verwerking programma (Tabel of Materials), analyseren | Tools | Montage van de kromme. Kopie de postbleach genormaliseerd en gecorrigeerd bleekmiddel ROI en de bijbehorende tijdwaarden, plak ze in de Curve Fitter venster. Exponentiële herstel van de Curve Fitter drop-down menu Selecteer passen.
    2. Berekenen van de M-f van de parameters van de functie van herstel, waarin waarden voor: 'a,' een langzaam herstellende Fractie; "b," de terugvinding; en 'c', een snel diffusing Fractie. Berekenen Mf door inpluggen in de waarden voor 'a' en 'c' in de vergelijking Mf = een + c. berekenen de If met behulp van de vergelijking ikf = 1 - Mf. T½ berekenen door te vervangen door de waarde voor 'b' in de vergelijking Equation 2 voor t-1/2vervolgens op te lossen. 11

Representative Results

Hieronder zijn de resultaten van een typisch experiment waarin we FRAP te onderzoeken van de mate van mobiliteit van p62 in ALIS in cellen van de RAW264.7 behandeld met LPS voor 3-5 h12gebruikt. Figuur 3 A toont de onbewerkte gegevens verkregen uit een bleekmiddel, controle, en ROI achtergrond nadat de stack van beelden had aangepast om te corrigeren voor kleine hoeveelheden (< ~ 3 µm) voor afbeelding drift van het ALIS. YFP-p62 fluorescentie in deze ALIS op prebleach en postbleach wordt weergegeven in Figuur 3E en aanvullende Video 1. Figuur 3 B toont deze gegevens na achtergrondcorrectie. Figuur 3 C toont deze gegevens na correctie voor fluorescentie in het besturingselement ROI. Figuur 3 D toont deze gegevens genormaliseerd naar de gemiddelde fluorescentie van de 5 prebleach waarden in het bleekmiddel ROI. De mate van bleken volstond in dit experiment (bleekmiddel diepte = 91.94). YFP-p62 fluorescentie binnen deze ALIS hersteld langzaam, als t-1/2 = 128.27 s (2.14 min). YFP-p62 was niet een zeer mobiele eiwit in dit experiment, Mf = 21.97 en ikf = 78.03.

Figure 1
Figuur 1 : Een diagram van een RAW264.7 cel en stappen voor beeldanalyse nadat de FRAP beelden zijn aangepast om te corrigeren voor afbeelding drift van het ALIS. (A) schema van een cel van de RAW264.7 beeltenis van verschillende ALIS bleekmiddel, controle en de achtergrond ROIs binnen de overname ROI. (B) een geïdealiseerde voorstelling van ruwe FRAP gegevens verkregen in het bleekmiddel, controle en achtergrond ROIs in deelvenster A. (C) een geïdealiseerde grafiek van de ruwe FRAP-gegevens die achtergrond-gecorrigeerd zijn. (D) een geïdealiseerde grafiek van achtergrond-gecorrigeerde FRAP gegevens die hebben is genormaliseerd naar fluorescentie in het besturingselement ROI. (E) een geïdealiseerde grafiek van genormaliseerde en achtergrond-gecorrigeerde FRAP-gegevens die op de prebleach fluorescentie in het bleekmiddel ROI hebben zijn genormaliseerd. Afkortingen: Con = controle; BG = achtergrond. Dit cijfer werd vanaf Rabut en Ellenberg4gewijzigd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: Afbeeldingen van de gebruikersinterface in de AIM-software (tabel of Materials) voor selectie van de laser, dimlicht pad configuratie, en beeld overname parameters voor de experimenten FRAP. (A) Laser controle scherm tonen het Argon/2 laserlijnen, uitvoer en gebruikte buis stroom. (B) configuratie controle scherm tonen de balk splitter en emissie filterinstellingen gebruikt. (C) Scan controle scherm toont de instelling voor image aquisition gebruikt. (D) Scan controle scherm tonen de pinhole detector winst, de verschuiving van de versterker, versterker gain en transmissie instellingen voor het Argon/2 514 nm laser lijn. (E) tijdreeksen controle scherm tonen de tijdsinstellingen voor de reeks gebruikt. (F) bleekmiddel zeggenschap zeef tonen van de prebleach en postbleach parameters gebruikt. Afkortingen: HFT = Haupt Farb teilig (primaire dichroïde balk splitter); NT1 = Neben Farb teilig 1 (eerste middelbare dichroïde beam splitter); NT2 = Neben Farb teilig 2 (tweede secundaire dichroïde balk splitter); EF = emissie filter. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : Een representatieve FRAP experiment om te studeren van YFP-p62 dynamiek in ALIS in RAW264.7 cellen. (A) de gegevens van de intensiteit van het ruwe fluorescentie voor een bleekmiddel, controle en achtergrond ROI. (B) de gegevens vermeld in deelvenster A nadat het bleekmiddel en controle ROI had gecorrigeerd voor fluorescentie op de achtergrond ROI. (C) de gegevens vermeld in panelen A en B na het normaliseren van de intensiteit van de fluorescentie in het bleekmiddel ROI op account voor fluorescentie in de achtergrond-gecorrigeerde besturingselement ROI. (D) de gegevens vermeld in panelen A-C na het normaliseren van de intensiteit van de fluorescentie in het genormaliseerde en achtergrond-gecorrigeerde bleekmiddel ROI berekend als het gemiddelde van de eerste 5 prebleach waarden in het bleekmiddel ROI. Mf = 21.97, ikf = 78.03, t-1/2 = 128.27 s (2.14 min), en bleekmiddel diepte = 91.94. (E) een beeld van een ALIS op prebleach (1.5 min) en postbleach (0, 6 en 16 min). Schaal bar = 5 µm en is geldig voor alle panelen. Afkortingen: Con = controle; BG = achtergrond; Corr. = gecorrigeerd; Norm. = genormaliseerd; Gemiddelde = gemiddelde. Dit cijfer is bewerkt van Cabe et al.12Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Supplementary Video 1
Aanvullende Video 1: een typische ALIS in een RAW264.7 macrofaag vóór en na photobleaching. YFP-p62 fluorescentie is traag om te herstellen na de photobleach; Vandaar, p62 is niet een zeer mobiele eiwit. Voor dit experiment, Mf = 25,62, ikf = 74.38, t-1/2 = 442.79 s (7.38 min), en bleekmiddel diepte = 90.19. Schaal bar = 5 µm. Deze video is bewerkt van Cabe et al.12gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)

Discussion

Wij bieden een complete, praktische en eenvoudige stapsgewijze protocol voor FRAP experimenten met levende cellen. Hierin, het protocol is gebruikt voor het meten van de mobiliteit van YFP-p62 in ALIS in macrofagen van de RAW264.7, maar het kan worden toegepast op veel van de laser confocal microscoop systemen scannen en genetisch gecodeerd fluorescente proteïnen die nu beschikbaar zijn. Voor elk systeem van microscopie zijn proefprojecten kritisch voor de bepaling van de optimale FRAP-parameters, met inbegrip van acquisitie, bleekmiddel, en controle ROI maten, laser intensiteit voor photobleaching en prebleach en postbleach Beeldacquisitie. Het is redelijk te verwachten dat de optimale FRAP-parameters kunnen verschillen voor elke genetisch gecodeerde fluorescent proteïne en cel regel.

Belangrijke factoren om te overwegen wanneer het uitvoeren van een experiment FRAP nemen (a) bereiken geschikt bleken diepte, (b) het gebruik van een korte bleken stap, (c) waardoor voldoende tijd postbleach te observeren de volledig herstel functie, (d) photobleaching efficiëntie, (e). cytotoxiciteit met herhaalde FRAP, en (f) de opneming van een besturingselement voor fluorescentie verlies als gevolg van herhaalde imaging. Het is raadzaam dat bleekmiddel diepte, die kan worden berekend op basis van de in punt 3.3.1 bedoelde vergelijking, ≥9013 worden. Wanneer bleekmiddel diepte is < 90, de mate van postbleach fluorescentie herstel zal worden onderschat, en de waarden van If, Mfen t-1/2 onjuist zal zijn. Hoewel de duur en de intensiteit van de laserpulsen bleekmiddel-inducerende tussen FRAP experimenten variëren kunnen, is het belangrijk dat de photobleaching stap kort en aanzienlijk sneller dan de fluorescentie recovery functie worden. Als het niet is, dan is een aanzienlijke hoeveelheid fluorescentie herstel kan optreden tijdens de bleken stap. Met een tijd van lange bleekmiddel, fluorescentie herstel tijdens de bleken stap niet zou worden gemeten, en het zou leiden tot onjuiste metingen van If, Mf, ent1/2. Bovendien, juist om waarden te verkrijgen voor If, Mf, ent1/2, de verwerving ROI nageleefd moet worden postbleach totdat het niveau van de fluorescentie in het bleekmiddel ROI heeft een plateau bereikt. Bijvoorbeeld, in onze FRAP-experimenten, er geen verschil was tussen de If, Mfen t-1/2 waarden wanneer we fluorescentie van de YFP-p62 in het bleekmiddel ROI voor 32.2 min postbleach waargenomen versus wanneer we YFP-p62 in het bleekmiddel ROI waargenomen voor 15.1 min postbleach; Dus wij geconcludeerd dat de recovery functie een plateau op 15.1 min postbleach12 bereikt. Met betrekking tot photobleaching efficiëntie toeneemt photobleaching met het kwadraat van de optische zoom factor14. Dus het gebruik van hoge optische zoomlenzen is gunstig voor de snelle photobleaching maar kan resulteren in ongewenste photobleaching tijdens overname; de laatste kan worden verklaard door een besturingselement ROI imaging. Herhaalde photobleaching dient te worden vermeden als het tot de generatie van cytotoxische reactieve zuurstof soorten (ROS leiden kan). Echter, de mate van ROS generatie als gevolg van blootstelling aan een hoge intensiteit laser is lager voor genetisch gecodeerde fluorescente proteïnen dan voor chemische fluorophores (bijvoorbeeld fluorescerende antilichamen)15, en het ROS gegenereerd zijn meer kans om te reageren binnen het genetisch gecodeerde fluorescerende eiwit dan met andere moleculen in de cel4. Naast de grotere waarschijnlijkheid van het genereren van cytotoxische ROS, dient herhaalde photobleaching te worden vermeden, want het is moeilijk te controleren. Tot slot, hoewel lage laser transmissie is bedoeld voor het verwerven van alle niet-bleekmiddel afbeeldingen, sommige photobleaching steevast plaatsvindt, die moet worden gecontroleerd. Mogelijke controles voor dit omvatten monitoring fluorescentie in een besturingselement ROI binnen de overname ROI, verkrijgen van controle beelden in een naburige ongebleekte cel en het uitvoeren van controle experimenten met de identieke instellingen voor die worden gebruikt de photobleaching experimenten, maar zonder de photobleaching gebeurtenis.

Disclosures

De auteurs hebben geen conflict van belang om te vermelden.

Acknowledgments

We bedanken voor zijn waardevolle opmerkingen over dit manuscript Dr. Seth Robia Loyola Universiteit van Chicago. Dit werk werd gesteund door de NIH grant 1R01NS073967-01A1 naar Joanna C. Bakowska.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium Hyclone SH30022.01 High Glucose (4.5 g/L)
Fetal bovine serum Gemini Bio-Products 100-106
Glass bottom dishes MatTek P35G-1.5-14-C 35 mm
ImageJ software National Institutes of Health N.A.
Lipopolysaccharide (LPS) Sigma L4391
Nocodazole Sigma M1404
Penicillin-streptomycin solution Corning 30-002-Cl 100×
Plan-Apochromat 63×/1.40 Oil objective Carl Zeiss MicroImaging, Inc 4407629904000000
Polyethylenimine (PEI) Polysciences 23966-1 linear (MW 25,000)
RAW 264.7 murine macrophages ATCC TIB-71
Zeiss confocal microscope Carl Zeiss MicroImaging, Inc LSM 510

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophysical Journal. 16 (9), 1055-1069 (1976).
  2. Peters, R., Peters, J., Tews, K. H., Bahr, W. A microfluorimetric study of translational diffusion in erythrocyte membranes. Biochimica et Biophysica Acta. 367 (3), 282-294 (1974).
  3. Patterson, G., Day, R. N., Piston, D. Fluorescent protein spectra. Journal of Cell Science. 114, Pt 5 837-838 (2001).
  4. Rabut, G., Ellenberg, J. Photobleaching techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, iFRAP, and FLIP. Live Cell Imaging: A Laboratory Manual (1st ed). , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 101-126 (2004).
  5. Fritzsche, M., Charras, G. Dissecting protein reaction dynamics in living cells by fluorescence recovery after photobleaching. Nature Protocols. 10 (5), 660-680 (2015).
  6. Goodwin, J. S., Kentworthy, A. K. Photobleaching approaches to investigate diffusional mobility and trafficking of Ras in living cells. Methods. 37 (2), 154-164 (2005).
  7. Hildick, K. L., Gonzàlez-Gonzàlez, I. M., Jaskolski, F., Henley, J. M. Lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching. Journal of Visualized Experiments. (60), e3747 (2012).
  8. Nissim-Rafinia, M., Meshorer, E. Photobleaching assays (FRAP & FLIP) to measure chromatin protein dynamics in living embryonic stem cells. Journal of Visualized Experiments. (52), e2696 (2011).
  9. Zheng, C., Petralia, R. S., Wang, Y., Kachar, B. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) of fluorescence tagged proteins in dendritic spines of cultured hippocampal neurons. Journal of Visualized Experiments. (50), e2568 (2011).
  10. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
  11. Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).
  12. Cabe, M., Rademacher, D. J., Karlsson, A. B., Cherukuri, S., Bakowska, J. C. PB1 and UBA domains of p62 are essential for aggresome-like induced structure formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (4), 2306-2311 (2018).
  13. Brown, E. B., Wu, E. S., Zipfel, W., Webb, W. W. Measurement of molecular diffusion in solution by multiphoton fluorescence photobleaching recovery. Biophysical Journal. 77 (5), 2837-2849 (1999).
  14. Centonze, V., Pawley, J. Tutorial on practical confocal microscopy and the use of the confocal test specimen. Handbook of biological confocal microscopy. , Plenum Press. New York. 549-570 (1995).
  15. Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. Physiological Reviews. 90 (3), 1103-1163 (2010).

Tags

Biologie kwestie 145 fluorescentie herstel na photobleaching FRAP gele fluorescerende eiwit levende cel imaging eiwit mobiliteit lymfkliertest macrofagen p62 sequestosome-1 aggresome
Fluorescentie herstel na Photobleaching van gele fluorescerende eiwit Tagged p62 in Aggresome-achtige geïnduceerde structuren
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rademacher, D. J., Cabe, M.,… More

Rademacher, D. J., Cabe, M., Bakowska, J. C. Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures. J. Vis. Exp. (145), e59288, doi:10.3791/59288 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter