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Biology

Fluoreszenz-Erholung nach Immunofluoreszenz von gelb fluoreszierende Protein Tagged p62 in Aggresome-induzierten Strukturen

Published: March 26, 2019 doi: 10.3791/59288
Automatic Translation
1, 2, 2
1Core Imaging Facility and Department of Microbiology and Immunology, Loyola University Chicago, 2Department of Molecular Pharmacology and Therapeutics, Loyola University Chicago

Summary

Wir beschreiben ein umfassendes und praxisnahes Protokoll für die Fluoreszenz-Wiederherstellung nach Immunofluoreszenz Experimente mit Zellen Leben. Obwohl das Protokoll verwendet wurde, um die Mobilität der gelb fluoreszierende Protein-Tags p62 in Aggresome-induzierten Strukturen zu messen, kann es zu einer Vielzahl von Mikroskopiesysteme und fluoreszierende Proteine angewendet werden.

Abstract

Fluoreszenz-Erholung nach Immunofluoreszenz (FRAP) ist eine Mikroskopie-Technik, die verwendet werden kann, um Protein Mobilität in lebenden Zellen zu quantifizieren. In einem typischen FRAP-Experiment wird durch wiederholte Bildgebung mit niedriger Intensität Laserlicht stationären Fluoreszenz beobachtet. Anschließend sind die fluoreszierenden Molekülen über kurze hochintensive Laser Lichteinwirkung rasch und irreversibel beeinträchtigt. Informationen über Protein Mobilität ergibt sich durch die Überwachung der Erholung der Fluoreszenz. Wir gewohnt FRAP, um die Mobilität der p62 in Aggresome-induzierten Strukturen (ALIS) in murinen Makrophagen nach Stimulation mit Lipopolysaccharid (LPS) zu bestimmen. Da viele vorhandene FRAP Protokolle entweder unvollständig oder komplex sind, war unser Ziel, eine umfassende, praktische und einfache Schritt für Schritt Protokoll für FRAP Experimente mit lebenden Zellen zur Verfügung zu stellen. Hier beschreiben wir RAW264.7 Makrophagen Transfektion mit gelb fluoreszierende Protein-p62 (YFP-p62), Induktion von ALIS indem man die Zellen LPS und eine schrittweise Methode für das Sammeln von prebleach und postbleach FRAP Bilder und Datenanalyse. Schließlich diskutieren wir wichtige Faktoren zu berücksichtigen, wenn Sie eine FRAP-Experiment durchführen.

Introduction

Fluoreszenz-Recovery nach Immunofluoreszenz (FRAP) eine Mikroskopie-Technik, die verwendet werden können ist, zu quantifizieren Proteindynamik Live Zellen1,2. Die Popularität der FRAP aufgrund der weit verbreiteten kommerziellen Verfügbarkeit von Laser-scanning-konfokale Mikroskope mit hoher Auflösung, Geschwindigkeit und Empfindlichkeit zugenommen hat, und ein "Regenbogen" von genetisch codiert fluoreszierende Proteine, wie z.B. Grün fluoreszierend Protein (GFP) und gelb fluoreszierenden Proteins (YFP)3. Genetisch codierte fluoreszierende Proteine sind an ein Protein des Interesses für die subzelluläre Lokalisation des Proteins des Interesses ermöglichen fusioniert. In einem typischen FRAP-Experiment wird die Steady-State Fluoreszenz in einer Übernahme Region of Interest (ROI) innerhalb einer Zelle über wiederholte Darstellung der diese Rendite mit Laserlicht niedriger Intensität beobachtet. Anschließend sind die fluoreszierenden Moleküle in eine vordefinierte Teilmenge des Erwerbs ROI, nachstehend das Bleichmittel ROI, durch kurze hochintensive Laser Lichteinwirkung rasch und irreversibel beeinträchtigt. Als neue ungebleicht Proteine gebleichten Proteine im Laufe der Zeit wieder aufzufüllen, informiert die Geschwindigkeit und die Intensität der Fluoreszenz-Erholung in der Bleiche ROI über Protein Mobilität (Abbildung 1)4.

Unser Interesse an der Ermittlung der Mobilität von Ubiquitin bindende Protein p62 (auch bekannt als Sequestosome-1) in Aggresome-induzierten Strukturen (ALIS) in murinen RAW264.7 Makrophagen nach Stimulation mit Lipopolysaccharid (LPS) uns zur Überprüfung der FRAP führte Literatur. Leider sind viele der vorhandenen FRAP Protokolle unvollständig oder übermäßig komplex5,6,7,8,9. Einige bieten keine detaillierte Informationen über die Lasereinstellungen, Strahl Weg Konfiguration und Bild Erwerb Parameter5,6,7,8,9. Andere wichtige Details zur Datenanalyse, z. B. wie man das Problem der Bleichmittel ROI Drift6,9 oder wie wichtig Wiederherstellungsparameter, einschließlich der mobilen Bruchteil (M-f), unbeweglich Bruchteil berechnen weggelassen (Ichf), und Halbzeit-Wiederherstellung (t½)5,7. Umgekehrt, andere zuviel Schwerpunkt auf komplexen mathematischen Formeln zur Berechnung von M-f, ichfund t1/25,6,8,9. Somit ist unser Ziel, eine umfassende, praktische und einfache Schritt für Schritt Protokoll für FRAP Experimente mit lebenden Zellen bieten.

Protocol

1. RAW264.7 Makrophagen Transfektion

  1. Kulturzellen 100.000 RAW264.7 (Table of Materials) in kompletten Kulturmedium (Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM)) (Table of Materials) mit 4,5 g/L Glukose ergänzt mit 10 % fötalen Rinderserum (Tabelle der Materialien ) und Penicillin/Streptomycin (Table of Materials) auf 35-mm-Glasboden Gerichte (Table of Materials) unbehandelt und legen die Gerichte in einem 37 °C/5% CO2 Inkubator. Am Folgetag transfizieren Sie die Zellen unter Verwendung von 1 mg/mL Polyethylenimine (PEI) (Table of Materials).
  2. Mix 1,5 μg des YFP-p62 mit 8 μL des PEI in 166 μL serumfreien DMEM (Basis Medium ohne fetalen Rinderserum und Penicillin/Streptomycin).
  3. Lassen Sie die Transfektion komplexe Mischung bei Raumtemperatur 15 Minuten vor dem Hinzufügen der Mischung in jeder Platte sitzen.
  4. Das vorhandene Medium mit Zellen und Rock die Platte vorsichtig die komplexe hinzufügen.
  5. Ort der Platte in einem 37 ° C 5 % CO2 Inkubator über Nacht.
  6. Am nächsten Morgen aspirieren Sie das Medium aus der Platte, dann einmal mit kompletten Medium spülen. 2 mL der kompletten Medium auf die Platte und die Zellen bis zum nächsten Tag zu erholen.

(2) Induktion von ALIS mit Lipopolysaccharid (LPS)

  1. Am nächsten Tag aspirieren Sie das Medium aus den Platten, dann fügen Sie 1 mL der komplette mittlere mit 10 ng/mL LPS (Table of Materials). Lassen Sie die Platten für 5 h in einem 37 °C/5% CO2 Inkubator auszubrüten.
  2. Aspirieren Sie nach der Behandlung LPS das Medium, dann fügen Sie 1 mL kalten, sterilen Tyrode-Puffer mit 145 mM NaCl 5 mM KCl, 10 mM Glukose, 1,5 mM CaCl2, 1,0 mM MgCl2und 10 mM HEPES (pH 7,4), die Platte zu spülen.
  3. Aspirieren des Puffers, dann fügen Sie 1 mL kalten, sterilen Tyrode-Puffer mit 10 μg/mL Nocodazole (Table of Materials) ergänzt. Lassen Sie die Platten bei 4 ° C für 15-20 min vor der FRAP Bildgebung und Analyse auszubrüten.
    Hinweis: Die Verwendung von Tyrode Puffer mit HEPES als die Pufferung Verbindung ermöglicht imaging bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Nocodazole wurde zur Mikrotubuli ALIS Bewegung zu verringern. Nährmedium enthält Bikarbonat als Pufferung Verbindung erfordern CO2 auf Puffer. Andernfalls das Bikarbonat in mittleren Änderungen pH-Wert bei fehlender CO2enthalten.

3. Aufbau des Confocal Mikroskop und Auswahl der Region von Interesse

  1. Laser-Auswahl und Weg Strahlkonfiguration
    1. Verwenden Sie geeigneten confocal Mikroskop (Table of Materials) mit Ziel oder ZEN-Software (Table of Materials) oder geeigneten imaging-Software ausgestattet.
    2. Wählen Sie die 514 nm Linie der Argon/2 Laser, wie YFP Peak Erregung an 512 nm und Peak-Emission bei 527 hat nm. Klicken Sie auf die Schaltfläche " Importieren ", und klicken Sie auf den Knopf " Laser ". Klicken Sie im Fenster Lasersteuerung Argon/2 458, 477, 488, 514 nm, klicken Sie auf die Schaltfläche " Standby ". Klicken Sie nach einer Wartezeit von ca. 3 min für den Laser zum Aufwärmen auf (Abb. 2A).
    3. Die Laserleistung von 514 nm Argon/2 Laserlinie auf 100 % (8,6 A) eingestellt. Klicken Sie auf die Schaltfläche " Importieren ", und klicken Sie auf den Knopf " Laser ". Geben Sie im Fenster Lasersteuerung 100 im Ausgabefeld [%] , und drücken Sie dann die Enter -Taste (Abb. 2A).
    4. Die Übertragung der 514 nm Argon/2 Laserlinie auf 5 % festgelegt. Klicken Sie auf Importieren , dann die Schaltfläche " Kanäle ". Im Scan- Fenster, klicken Sie auf die Schaltfläche " Kanäle ", dann klicken Sie auf die quadratische weiße Feld auf der linken Seite des Textes 514 nm in der aktiven Zeile Spalte 514 nm Laserlinie aktivieren. Geben Sie 5 im Feld Übermittlung [%] für die 514 nm Laserlinie (Abbildung 2D).
    5. Den primäre dichroitischer Strahlteiler (Haupt Farb Teiler (HFT)) an der HFT 458/514/561 -Position so eingestellt, dass diese Bands auf die Probe für Erregung abgelenkt werden. Klicken Sie auf Importieren , dann die Schaltfläche " Config ". Klicken Sie im Configuration Control -Fenster auf Channel-Modus , dann die Schaltfläche " Eingleisig ". Klicken Sie auf die Schaltfläche " HFT ", dann wählen Sie HFT 458/514/561 aus dem Dropdown Menü (Abbildung 2B).
    6. Die Spiegel -Position, die 100 % des Lichts, der zweite sekundäre dichroitischer Strahlteiler (Neben Farb Teiler 2 (NFT2)) abzulenken, wird den erste sekundäre dichroitischer Strahlteiler (Neben Farb Teiler 1 (NFT1)) gesetzt. Klicken Sie auf Importieren , dann die Schaltfläche " Config ". Klicken Sie im Configuration Control -Fenster auf Channel-Modus , dann die Schaltfläche " Eingleisig ". Klicken Sie auf die Schaltfläche " NFT1 ", dann wählen Sie Spiegel aus dem Dropdown-Menü (Abbildung 2B).
    7. Stellen die zweite sekundäre dichroitischer Strahlteiler (NFT2) auf die NFT 515 Position um sicherzustellen, dass Wellenlängen < 515 nm reflektiert wird und Wellenlängen > 515 nm übertragen werden. Klicken Sie auf Importieren , dann die Schaltfläche " Config ". Klicken Sie im Configuration Control -Fenster auf Channel-Modus , dann die Schaltfläche " Eingleisig ". Klicken Sie auf die Schaltfläche " NFT2 ", dann wählen Sie NFT 515 aus dem Dropdown Menü (Abbildung 2B).
    8. Setzen Sie den langen Pass (LP) Emission Filter (EF), LP-530, so dass Wellenlängen > 530 nm auf das Rohr Photomultiplier (PMT, Detektor) übertragen wird. Klicken Sie auf Importieren , dann die Schaltfläche " Config ". Klicken Sie im Configuration Control -Fenster auf Channel-Modus , dann die Schaltfläche " Eingleisig ". Klicken Sie die Schaltfläche " Emission Filter " und wähle LP 530 aus dem Dropdown-Menü (Abbildung 2B).
    9. Wählen Sie Kanal 3. Klicken Sie auf Importieren , dann die Schaltfläche " Config ". Klicken Sie im Configuration Control -Fenster auf Channel-Modus , dann die Schaltfläche " Eingleisig ". Klicken Sie auf das quadratische weiße Feld links neben der Schaltfläche " Ch3 ".
  2. Bild Erwerb Set-up
    1. Wählen Sie den Plan-Apochromat 63 X / 1.40 oil Ziel (Table of Materials). Anzeigen der Probe durch das Mikroskop Okular und legen die ALIS in der Mitte des Sichtfeldes. Klicken Sie auf Importieren , dann die Schaltfläche " Micro ". Im Mikroskop Fenster, klicken Sie auf Ziel, dann wählen Sie den Plan-Apochromat 63 X / 1.40 oil Ziel aus dem Dropdown-Menü.
    2. Legen Sie die Frame-Größe 512 x 512 Pixel, die Scan-Geschwindigkeit bis 8und die Datentiefe auf 12 Bit. Klicken Sie auf Importieren , dann die Scan -Taste. Klicken Sie im Scan- Fenster auf die Schaltfläche " Modus " und die Schaltfläche " Frame ", und klicken Sie dann auf die Schaltfläche " 512 ". Geben Sie 8 im Feld Scan-Geschwindigkeit drücken Sie die Eingabetaste, und klicken Sie dann auf die 12-Bit -Schaltfläche (Abbildung 2C).
    3. Legen Sie die Scan-Durchschnitt auf 1 und der optische Zoom, 3. Klicken Sie auf die Schaltfläche " Acquire ", klicken Sie auf die Schaltfläche " Scannen ". Klicken Sie im Scan- Fenster auf nach unten Pfeil der Scan durchschnittliche Feld, dann wählen Sie 1 aus der Drop-Down-Menü. Geben Sie 3 im Feld optischer Zoom, dann drücken Sie Sie die Eingabetaste (Abbildung 2C).
    4. Legen Sie die Lochblende auf 1,95 luftigen Einheiten und Detektor zu gewinnen, um 582 (knapp unter Sättigung). Klicken Sie auf Importieren , dann die Scan -Taste. Klicken Sie im Scan- Fenster auf die Schaltfläche " Kanäle ", geben Sie 196 im Feld Pinhole, dann drücken Sie die Eingabetaste. Geben Sie 582 im Feld Detektor zu gewinnen, dann drücken Sie Sie die Eingabetaste (Abbildung 2D).
    5. Sicherstellen Sie, dass die 514 nm Argon/2 Laserlinie auf 100 % Leistung (8,6 A) eingestellt ist. Klicken Sie auf die Schaltfläche " Acquire ", dann den Knopf " Laser ". Im Menü Lasersteuerung sollte der Wert im Feld Output [%] 100 (Abb. 2A).
    6. Sicherstellen Sie, dass die 514 nm Argon/2 Laserlinie auf 5 % Übertragung eingestellt ist. Klicken Sie auf Importieren , dann die Scan -Taste. Im Scan- Fenster sollte der Wert im Feld Übermittlung [%] für die 514 nm Laser-Linie 5 (Abb. 2D).
    7. Erstellen Sie einen quadratischen ROI (Erwerb ROI), die die Abmessungen 150 x 150 Pixel (194.6 µm2) hat. Klicken Sie auf Importieren , dann auf die Schaltfläche Bearbeiten ROI . Im Menü Bearbeiten ROI Rechteck klicken, dann klicken Sie und ziehen Sie im Bildfenster ein Quadrat zu erstellen, die die Abmessungen 150 x 150 Pixel (194.6 µm2) hat (Abb. 1A).
      Hinweis: Die Akquisition ROI umfasst (a) eine ALIS Interesse, (b) eine Fläche von Fluoreszenz, die keine ALIS (ROI-Steuerung) und beträgt mindestens 20 x 20 Pixel (3,3 µm2) und (c) eine Fläche von wenig bis keine Fluoreszenz (Hintergrund ROI), die mindestens 20 x 20 Pixel (3,3 µm 2) (Abb. 1A). Es ist wichtig, ein Steuerelement ROI bei der Akquisition ROI enthalten, so dass die Immunofluoreszenz, die mit wiederholten Bildgebung auftreten können gesteuert werden kann. Der Erwerb ROI, die hier definiert ist wird der einzige Bereich, der gescannt werden sollen. Wiederholte Laser Scannen im Rahmen einer Akquisition ROI nur schränkt Immunofluoreszenz zu den ROI, anstatt, zum Beispiel Immunofluoreszenz die gesamte Zelle oder mehrere Zellen, und die Anzahl der Pixel bei der PMT (Detektor) gesammelt werden größer als die Anzahl der Pixel bei der PMT (Detektor) nach dem Scannen eine gesamte Zelle oder mehrere Zellen gesammelt.
    8. Set-up der Zeitreihe so, dass der Erwerb ROI 35 Mal gescannt wird, sobald alle 30 klicken Sie auf die Schaltfläche " Importieren " und dann die Schaltfläche " Time Series s. ". Klicken Sie im Fenster Zeitsteuerung Serie die Handbuch Serie Starttaste und die Schaltfläche manuelle Stopp Serie . Geben Sie 35 in das manuelle Stopp Serienfeld ein, drücken Sie die Enter -Taste, dann klicken Sie auf 30,0 Sek. Zyklus Verzögerung (Abb. 2E).
    9. Das Bleichmittel-Steuerelement so eingestellt, dass die Immunofluoreszenz nach Scan Nummer 5, 5 prebleach Bilder des Erwerbs ROI sammeln auftreten. Klicken Sie auf erfassen , dann die Bleichen bearbeiten -Schaltfläche. Bleach Kontrollfenster klicken Sie auf das weiße Quadrat neben der bleichen nach Anzahl Scans. Geben Sie 5 im Feld Scan, dann drücken Sie die Eingabetaste (Abbildung 2F) .
      Hinweis: Prebleach und postbleach Bilder sollten in der gleichen optischen Tiefe erworben werden.
    10. Erstellen Sie eine kreisförmige Bleichmittel ROI innerhalb der ALIS, die einen Durchmesser von 10 Pixel hat (Bereich = 0,8 µm2). Klicken Sie erwerben | Bleichmittel bearbeiten | Bereiche definieren. Klicken Sie im Fenster Bleach Regionen das Kreis -Symbol. Klicken und ziehen Sie im Bildfenster auf einen Kreis zu erzeugen, die einen Durchmesser von 10 Pixel hat (Bereich = 0,8 µm2) (Abbildung 2F).
    11. Iterationen auf 300gesetzt. Klicken Sie auf erfassen , dann die Bleichen bearbeiten -Schaltfläche. Geben Sie im Bleichen Kontrollfenster 300 im Feld Iterationen, dann drücken Sie die Eingabetaste (Abbildung 2F) .
    12. Legen Sie die Argon/2 514 nm Laserlinie auf 100 % (8,6 A) und 100 % Transmission während das Bleichmittel. Klicken Sie auf erfassen , dann die Bleichen bearbeiten -Schaltfläche. Im Bleichen Kontrollfenster, klicken Sie auf das weiße Kästchen links neben der 514 nm. Geben Sie 100 im Feld Übermittlung [%] für die 514 nm Laserlinie, dann drücken Sie die Enter -Taste (Abbildung 2F).
      Hinweis: Die Anzahl der Iterationen muss empirisch bestimmt werden. Es hängt von der Fluorophor, die Größe der Struktur, die gebleicht werden und der Laser.
  3. Erhebung von Daten
    1. Starten Sie die FRAP-Experiment. Sammeln Sie die ersten 5 prebleach Bilder und das erste postbleach Bild, dann berechnen Sie Bleichmittel Tiefe nach der folgenden Gleichung.
      Equation 1
      Wenn Bleichmittel Tiefe < 90, das Experiment zu stoppen und die Daten zu verwerfen, da die Bleichmittel Tiefe nicht ausreichend war. Wenn Bleichmittel Tiefe ≥90 ist, sammeln Sie Daten zur Analyse mit einem Bildbearbeitungs-Programm und ein Tabellenkalkulations-Programm (Table of Materials).
      Hinweis: Beim Drift von der ALIS ≥3 µm ist, beenden Sie den Test und verwerfen Sie die Daten zu, da diese Menge an Bild Drift für Analyse mit Bildbearbeitungssoftware (Table of Materials) korrigiert werden kann. Beim Drift von der ALIS ist < 3 µm, sammeln die Daten für die Datenanalyse mit einem Bildbearbeitungs-Programm und ein Tabellenkalkulations-Programm (Table of Materials).
    2. Erhoben Sie FRAP Daten von 10 ALIS von 10 Zellen mit weniger als 3 µm der Drift der ALIS. Als nächstes übertragen Sie die Ziel .lsm Dateien auf einen PC für die Datenanalyse.
  4. Datenanalyse in einem Bildbearbeitungsprogramm
    1. Für Bild-Drift von ausrichten oder passende korrekt (z.B. Registrierung) der Stapel von Zeitreihen Bilder des Erwerbs ROI. Dazu öffnen Sie jedes Ziel .lsm Datei mit einem Bildbearbeitungsprogramm (Table of Materials), dann wählen Sie Plugins | Anmeldung | StackReg | Übersetzung. Wählen Sie als nächstes Plugins | Anmeldung | StackReg | Starre Körper10.
    2. Set-up ROI-Manager um die Signalintensität in der Bleiche ROI zu messen. Wählen Sie analysieren | Werkzeuge | ROI-Manager. Wählen Sie das ovale Werkzeug, dann zeichnen Sie einen Kreis in der Bleiche ROI mit einem Durchmesser von 10 Pixel, dann klicken Sie auf die Schaltfläche " Hinzufügen ".
    3. Set-up ROI Manager Signalintensität im Steuerelement ROI zu messen. Wählen Sie im ROI-Manager das Rechteck -Werkzeug zeichnen Sie ein Quadrat von 20 x 20 Pixel in der Kontrollregion ROI, dann klicken Sie auf die Schaltfläche " Hinzufügen ".
    4. Set-up ROI Manager Signalintensität im Hintergrund ROI zu messen. Wählen Sie im ROI-Manager das Rechteck -Werkzeug, zeichnen Sie ein Quadrat von 20 x 20 Pixel in der Hintergrund-ROI-Region, dann klicken Sie auf die Schaltfläche " Hinzufügen ".
    5. Benennen Sie die ROIs. Nach dem Hinzufügen des ROIs im ROI-Manageranalysiert werden, benennen Sie sie bleichen ROI Steuerung ROIund Hintergrund ROI entsprechend.
    6. Maßnahme Signalintensität in der ROIs. Wählen Sie bleichen ROI Steuerung ROIund Hintergrund ROIund dann mehr | Multi-Maßnahme. Stellen Sie sicher, dass alle 35 Scheiben messen und eine Zeile pro Slice ausgewählt sind. Sicherzustellen Sie im Fenster Set Messungen , dass nur graue Mittelwert ausgewählt ist.
      Hinweis: Dies sind die Rohdaten FRAP (Abbildung 1B).
    7. Fügen Sie die Ergebnisse in einem Tabellenkalkulationsprogramm (Table of Materials). Kopie der Bleiche ROI, Steuern ROI und Hintergrund ROI Signalintensität ergibt sich dann fügen Sie sie in Spalten mit der Bezeichnung Bleach ROI, Kontrolle ROIund Hintergrund ROI, bzw. in einem Tabellenkalkulationsprogramm (Table of Materials).
  5. Datenanalyse in einem Tabellenkalkulationsprogramm
    1. Hintergrund-Korrektur der Signalintensität in der Bleiche ROI und Kontrolle ROI (Abbildung 1A, C). Verwenden Sie die Funktion einfügen -Werkzeug in einem Tabellenkalkulationsprogramm (Table of Materials), subtrahieren Sie die Werte in der Spalte mit der Bezeichnung Hintergrund ROI aus den Werten in der Spalte Bleach ROI. Subtrahieren Sie die Werte in der Spalte mit der Bezeichnung Hintergrund ROI aus den Werten in der Spalte Control ROI. Beschriften Sie diese neuen Spalten Korrigiert Bleach ROI und Korrigiert Kontrolle ROI.
    2. Das Signal in das Bleichmittel ROI auf das Hintergrund-korrigierte Signal im Steuerelement ROI (Abbildung 1A, D) zu normalisieren. Verwenden Sie die Funktion Einfügen in ein Tabellenkalkulationsprogramm (Table of Materials), teilen Sie die Werte in der Spalte mit der Bezeichnung Korrigiert Bleach ROI durch die Werte in der Spalte mit der Bezeichnung Korrigiert Kontrolle ROI. Beschriften Sie diese neue Spalte Normalisiert korrigiert Bleach ROI.
    3. Das Signal in der Spalte Normalisiert korrigiert Bleach ROI auf den Durchschnitt der 5 prebleach Werte in das Bleichmittel ROI (Abbildung 1A, E) zu normalisieren. Berechnen Sie den Mittelwert der 5 prebleach Werte in das Bleichmittel ROI. Als nächstes teilen Sie die Werte in der Spalte Normalisiert korrigiert Bleach ROI durch den Durchschnitt der 5 prebleach Werte in das Bleichmittel ROI. Beschriften Sie diese neue Spalte Normalisiert korrigiert Prebleach durchschnittliche Bleach ROI.
  6. Mobilen Bruchteil und Halbzeit der Wiederaufnahme von Kurve ausgestattet Daten
    1. Fit-Kurve die normierte und korrigierte Bleichmittel ROI-Daten mit einem Bildbearbeitungsprogramm (Table of Materials). Wählen Sie in der Verarbeitung Bildbearbeitungsprogramm (Table of Materials), analysieren | Werkzeuge | Curve Fitting. Kopie der Postbleach normalisiert und korrigiert Bleichmittel ROI-Werte und die zugehörigen Zeitwerte, fügen Sie sie dann in die Kurve Fitter Fenster. Wählen Sie Exponentielle Recovery Kurve Fitter Drop-Down-Menü, dann passen.
    2. Berechnen Sie die M-f aus den Parametern der Recovery-Funktion, die Werte für bietet: 'a', eine sich langsam erholenden Bruchteil; 'b', die Wiederfindungsrate; und "c", eine stark diffundierende Bruchteil. Calculate Mf durch Einstecken in die Werte für 'a' und 'c' in der Gleichung Mf = ein + c. berechnen die ichf mit der Gleichung ichf = 1 - M-f. Setzt man den Wert für 'b' in der Gleichung berechnen t½ Equation 2 dann die Lösung für t1/2. 11

Representative Results

Hier sind die Ergebnisse der ein typisches Experiment, in dem wir FRAP verwendet, um den Grad der Mobilität der p62 in ALIS in RAW264.7 Zellen behandelt mit LPS für 3-5 h12zu untersuchen. Abbildung 3 A zeigt die rohen Daten aus ein Bleichmittel, Steuern und Hintergrund ROI, nachdem der Stapel von Bildern angeglichen hatte, um für Kleinbeträge zu korrigieren (< ~ 3 µm) Bild Drift von der ALIS. YFP-p62 Fluoreszenz in diesem ALIS an Prebleach und Postbleach ist in Abbildung 3E und ergänzende Video 1gezeigt. Abbildung 3 B zeigt diese Daten nach der Hintergrund-Korrektur. Abbildung 3 C zeigt diese Daten nach der Korrektur Fluoreszenz im Steuerelement ROI. Abbildung 3 D zeigt diese Daten auf die mittlere Fluoreszenz der 5 prebleach Werte in das Bleichmittel ROI normalisiert. Der Grad der bleichen reichte in diesem Experiment (Bleichen Tiefe = 91.94). YFP-p62 Fluoreszenz innerhalb dieses ALIS erholte sich langsam, als t1/2 = 128.27 s (2,14 min). YFP-p62 war kein sehr mobiler Protein in diesem Experiment als Mf = 21.97 und If = 78.03.

Figure 1
Abbildung 1 : Ein Diagramm mit einer RAW264.7 Zelle und Schritte für die Bildanalyse nach Behebung für Drift-Bild von der ALIS FRAP Bilder ausgerichtet wurden. (A) schematische Darstellung einer RAW264.7 Zelle Darstellung mehrere ALIS und der Bleiche, Kontrolle und Hintergrund ROIs im Rahmen der Akquisition ROI. (B) eine idealisierte Darstellung des rohen FRAP Daten erhalten die Bleichmittel, Steuerung, als auch im Hintergrund ROIs Panel A. (C) eine idealisierte Grafik der FRAP-Rohdaten, die Hintergrund-korrigiert wurden. (D) eine idealisierte Grafik von Hintergrund-korrigierte FRAP-Daten, die auf Fluoreszenz im Steuerelement ROI normalisiert haben. (E) eine idealisierte Grafik des normalisierten und Hintergrund-korrigierte FRAP-Daten, die auf die prebleach Fluoreszenz in der Bleiche ROI normalisiert haben. Abkürzungen: Con = Kontrolle; BG = Hintergrund. Diese Zahl wurde von Rabut und Ellenberg4geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Bilder der Benutzeroberfläche in der Ziel-Software (Table of Materials) für die Laser-Auswahl, breite Weg Konfiguration und Erwerb Bildparameter für die FRAP Experimente. (A) Laser steuern Bildschirm zeigt das Argon/2 Laserlinien, Ausgabe und Röhrenstrom verwendet. (B) Konfiguration steuern Bildschirm zeigt den Strahl Splitter und Emission Filtereinstellungen verwendet. (C) Bild steuern Bildschirm zeigt die Einstellung für die Bildaufnahme verwendet. (D) Scan steuern Bildschirm zeigt die Lochkamera, Detektor Gewinn, Verstärker Offset, Verstärkungsfaktor und Getriebeeinstellungen für Argon/2 514 nm Laserlinie. (E) Time-Serie kontrollieren Bildschirm zeigt die Zeiteinstellungen Serie verwendet. (F) Bleach steuern Bildschirm zeigt die Prebleach und postbleach Parameter verwendet. Abkürzungen: HFT = Haupt-Farb-Teiler (primäre dichroitischer Strahlteiler); NT1 = Neben Farb Teiler 1 (erste sekundäre dichroitischen beam Splitter); NT2 = Neben Farb Teiler 2 (zweiter sekundäre dichroitischer Strahlteiler); EF = Emission Filter. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Eine repräsentative FRAP-Experiment, YFP-p62 Dynamik in ALIS in RAW264.7 Zellen zu studieren. (A) Raw Fluoreszenz Intensitätsdaten für ein Bleichmittel, Kontrolle und Hintergrund ROI. (B) die Angaben in zentrale A nachdem die Bleichmittel und Kontrolle ROI für Fluoreszenz im Hintergrund ROI berichtigt worden. (C) die Daten nach Normalisierung der Fluoreszenzintensität in das Bleichmittel ROI zu Konto für Fluoreszenz im Hintergrund-korrigierte Steuerelement ROI in Platten A und B gegeben. (D) die Angaben in A-C-Panels nach Normalisierung der Fluoreszenzintensität im normalisierten und Hintergrund-korrigierte Bleichmittel ROI auf den Durchschnitt der ersten 5 prebleach Werte in das Bleichmittel ROI. Mf = 21.97, ichf = 78.03, t1/2 = 128.27 s (2,14 min) und Bleichmittel Tiefe = 91.94. (E) ein Bild von einem ALIS Prebleach (1,5 min) und Postbleach (0, 6 und 16 min.). Maßstabsleiste = 5 µm und gilt für alle Paneele. Abkürzungen: Con = Kontrolle; BG = Hintergrund; Korr. = korrigiert; Norm. = normalisiert; Ø = Durchschnitt. Diese Zahl wurde von Cabe Et Al.12geändertKlicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Supplementary Video 1
Ergänzende Video 1: eine typische ALIS in einem RAW264.7 Makrophagen vor und nach Immunofluoreszenz. YFP-p62 Fluoreszenz ist langsam zum erholen nach der Photobleach; p62 ist daher nicht sehr mobil Protein. Für dieses Experiment, Mf = 25.62, ichf = 74.38, t1/2 = 442.79 s (7,38 min) und Bleichmittel Tiefe = 90.19. Maßstabsleiste = 5 µm. Dieses Video wurde von Cabe Et Al.12Bitte klicken Sie hier geändert, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)

Discussion

Wir bieten eine umfassende, praktische und einfache Schritt für Schritt Protokoll für FRAP Experimente mit lebenden Zellen. Hier das Protokoll wurde verwendet, um die Mobilität der YFP-p62 in ALIS in RAW264.7 Makrophagen zu messen, aber es kann auf viele der Laserscanning confocal Mikroskop-Systeme angewendet werden und genetisch codierte fluoreszierende Proteine, die jetzt verfügbar sind. Für jedes Mikroskopie-System sind Pilotversuchen entscheidend für die Bestimmung der optimalen FRAP-Parameter, einschließlich Erwerb, Bleichmittel und Kontrolle ROI Größen Laserintensität für Immunofluoreszenz und prebleach und postbleach Bildaufnahme. Es ist sinnvoll, die optimale FRAP-Parameter für jede genetisch codierte fluoreszierende Protein und Zelle Linie abweichen zu erwarten.

Wichtige Faktoren zu berücksichtigen, wenn Durchführung eines Experiments FRAP umfassen (a) erreichen geeignet bleichen Tiefe, (b) die Verwendung von einem kurzen bleichen Schritt (c) so dass genügend Zeit Postbleach zu beobachten, die vollständige Wiederherstellungsfunktion, (d) Immunofluoreszenz Effizienz, (e). Zytotoxizität mit wiederholten FRAP und (f) die Aufnahme eines Steuerelements für Fluoreszenz-Verlust wegen wiederholter Bildgebung. Es wird empfohlen, Tiefe, Bleichmittel, die gemäß der in Abschnitt 3.3.1 bereitgestellten Gleichung berechnet werden kann, ≥9013Jahre alt sein. Als Bleichmittel Tiefe ist < 90, der Grad der postbleach Fluoreszenz Erholung wird unterschätzt werden, und die Werte von IfMfund t1/2 werden falsch. Obwohl die Dauer und Intensität der Laserpulse Bleichmittel-induzierende zwischen FRAP Experimente variieren, ist es wichtig, dass die Immunofluoreszenz Schritt kurz und deutlich schneller als der Fluoreszenz-Recovery-Funktion. Wenn es nicht ist, könnte eine erhebliche Menge an Fluoreszenz Erholung während der Bleiche Schritt auftreten. Mit einer langen Bleichmittel, Fluoreszenz Erholung während der Bleiche Schritt nicht gemessen werden, und es würde führen zu Fehlmessungen von If, M,f, undt1/2. Darüber hinaus, um korrekte Werte zu erhalten für If, M,f, undt1/2, mit dem ROI beachtet werden postbleach bis die Fluoreszenz in der Bleiche ROI ein Plateau erreicht hat. Zum Beispiel in unseren Experimenten FRAP gab es keinen Unterschied zwischen dem ichf, M,fund t1/2 Werte wenn wir YFP-p62 Fluoreszenz in der Bleiche ROI 32,2 min postbleach beobachtet gegenüber wenn wir YFP-p62, in der Bleiche ROI beobachtet für 15,1 min Postbleach; So schlossen wir, dass die Recovery-Funktion ein Plateau bei 15,1 min postbleach12erreicht. Im Hinblick auf Immunofluoreszenz Effizienz erhöht Immunofluoreszenz mit dem Quadrat der optische Zoom Faktor14. Somit ist die Verwendung von hohen optischen Zoom-Objektive ist günstig für schnelle Immunofluoreszenz aber unerwünschte Immunofluoreszenz während der Akquisition führen kann; Letztere können berücksichtigt werden durch bildgebende ein Steuerelement ROI. Wiederholte Immunofluoreszenz soll vermieden werden, da es zu der Generation von zytotoxisch reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) führen kann. Jedoch der Grad der ROS-Generation aufgrund der Exposition gegenüber einem Hochleistungs Laser ist geringer bei genetisch codierte fluoreszierende Proteine als chemische Fluorophore (z. B. fluoreszierende Antikörper)15, und der ROS erzeugt eher reagieren innerhalb der genetisch codierten fluoreszierenden Proteins als mit anderen Molekülen in der Zelle4. Neben der erhöhten Wahrscheinlichkeit der Erzeugung von zytotoxischen ROS soll wiederholte Immunofluoreszenz vermieden werden, da es schwer zu kontrollieren ist. Schließlich obwohl niedrige Laser Übertragung verwendet wird, um alle nicht-Bleichmittel Bilder zu erwerben, wird einige Immunofluoreszenz unweigerlich auftreten, muss kontrolliert werden. Mögliche Kontrollen dafür gehören Überwachung Fluoreszenz in einem Steuerelement ROI innerhalb der Erwerb ROI, Erlangung der Kontrolle Bilder in eine Nachbarzelle ungebleicht und Kontrolle experimentieren mit identischen Einstellungen für die in der Immunofluoreszenz-Experimente, aber ohne das Immunofluoreszenz-Ereignis.

Disclosures

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt, offen zu legen.

Acknowledgments

Wir danken Dr. Seth Robia Loyola University Chicago für seine wertvollen Anmerkungen zu dieser Handschrift. Diese Arbeit wurde von NIH Grant 1R01NS073967-01A1 zu Joanna C. Bakowska unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium Hyclone SH30022.01 High Glucose (4.5 g/L)
Fetal bovine serum Gemini Bio-Products 100-106
Glass bottom dishes MatTek P35G-1.5-14-C 35 mm
ImageJ software National Institutes of Health N.A.
Lipopolysaccharide (LPS) Sigma L4391
Nocodazole Sigma M1404
Penicillin-streptomycin solution Corning 30-002-Cl 100×
Plan-Apochromat 63×/1.40 Oil objective Carl Zeiss MicroImaging, Inc 4407629904000000
Polyethylenimine (PEI) Polysciences 23966-1 linear (MW 25,000)
RAW 264.7 murine macrophages ATCC TIB-71
Zeiss confocal microscope Carl Zeiss MicroImaging, Inc LSM 510

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References

  1. Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophysical Journal. 16 (9), 1055-1069 (1976).
  2. Peters, R., Peters, J., Tews, K. H., Bahr, W. A microfluorimetric study of translational diffusion in erythrocyte membranes. Biochimica et Biophysica Acta. 367 (3), 282-294 (1974).
  3. Patterson, G., Day, R. N., Piston, D. Fluorescent protein spectra. Journal of Cell Science. 114, Pt 5 837-838 (2001).
  4. Rabut, G., Ellenberg, J. Photobleaching techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, iFRAP, and FLIP. Live Cell Imaging: A Laboratory Manual (1st ed). , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 101-126 (2004).
  5. Fritzsche, M., Charras, G. Dissecting protein reaction dynamics in living cells by fluorescence recovery after photobleaching. Nature Protocols. 10 (5), 660-680 (2015).
  6. Goodwin, J. S., Kentworthy, A. K. Photobleaching approaches to investigate diffusional mobility and trafficking of Ras in living cells. Methods. 37 (2), 154-164 (2005).
  7. Hildick, K. L., Gonzàlez-Gonzàlez, I. M., Jaskolski, F., Henley, J. M. Lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching. Journal of Visualized Experiments. (60), e3747 (2012).
  8. Nissim-Rafinia, M., Meshorer, E. Photobleaching assays (FRAP & FLIP) to measure chromatin protein dynamics in living embryonic stem cells. Journal of Visualized Experiments. (52), e2696 (2011).
  9. Zheng, C., Petralia, R. S., Wang, Y., Kachar, B. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) of fluorescence tagged proteins in dendritic spines of cultured hippocampal neurons. Journal of Visualized Experiments. (50), e2568 (2011).
  10. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
  11. Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).
  12. Cabe, M., Rademacher, D. J., Karlsson, A. B., Cherukuri, S., Bakowska, J. C. PB1 and UBA domains of p62 are essential for aggresome-like induced structure formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (4), 2306-2311 (2018).
  13. Brown, E. B., Wu, E. S., Zipfel, W., Webb, W. W. Measurement of molecular diffusion in solution by multiphoton fluorescence photobleaching recovery. Biophysical Journal. 77 (5), 2837-2849 (1999).
  14. Centonze, V., Pawley, J. Tutorial on practical confocal microscopy and the use of the confocal test specimen. Handbook of biological confocal microscopy. , Plenum Press. New York. 549-570 (1995).
  15. Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. Physiological Reviews. 90 (3), 1103-1163 (2010).

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Biologie Ausgabe 145 Fluoreszenz Erholung nach Immunofluoreszenz FRAP gelb fluoreszierende Protein live Cell imaging Protein Mobilität murinen Makrophagen p62 Sequestosome-1 aggresome
Fluoreszenz-Erholung nach Immunofluoreszenz von gelb fluoreszierende Protein Tagged p62 in Aggresome-induzierten Strukturen
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Rademacher, D. J., Cabe, M., Bakowska, J. C. Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures. J. Vis. Exp. (145), e59288, doi:10.3791/59288 (2019).

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