Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Fluorescens utvinning etter Photobleaching av gule fluorescerende Protein merket p62 i Aggresome-lignende indusert strukturer

Published: March 26, 2019 doi: 10.3791/59288
Automatic Translation
1, 2, 2
1Core Imaging Facility and Department of Microbiology and Immunology, Loyola University Chicago, 2Department of Molecular Pharmacology and Therapeutics, Loyola University Chicago

Summary

Vi beskriver en omfattende og praktisk protokoll for fluorescens gjenoppretting etter photobleaching eksperimenter med live celler. Selv om protokollen ble brukt til å måle mobilitet av gule fluorescerende protein-merket p62 i aggresome-lignende menneskeskapte strukturer, kan den brukes til en rekke mikroskopi systemer og fluorescerende proteiner.

Abstract

Fluorescens utvinning etter photobleaching (FRAP) er en mikroskopi teknikk som kan brukes til å kvantifisere protein mobilitet lever celler. I et typisk FRAP eksperiment, er stabil fluorescens observert av gjentatte bildebehandling med lav intensitet laserlys. Deretter er fluorescerende molekylene raskt og irreversibelt svekket via kort eksponering for høy intensitet laserlys. Informasjon om protein mobilitet oppnås ved å overvåke utvinning av fluorescens. Vi brukte FRAP for å bestemme mobilitet av p62 i aggresome-lignende menneskeskapte strukturer (ALIS) i murine makrofager etter stimulering med lipopolysakkarid (LPS). Fordi mange eksisterende FRAP protokoller er enten ufullstendig eller komplekse, var målet vårt å gi en omfattende, praktisk og enkel trinnvise protokoll for FRAP eksperimenter med levende celler. Her beskriver vi RAW264.7 macrophage transfection med gule fluorescerende protein-p62 (YFP-p62), induksjon av ALIS ved å utsette cellene LPS, og en trinnvis metode for innsamling av prebleach og postbleach FRAP bilder og data analyse. Til slutt, vi diskutere viktige faktorer å vurdere når du utfører en FRAP eksperiment.

Introduction

Fluorescens gjenoppretting etter photobleaching (FRAP) er en mikroskopi teknikk som kan brukes til å kvantifisere protein dynamikk i levende celler1,2. Populariteten til FRAP har økt fordi kommersielle av laserskanning AC confocal mikroskop med høy oppløsning, hastighet og sensitivitet, og en "rainbow" av genetisk kodet fluorescerende proteiner, som grønn fluorescerende protein (GFP) og gule fluorescerende protein (YFP)3. Genetisk kodet fluorescerende proteiner er smeltet til et protein av interesse å tillate den subcellular lokaliseringen av protein av interesse. I et typisk FRAP eksperiment, er stabil fluorescens i et oppkjøp område av interesse (ROI) i en celle observert via gjentatte avbilding av at Avkastningen med lav intensitet laserlys. Deretter er fluorescerende molekylene raskt og irreversibelt nedsatt i et forhåndsdefinert delsett av oppkjøpet avkastning, heretter referert til som blekemiddel avkastning, med kort eksponering for høy intensitet laserlys. Som nye ubleket proteiner fylle bleket proteiner over tid, gir fart og intensitet på fluorescens utvinning i blekemiddel ROI informasjon om protein mobilitet (figur 1)4.

Vår interesse i å bestemme mobilitet av ubiquitin binding protein p62 (også kjent som sequestosome-1) i aggresome-lignende menneskeskapte strukturer (ALIS) i murine RAW264.7 makrofager etter stimulering med lipopolysakkarid (LPS) førte oss til å vurdere FRAP litteratur. Dessverre, mange av de eksisterende FRAP protokollene er ufullstendig eller inordinately komplekse5,6,7,8,9. Noen gir ikke detaljert informasjon om laser innstillinger, strålen banen konfigurasjon og bilde oppkjøpet parametere5,6,7,8,9. Andre utelatt detaljer om dataanalyse, som hvordan å løse problemet av blekemiddel ROI drift6,9 eller beregne viktige utvinning parametere, inkludert mobile brøkdel (Mf), ubevegelig brøk (Jegf), og halv-time recovery (t½)5,7. Derimot andre plassert mye vekt på komplekse matematiske formler brukes til å beregne Mf, jegfog t,1/2,5,,6,,8,,9. Dermed er vårt formål å gi en omfattende, praktisk og enkel trinnvise protokoll for FRAP eksperimenter med levende celler.

Protocol

1. RAW264.7 Macrophage Transfection

  1. Kultur 100.000 RAW264.7 celler (Tabell for materiale) i fullstendig kultur medium (Dulbeccos endret Eagle Medium (DMEM)) (Tabell for materiale) inneholder 4,5 finans glukose supplert med 10% fosterets bovin serum (Tabell for materiale ) og penicillin/streptomycin (Table of Materials) til ubehandlet 35 mm glass bunn retter (Tabell for materiale) og plassere retter i en 37 °C/5% CO2 inkubator. På dagen transfect cellene med 1 mg/mL polyethylenimine (PEI) (Tabell for materiale).
  2. Mix 1.5 μg av YFP-p62 med 8 μL PEI i 166 μL serum-free DMEM (base medium uten fosterets bovin serum og penicillin/streptomycin).
  3. La transfection komplekse blandingen sitte ved romtemperatur i 15 minutter før du legger blandingen i hver plate.
  4. Legg komplekser til eksisterende medium celler og rock platen forsiktig.
  5. Plasser platen i en 37 ° C /5% CO2 inkubator over natten.
  6. Morgenen Sug opp mediet av platen, og deretter skyll når med komplett medium. Legg 2 mL komplett medium til platen, og at cellene å komme seg før neste dag.

2. induksjon av ALIS med lipopolysakkarid (LPS)

  1. Neste dag, Sug opp mediet platene, og deretter legge 1 mL av komplett middels inneholder 10 ng/mL LPS (Tabell for materiale). La platene å ruge 5 h i en 37 °C/5% CO2 inkubator.
  2. Etter LPS behandling, Sug opp mediet, deretter legge 1 mL kaldt, sterile Tyrode buffer med 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM glukose, 1,5 mM CaCl2, 1.0 mM MgCl2og 10 mM HEPES (pH 7.4) skylle platen.
  3. Sug opp bufferen, deretter legge 1 mL kaldt, sterile Tyrode buffer med 10 μg/mL nocodazole (Tabell for materiale). La platene å ruge på 4 ° C i 15-20 min før FRAP bildebehandling og analyse.
    Merk: Bruk av Tyrodes bufferen som inneholder HEPES som bufring sammensatte tillater å utføres ved romtemperatur. Nocodazole ble brukt til å redusere ALIS bevegelse av piskehale som henger. Kultur medium inneholder bikarbonat som et bufring sammensatt krever CO2 til bufferen. Ellers bikarbonat finnes i middels endringer pH i fravær av CO2.

3. oppsett av AC Confocal mikroskopet og velge regionen rundt

  1. Utvalg og strålen banen konfigurasjon
    1. Bruke noen passende AC confocal mikroskop (Tabell for materiale) utstyrt med sikte eller ZEN programvare (Tabell for materiale) eller egnet tenkelig programvare.
    2. Velg 514 nm Argon/2 laser, som YFP har topp eksitasjon på 512 nm og topp utslipp på 527 nm. Klikk på Hent -knappen og deretter knappen Laser . I vinduet Laser kontroll klikker Argon/2 458, 477, 488, 514 nm, deretter Standby . Etter venter ~ 3 minutter til at laseren varme opp, klikker du på (figur 2A).
    3. Sette laser makt 514 nm Argon/2 laser linjen til 100% (8.6 A). Klikk på Hent -knappen og deretter knappen Laser . I vinduet Laser kontrollen angir 100 i feltet Output [%] , og trykk på Enter -knappen (figur 2A).
    4. Angi sendingen av 514 nm Argon/2 laser linjen 5%. Klikk på Hent -knappen, deretter knappen kanaler . I vinduet Scan kontroll Klikk kanaler og deretter den firkantede hvite boksen til venstre for teksten 514 nm i linje aktiv -kolonnen for å aktivere 514 nm laser linjen. Angi 5 i feltet overføring [%] for 514 nm laser linjen (figur 2D).
    5. Angi den primære dichroic stråle splitteren (Haupt Farb Teiler (HFT)) til HFT 458/514/561 posisjon slik at disse bandene er avledet til prøven for eksitasjon. Klikk på Hent -knappen, deretter knappen Config . Klikk knappen Kanalsmodus , deretter Enkelt spor -knappen i vinduet Konfigurasjonskontrollen . Klikk HFT , og velg HFT 458/514/561 fra det miste-ned menyen (figur 2B).
    6. Angi den første sekundære dichroic stråle splitteren (Neben Farb Teiler 1 (NFT1)) til speilet stillingen, som vil avlede 100% av lyset til andre sekundære dichroic strålen fordeleren (Neben Farb Teiler 2 (NFT2)). Klikk på Hent -knappen, deretter knappen Config . Klikk knappen Kanalsmodus , deretter Enkelt spor -knappen i vinduet Konfigurasjonskontrollen . Klikk NFT1 , og velg speil fra det miste-ned menyen (figur 2B).
    7. Angi andre sekundære dichroic strålen splitter (NFT2) i NFT 515 stilling slik at bølgelengder < 515 nm gjenspeiles og bølgelengder > 515 nm overføres. Klikk på Hent -knappen, deretter knappen Config . Klikk knappen Kanalsmodus , deretter Enkelt spor -knappen i vinduet Konfigurasjonskontrollen . Klikk NFT2 , og velg NFT 515 fra det miste-ned menyen (figur 2B).
    8. Angi lang pass (LP) utslipp filteret (EF) til LP 530, slik at bølgelengder > 530 nm overføres til photomultiplier røret (avdrag, detektor). Klikk på Hent -knappen, deretter knappen Config . Klikk knappen Kanalsmodus , deretter Enkelt spor -knappen i vinduet Konfigurasjonskontrollen . Klikk utslipp filter -knappen, og velg LP 530 fra det miste-ned menyen (figur 2B).
    9. Velg kanal 3. Klikk på Hent -knappen, deretter knappen Config . Klikk knappen Kanalsmodus , deretter Enkelt spor -knappen i vinduet Konfigurasjonskontrollen . Klikk den firkantede hvite boksen til venstre for knappen Ch3 .
  2. Image oppkjøpet oppsett
    1. Velg Plan-Apochromat 63 x / 1.40 olje mål (Tabell for materiale). Vis prøven gjennom mikroskop okularet og plassere ALIS midt i synsfeltet. Klikk på Hent -knappen, deretter knappen mikro . Klikk på målet, så velg Plan-Apochromat 63 x i Mikroskop kontrollvinduet, / 1.40 olje målet fra det miste-ned menyen.
    2. Angi bildestørrelsen til 512 x 512 bildepunkter, skannehastighet 8og data dybden til 12 bit. Klikk på Hent -knappen, deretter skanne knappen. I vinduet Scan kontroll på modus -knappen og knappen ramme , klikk på knappen 512 . ENTER 8 innen Skanning fart , trykk Enterog deretter på knappen 12 Bit (figur 2C).
    3. Angi skanning gjennomsnittet til 1 og optisk zoom til 3. Klikk på Hent -knappen og deretter på Scan -knappen. I vinduet Scan kontroll , klikk pil ned-knappen av skanning gjennomsnittlig feltet og velg 1 fra det miste-ned menyen. Angi 3 i feltet optisk zoom, trykk Enter (figur 2C).
    4. Angi hullet 1.95 luftige enheter og detektoren gevinst å 582 (like nedenfor metning). Klikk på Hent -knappen, deretter skanne knappen. I vinduet Scan kontroll Klikk kanaler , angi 196 i feltet Pinhole, trykk deretter Enter. Angi 582 i feltet detektor få, trykk Enter (figur 2D).
    5. Kontroller at 514 nm Argon/2 laser linjen er satt til 100% strøm (8.6 A). Klikk på Hent -knappen, deretter Laser -knappen. I Laser systemmenyen, bør verdien i feltet Output [%] være 100 (figur 2A).
    6. Kontroller at 514 nm Argon/2 laser linjen er satt til 5% overføring. Klikk på Hent -knappen, deretter skanne knappen. I vinduet Scan kontroll skal verdien i feltet overføring [%] for 514 nm laser linjen 5 (figur 2D).
    7. Opprette en firkantet avkastning (acquisition ROI), som har dimensjoner 150 x 150 piksler (194.6 µm2). Klikk på Hent -knappen, deretter knappen Rediger avkastning . I menyen Rediger ROI klikker ikonet rektangel, og klikk og dra i bildevinduet for å opprette et felt som har dimensjoner 150 x 150 bildepunktene (194.6 µm2) (figur 1A).
      Merk: Oppkjøpet ROI omfatter (a) en ALIS interesse, (b) et område på fluorescens som ikke en ALIS (kontroll ROI) og er minst 20 x 20 piksler (3,3 µm2) og (c) et område med liten eller ingen fluorescens (bakgrunn ROI) som er minst 20 x 20 piksler (3,3 µm 2) (figur 1A). Det er viktig å inkludere en kontroll avkastning i oppkjøpet avkastning slik at photobleaching som kan oppstå med gjentatte bildebehandling kan kontrolleres. Oppkjøpet avkastning som er definert her vil være det eneste området som skal skannes. Gjentatte laser skanningen innenfor en anskaffelse Avkastningen bare vil begrense photobleaching til den Avkastningen i stedet, for eksempel photobleaching hele cellen eller flere celler, og antall piksler samlet på avdrag (detektor) vil være større enn antall piksler samlet på avdrag (detektor) etter en hel celle eller flere celler.
    8. Oppsettet tidsserien slik at oppkjøpet Avkastningen er skannet 35 ganger, en gang enhver 30 s. Klikk på Hent -knappen og knappen Tidsserier . Klikk knappen manuelt starte serien og manuell stopp serien i vinduet Tidskontroll serien . Angir 35 i seriefeltet manuelle, trykk Enter , deretter klikker 30.0 sek syklus forsinkelse (figur 2E).
    9. Angi blekemiddel kontrollen slik at photobleaching vil skje etter skanning for 5 å samle 5 prebleach bilder av oppkjøpet avkastning. Klikk på Hent -knappen, deretter Redigere Bleach knappen. I vinduet Bleach kontroll , klikker du den hvite firkanten ved siden av den bleke etter antall skanninger. Angi 5 i feltet skanning, og trykk Enter (figur 2F) .
      Merk: Prebleach og postbleach bør være kjøpt på samme optiske dybden.
    10. Opprette en rund-formet blekemiddel avkastning innen ALIS som har en 10-piksler diameter (området = 0,8 µm2). Klikk kjøpe | Redigere blekemiddel | Definere områder. Klikk ikonet sirkel i vinduet Bleach regioner . Klikk og dra i bildevinduet for å lage en sirkel som har en 10-piksler diameter (området = 0,8 µm2) (figur 2F).
    11. Angi gjentakelser til 300. Klikk på Hent -knappen, deretter Redigere Bleach knappen. Angi 300 i feltet gjentakelser i vinduet Bleach kontroll , og trykker Enter (figur 2F) .
    12. Angi Argon/2 514-nm laser linje til 100% strøm (8.6 A) og 100% overføring under blekemiddel. Klikk på Hent -knappen, deretter Redigere Bleach knappen. I vinduet Bleach kontroll klikker den hvite firkantet boksen til venstre for 514 nm. Angir 100 i feltet overføring [%] for 514 nm laser linjen og trykker på Enter -knappen (figur 2F).
      Merk: Antall gjentakelser må bestemmes empirisk. Det varierer avhengig av fluorophore, størrelsen på strukturen som vil være bleket og laser.
  3. Datainnsamling
    1. Starte FRAP eksperimentet. Samle 5 første prebleach bilder og det første postbleach bildet, og deretter beregne blekemiddel dybde i henhold til denne formelen.
      Equation 1
      Hvis blekemiddel dybden er < 90, stoppe eksperimentet og forkaste data, som bleach dybden ikke var tilstrekkelig. Når blekemiddel dybde er ≥90, samle data for analyse med en bildebehandling program og et regnearkprogram (Tabell for materiale).
      Merk: Når drift av ALIS ≥3 µm, stoppe eksperimentet og forkaste data, som denne mengden bilde drift ikke kan korrigeres for analysen med bildebehandling (Tabell for materiale). Når drift av ALIS er < 3 µm, samle data for dataanalyse med en bildebehandling program og et regnearkprogram (Tabell for materiale).
    2. Samle FRAP data fra 10 ALIS fra 10 celler med mindre enn 3 µm av drift av ALIS. Deretter overføre målet .lsm filer til en PC for dataanalyse.
  4. Dataanalyse i et bildebehandling-Program
    1. Riktig for bildet drift av justere eller tilsvarende (dvs. registrering) av gang-serie bilder av oppkjøpet avkastning. Gjør åpne hver målet .lsm fil med en bilde-behandlingsprogram (Tabell for materiale) og velg Plugins | Registrering | StackReg | Oversettelse. Deretter velger Plugins | Registrering | StackReg | Rigid kropp10.
    2. Satt opp ROI Manager å måle signal intensiteten i blekemiddel avkastning. Velg analysere | Verktøy | ROI Manager. Velg ellipse -verktøyet, tegne en sirkel i blekemiddel avkastning med en diameter på 10 bildepunkter, deretter klikker du Legg til .
    3. Satt opp ROI Manager å måle signal intensiteten i kontrollen avkastning. I Avkastningen Manager, velg Rektangelverktøy, og tegn en firkant på 20 x 20 piksler i regionen kontroll avkastning og deretter Legg .
    4. Satt opp ROI Manager å måle signal intensiteten i bakgrunnen avkastning. I Avkastningen Manager, velg Rektangelverktøy , tegne et kvadrat 20 x 20 piksler i regionen bakgrunn avkastning, så klikk Legg .
    5. Gi nytt navn ROIs. Etter tilføyer ROIs skal analyseres ROIManager, gi dem Bleach avkastning, kontroll avkastningog Bakgrunn avkastning tilsvarende.
    6. Mål signal intensitet i ROIs. Velg Bleach avkastning, kontroll avkastningog Bakgrunn avkastning, og velg mer | Multi mål. Kontroller at måle alle 35 skiver og én rad per sektor er valgt. Kontroller at bare mener grå verdi er valgt i vinduet Angi målinger .
      Merk: Dette er FRAP rådataene (figur 1B).
    7. Lim inn resultatene til et regnearkprogram (Tabell for materiale). Kopier blekemiddel avkastning, kontrollere avkastning, og bakgrunnen ROI signal intensitet resultater og lim dem til kolonner merket Bleach avkastning, kontroll avkastningog Bakgrunn avkastning, henholdsvis i et regnearkprogram (Tabell for materiale).
  5. Dataanalyse i et regnearkprogram
    1. Bakgrunn-korrekt signal intensiteten i blekemiddel avkastning og kontroll avkastning (figur 1A, C). Bruk verktøyet Sett inn funksjon i et regnearkprogram (Tabell for materiale) for å trekke verdiene i kolonnen Bakgrunn avkastning fra verdiene i kolonnen Bleach avkastning. Trekke verdiene i kolonnen Bakgrunn avkastning fra verdiene i kolonnen Kontroll avkastning. Merke disse nye kolonner Korrigert Bleach avkastning og Korrigert kontrollen avkastning.
    2. Normalisere signalet i blekemiddel avkastning på bakgrunn-korrigert signalet i kontrollen avkastning (figur 1A, D). Bruke funksjonen Sett inn i et regnearkprogram (Tabell for materiale) for å dividere verdiene i kolonnen Korrigert Bleach Avkastningen av verdiene i kolonnen Korrigert kontrollen avkastning. Merk denne nye kolonnen Normalisert korrigert Bleach avkastning.
    3. Normalisere signalet i kolonnen Normalisert korrigert Bleach avkastning til gjennomsnittet av de 5 prebleach verdiene i blekemiddel avkastning (figur 1A, E). Beregne gjennomsnittet av de 5 prebleach verdiene i blekemiddel avkastning. Deretter dividere verdiene i kolonnen Normalisert korrigert Bleach Avkastningen av gjennomsnittet av de 5 prebleach verdiene i blekemiddel avkastning. Merk denne nye kolonnen Normalisert korrigert Prebleach gjennomsnittlig Bleach avkastning.
  6. Mobile brøk og halv Time til utvinning fra kurven-montert Data
    1. Kurve-fit normalisert og korrigert blekemiddel ROI dataene med et bilde-behandlingsprogram (Tabell for materiale). Behandling bildebehandlingsprogrammet (Tabell for materiale), velg analyser | Verktøy | Kurven passende. Kopi av postbleach normalisert og korrigert blekemiddel ROI verdier og tilsvarende tidsverdier, deretter lime dem inn i vinduet Kurve montør . Velg Eksponentiell utvinning fra Kurven montør rullegardinmenyen og velg Tilpass.
    2. Beregne Mf fra parameterne for funksjonen utvinning, som inneholder verdier for: "a," en sakte utvinne brøkdel; 'b', utvinningsgrad; og 'c', en raskt spre brøkdel. Beregn Mf ved å koble verdiene for 'en' og 'c' i ligningen Mf = en + c. beregne If ved hjelp av formelen jegf = 1 - Mf. Beregne t½ ved å erstatte verdien for 'b' i ligningen Equation 2 deretter løse for t1/2. 11

Representative Results

Vist her er resultatet av en typisk eksperiment der vi brukte FRAP undersøke graden av mobilitet for p62 innenfor ALIS i RAW264.7 celler behandlet med LPS for 3-5 h12. Figur 3 En viser rådata fra en blekemiddel, kontrollere og bakgrunn avkastning etter av bilder hadde blitt justert til rette for små mengder (< ~ 3 µm) av bildet drift av ALIS. YFP-p62 fluorescens i denne ALIS på prebleach og postbleach er vist i Figur 3E og supplerende Video 1. Figur 3 B viser disse dataene etter bakgrunn-korreksjon. Figur 3 Disse dataene viser etter korrigering til fluorescens i kontrollen avkastning. Figur 3 D viser disse dataene normalisert å bety fluorescens 5 prebleach verdiene i blekemiddel avkastning. Graden av bleking var tilstrekkelig i dette eksperimentet (bleke dybde = 91.94). YFP-p62 fluorescens innenfor denne ALIS gjenopprettet sakte, t1/2 = 128.27 s (2,14 min). YFP-p62 var ikke et svært mobile protein i dette eksperimentet, som Mf = 21.97 og jegf = 78.03.

Figure 1
Figur 1 : Et diagram av en RAW264.7 celle og trinn for bildeanalyser etter FRAP bildene har blitt justert for å korrigere bildet drift av ALIS. (A) Diagram av en RAW264.7 celle viser flere ALIS og blekemiddel, kontroll og bakgrunn ROIs i oppkjøpet avkastning. (B) en idealisert skildring av rå FRAP data innhentet i blekemiddel, kontroll og bakgrunn ROIs i panelet A. (C) en idealisert graf med rå FRAP data som har blitt bakgrunn-korrigert. (D) en idealisert graf bakgrunn-korrigert FRAP data som har blitt normalisert til fluorescens i kontrollen avkastning. (E) en idealisert graf normalisert og bakgrunn-korrigert FRAP data som har blitt normalisert til den prebleach fluorescensen i blekemiddel avkastning. Forkortelser: Con = kontroll; BG = bakgrunn. Dette tallet ble endret fra Rabut og Ellenberg4. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Bilder av brukergrensesnittet i AIM-programvaren (tabell av materialer) for valg av laser stråle banen konfigurasjon og bilde oppkjøpet parametere for FRAP eksperimenter. (A) Laser administrere skjermen viser Argon/2 laser linjene, produksjon og rør gjeldende brukes. (B) konfigurasjon administrere skjermen viser strålen splitter og utslipp filterinnstillinger brukes. (C) skanning administrere skjermen viser innstillingen for bildeopptak. (D) skanning administrere skjermen viser pinhole, detektor, forsterker forskyvning, forsterker gevinst, tap og overføring innstillingene for Argon/2 514 nm laser linjen. (E) tidsserier administrere skjermen viser serien tidsinnstillingene brukes. (F) blekemiddel administrere skjermen viser prebleach og postbleach parameterene anvendt. Forkortelser: HFT = Haupt Farb Teiler (primære dichroic strålen splitter); NT1 = Neben Farb Teiler 1 (første videregående dichroic stråle splitter); NT2 = Neben Farb Teiler 2 (andre sekundære dichroic strålen splitter); EF = utslipp filter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Et representativt FRAP eksperiment å studere YFP-p62 dynamikk i ALIS i RAW264.7 celler. (A) rå fluorescens intensitet data for blekemiddel, kontroll, og bakgrunnen avkastning. (B) dataene gitt i panelet A etter blekemiddel og kontroll ROI hadde rettet til fluorescens i bakgrunnen avkastning. (C) dataene gitt i paneler A og B etter normalisere fluorescens intensiteten i blekemiddel ROI kontoen til fluorescens i kontrollen bakgrunn-korrigert Avkastningen. (D) data gitt i paneler vekselstrøm etter normalisere fluorescens intensiteten i normalisert og bakgrunn-korrigert bleke ROI gjennomsnittet av de 5 første prebleach verdiene i blekemiddel avkastning. Mf = 21.97, jegf = 78.03, t1/2 = 128.27 s (2,14 min) og blekemiddel dybde = 91.94. (E) et bilde av en ALIS prebleach (1,5 min) og postbleach (0, 6 og 16 min). Skala bar = 5 µm og gjelder for alle paneler. Forkortelser: Con = kontroll; BG = bakgrunn; Corr. = rettet; Normen. = normalisert; Gj.snittlig = gjennomsnitt. Dette tallet ble endret fra Cabe et al.12Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplementary Video 1
Supplerende Video 1: en typisk ALIS i en RAW264.7 macrophage før og etter photobleaching. YFP-p62 fluorescens er langsom å gjenopprette etter photobleach; Dermed er p62 ikke et svært mobile protein. For dette eksperimentet, Mf = 25.62, jegf = 74.38, t1/2 = 442.79 s (7.38 min) og blekemiddel dybde = 90.19. Skala bar = 5 µm. Denne videoen ble endret fra Cabe et al.12Vennligst klikk her for å vise denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Discussion

Vi gir en omfattende, praktisk og enkel trinnvise protokoll for FRAP eksperimenter med levende celler. Her, protokollen ble brukt til å måle mobilitet av YFP-p62 innenfor ALIS i RAW264.7 makrofager, men det kan brukes til mange av laser skanning AC confocal mikroskop systemer og genetisk kodet fluorescerende proteiner som er nå tilgjengelig. For alle mikroskopi system er piloten eksperimenter kritiske for å bestemme optimale FRAP parametere, inkludert kjøp, blekemiddel og kontroll ROI størrelser, laser intensitet for photobleaching, og prebleach og postbleach bilde. Det er rimelig å forvente parameterne for optimal FRAP forskjellig for hver genetisk kodet fluorescerende protein og cellen linje.

Viktigste faktorene når gjennomfører en FRAP eksperiment omfatter (a) oppnå egnet blekemiddel dybde, (b) bruk av et kort bleking skritt (c) tillater nok tid postbleach å observere full gjenoppretting funksjon, (d) photobleaching effektivitet, (e). cytotoksisitet med gjentatte FRAP, og (f) inkludering av en kontroll for fluorescens tap på grunn av gjentatte bildebehandling. Vi anbefaler at blekemiddel dybde, som kan beregnes i henhold til formelen i punkt 3.3.1, ≥9013. Når blekemiddel dybde er < 90, graden av postbleach fluorescens utvinning vil undervurderes, og verdiene av jegf, Mfog t1/2 vil være feil. Selv om varigheten og intensiteten av blekemiddel-inducing laser pulser kan variere mellom FRAP eksperimenter, er det viktig at photobleaching trinnet være kort og betydelig raskere enn funksjonen fluorescens utvinning. Hvis ikke kan en betydelig mengde fluorescens utvinning oppstå under bleking trinnet. Med en lang blekemiddel, fluorescens utvinning under bleking trinnet skulle ikke måles, og det vil føre til feil målinger av jegf, Mf, ogt1/2. I tillegg til få riktige verdier for jegf, Mf, ogt1/2, oppkjøpet ROI observeres postbleach til fluorescens nivået i blekemiddel Avkastningen har nådd et platå. For eksempel i våre FRAP eksperimenter, det var ingen forskjell mellom If, Mfog t1/2 verdier når vi observert YFP-p62 fluorescens i blekemiddel avkastning i 32.2 min postbleach versus når vi observert YFP-p62 i blekemiddel avkastning for 15,1 min postbleach; Derfor vi konkluderte med at utvinning funksjonen nådd et platå på 15,1 min postbleach12. Med hensyn til photobleaching effektivitet øker photobleaching med kvadratet av optisk zoom faktor14. Dermed bruk av høy optisk zoom objektiver er gunstig for rask photobleaching, men kan resultere i uønskede photobleaching under oppkjøpet; sistnevnte kan forklares av imaging en kontroll avkastning. Gjentatte photobleaching er unngås siden det kan føre til generering av cytotoksiske reaktive oksygen arter (ROS). Men graden av ROS generasjon skyldes eksponering for en høy intensitet laser er lavere for genetisk kodet fluorescerende proteiner enn kjemiske fluorophores (f.eks fluorescerende antistoffer)15og ROS generert er mer sannsynlig å reagere innen genetisk kodet fluorescerende protein enn med andre molekyler i cellen4. Økt sannsynlighet for å generere cytotoksiske ROS er gjentatt photobleaching unngås som det er vanskelig å kontrollere. Til slutt, selv om lavt laser overføring brukes til å hente alle ikke-blekemiddel bilder, noen photobleaching alltid skjer, som må kontrolleres. Mulig for dette omfatter overvåking fluorescens i en kontroll avkastning i oppkjøpet avkastning, få kontroll bilder i en nærliggende ubleket celle og utføre kontroll eksperimenter med identiske innstillinger for de som brukes i den photobleaching eksperimenter, men uten hendelsen photobleaching.

Disclosures

Forfatterne har noen interessekonflikt avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Seth Robia ved Loyola University Chicago for hans verdifulle kommentarer på dette manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av NIH grant 1R01NS073967-01A1 til Joanna C. Bakowska.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium Hyclone SH30022.01 High Glucose (4.5 g/L)
Fetal bovine serum Gemini Bio-Products 100-106
Glass bottom dishes MatTek P35G-1.5-14-C 35 mm
ImageJ software National Institutes of Health N.A.
Lipopolysaccharide (LPS) Sigma L4391
Nocodazole Sigma M1404
Penicillin-streptomycin solution Corning 30-002-Cl 100×
Plan-Apochromat 63×/1.40 Oil objective Carl Zeiss MicroImaging, Inc 4407629904000000
Polyethylenimine (PEI) Polysciences 23966-1 linear (MW 25,000)
RAW 264.7 murine macrophages ATCC TIB-71
Zeiss confocal microscope Carl Zeiss MicroImaging, Inc LSM 510

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophysical Journal. 16 (9), 1055-1069 (1976).
  2. Peters, R., Peters, J., Tews, K. H., Bahr, W. A microfluorimetric study of translational diffusion in erythrocyte membranes. Biochimica et Biophysica Acta. 367 (3), 282-294 (1974).
  3. Patterson, G., Day, R. N., Piston, D. Fluorescent protein spectra. Journal of Cell Science. 114, Pt 5 837-838 (2001).
  4. Rabut, G., Ellenberg, J. Photobleaching techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, iFRAP, and FLIP. Live Cell Imaging: A Laboratory Manual (1st ed). , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 101-126 (2004).
  5. Fritzsche, M., Charras, G. Dissecting protein reaction dynamics in living cells by fluorescence recovery after photobleaching. Nature Protocols. 10 (5), 660-680 (2015).
  6. Goodwin, J. S., Kentworthy, A. K. Photobleaching approaches to investigate diffusional mobility and trafficking of Ras in living cells. Methods. 37 (2), 154-164 (2005).
  7. Hildick, K. L., Gonzàlez-Gonzàlez, I. M., Jaskolski, F., Henley, J. M. Lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching. Journal of Visualized Experiments. (60), e3747 (2012).
  8. Nissim-Rafinia, M., Meshorer, E. Photobleaching assays (FRAP & FLIP) to measure chromatin protein dynamics in living embryonic stem cells. Journal of Visualized Experiments. (52), e2696 (2011).
  9. Zheng, C., Petralia, R. S., Wang, Y., Kachar, B. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) of fluorescence tagged proteins in dendritic spines of cultured hippocampal neurons. Journal of Visualized Experiments. (50), e2568 (2011).
  10. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
  11. Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).
  12. Cabe, M., Rademacher, D. J., Karlsson, A. B., Cherukuri, S., Bakowska, J. C. PB1 and UBA domains of p62 are essential for aggresome-like induced structure formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (4), 2306-2311 (2018).
  13. Brown, E. B., Wu, E. S., Zipfel, W., Webb, W. W. Measurement of molecular diffusion in solution by multiphoton fluorescence photobleaching recovery. Biophysical Journal. 77 (5), 2837-2849 (1999).
  14. Centonze, V., Pawley, J. Tutorial on practical confocal microscopy and the use of the confocal test specimen. Handbook of biological confocal microscopy. , Plenum Press. New York. 549-570 (1995).
  15. Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. Physiological Reviews. 90 (3), 1103-1163 (2010).

Tags

Biologi problemet 145 fluorescens utvinning etter photobleaching FRAP gul fluorescerende protein live celle imaging protein mobilitet murine makrofager p62 sequestosome-1 aggresome
Fluorescens utvinning etter Photobleaching av gule fluorescerende Protein merket p62 i Aggresome-lignende indusert strukturer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rademacher, D. J., Cabe, M.,… More

Rademacher, D. J., Cabe, M., Bakowska, J. C. Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures. J. Vis. Exp. (145), e59288, doi:10.3791/59288 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter