Summary
Descreveremos um protocolo abrangente e prático para recuperação de fluorescência após fotobranqueamento experimentos com células vivem. Embora o protocolo foi usado para medir a mobilidade dos p62 com tag proteína fluorescente amarelo em estruturas aggresome induzidas, pode ser aplicado a uma variedade de sistemas de microscopia e proteínas fluorescentes.
Abstract
Recuperação de fluorescência após fotobranqueamento (FRAP) é uma técnica de microscopia que pode ser usada para quantificar a mobilidade de proteínas nas células vivas. Em um típico experimento FRAP, fluorescência de estado estacionário é observada por imagem repetida com luz laser de baixa intensidade. Posteriormente, as moléculas fluorescentes são rapidamente e irreversivelmente prejudicadas através de breve exposição à luz do laser de alta intensidade. Informações sobre mobilidade de proteína são obtidas pelo monitoramento da recuperação de fluorescência. Costumávamos FRAP para determinar a mobilidade de p62 em aggresome induzida por estruturas (ALIS) em macrófagos murino após estimulação com lipopolissacarídeo (LPS). Porque muitos protocolos FRAP existentes são incompletas ou complexo, nosso objetivo era fornecer um protocolo passo a passo abrangente, prático e simples para FRAP experimentos com células vivas. Aqui, descrevemos a transfeccao de macrófagos RAW264.7 com amarelo fluorescente proteína-p62 (YFP-p62), indução de ALIS, expondo as células de LPS e um método passo a passo para a coleta de prebleach e postbleach FRAP imagens e análise de dados. Finalmente, discutimos factores importantes a considerar quando conduzindo um experimento FRAP.
Introduction
Recuperação de fluorescência após fotobranqueamento (FRAP) é uma técnica de microscopia que pode ser usada para quantificar a dinâmica da proteína em vivo células1,2. A popularidade do FRAP aumentou devido a ampla disponibilidade comercial de microscópios confocal com alta resolução, velocidade e sensibilidade de exploração do laser, e um "arco-íris" de geneticamente codificado proteínas fluorescentes, como verde fluorescente proteína (GFP) e proteína fluorescente amarela (YFP)3. Proteínas fluorescentes geneticamente codificadas são fundidas para uma proteína de interesse para permitir a Localização subcellular da proteína de interesse. Em um típico experimento FRAP, a fluorescência de estado estacionário em uma região de aquisição de interesse (ROI) dentro de uma célula é observada através de imagens repetidas de que ROI com luz laser de baixa intensidade. Posteriormente, as moléculas fluorescentes são rapidamente e irreversivelmente prejudicadas em um subconjunto predefinido da aquisição ROI, doravante referida como a lixívia, ROI, pela breve exposição à luz do laser de alta intensidade. Como novas proteínas crus repor proteínas descoradas ao longo do tempo, a velocidade e a intensidade da recuperação de fluorescência em lixívia ROI fornece informações sobre proteínas de mobilidade (Figura 1)4.
Nosso interesse em determinar a mobilidade do ubiquitin ligação proteína p62 (também conhecido como sequestosome-1) na aggresome induzida por estruturas (ALIS) em murino RAW264.7 macrófagos após estimulação com lipopolissacarídeo (LPS) levou-na rever o FRAP literatura. Infelizmente, muitos dos protocolos FRAP existentes são incompletas ou excessivamente complexo5,6,7,8,9. Alguns não fornecem informações detalhadas sobre as configurações do laser, configuração de caminho do feixe e imagem aquisição parâmetros5,6,7,8,9. Outros omitido detalhes importantes sobre a análise de dados, como forma de abordar a questão da lixívia ROI deriva6,9 ou como calcular parâmetros importantes de recuperação, incluindo a fração móvel (Mf), a fração de imóvel (Euf) e metade do tempo de recuperação (t½)5,7. Por outro lado, outros ênfase demais complexas fórmulas matemáticas para calcular Mf, eufe t1/25,6,8,9. Assim, nosso objetivo é fornecer um protocolo passo a passo abrangente, prático e simples para FRAP experimentos com células vivas.
Protocol
1. RAW264.7 macrófago Transfection
- A cultura de 100.000 células RAW264.7 (Tabela de materiais) em meio de cultura completo (de Dulbecco modificado águia médio (DMEM)) glicose de 4,5 g/L (Tabela de materiais) contendo suplementado com 10% de soro fetal bovino (Tabela de materiais ) e penicilina/estreptomicina (Tabela de materiais) para não tratada pratos 35mm vidro-fundo (Tabela de materiais) e coloque os pratos numa incubadora 37 °C/5% CO2 . No dia seguinte, transfect as células usando o 1 mg/mL polyethylenimine Item (PEI) (Tabela de materiais).
- Mistura 1,5 μg de YFP-p62 com 8 μL de PEI em 166 μL de soro livre DMEM (base meio sem soro fetal bovino e penicilina/estreptomicina).
- Deixe a mistura complexa de transfeccao sentar-se à temperatura ambiente por 15 min antes de adicionar a mistura em cada prato.
- Adicione os complexos ao meio existente com células e rock a placa suavemente.
- Lugar a placa em uma 37 ° C 5% CO2 incubadora durante a noite.
- Na manhã seguinte, Aspire o meio do prato e, em seguida, lave uma vez com meio completo. Adicionar 2 mL de meio completo para a placa e permitem que as células se recuperar até o dia seguinte.
2. indução de ALIS com lipopolissacarídeo (LPS)
- No dia seguinte, Aspire o meio das placas e, em seguida, adicione 1 mL de completa médio contendo 10 ng/mL LPS (Tabela de materiais). Permitir que as placas incubar por 5h numa incubadora 37 °C/5% CO2 .
- Após o tratamento de LPS, Aspire o meio e, em seguida, adicione 1 mL de tampão de frio e estéril de Tyrode contendo 145 mM de NaCl, 5 mM KCl, glicose 10 mM, 1.5 mM CaCl2, 1,0 mM MgCl2e 10 mM HEPES (pH 7,4) para enxaguar o prato.
- Aspire o buffer e, em seguida, adicione 1 mL de tampão frio e estéril de Tyrode suplementado com 10 μg/mL nocodazole (Tabela de materiais). Permitir que as placas incubar a 4 ° C por 15-20 min antes da FRAP imaging e análise.
Nota: A utilização de buffer de Tyrode contendo HEPES como buffering composto permite a imagem para ser executada à temperatura ambiente. Nocodazole foi usado para diminuir o movimento ALIS por microtúbulos. Meio de cultura contém bicarbonato como um composto buffer exigindo CO2 para reserva. Caso contrário, o bicarbonato contido no pH médio alterações na ausência de CO2.
3. configuração do microscópio Confocal e selecionando a região de interesse
- Seleção e configuração de caminho do feixe de laser
- Use qualquer microscópio confocal adequado (Tabela de materiais) equipado com software objetivo ou ZEN (Tabela de materiais) ou qualquer software de imagem apropriado.
- Selecione a linha 514 nm do laser do argônio/2, como YFP tem excitação de pico em 512 nm pico de emissão em 527 nm. Clique no botão adquirir e, em seguida, clique no botão do Laser . Na janela de controle do Laser, clique argônio/2 458, 477, 488, 514 nm, , em seguida, clique no botão de Standby . Depois de esperar ~ 3 min para o laser aquecer, clique no botão(Figura 2).
- Defina a potência do laser da linha 514 nm argônio/2 laser a 100% (8.6 A). Clique no botão adquirir e, em seguida, clique no botão do Laser . Na janela de controle do Laser, digite 100 no campo de saída [%] e, em seguida, pressione o botão Enter (Figura 2).
- Conjunto da transmissão o 514 nm argônio/2 da linha de laser para 5%. Clique no botão adquirir , em seguida, o botão de canais . Na janela de Controle de digitalização , clique no botão de canais e, em seguida, clique na caixa quadrada branca à esquerda do texto 514 nm na coluna linha ativa para ativar a linha de laser 514 nm. Insira 5 no campo de transmissão [%] para a linha de laser 514 nm (Figura 2D).
- Defina o divisor de feixe primário de dicroicas (Haupt Farb Teller (HFT)) para a posição de HFT 458/514/561 tal que essas bandas são desviadas para a amostra para a excitação. Clique no botão adquirir , em seguida no botão Config . Na janela de Controle de configuração , clique no botão de Modo de canal , então a Única faixa . Clique no botão HFT e, em seguida, selecione HFT 458/514/561 no menu suspenso (Figura 2B).
- Defina o primeiro divisor de feixe de dicroicas secundário (Neben Farb Teiler 1 (NFT1)) para a posição de espelho , que vai desviar 100% da luz para o segundo divisor de feixe dicroicas secundário (Neben Farb Teiler 2 (NFT2)). Clique no botão adquirir , em seguida no botão Config . Na janela de Controle de configuração , clique no botão de Modo de canal , então a Única faixa . Clique no botão NFT1 , em seguida, selecione o espelho no menu suspenso (Figura 2B).
- Definir o segundo divisor de feixe de dicroicas secundário (NFT2) para a posição de NFT 515 para garantir que comprimentos de onda < 515 nm será refletida e comprimentos de onda > 515 nm será transmitido. Clique no botão adquirir , em seguida no botão Config . Na janela de Controle de configuração , clique no botão de Modo de canal , então a Única faixa . Clique no botão NFT2 , em seguida, selecione NFT 515 no menu suspenso (Figura 2B).
- Definir o filtro de emissão de passe longo (LP) (EF) para 530 LP, para que comprimentos de onda > 530 nm será transmitido ao tubo fotomultiplicador (PMT, detector). Clique no botão adquirir , em seguida no botão Config . Na janela de Controle de configuração , clique no botão de Modo de canal , então a Única faixa . Clique no botão do filtro de emissões e, em seguida, selecione LP 530 no menu suspenso (Figura 2B).
- Selecione o canal 3. Clique no botão adquirir , em seguida no botão Config . Na janela de Controle de configuração , clique no botão de Modo de canal , então a Única faixa . Clique na caixa à esquerda do botão Ch3 quadrada branca.
- Afinação de aquisição de imagem
- Selecione o plano-Apochromat 63 x 1,40 óleo objetivo (Tabela de materiais). Visualizar a amostra através da ocular do microscópio e coloque os ALIS no centro do campo de visão. Clique no botão adquirir , então o botão do Micro . Na janela de Controle do microscópio , clique no objetivoe, em seguida, selecione o plano-Apochromat x 63 / 1.40 óleo objetivo do menu drop-down.
- Defina o tamanho de quadro para 512 x 512 pixels, a velocidade de varredura para 8e a profundidade de dados de 12 bits. Clique no botão adquirir , em seguida, o botão Scan . Na janela de Controle de varredura , clique o botão de modo e o botão do quadro e, em seguida, clique no botão de 512 . N 8 Enter no campo de Velocidade de varredura , pressione Entere, em seguida, clique no botão de 12 bits (Figura 2C).
- Defina a média de varredura para 1 e o zoom óptico de 3. Clique no botão adquirir e, em seguida, clique no botão digitalizar . Na janela de Controle de varredura , clique no botão de seta para baixo do campo número médio de varredura e, em seguida, selecione 1 do menu drop-down. Digite 3 no campo de zoom óptico e, em seguida, pressione Enter (Figura 2C).
- Defina o pinhole para ganho de 1,95 unidades arejadas e detector de 582 (logo abaixo de saturação). Clique no botão adquirir , em seguida, o botão Scan . Na janela de Controle de varredura , clique no botão de canais , digite 196 no campo Pinhole e pressione Enter. Digite 582 no campo Detector ganhar e, em seguida, pressione Enter (Figura 2D).
- Certifique-se de que a linha de laser de argônio/2 nm 514 é definido como 100% de energia (8.6 A). Clique no botão adquirir , então o botão do Laser . No menu de Controle do Laser , o valor no campo de saída [%] deve ser 100 (Figura 2).
- Certifique-se de que a linha de laser de argônio/2 nm 514 é definido como 5% de transmissão. Clique no botão adquirir , em seguida, o botão Scan . Na janela de Controle de varredura , o valor no campo de transmissão [%] para a linha de laser 514 nm deve ser 5 (Figura 2D).
- Crie um ROI quadrada (aquisição ROI) que tem as dimensões de 150 x 150 pixels (194.6 µm.2). Clique no botão adquirir , então o botão Editar ROI . No menu Editar ROI , clique no ícone de retângulo, clique e arraste na janela de imagem para criar um quadrado que tem as dimensões de 150 x 150 pixels (194.6 µm2) (Figura 1A).
Nota: A aquisição de ROI inclui um ALIS de interesse, (b) uma área de fluorescência que não é um ALIS (controle ROI) e é pelo menos 20 x 20 pixels (3,3 µm2) e (c) uma área de pouca ou nenhuma fluorescência (fundo ROI) é pelo menos 20 x 20 pixels (µm 3,3 2) (Figura 1A). É importante incluir um controle ROI na aquisição ROI para que o fotobranqueamento que pode ocorrer com imagem repetida pode ser controlado. A aquisição de ROI é definido aqui será a única área que será digitalizada. Laser repetida digitalização dentro uma aquisição ROI só irá restringir fotobranqueamento o ROI em vez de, por exemplo, fotobranqueamento a célula inteira ou várias células, e o número de pixels coletadas no PGTO (detector) será maior que o número de pixéis coletadas no PGTO (detector) após a digitalização de uma célula inteira ou várias células. - Set-up da série de tempo tal que a aquisição de ROI é digitalizada 35 vezes, uma vez a cada 30 s. Clique no botão adquirir e, em seguida, o botão de Séries temporais . Na janela de Controle de série de tempo , clique na tecla Manual início de série e o botão Manual parar a série . Digite 35 no campo de série de paragem manual, pressione a tecla Enter e, em seguida, clique no botão de atraso do ciclo de 30,0 seg (Figura 2).
- Defina o controle de lixívia, tal que o fotobranqueamento ocorrerá após verificação número 5, coletar 5 imagens prebleach da aquisição ROI. Clique no botão adquirir , em seguida, o botão Editar Bleach . Na janela de Controle de Bleach , clique no quadrado branco ao lado do Bleach após números exames. Insira 5 no campo número de verificação e, em seguida, pressione a tecla Enter (Figura 2-F).
Nota: Imagens de prebleach e postbleach devem ser adquiridas na mesma profundidade óptica. - Criar uma ROI dentro os ALIS que tem um diâmetro de 10 pixels de forma circular água sanitária (área = 0,8 µm2). Clique adquirir | Editar Bleach | Definir as regiões. Na janela de Regiões de Bleach , clique no ícone de círculo . Clique e arraste na janela de imagem para criar um círculo que tem um diâmetro de 10 pixels (área = 0,8 µm2) (Figura 2-F).
- Definir iterações para 300. Clique no botão adquirir , em seguida, o botão Editar Bleach . Na janela de Controle de Bleach , digite 300 no campo de iterações e, em seguida, pressione a tecla Enter (Figura 2-F).
- Defina a linha de 514 nm laser de argônio/2 a 100% da potência (8.6 A) e 100% de transmissão durante a lixívia. Clique no botão adquirir , em seguida, o botão Editar Bleach . Na janela de Controle de Bleach , clique na caixa branca quadrada à esquerda do 514 nm. Digite 100 no campo de transmissão [%] para a linha de laser 514 nm e, em seguida, pressione o botão Enter (Figura 2-F).
Nota: O número de iterações precisa ser determinado empiricamente. Isso irá variar dependendo o fluoróforo, o tamanho da estrutura que irá ser branqueada e o laser.
- Coleta de dados
- Inicie o experimento FRAP. Recolher as 5 primeiras imagens prebleach e a primeira imagem de postbleach e, em seguida, calcular a profundidade de água sanitária, de acordo com a seguinte equação.
Se a profundidade da água sanitária é < 90, parar o experimento e descartar os dados, como a profundidade da água sanitária não era suficiente. Quando a profundidade da água sanitária é ≥ 90, colete dados para análise com uma programa e um programa de planilha (Tabela de materiais) de processamento de imagem.
Nota: Quando deriva dos ALIS é ≥3 µm, parar o experimento e descartar os dados, como essa quantidade de deriva de imagem não pode ser corrigida para análise com software de processamento de imagem (Tabela de materiais). Quando deriva dos ALIS é < 3 µm, coletar os dados para análise de dados com uma programa e um programa de planilha (Tabela de materiais) de processamento de imagem. - Colete dados FRAP de 10 ALIS de 10 células com menos de 3 µm de deriva das ALIS. Em seguida, transferi os arquivos de .lsm de objectivo para um computador pessoal para análise de dados.
- Inicie o experimento FRAP. Recolher as 5 primeiras imagens prebleach e a primeira imagem de postbleach e, em seguida, calcular a profundidade de água sanitária, de acordo com a seguinte equação.
- Análise de dados em um programa de processamento de imagem
- Correta para drift de imagem por alinhar ou correspondência (i.e., registrando) a pilha de séries temporais de imagens da aquisição ROI. Para fazer isso, abra cada arquivo de .lsm objetivo com um programa de processamento de imagem (Tabela de materiais) e, em seguida, selecione Plugins | Registo | StackReg | Tradução. Em seguida, selecione Plugins | Registo | StackReg | Corpo rígido10.
- Gerente de ROI de set-up para medir a intensidade de sinal em lixívia ROI. Selecione analisar | Ferramentas | ROI Manager. Selecione a ferramenta Oval , em seguida, desenhar um círculo em lixívia ROI com um diâmetro de 10 pixels, em seguida, clique no botão Adicionar .
- Gerente de ROI de set-up para medir a intensidade de sinal no controle de ROI. No Gerenciador de ROI, selecione a ferramenta retângulo , em seguida, desenhar um quadrado de 20 x 20 pixels na região ROI de controle, então clique no botão Adicionar .
- Set-up ROI Manager para medir a intensidade de sinal no fundo ROI. No Gerenciador de ROI, selecione a ferramenta retângulo , desenhar um quadrado de 20 x 20 pixels na região ROI de fundo, em seguida, clique no botão Adicionar .
- Renomear o ROIs. Depois de adicionar o ROIs para ser analisado em ROI Manager, renomeá-los Bleach ROI ROI de controlee Fundo ROI em conformidade.
- Intensidade do sinal de medida na ROIs. Selecione Bleach ROI ROI de controlee ROI de fundoe, em seguida, selecione mais | Medida de multi. Certifique-se que medir todas as 35 fatias e uma linha para cada fatia são selecionados. Na janela Definir medições , certifique-se de que só quer dizer cinza valor é selecionado.
Nota: Estes são os dados brutos da FRAP (Figura 1B). - Cole os resultados em um programa de planilha (Tabela de materiais). Cópia do alvejante ROI, controlar o ROI, e intensidade do sinal de fundo ROI resulta, em seguida, colá-los para colunas rotuladas e Bleach ROI, controle ROI ROI de fundo, respectivamente, em um programa de planilha (Tabela de materiais).
- Análise de dados em um programa de planilha
- Fundo-corrigir a intensidade do sinal em lixívia ROI e controle ROI (Figura 1A, C). Use a ferramenta de Inserir função em um programa de planilha (Tabela de materiais) para subtrair os valores na coluna rotulada ROI de fundo dos valores na coluna rotulada ROI de Bleach. Subtrai os valores na coluna rotulada ROI de fundo dos valores na coluna rotulada Controle ROI. Rotule essas novas colunas Corrigido Bleach ROI e Corrigida ROI de controle.
- Normalize o sinal na lixívia ROI para o sinal de correção de fundo no controle ROI (Figura 1A, D). Use a função Inserir em um programa de planilha (Tabela de materiais) para dividir os valores na coluna rotulada Corrigido ROI Bleach pelos valores na coluna rotulada Corrigido ROI de controle. Rotule essa nova coluna Normalizados ROI corrigida de Bleach.
- Normalize o sinal na coluna Normalizados corrigido Bleach ROI para a média dos 5 valores prebleach em lixívia ROI (Figura 1A, E). Calcule a média dos 5 valores prebleach em lixívia ROI. Em seguida, divida os valores na coluna rotulada Normalizado ROI Bleach corrigido pela média dos 5 valores prebleach em lixívia ROI. Rotule essa nova coluna Normalizados corrigido Prebleach média Bleach ROI.
- Fração móvel e metade do tempo de recuperação de dados de curva-cabido
- Ajuste de curva os dados ROI de lixívia normalizado e corrigidos usando um programa de processamento de imagem (Tabela de materiais). No programa de processamento de imagem (Tabela de materiais), selecione Analyze | Ferramentas | Encaixe de curva. Cópia do postbleach normalizado e corrigido valores ROI de lixívia e os correspondentes valores de tempo, colá-los para a janela Curva colocador . Selecione Recuperação exponencial o Curva Fitter menu drop-down e, em seguida, selecione ajustar.
- Calcular o Mf dos parâmetros da função de recuperação, que fornece valores para: 'a,' uma fração lentamente recuperando; 'b', a taxa de recuperação; e 'C', uma fração rápida difusão. Calcular Mf conectando os valores para 'a' e 'C' para a equação Mf = a + c. o eu calcularf usando a equaçãof = 1 - Mf. Calcular t½ , substituindo o valor de 'b' na equação
então resolvendo para t1/2. 11
então resolvendo para t1/2. 11
Representative Results
Aqui são mostrados os resultados de um experimento típico em que costumávamos FRAP para examinar o grau de mobilidade dos p62 no ALIS em células RAW264.7 tratados com LPS para 3-5 h12. Figura 3 A mostra os dados brutos obtidos de um alvejante, controlar e depois que a pilha de imagens tinha sido alinhada para corrigir para pequenas quantidades de fundo ROI (< ~ 3 µm) de deriva de imagem das ALIS. YFP-p62 fluorescência nesta ALIS em prebleach e postbleach é mostrada na Figura 3E e complementar Video 1. Figura 3 B mostra estes dados após a correção de fundo. Figura 3 C mostra estes dados após a correção para fluorescência no controle de ROI. Figura 3 D mostra esses dados normalizados para a fluorescência média dos 5 valores prebleach em lixívia ROI. O grau de branqueamento era suficiente neste experimento (lixívia profundidade = 91.94). Fluorescência YFP-p62 dentro desta ALIS recuperou-se lentamente, como t1/2 = 128.27 s (2,14 min). YFP-p62 não era uma proteína muito móvel neste experimento, como Mf = 21.97 e euf = 78.03.
Figura 1 : Um diagrama de uma célula RAW264.7 e as etapas para análise de imagem depois que as imagens da FRAP foram alinhadas para corrigir desvio de imagem dos ALIS. (A) diagrama de uma célula RAW264.7 retratando vários ALIS e a água sanitária, controle e ROIs de fundo dentro da aquisição ROI. (B) uma representação idealizada da FRAP cru dados obtidos na lixívia, controle e fundo ROIs em painel r. (C) um gráfico idealizado dos dados brutos do FRAP que foram fundo-corrigido. (D) um gráfico idealizado de fundo-corrigido FRAP dados que têm sido normalizados para fluorescência no controle de ROI. (E) uma idealizada gráfico de dados FRAP normalizados e correção de fundo que têm sido normalizados para a fluorescência prebleach em lixívia ROI. Abreviaturas: Con = controle; BG = plano de fundo. Esta figura foi modificada de Rabut e Ellenberg4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagens da interface do usuário do software AIM (tabela de materiais) para a seleção do laser, feixe caminho configuração e parâmetros de aquisição de imagem para os experimentos FRAP. (A) Laser controle tela mostrando as linhas de laser argônio/2, saída e corrente do tubo utilizado. (B) configuração controle de tela que mostra o feixe divisor e emissão de filtram as configurações usadas. (C) Scan controle de tela que mostra a configuração usada para aquisição de imagens. Scan (D) controlar a tela mostrando o pinhole, detector ganho, deslocamento de amplificador, amplificador e configurações de transmissão para a linha de laser argônio/2 514 nm. (E) séries temporais controlam de tela que mostra as configurações de série de tempo usadas. Bleach (F) controle de tela que mostra a prebleach e postbleach parâmetros usados. Abreviaturas: HFT = Haupt Farb Teiler (divisor de feixe primário de dicroicas); NT1 = Neben Farb Teiler 1 (divisor de feixe dicroicas primeira secundária); NT2 = Neben Farb Teiler 2 (divisor de feixe dicroicas segundo secundário); EF = filtro de emissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Um experimento FRAP representativo para estudar a dinâmica YFP-p62 no ALIS em células RAW264.7. (A) dados de intensidade de fluorescência Raw para um alvejante, controle e fundo ROI. (B) os dados apresentados no painel A após a lixívia e controle ROI tinham sido corrigidos para fluorescência no fundo ROI. (C) os dados fornecidos em painéis A e B após normalizar a intensidade de fluorescência em lixívia ROI para dar conta da fluorescência no controle de correção de fundo ROI. (D) os dados fornecidos em painéis A C após normalizar a intensidade de fluorescência na lixívia normalizada e correção de fundo ROI para a média dos 5 primeiros valores prebleach em lixívia ROI. Mf = 21.97, euf = 78.03, t1/2 = 128.27 s (2,14 min) e profundidade de lixívia = 91.94. (E), uma imagem de um ALIS em prebleach (1,5 min) e postbleach (0, 6 e 16 min). Barra de escala = 5 µm e é válido para todos os painéis. Abreviaturas: Con = controle; BG = plano de fundo; Corr. = corrigida; Norm. = normalizados; Média = média. Esta figura foi modificada de Cabe et al12clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Complementar Video 1: um típico ALIS em um macrófago RAW264.7 antes e depois de fotobranqueamento. P62-YFP fluorescência é lenta para se recuperar após a photobleach; Portanto, p62 não é uma proteína muito móvel. Para este experimento, Mf = 25.62, euf = 74.38, t1/2 = 442.79 s (7,38 min) e profundidade de lixívia = 90.19. Barra de escala = 5 µm. Este vídeo foi modificado da Cabe et al12por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
Discussion
Nós fornecemos um protocolo passo a passo abrangente, prático e simples para FRAP experimentos com células vivas. Neste documento, o protocolo foi utilizado para medir a mobilidade dos YFP-p62 no ALIS em macrófagos RAW264.7, mas pode ser aplicado a muitos dos sistemas do microscópio confocal de varredura a laser e geneticamente codificado proteínas fluorescentes que agora estão disponíveis. Para qualquer sistema de microscopia, experimentos piloto são críticos para a determinação de parâmetros ideais FRAP, incluindo aquisição, lixívia e tamanhos ROI de controle, intensidade do laser para fotobranqueamento e aquisição de imagem prebleach e postbleach. É razoável esperar que os parâmetros FRAP ideais para diferentes para cada linha fluorescente geneticamente codificada de proteína e células.
Factores importantes a considerar quando conduzindo um experimento FRAP incluem (a) realização adequada do descorante profundidade, (b) o uso de uma breve etapa de branqueamento, (c) que permite postbleach de tempo suficiente para observar a função de recuperação completa, (d) fotobranqueamento eficiência, (e). citotoxicidade com repetidas FRAP e (f) a inclusão de um controle para perda de fluorescência devido a imagem repetida. É recomendável que a profundidade de água sanitária, que pode ser calculada de acordo com a equação fornecida na seção 3.3.1, ser ≥ 9013. Quando a profundidade da água sanitária é < 90, o grau de recuperação de fluorescência postbleach ser subestimado e os valores de If, M,fe t1/2 será incorretas. Embora a duração e a intensidade dos pulsos de laser de lixívia de indução podem variar entre FRAP experimentos, é importante que a etapa de fotobranqueamento ser breve e substancialmente mais rápido do que a função de recuperação de fluorescência. Se não é, então, uma quantidade significativa de recuperação de fluorescência pode ocorrer durante a etapa de branqueamento. Com um tempo longo de lixívia, recuperação de fluorescência durante a etapa de branqueamento não seria medida, e levaria a medições incorretas de If, M,f, et1/2. Além disso, para obter os valores corretos paraf, M,f, et1/2, a aquisição de ROI deve ser observada postbleach até o nível de fluorescência em lixívia ROI atingiu um platô. Por exemplo, em nossos experimentos FRAP, não houve diferença entre o quef, M,fe t1/2 valores quando observamos YFP-p62 fluorescência em lixívia ROI para 32,2 min postbleach versus quando observamos YFP-p62 em lixívia ROI para postbleach de 15,1 min; assim, concluímos que a função de recuperação alcançado um platô em 15,1 min postbleach12. No que respeita à eficiência de fotobranqueamento, fotobranqueamento aumenta com o quadrado do fator zoom óptico14. Assim, o uso de lentes de zoom ópticos altos é favorável para fotobranqueamento rápido mas pode resultar em indesejável fotobranqueamento durante a aquisição; Este último pode ser contabilizado por um ROI de controle de imagem. Fotobranqueamento repetido é deve ser evitada pois pode levar à geração de espécies citotóxicas reativas de oxigênio (ROS). No entanto, o grau de geração de ROS devido à exposição a um laser de alta intensidade é mais baixo para proteínas fluorescentes geneticamente codificadas, do que para fluorophores química (por exemplo, anticorpos fluorescentes)15, e o ROS gerado são mais propensos a reagir dentro a proteína fluorescente geneticamente codificada do que com outras moléculas na célula4. Além da probabilidade aumentada de gerar ROS citotóxicos, repetido fotobranqueamento é deve ser evitada pois é difícil de controlar. Finalmente, embora a transmissão do laser de baixa é usado para adquirir todas as imagens não-alvejante, alguns fotobranqueamento invariavelmente ocorrerá, que deve ser controlado. Controles possíveis para isto incluem monitoramento fluorescência em um ROI de controle dentro da aquisição ROI, obtenção de imagens de controle em uma célula não-branqueada vizinha e realizando experiências de controle com as configurações idênticas para aqueles usados na experimentos de fotobranqueamento mas sem o fotobranqueamento evento.
Disclosures
Os autores não têm nenhum conflito de interesses para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos o Dr. Seth Robia na Loyola University Chicago por seus valiosos comentários sobre este manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo NIH grant 1R01NS073967-01A1 para Joanna C. Bakowska.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Hyclone | SH30022.01 | High Glucose (4.5 g/L) |
| Fetal bovine serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | 35 mm |
| ImageJ software | National Institutes of Health | N.A. | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L4391 | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| Penicillin-streptomycin solution | Corning | 30-002-Cl | 100× |
| Plan-Apochromat 63×/1.40 Oil objective | Carl Zeiss MicroImaging, Inc | 4407629904000000 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Polysciences | 23966-1 | linear (MW 25,000) |
| RAW 264.7 murine macrophages | ATCC | TIB-71 | |
| Zeiss confocal microscope | Carl Zeiss MicroImaging, Inc | LSM 510 |
References
- Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophysical Journal. 16 (9), 1055-1069 (1976).
- Peters, R., Peters, J., Tews, K. H., Bahr, W. A microfluorimetric study of translational diffusion in erythrocyte membranes. Biochimica et Biophysica Acta. 367 (3), 282-294 (1974).
- Patterson, G., Day, R. N., Piston, D. Fluorescent protein spectra. Journal of Cell Science. 114, Pt 5 837-838 (2001).
- Rabut, G., Ellenberg, J. Photobleaching techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, iFRAP, and FLIP. Live Cell Imaging: A Laboratory Manual (1st ed). , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 101-126 (2004).
- Fritzsche, M., Charras, G. Dissecting protein reaction dynamics in living cells by fluorescence recovery after photobleaching. Nature Protocols. 10 (5), 660-680 (2015).
- Goodwin, J. S., Kentworthy, A. K. Photobleaching approaches to investigate diffusional mobility and trafficking of Ras in living cells. Methods. 37 (2), 154-164 (2005).
- Hildick, K. L., Gonzàlez-Gonzàlez, I. M., Jaskolski, F., Henley, J. M. Lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching. Journal of Visualized Experiments. (60), e3747 (2012).
- Nissim-Rafinia, M., Meshorer, E. Photobleaching assays (FRAP & FLIP) to measure chromatin protein dynamics in living embryonic stem cells. Journal of Visualized Experiments. (52), e2696 (2011).
- Zheng, C., Petralia, R. S., Wang, Y., Kachar, B. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) of fluorescence tagged proteins in dendritic spines of cultured hippocampal neurons. Journal of Visualized Experiments. (50), e2568 (2011).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
- Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).
- Cabe, M., Rademacher, D. J., Karlsson, A. B., Cherukuri, S., Bakowska, J. C. PB1 and UBA domains of p62 are essential for aggresome-like induced structure formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (4), 2306-2311 (2018).
- Brown, E. B., Wu, E. S., Zipfel, W., Webb, W. W. Measurement of molecular diffusion in solution by multiphoton fluorescence photobleaching recovery. Biophysical Journal. 77 (5), 2837-2849 (1999).
- Centonze, V., Pawley, J. Tutorial on practical confocal microscopy and the use of the confocal test specimen. Handbook of biological confocal microscopy. , Plenum Press. New York. 549-570 (1995).
- Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. Physiological Reviews. 90 (3), 1103-1163 (2010).
