Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Fluorescens återhämtning efter Fotoblekning av gula fluorescerande Protein taggade p62 i Aggresome-liknande inducerad strukturer

Published: March 26, 2019 doi: 10.3791/59288
Automatic Translation
1, 2, 2
1Core Imaging Facility and Department of Microbiology and Immunology, Loyola University Chicago, 2Department of Molecular Pharmacology and Therapeutics, Loyola University Chicago

Summary

Vi beskriver ett omfattande och praktiska protokoll för fluorescens återhämtning efter fotoblekning experiment med levande celler. Även om protokollet användes för att mäta rörligheten för gula fluorescerande protein-taggade p62 i aggresome-inducerad strukturer, kan det tillämpas på en mängd mikroskopi system och fluorescerande proteiner.

Abstract

Fluorescens återhämtning efter fotoblekning (FRAP) är en mikroskopi teknik som kan användas för att kvantifiera protein rörlighet i levande celler. I en typisk FRAP experiment observeras steady state fluorescens av upprepade imaging med låg intensitet laserljus. Därefter är de fluorescerande molekylerna snabbt och oåterkalleligt nedsatt via kort exponering för högintensiva laserljuset. Information om protein rörlighet erhålls genom övervakning återvinning av fluorescens. Vi använde FRAP för att bestämma rörligheten för p62 i aggresome-liknande inducerad strukturer (ALIS) i murina makrofager efter stimulering med lipopolysackarid (LPS). Eftersom många befintliga FRAP protokoll är antingen ofullständiga eller komplexa, var vårt mål att tillhandahålla ett omfattande, praktisk och enkel steg för steg protokoll för FRAP experiment med levande celler. Här beskriver vi RAW264.7 makrofag transfection med gula fluorescerande protein-p62 (YFP-p62), induktion av ALIS genom att utsätta celler till LP-skivor, och en stegvis metod för att samla in prebleach och postbleach FRAP bilder och dataanalys. Slutligen diskuterar vi viktiga faktorer att beakta när man genomför en FRAP experiment.

Introduction

Fluorescens återhämtning efter fotoblekning (FRAP) är en mikroskopi teknik som kan användas för att kvantifiera protein dynamik i levande celler1,2. FRAP popularitet har ökat på grund av den utbredda kommersiella tillgången till laserscanning confocal Mikroskop med hög upplösning, hastighet och känslighet, och en ”rainbow” av genetiskt kodade fluorescerande proteiner, såsom grön fluorescerande protein (GFP) och gula fluorescerande protein (YFP)3. Genetiskt kodade fluorescerande proteiner är smält till ett protein av intresse att möjliggöra subcellulär lokalisering av proteinet av intresse. I en typisk FRAP experiment observeras steady state fluorescensen i ett förvärv region av intresse (ROI) i en cell via upprepade avbildning av att ROI med låg intensitet laserljus. Därefter är fluorescerande molekylerna snabbt och oåterkalleligt försämras i en fördefinierad undergrupp av förvärvet ROI, hädanefter blekmedel ROI, av kort exponering för hög intensitet laserljus. Som nya oblekt proteiner fylla på blekt proteiner över tid, ger hastighet och intensitet av fluorescens återhämtning i blekmedel ROI information om protein rörlighet (figur 1)4.

Vårt intresse för bestämning av ubiquitin bindande protein p62 (även känd som sequestosome-1) i aggresome-liknande inducerad strukturer (ALIS) i murina RAW264.7 makrofager rörlighet efter stimulering med lipopolysackarid (LPS) ledde oss att granska FRAP litteratur. Tyvärr, många av de befintliga FRAP-protokoll är ofullständiga eller orimligt komplexa5,6,7,8,9. Några ger inte detaljerad information om laser inställningar, beam sökvägen konfiguration och bild förvärv parametrar5,6,7,8,9. Andra utelämnas viktiga detaljer rörande analys av data, till exempel hur frågan om blekmedel ROI drift6,9 eller att beräkna viktiga återhämtning parametrar, inklusive mobila bråkdel (Mf), orörliga bråkdel (Jagf), och halvtid återhämtning (t½)5,7. Däremot andra placeras alltför stor vikt vid komplexa matematiska formler för att beräkna Mf, jagfoch t1/25,6,8,9. Vårt syfte är således att ge en omfattande, praktisk och enkel steg för steg-protokollet för FRAP experiment med levande celler.

Protocol

1. RAW264.7 makrofag Transfection

  1. Kultur 100.000 RAW264.7 celler (Tabell för material) i komplett odlingsmedium (Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM)) (Tabell för material) som innehåller 4,5 g/L glukos kompletteras med 10% fetalt bovint serum (Tabell för material ) och penicillin/streptomycin (Tabell för material) på obehandlad 35 mm glasbotten rätter (Tabell av material) och placera rätterna i en 37 °C/5% CO2 inkubator. Följande dag, transfect cellerna med 1 mg/mL polyethylenimine (PEI) (Tabell för material).
  2. Blanda 1,5 μg av YFP-p62 med 8 μl av PEI i 166 μL av serumfritt DMEM (bas medium utan fetalt bovint serum och penicillin/streptomycin).
  3. Låt transfection komplexa blandningen stå i rumstemperatur i 15 min innan du lägger till blandningen in i varje platta.
  4. Tillsätt komplexen till befintliga medium med celler och rock plattan försiktigt.
  5. Placera plattan i en 37 ° C /5% CO2 inkubator över natten.
  6. Följande morgon, aspirera på medellång off plattan, skölj en gång med komplett medium. Tillsätt 2 mL av komplett medium till plattan och cellerna att återhämta sig till nästa dag.

2. induktion av ALIS med lipopolysackarid (LPS)

  1. Nästa dag, aspirera på medellång från plattorna och tillsätt 1 mL komplett medium innehållande 10 ng/mL LPS (Tabell för material). Låt plattorna att Inkubera i 5 h i en 37 °C/5% CO2 inkubator.
  2. Efter behandlingen LPS aspirera på medellång och tillsätt 1 mL kall, steril Tyrodes buffert innehållande 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM glukos, 1,5 mM CaCl2, 1,0 mM MgCl2och 10 mM HEPES (pH 7,4) att skölja plattan.
  3. Aspirera bufferten och tillsätt 1 mL kall, steril Tyrodes buffert kompletteras med 10 μg/mL nocodazole (Tabell för material). Låt plattorna att Inkubera vid 4 ° C i 15-20 min före FRAP bildhantering och analys.
    Obs: Användning av Tyrodes buffert innehållande HEPES som den buffrande förening tillåter imaging att utföras vid rumstemperatur. Nocodazole användes för att minska ALIS rörelse av Mikrotubuli. Odlingsmedium innehåller bikarbonat som en buffert förening som kräver CO2 till buffert. Annars bikarbonat som ingår i medelstora förändringar pH i avsaknad av CO2.

3. inställning av mikroskopet Confocal och välja regionen av intresse

  1. Laser urval och Beam sökvägen konfiguration
    1. Använda någon lämplig confocal Mikroskop (Tabell för material) utrustade med målet eller ZEN programvara (Tabell för material) eller någon lämplig avbildningsprogrammet.
    2. Välj raden 514 nm av Argon/2 laser, YFP har peak magnetiseringen på 512 nm och peak utsläpp på 527 nm. Klicka på knappen Hämta , klicka på knappen Laser . Klicka på i fönstret Laser kontroll av Argon/2 458, 477, 488, 514 nm, klicka sedan på knappen Standby . Efter att ha väntat ~ 3 min för laser för att värma upp, klickar du på knappen (figur 2A).
    3. Ange laser makt 514 nm Argon/2 laserlinjen till 100% (8,6 A). Klicka på knappen Hämta , klicka på knappen Laser . I fönstret Laser kontroll ange 100 i fältet utgång [%] och tryck sedan på Enter -knappen (figur 2A).
    4. Ställa in överföring av 514 nm Argon/2 laserlinjen till 5%. Klicka på knappen förvärva , sedan knappen kanaler . I fönstret Skanna Control knappen kanaler , klicka på den fyrkantiga vita rutan till vänster om texten 514 nm i kolumnen rad aktiva att aktivera 514 nm laserlinjen. Ange 5 i fältet överföring [%] för 514 nm laserlinjen (figur 2D).
    5. Ange primära dikroisk stråldelare (Haupt Farb Teiler (HFT)) till HFT 458/514/561 position så att dessa band är avlänkas med förlagan för magnetisering. Klicka på knappen förvärva , sedan på Config -knappen. Klicka på knappen Channel Mode , sedan knappen Enkelspår i fönstret Konfigurationskontroll . Klicka på knappen HFT , och välj sedan HFT 458/514/561 från droppa-ned menyn (bild 2B).
    6. Placera första sekundära dikroisk stråldelare (Anslutninglinuxneben Farb Teiler 1 (NFT1)) på positionen spegel , som kommer att avleda 100% av ljuset till andra sekundära dikroisk stråldelare (Anslutninglinuxneben Farb Teiler 2 (NFT2)). Klicka på knappen förvärva , sedan på Config -knappen. Klicka på knappen Channel Mode , sedan knappen Enkelspår i fönstret Konfigurationskontroll . Klicka på knappen NFT1 , sedan välja spegel från droppa-ned menyn (bild 2B).
    7. Ange andra sekundära dikroisk stråldelare (NFT2) till NFT 515 positionen för att säkerställa att våglängder < 515 nm kommer att återspeglas och våglängder > 515 nm skall vidarebefordras. Klicka på knappen förvärva , sedan på Config -knappen. Klicka på knappen Channel Mode , sedan knappen Enkelspår i fönstret Konfigurationskontroll . Klicka på NFT2 -knappen, och välj sedan NFT 515 från droppa-ned menyn (bild 2B).
    8. Anger långa pass (LP) utsläpp filter (EF) LP 530, så att våglängder > 530 nm kommer att översändas till fotomultiplikatorn röret (PMT, detektor). Klicka på knappen förvärva , sedan på Config -knappen. Klicka på knappen Channel Mode , sedan knappen Enkelspår i fönstret Konfigurationskontroll . Klicka på knappen utsläpp filter , och välj sedan LP 530 från droppa-ned menyn (bild 2B).
    9. Välj kanal 3. Klicka på knappen förvärva , sedan på Config -knappen. Klicka på knappen Channel Mode , sedan knappen Enkelspår i fönstret Konfigurationskontroll . Klicka på den fyrkantiga vita rutan till vänster om knappen Ch3 .
  2. Bild förvärv Set-Up
    1. Välj den Plan-Apochromat 63 x / 1,40 olja mål (Tabell för material). Visa preparatet genom mikroskopet okularet och placera ALIS i mitten av synfältet. Klicka på knappen förvärva , sedan knappen Micro . I fönstret Mikroskop kontroll Klicka på måloch sedan Välj de Plan-Apochromat 63 x / 1,40 olja mål från droppa-ned menyn.
    2. Ange ramens storlek till 512 x 512 pixlar, spolningshastighet till 8och data djupet till 12 bitar. Klicka på knappen förvärva , sedan knappen Skanna . I fönstret Skanna Control Mode -knappen och knappen ram , klicka på knappen 512 . Retur 8 i fältet Skanna hastighet , Tryck Enter, klicka på knappen 12 bitar (figur 2C).
    3. Ställa in Skanna genomsnittet 1 och den optiska zoomen till 3. Klicka på knappen Hämta , klicka på knappen Skanna . I fönstret Skanna kontroll , klicka på nedåtpilen i fältet genomsnittliga scan, och välj sedan 1 från droppa-ned menyn. Ange 3 i fältet optisk zoom och tryck på RETUR (figur 2C).
    4. Ange pinhole till 1,95 luftiga rummen och detektor vinst till 582 (strax under mättnad). Klicka på knappen förvärva , sedan knappen Skanna . I fönstret Skanna kontroll , klicka på knappen kanaler , ange 196 i fältet Pinhole och tryck på RETUR. Ange 582 i fältet detektor vinna, tryck på Enter (figur 2D).
    5. Se till att raden 514 nm för Argon/2 laser är inställd på 100% effekt (8,6 A). Klicka på knappen förvärva , sedan knappen Laser . I menyn Laser kontroll bör värdet i fältet utgång [%] 100 (figur 2A).
    6. Se till att raden 514 nm för Argon/2 laser är inställd på 5% transmission. Klicka på knappen förvärva , sedan knappen Skanna . I fönstret Skanna kontroll av bör värdet i fältet överföring [%] för 514 nm laserlinje 5 (figur 2D).
    7. Skapa en fyrkantig ROI (förvärv ROI) som har måtten 150 x 150 pixlar (194,6 µm2). Klicka på knappen förvärva , sedan knappen Redigera ROI . I menyn Redigera ROI , klicka på ikonen rektangel, klicka och dra i bildfönstret för att skapa en kvadrat som har måtten 150 x 150 pixlar (194,6 µm2) (figur 1A).
      Obs: Förvärvet ROI omfattar a en ALIS intresse, (b) ett område av fluorescens som inte är en ALIS (kontroll ROI) och är minst 20 x 20 pixlar (3.3 µm2) och (c) ett område med liten eller ingen fluorescens (bakgrund ROI) som är minst 20 x 20 pixlar (3.3 µm 2) (figur 1A). Det är viktigt att inkludera en kontroll ROI i förvärvet ROI så att den fotoblekning som kan uppstå med upprepade imaging kan kontrolleras. Förvärv ROI som har definierats här kommer vara det enda område som kommer att skannas. Upprepade laser scanning inom ett förvärv ROI endast kommer att begränsa fotoblekning till ROI snarare än, exempelvis fotoblekning hela cellen eller flera celler, och antalet pixlar som samlats vid PMT (detektor) blir större än antalet pixlar som samlas in på PMT (detektor) efter skanning en hela cellen eller flera celler.
    8. Set-up tidsserierna sådan att förvärvet ROI genomsöks 35 gånger en gång varje 30 s. Klicka på knappen Hämta och sedan knappen Tidsserier . Klicka på knappen Manual start serien och knappen Manual stoppa serien i fönstret Time Series Control . Ange 35 i fältet manuell stop serien, Tryck Enter , klicka på knappen 30,0 sec cykel fördröjning (figur 2E).
    9. Ange blekmedel kontrollen så att fotoblekning sker efter genomsökning nummer 5, samla 5 prebleach bilder av förvärvet ROI. Klicka på knappen förvärva , sedan knappen Redigera blekmedel . Klicka på den vita fyrkanten bredvid den bleka efter antal skanningari fönstret Bleach kontroll . Ange 5 i fältet scan, och tryck sedan på Enter (figur 2F) .
      Obs: Prebleach och postbleach bilder bör förvärvas i samma optiska djup.
    10. Skapa en runda blekmedel ROI inom ALIS som har en 10-pixel diameter (område = 0,8 µm2). Klicka förvärva | Redigera blekmedel | Definiera områden. Klicka på cirkel i fönstret Bleach regioner . Klicka och dra i bildfönstret för att skapa en cirkel som har en 10-pixel diameter (område = 0,8 µm2) (figur 2F).
    11. Ange iterationer till 300. Klicka på knappen förvärva , sedan knappen Redigera blekmedel . Bleach kontrollfönstret, ange 300 i fältet iterationer, och tryck sedan på Enter (figur 2F) .
    12. Ställ in Argon/2 514-nm laserlinje till 100% effekt (8,6 A) och 100% transmission under blekmedel. Klicka på knappen förvärva , sedan knappen Redigera blekmedel . I fönstret Bleach kontroll , klicka på den vita fyrkantiga rutan till vänster om 514 nm. Ange 100 i fältet överföring [%] för 514 nm laser raden och tryck på knappen Enter (figur 2F).
      Obs: Antalet iterationer måste fastställas empiriskt. Det kommer att variera beroende på fluorophore, storleken på den struktur som kommer att vara blekt och laser.
  3. Insamling av data
    1. Starta FRAP experimentet. Samla de första 5 prebleach bilderna och första postbleach bilden och sedan beräkna blekmedel djup enligt följande ekvation.
      Equation 1
      Om blekmedel djupet är < 90, stoppa experimentet och ignorera data, som blekmedel djupet inte var tillräckligt. När blekmedel djupet är ≥90, samla in data för analys med en bildbehandling program och ett kalkylprogram (Tabell för material).
      Obs: När drift av ALIS ligger ≥3 µm, stoppa experimentet och kassera data, eftersom denna mängd bild drift inte kan korrigeras för av analys med programvara bildbehandling (Tabell för material). När drift av ALIS är < 3 µm, samla in data för analys av data med en bildbehandling program och ett kalkylprogram (Tabell för material).
    2. Samla in FRAP data från 10 ALIS från 10 celler med mindre än 3 µm för drift av ALIS. Nästa, överföra målet .lsm filer till en persondator för dataanalys.
  4. Dataanalys i ett Program för bildbehandling
    1. Rätt för bild drift genom att justera eller matchande (dvs registrering) stacken av tidsserier bilder av förvärvet ROI. För att göra detta, öppna varje AIM .lsm fil med en bild bearbetningsprogram (Tabell av material) och markera Plugins | Registrering | StackReg | Översättning. Nästa, Välj Plugins | Registrering | StackReg | Stel kropp10.
    2. Set-up ROI Manager att mäta signal intensiteten i blekmedel ROI. Välj analysera | Verktyg | ROI Manager. Välj ovalverktyget, Rita en cirkel i blekmedel ROI med en diameter på 10 pixlar och sedan klicka på Lägg till .
    3. Set-up ROI Manager att mäta signalintensitet i kontrollen ROI. I ROI-hanteraren, Välj rektangelverktyget, Rita en kvadrat på 20 x 20 pixlar i regionen kontroll ROI och sedan klicka på Lägg till .
    4. Set-up ROI Manager att mäta signalintensitet i bakgrunden ROI. I ROI-hanteraren, Välj rektangelverktyget , rita en kvadrat på 20 x 20 pixlar i regionen bakgrund ROI, klicka knappen Lägg till .
    5. Byt namn på ROIs. Efter tillägger ROIs som ska analyseras i ROI Manager, byta namn på dem bleka ROI, kontroll ROIoch Bakgrunden ROI med detta.
    6. Åtgärd signalintensitet i ROIs. Välj Bleach ROI, kontroll ROIoch Bakgrunden ROIoch sedan mer | Multi åtgärd. Se till att mäta alla 35 skivor och en rad per segment väljs. Se till att bara grå medelvärde är markerat i fönstret Ange mätningar .
      Obs: Dessa är FRAP rådata (figur 1B).
    7. Klistra in resultaten i ett kalkylprogram (Tabell för material). Kopia blekmedel ROI, styr ROI och bakgrunden ROI signalintensitet resultat sedan klistra in dem till kolumner märkta Bleach ROI, kontroll ROIoch Bakgrunden ROI, respektive i ett kalkylprogram (Tabell för material).
  5. Dataanalys i ett kalkylbladsprogram
    1. Bakgrund-rätt signal intensiteten i blekmedel ROI och kontroll ROI (figur 1A, C). Verktyget Infoga funktion i ett kalkylprogram (Tabell för material) för att subtrahera värdena i kolumnen märkt Bakgrund ROI från värdena i kolumnen märkt Bleach ROI. Subtrahera värdena i kolumnen märkt Bakgrund ROI från värdena i kolumnen märkt Kontroll ROI. Märk dessa nya kolumner Korrigerade Bleach ROI och Korrigerade kontrollen ROI.
    2. Normalisera signalen i blekmedel ROI till bakgrundskorrigerade signalen i kontrollen ROI (figur 1A, D). Använda funktionen Infoga i ett kalkylprogram (Tabell för material) dela upp värdena i kolumnen märkt Korrigerade Bleach ROI med värdena i kolumnen märkt Korrigerade kontrollen ROI. Etikett denna nya kolumn Normaliserade korrigerade Bleach ROI.
    3. Normalisera signalen i kolumnen Normaliserade korrigerade Bleach ROI med medelvärdet av 5 prebleach värdena i blekmedel ROI (figur 1A, E). Beräkna medelvärdet av 5 prebleach värdena i blekmedel ROI. Nästa, dividera värdena i kolumnen märkt Normaliserade korrigerade Bleach ROI av medelvärdet av 5 prebleach värdena i blekmedel ROI. Etikett denna nya kolumn Normaliserade korrigerat Prebleach genomsnittliga Bleach ROI.
  6. Mobila bråk och halvtid på återhämtning från kurvan-utrustade Data
    1. Curve-fit normaliserat och korrigerade blekmedel ROI data med hjälp av en bild bearbetningsprogram (Tabell för material). I bearbetning bildprogrammet (Tabell för material), Välj analysera | Verktyg | Kurva montering. Kopia postbleach normaliserats och korrigerade blekmedel ROI värden och de motsvarande tid, sedan klistra in dem i fönstret Kurva montör . Välj Exponentiell återhämtning från den Kurva montör rullgardinsmenyn och sedan passa.
    2. Beräkna den M-f från parametrarna i funktionen återställning, vilket ger värden för: 'a,' en långsamt återhämta bråkdel; 'b,' återvinningsgraden; och 'c,' en snabbt sprida bråkdel. Beräkna Mf genom att koppla in de värden för 'a' och 'c' i den ekvation Mf = en + c. beräkna If med hjälp av ekvation jagf = 1 - Mf. Beräkna t½ genom att ersätta värdet för 'b' i ekvationen Equation 2 sedan lösa för t1/2. 11

Representative Results

Här visas resultatet av en typisk experiment där vi använde FRAP för att undersöka graden av rörlighet p62 i ALIS i RAW264.7 celler behandlas med LPS för 3-5 h12. Figur 3 A visar rådata från ett blekmedel, styra och bakgrund ROI efter stacken bilder hade anpassats för att korrigera för små mängder (< ~ 3 µm) av bilden drivan av ALIS. YFP-p62 fluorescens i denna ALIS på prebleach och postbleach visas i figur 3E och kompletterande Video 1. Figur 3 B visar dessa data efter bakgrund-korrigering. Figur 3 C visar dessa data efter korrigering för fluorescens i kontrollen ROI. Figur 3 D visar dessa data normaliserad till genomsnittlig fluorescensen av 5 prebleach värdena i blekmedel ROI. Graden av blekning var tillräcklig i detta experiment (blekmedel djup = 91.94). YFP-p62 fluorescens inom denna ALIS återhämtade sig långsamt, som t1/2 = 128.27 s (2.14 min). YFP-p62 var inte en mycket mobil protein i detta experiment, som Mf = 21,97 och jagf = 78.03.

Figure 1
Figur 1 : Ett diagram över en RAW264.7 cell och steg för bildanalys efter FRAP bilder har anpassats för att korrigera för bild drivan av ALIS. (A) Diagram över en RAW264.7 cell som skildrar flera ALIS och blekmedel, kontroll och bakgrunden ROIs inom förvärvet ROI. (B) en idealiserade skildring av rå FRAP data erhållits i blekmedel, kontroll och bakgrund ROIs i panelen A. (C) en idealiserad grafen av FRAP-rådata som varit bakgrundskorrigerade. (D) en idealiserad grafen av bakgrundskorrigerade FRAP data som har varit normaliserad till fluorescens i kontrollen ROI. (E) en idealiserad diagram normaliserat och bakgrundskorrigerade FRAP-data som har varit normaliserad till prebleach fluorescensen i blekmedel ROI. Förkortningar: Con = kontroll; BG = bakgrund. Denna siffra ändrades från Rabut och Ellenberg4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Bilder av användargränssnittet i AIM-programvaran (tabell av material) för laser urval, helljus sökvägen konfiguration och bild förvärv parametrar för FRAP experiment. (A) Laser styra skärmen visar Argon/2 laserlinjer, utdata och tube ström används. (B) konfiguration styra skärmen visar balken splitter och utsläpp filterinställningar som används. (C) Scan styra skärmen visar den inställning som används för bild förvärv. (D) Scan styra skärmen visar den pinhole, detektorn vinst, förstärkare offset, förstärkare vinst och överföringsinställningar för raden Argon/2 514 nm laser. (E) tidsserier styra skärmen visar de inställningar för serie av tid som används. (F) blekmedel styra skärmen visar prebleach och postbleach parametrar som används. Förkortningar: HFT = Haupt Farb Teiler (primära dikroisk stråldelare); NT1 = Anslutninglinuxneben Farb Teiler 1 (första sekundära dichroic balk splitter); NT2 = Anslutninglinuxneben Farb Teiler 2 (andra sekundära dikroisk stråldelare); EF = utsläpp filter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Ett representativt FRAP-experiment för att studera YFP-p62 dynamik i ALIS i RAW264.7 celler. (A) Raw fluorescens intensitet data för ett blekmedel, kontroll och bakgrund ROI. (B) de uppgifter som lämnas i panel A efter att blekmedel och kontrollera ROI hade korrigerats för fluorescens i bakgrunden ROI. (C) de uppgifter som lämnas i paneler A och B efter normalisering fluorescensintensiteten i blekmedel ROI till konto för fluorescens i kontrollen bakgrundskorrigerade ROI. (D) de uppgifter som lämnas i paneler A-C efter normalisering fluorescensintensiteten i normaliserat och bakgrundskorrigerade blekmedel ROI med genomsnittet av de första 5 prebleach värdena i blekmedel ROI. Mf = 21,97, jagf = 78.03, t1/2 = 128.27 s (2.14 min) och blekmedel djup = 91.94. (E), en bild av en ALIS på prebleach (1,5 min) och postbleach (0, 6 och 16 min). Skalstapeln = 5 µm och är giltig för alla paneler. Förkortningar: Con = kontroll; BG = bakgrund; Corr. = korrigeras; Norm. = normaliserat; AVG. = genomsnittet. Denna siffra ändrades från Cabe et al.12vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Supplementary Video 1
Kompletterande Video 1: en typisk ALIS i en RAW264.7 makrofag före och efter fotoblekning. YFP-p62 fluorescens är långsam att återhämta sig efter photobleach; p62 är därför inte ett mycket mobila protein. För detta experiment, Mf = 25,62, jagf = 74.38, t1/2 = 442.79 s (7.38 min) och blekmedel djup = 90,19. Skalstapeln = 5 µm. Denna video ändrades från Cabe et al.12vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)

Discussion

Vi tillhandahåller ett omfattande, praktisk och enkel steg för steg protokoll för FRAP experiment med levande celler. Häri, protokollet användes för att mäta YFP-p62 i ALIS rörlighet i RAW264.7 makrofager, men det kan tillämpas på många av de laserscanning confocal Mikroskop system och genetiskt kodade fluorescerande proteiner som finns nu. För mikroskopi system är pilotförsök avgörande för att fastställa de optimala FRAP-parametrar, inklusive förvärv, blekmedel och kontroll ROI storlekar, laser intensitet för fotoblekning och prebleach och postbleach bild förvärv. Det är rimligt att förvänta sig de optimala FRAP parametrarna skiljer sig för varje genetiskt kodade fluorescerande protein och cell linje.

Viktiga faktorer att beakta när genomför en FRAP experiment inkluderar (a) att uppnå lämplig blekmedel djup, (b) användning av ett kort blekning steg, (c) tillåta tillräcklig tid postbleach att observera den fullständig återhämtning funktion, d fotoblekning effektivitet, (e). cytotoxicitet med upprepade FRAP, och (f) införandet av en kontroll för fluorescens förlust på grund av upprepade imaging. Vi rekommenderar att blekmedel djup, som kan beräknas enligt ekvation som anges i avsnitt 3.3.1, ≥9013. När blekmedel djup är < 90, graden av postbleach fluorescens återhämtning kommer att underskattas, och värdena av If, Mfoch t1/2 blir felaktiga. Även om varaktighet och intensitet av blekmedel-inducerande laser pulserna kan variera mellan FRAP experiment, är det viktigt att fotoblekning steg bli kort och väsentligen snabbare än fluorescens recovery funktion. Om det inte är, kunde då en betydande mängd fluorescens återhämtning uppstå under blekning steg. Med en lång blekmedel tid, fluorescens återhämtning under blekning steg inte skulle mätas, och det skulle leda till felaktiga mätningar av If, Mf, ocht1/2. Förutom att få korrekta värden för If, Mf, ocht1/2, förvärvet ROI bör observeras postbleach tills fluorescens i blekmedel ROI har nått en platå. Till exempel i vår FRAP experiment, fanns ingen skillnad mellan I-f, Mfoch t1/2 värden när vi observerade YFP-p62 fluorescens i blekmedel ROI för 32,2 min postbleach kontra när vi observerat YFP-p62 i blekmedel ROI för 15,1 min postbleach; Således fann vi att funktionen återställning nått en platå på 15,1 min postbleach12. När det gäller fotoblekning effektivitet ökar fotoblekning med kvadraten av optisk zoom faktor14. Således, användning av hög optisk zoom objektiv är gynnsam för snabb fotoblekning men kan resultera i oönskade fotoblekning under förvärvet; den senare kan förklaras av imaging en kontroll ROI. Upprepade fotoblekning ska undvikas eftersom det kan leda till generation av cytotoxiska reaktiva syreradikaler (ROS). Men graden av ROS generation på grund av exponering för en hög intensitet laser är lägre för genetiskt kodade fluorescerande proteiner än för kemiska fluorophores (t.ex. fluorescerande antikroppar)15och ROS genereras är mer benägna att reagera inom det genetiskt kodade fluorescerande proteinet än med andra molekyler i cell4. Förutom den ökade sannolikheten för att generera cytotoxiska ROS, är upprepade fotoblekning som skall undvikas eftersom det är svårt att styra. Slutligen, även om låga laser överföring används för att förvärva alla icke-bleka bilder, vissa fotoblekning alltid inträffar, som måste kontrolleras. Eventuella kontroller för detta inkluderar övervakning fluorescens i en kontroll ROI inom förvärvet ROI, få kontroll bilder i en närliggande oblekt cell och utför kontroll experiment med identiska inställningar för dem som används i den fotoblekning experiment men utan händelsen fotoblekning.

Disclosures

Författarna har ingen intressekonflikt att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar Dr. Seth Robia på Loyola University Chicago för hans värdefulla kommentarer på detta manuskript. Detta arbete stöds av NIH grant 1R01NS073967-01A1 till Joanna C. Bakowska.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium Hyclone SH30022.01 High Glucose (4.5 g/L)
Fetal bovine serum Gemini Bio-Products 100-106
Glass bottom dishes MatTek P35G-1.5-14-C 35 mm
ImageJ software National Institutes of Health N.A.
Lipopolysaccharide (LPS) Sigma L4391
Nocodazole Sigma M1404
Penicillin-streptomycin solution Corning 30-002-Cl 100×
Plan-Apochromat 63×/1.40 Oil objective Carl Zeiss MicroImaging, Inc 4407629904000000
Polyethylenimine (PEI) Polysciences 23966-1 linear (MW 25,000)
RAW 264.7 murine macrophages ATCC TIB-71
Zeiss confocal microscope Carl Zeiss MicroImaging, Inc LSM 510

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophysical Journal. 16 (9), 1055-1069 (1976).
  2. Peters, R., Peters, J., Tews, K. H., Bahr, W. A microfluorimetric study of translational diffusion in erythrocyte membranes. Biochimica et Biophysica Acta. 367 (3), 282-294 (1974).
  3. Patterson, G., Day, R. N., Piston, D. Fluorescent protein spectra. Journal of Cell Science. 114, Pt 5 837-838 (2001).
  4. Rabut, G., Ellenberg, J. Photobleaching techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, iFRAP, and FLIP. Live Cell Imaging: A Laboratory Manual (1st ed). , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 101-126 (2004).
  5. Fritzsche, M., Charras, G. Dissecting protein reaction dynamics in living cells by fluorescence recovery after photobleaching. Nature Protocols. 10 (5), 660-680 (2015).
  6. Goodwin, J. S., Kentworthy, A. K. Photobleaching approaches to investigate diffusional mobility and trafficking of Ras in living cells. Methods. 37 (2), 154-164 (2005).
  7. Hildick, K. L., Gonzàlez-Gonzàlez, I. M., Jaskolski, F., Henley, J. M. Lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching. Journal of Visualized Experiments. (60), e3747 (2012).
  8. Nissim-Rafinia, M., Meshorer, E. Photobleaching assays (FRAP & FLIP) to measure chromatin protein dynamics in living embryonic stem cells. Journal of Visualized Experiments. (52), e2696 (2011).
  9. Zheng, C., Petralia, R. S., Wang, Y., Kachar, B. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) of fluorescence tagged proteins in dendritic spines of cultured hippocampal neurons. Journal of Visualized Experiments. (50), e2568 (2011).
  10. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
  11. Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).
  12. Cabe, M., Rademacher, D. J., Karlsson, A. B., Cherukuri, S., Bakowska, J. C. PB1 and UBA domains of p62 are essential for aggresome-like induced structure formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (4), 2306-2311 (2018).
  13. Brown, E. B., Wu, E. S., Zipfel, W., Webb, W. W. Measurement of molecular diffusion in solution by multiphoton fluorescence photobleaching recovery. Biophysical Journal. 77 (5), 2837-2849 (1999).
  14. Centonze, V., Pawley, J. Tutorial on practical confocal microscopy and the use of the confocal test specimen. Handbook of biological confocal microscopy. , Plenum Press. New York. 549-570 (1995).
  15. Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. Physiological Reviews. 90 (3), 1103-1163 (2010).

Tags

Biologi fråga 145 fluorescens återhämtning efter fotoblekning FRAP gul fluorescerande protein live cell imaging murina makrofager sequestosome-1 p62 protein rörlighet aggresome
Fluorescens återhämtning efter Fotoblekning av gula fluorescerande Protein taggade p62 i Aggresome-liknande inducerad strukturer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rademacher, D. J., Cabe, M.,… More

Rademacher, D. J., Cabe, M., Bakowska, J. C. Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures. J. Vis. Exp. (145), e59288, doi:10.3791/59288 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter