Summary
Bu iletişim kuralı bir roman yöntemi lipid damlacık tecrit ve arıtma fare karaciğer, bir iyi kurulmuş endoplazmik retikulum izolasyon kit kullanarak üzerinden kurar.
Abstract
Lipid damlacıkları (LDs) biyoaktif organelleri en ökaryotik ve bazı prokaryotik hücreler sitozol içinde bulundu vardır. LDs nötr lipitler fosfolipitler ve proteinler monolayer ile kaplı oluşur. Seramidler ve proteinlerinin hepatik LD lipidler hepatik yağlanma neden çeşitli hastalıklarda karıştığı. Önceki yöntemler LD yalıtım için kurulmuş olsa da, onlar reaktifler zaman alıcı bir hazırlık gerektirir ve birden çok hücre altı bölmeleri yalıtım için tasarlanmamıştır. Yalıtım LDs, endoplazmik retikulum (ER) ve organellerin tek fare karaciğer üzerinden etkinleştirmek için yeni bir iletişim kuralı kurmak istedi.
Ayrıca, tüm reaktifler burada sunulan protokolünde kullanılan piyasada bulunan ve LD saflık ödün vermeden en az reaktif hazırlık gerektirir. Burada veri standart Sükroz degrade iletişim kuralı, bu yeni iletişim kuralına karşılaştırma karşılaştırılabilir saflık, morfoloji ve verim gösteren mevcut. Ayrıca, biz ER ve aynı örnek kullanarak organellerin oluşumu ve lipidler ve onların ilişkili proteinler hücre içi akı gösteren ayrıntılı bilgilere sağlayan ortadan kaldırabilirsiniz.
Introduction
LDs sitozol en ökaryotik hücre ve bazı prokaryotik hücreler1,2,3biyoaktif organelleri vardır. LD çekirdek Trigliserid (TG) ve kolesterol esterleri gibi nötr lipitler oluşur. Ayrıca Seramidler, biyoaktif lipidler hücresel sinyal yolları4,5' te yer alan içerirler. LDs Fosfolipid monolayer tarafından çevrili ve perilipin protein perilipin 2 (PLIN2) ve 3 (PLIN3)1,5,6dahil olmak üzere proteinler ile kaplı. Ayrıca lipogenic enzimler, lipaz ve alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı, alkolik karaciğer hastalığı ve hepatit C3,5 de dahil olmak üzere birkaç hepatik steatotic hastalıklar için bağlı membran kaçakçılığı proteinler mevcuttur ,6,7,8,9,10.
LDs acil servis dış membran form ve serbest yağ asitleri ER elde edilen11' den kaynaklı yeni sentezlenmiş TG içeren düşünülmektedir. Havuza alınan lipidler bud, ancak, bilinmeyen kalır bağlı kalan veya ER6,11yalıtım LDS teknik olarak zor ER ücretsiz yapma, güvenliğe. Serbest yağ asidi LDS'den enerji üretim veya membran sentezi için sağlamak için yüzey lipazlar eylem tarafından özgür olmak. Ayrıca, LDs lipophagy bir düzenleyici mekanizma olarak ve serbest yağ asitleri12üretmek için düşebilir.
ER ve organellerin yanı sıra, diğer organelleri vardır — mitokondri, endosomes, tanımladıkları ve plazma zarı gibi — LDs11yakın ilişki içinde bulunur. Bu sıkı çok eşlilik bir saf LD çekimi gerçekleştirmek zorlaştırır. Ancak, nötr lipitler doğuştan gelen düşük yoğunluklu Santrifüjü5üzerinden avantaj alınabilir.
Geleneksel olarak, LDs Sükroz yoğunluk gradient1,5,13kullanarak izole edilmiştir. Ancak, bu yöntemleri diğer organelleri yalıtmak için tasarlanmış değil. Ayrıca, onlar reaktifler zaman alıcı hazırlık gerektirir. Bu iletişim kuralı bir piyasada bulunan ER yalıtım adapte LD yalıtım için izin vermek için (bkz. Tablo reçetesi) kit. Biz paketi tarafından sağlanan ayıklama arabellek LD yalıtım adım ekleme kullanın. Ayrıca, protokol ER ve LDs yaşam döngüsünün daha kapsamlı bir resim için izin aynı örnekleri kullanarak lizozomal yalıtım için de kullanılabilir. Bu yeni yöntem doğrulamak için LD verim, Morfoloji, boyutu ve saflık tahlil. Biz burada sunulan bu LD yalıtım için Sükroz degrade kullanan yaygın olarak kullanılan bir iletişim kuralı ile elde edilen sonuçlar karşılaştırın.
Biz bir 10 - için 12-hafta-yaşlı kullanılan, su ücretsiz erişim ile 16 h (5 Açıkhava 9: sabah LD yalıtım kez gıda kaldırmayı) için 20 g kadın C57BL/6 fare oruç tuttum. TG için tipik verim 0.6 mg/g karaciğer için LD protein, 0.25 mg/g karaciğer mi var... Bu ~ 10 immunoblots tarafından SDS sayfası için yeterli malzeme sağlar. Ayrıntılar kullanılan reaktifler aşağıda Protokolü ve bir tek 1 g karaciğer için uygun bir protokol. Sükroz degrade yalıtım Protokolü Sato14 ve Wu15uyarlanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneyler ile kişisel koruyucu ekipman için biyogüvenlik düzeyi 1, önlük, eldiven ve koruyucu gözlük gibi uygun bir laboratuvar tezgah üzerinde yapılmıştır. Deneyler kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), Pennsylvania Üniversitesi tarafından onaylanmış protokolleri göre yapıldı. Tüm çabaları hayvan rahatsızlık en aza indirmek için yapılmış ve hayvanlar ile insana ilişkin bakım tedavi edildi.
1. bir ER izolasyon kit kullanarak LD yalıtım
-
Hazırlık
Not: Listelenen tutarları tek 1 g fare karaciğer için uygundur.- 10 mL 1 x izotonik ayıklama arabelleği (IE arabellek, ER izolasyon Kit) 5 x IE arabellek 2 mL 8 mL ultrasaf su ile sulandrarak hazırlayın. Arabellek buza yerleştirerek serin.
- 100 mL 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x 10 x PBS ultrasaf su 90 ml 10 mL sulandrarak hazırlayın. Buzda yerleştirerek sakin ol.
- 10 mL % 5 polietilen glikol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-fenil eter (PGPE) 9.5 mL ultrasaf su 500 µL sulandrarak, PGPE hazırlayın. 1 mL şırınga viskoz olduğu gibi PGPE ölçmek için kullanın. Buzda yerleştirerek sakin ol.
- Buzda yerleştirerek tüm tüpler cool: 1.7 mL microcentrifuge tüpler, 15 mL santrifüj tüpleri, 50 mL yüksek hızlı santrifüj tüpleri ve 13 mL ultracentrifuge tüpleri.
- 4 gerekli tüm santrifüjler serin ° C: bir microcentrifuge 15 mL için yüksek kapasite santrifüj tüpü 50 mL tüpler ve bir ultracentrifuge için yüksek hızlı bir santrifüj.
- Forseps ve diseksiyon makası tarafından ısıyla sterilize.
-
Doku hazırlık
- Fare servikal çıkığı gerçekleştirerek % 100 CO2 10 dk. Onayla ötenazi için dolu bir odaya yerleştirerek ötenazi.
- Steril forseps ve karaciğer ortaya çıkarmak için arka/ön ekseninde karın kas ve deri katmanları kesmek diseksiyon makası kullanarak.
- Diyafram ve bağırsak karaciğer bağlayan ligament kesti. Forseps bağırsak karaciğer ligament ortaya çıkarmak için arka doğru uzak çekmek için kullanın.
- Karaciğer ve dorsal göğüs kafesi arasında kesme, posterior anterior karaciğer kadar hareketli özgür oldu.
- Karaciğer soğuk 5 cm 10 mL soğuk 1 x PBS ile Petri kabına aktarın.
- Karaciğer 2 yıkama x 10 ml soğuk 1 x PBS 5 cm Petri kabına 4 ° C'de 5 min için sallanan bir platformda. 1 x PBS sonra son yıkama dökün.
- Bir boyut-10 steril cerrahi bıçak kullanın (5 cm Petri kabına (şekil 1A) 3-5 mm parçalara karaciğer zar için Malzemeler tablobkz:).
- Doğranmış karaciğer 2 yıkama x 10 mL soğuk 1 x 5 cm Petri kabına 4 ° C'de 5 min için PBS ile.
Not: Lysosome yalıtımı, 0.5 g karaciğer temiz 45 mL homogenizer aktarmak ve lysosome çıkarma tarafından sağlanan yönergeleri izleyin ( Tablo reçetesigörmek) kit. - 1 x PBS dikkatle boşaltmak ve doğranmış karaciğer adet soğuk 45 mL Dounce homogenizer için transfer. Tüm taşlarını homogenizer altındaki gidin emin olun.
- 7 mL soğuk 1 x IE arabelleğinden (ER izolasyon kit) ekleyin ve buz üzerinde havaneli 20 x yukarı ve aşağı hareket ettirerek homojenize. Havaneli her inme sırasında homogenizer altına gider emin olun.
- Homogenate (şekil 1B) soğuk 15 mL santrifüj tüpü aktarın.
- Durulama soğuk 1 IE arabelleğinden (ER izolasyon kit) x 1 mL ile homogenizer ve bu homogenate geri kalanına ekleyin.
-
LD yalıtım
- Çekirdeklerin 4 ° c (şekil 1 c) 10 dk 1000 x g de yüksek kapasite santrifüj homogenate centrifuging tarafından kaldırın.
- Postnuclear süpernatant (PNS) yeni, soğuk 50 mL santrifüj tüpü aktarın. LD kaybını önlemek için 15 mL tüp başında toplanan herhangi bir lipid PNS aktarmadan önce resuspended emin olun.
- 100 µL PNS saflık analizi için aliquot alıp bir soğuk 1.7 mL microcentrifuge tüpü yerleştirin. Buza koyun.
- Mitokondri kaldırmak için PNS örnek, 12.000 x g de buzdolabında yüksek hızlı santrifüj 4 ° C'de 15 dakika içinde aliquot değil santrifüj kapasitesi
- İsteğe bağlı: için ham LD (CID) yalıtır (sitozol ve hücre zarının kirlenme) ile cam pipet kullanarak üst lipit katmanı toplamak ve 1.7 mL microcentrifuge tüp transferi. 1.4 Bölüm devam ediyor.
- Postmitochondrial süpernatant (PMS) bir ultracentrifuge tüp aktarın. LD kaybını önlemek için üst kısmında toplanan herhangi bir lipid PMS aktarmadan önce resuspended emin olun.
- 100 µL PMS saflık analizi için aliquot alıp bir soğuk 1.7 mL microcentrifuge tüpü yerleştirin. Buza koyun.
- Bir ultracentrifuge tüp ağzına kadar soğuk 1 tüp ultrasantrifüj sırasında çöken önlemek için IE arabellek x ile doldurun.
- Örnekleri denge ve onları bir ultracentrifuge 60 dk 4 ° c (şekil 1 d) için 100.000 x g de içinde santrifüj kapasitesi.
- LD katman kaldırmak için tüp 45 ° açıyla eğilme ve Aspire edin için cam pipet kullanın. Pelet soğuk 1.7 mL microcentrifuge tüp aktarın.
Not: Pelet izole ER içerir. Bu kesir aşağı ER yalıtımı için kullanma. - Post-ER süpernatant (PER) altında lipit katmanı saflık analizi için 100 µL toplamak.
-
LD çamaşır
- 1 x PBS 1.3 mL toplam hacmiyle 1.7 microcentrifuge tüp içinde toplanan LD kesir ekleyin.
- Girdap örnek.
- Bir microcentrifuge 4 ° C'de herhangi bir hücre artıkları cips için 5 min için üst hızda santrifüj kapasitesi. Tüpü yavaşça elle LD katman resuspend yardımcı olmak için sıcak. Lipid katmana yeni bir 1,7 mL microcentrifuge tüp de dahil olmak üzere süpernatant, aktarın.
- Adımları 1.4.1–1.4.3 tekrar 2 x-3 x, pelet görünene kadar.
- 1 x PBS Pelet ücretsiz LD 1,5 mL nihai bir birime süpernatant ekleyin. Yıkama lipid kısmı bir microcentrifuge 4 ° C'de 5 min için üst hızda Santrifüjü tarafından
- 1 mL 1 x PBS (altında lipit katmanı) cam pipet ile lipit katmanı bozmadan kaldırın.
- 1.4.5 ve 1.4.6. adımları yineleyin 4 x x-5, 1 x PBS yok bulanıklık ile görsel olarak saydam olana.
- Tümünü Kaldır cam pipet (şekil 1E) kullanarak 1 x PBS lipid katmanın altında.
- Sonuç, saf LD kesir aşağı akım analizi için kullanın.
-
LD protein Nefelometri bicinchoninic asit tahlil tarafından
Not: LD Morfoloji değerlendirilmek için ise bir bicinchoninic asit tahlil (BCA) kullanmayın.- LD % 5 PGPE 500 μL içinde resuspend.
- Örnekleri 95 ° C'de 5 dakika kaynatın girdap onları ve örnekleri soğuması 5 min için oda sıcaklığında kuluçkaya.
- 1.5.2 ek 2 x arasındaki adımları yineleyin.
- Örnekleri ile bir 30 5 min için solüsyon içeren temizleyicide s açma/kapama döngüsü, Orta yoğunluk.
- Örnekleri BCA tahlil tarafından protein konsantrasyonu tüm saflık analizi örnekleri ve LD kesir ölçerek normalleştirmek.
2. Sükroz yoğunluk gradient kullanarak LD yalıtım
-
Hazırlık
- TE arabellek (10 mM Tris-[pH 7.4], HCl 1 mM EDTA [pH 8.0]) 200 mL olun. Buzda yerleştirerek sakin ol.
- 100 mL % 60'ı (w/v) Sükroz çözeltisi TE arabellekte 60 g Sükroz son hacim için 100 mL getiren TE arabellekte çözülerek olun. Buzda yerleştirerek sakin ol.
- 6 mL % 40 (w/v) Sükroz çözeltisi % 60 Sükroz 4 mL 2 mL TE arabelleği ekleyerek olun. Buzda yerleştirerek sakin ol.
- 6 mL % 25 (w/v) Sükroz çözeltisi TE arabellek için 3,5 mL 2.5 mL % 60 Sükroz ekleyerek getirin. Buzda yerleştirerek sakin ol.
- 4 mL % 10 (w/v) Sükroz çözeltisi TE arabellek için 3,3 mL % 60 Sükroz 0.7 mL ekleyerek getirin. Buzda yerleştirerek sakin ol.
- Fosfataz ve proteaz inhibitörü çözüm 10 mL 10 mL TE arabelleği fosfataz ve proteaz inhibitörleri bir tablet ekleyerek getirin.
- Doku homogenate arabellek 4 mL fosfataz ve proteaz inhibitörü çözeltisi 50 mL % 60 Sükroz stok çözeltisi ekleyerek hazırlayın. Buzda yerleştirerek sakin ol.
- Bindirme arabellek TE arabellek için 50 mL 2 mL fosfataz ve proteaz inhibitörü çözeltisi ekleyerek hazırlayın. Buzda yerleştirerek sakin ol.
- 100 mL 1 x PBS 10 x PBS ultrasaf su 90 ml 10 mL sulandrarak hazırlayın. Buzda yerleştirerek sakin ol.
- 10 mL % 5'lik hazırlamak 9.5 mL ultrasaf su 500 µL sulandrarak, PGPE tarafından PGPE. 1 mL şırınga viskoz olduğu gibi PGPE ölçmek için kullanın. Buzda yerleştirerek sakin ol.
- Aşağıdaki santrifüj tüpleri buza yerleştirerek cool: 1.7 mL microcentrifuge tüpler, 15 mL santrifüj tüpleri, 50 mL yüksek hızlı santrifüj tüpleri ve 13 mL ultracentrifuge tüpleri.
- 4 gerekli santrifüjler serin ° c a microcentrifuge, yüksek kapasite santrifüj (15 mL tüpler için) (50 mL tüpler için) yüksek hızlı bir santrifüj ve bir ultracentrifuge.
-
Doku hazırlık
- Doku homojenizasyon için hazırlamak için adımlar 1.2.1–1.2.9 kullanın.
- 7 mL soğuk doku homogenate arabellek ekleyin ve havaneli 20 x yukarı ve aşağı hareket ettirerek buza lunaparkçı. İlk beş vuruş sırasında havan tokmağı homogenizer altına gider emin olun.
- Homogenate soğuk 15 mL santrifüj tüpü aktarın.
- Homogenizer 1 mL soğuk doku homogenate arabelleği ile durulayın ve önceden kullanılan 15 mL santrifüj tüpü için transfer.
- Homogenate hacmi getirmek doku homogenate arabellek ile ilâ 10 mL.
- 1000 x g de yüksek kapasite santrifüj 4 ° C'de 10 dakika için örnekte santrifüj kapasitesi
- Transfer süpernatant 8 mL 50 mL santrifüj tüpü.
- Saflık analizi için PNS örnek olarak, kalan süpernatant 100 µL aktarın.
-
Sükroz gradyan
- PNS 45 ° açıyla 8 mL içeren 50 mL santrifüj tüpü yatırmak. 6 mL % 40 Sükroz çözeltisi, iki aşamada ayrı kalmak sağlamak dikkatle ekleyin.
- Benzer şekilde, yavaş yavaş 6 mL % 25 Sükroz çözeltisi ekleyin; daha sonra 4 mL % 10 Sükroz çözeltisi ekleyin; son olarak, bindirme arabellek 8 mL ekleyin.
- 30 dk için yüksek hızlı bir santrifüj 30.000 x g 4 ° c de örnekte santrifüj kapasitesi.
- 1.7 mL microcentrifuge Tube LDs içeren üst tabaka aktarın.
- LD yıkanmasında 1.4 bölümündeki adımları izleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biz LD yalıtım ER kiti ile yaklaşık 30 fareler üzerinde yapılan ve yaklaşık 40 fareler üzerinde Sükroz yalıtım Protokolü izleyenler ile sonuçları karşılaştırılır. Her iki protokoller için tipik bildirilen bulgulardir. Fareler gecede LD verimi artırmak için su, ücretsiz erişim ile oruç. Sükroz degrade kullanarak LD yalıtım ER kiti LD yalıtım protokolü ile paralel olarak çalıştırıldı. PNS, PMS, örnekleri başına, CLDs ve LDs ER kiti LD yalıtım Protokolü toplanan. İş akışı kısıtlaması nedeniyle sukroz yalıtım protokolünün, sadece PNS ve LD izole toplanan.
Floresan mikroskopi için izole LDS 50 µL 100 µM 4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene (DPBDI) eşit bir hacmi ile karışık. Örnekleri ışıktan korunan ve 30 dk için oda sıcaklığında inkübe edildi. Örnekleri 1 mL 1 x PBS, ardından Santrifüjü ve aşırı arabellek kaldırma ekleyerek yıkanmış. LD kısmını 1 µL bir mikroskop slayt ve coverslipped üzerine yerleştirildi. Temsilcisi 20 x floresan ve aydınlık alan LD adet fotoğraf (şekil 2A-D) yöntemleri, bir ters araştırma mikroskop kullanarak ER kiti LD yalıtım ve sukroz LD yalıtım alınmıştır ( Tablo reçetesigörmek). Aydınlık alan görüntüleri Partiküler madde, benzer eroine farklı protokolleri kullanarak düşündüren benzer düzeyde ortaya koyuyor.
Verim iki protokol arasındaki farkları belirlemek için kıyaslanabilir büyüklükte fare ve fare karaciğer (şekil 2EF) kullanılır. Renkölçer deneyleri ( Tablo reçetesigörmek) kullanarak aşağıdaki arıtma, LD TG ve protein düzeyleri ölçüldü ve verileri karaciğer ağırlığı (Şekil 2 gH) normalleştirilmiş. Biz bulundu, ne zaman biz başlangıç materyali normalleştirilmiş LD protein ve TG ER seti kullanarak LD yalıtım sonra verim ve sukroz benzer. LD boyutu da benzer olsaydı, biz sayısal görüntü analiz yazılımı kullanarak LD çapları belirlemek için (bkz. Tablo malzeme). LDs 0,27 6,37 µm arasında değişiyordu. ER kiti LD yalıtım (3A rakam) ve sukroz LD yalıtım (3B rakam) LDs benzer boyutlarda verim LD çapı frekans dağılımını gösterir.
LD saflık değerlendirmek için örnekleri immunoblotting tarafından denetlesinler. Bir miktar protein örnek başına 20 µg SDS sayfa tarafından denetlesinler. Örnekleri antikor işaretleri ile LDs (PLIN2 ve PLIN3), ER (Sec61), mitokondri (VDAC), organellerin (LAMP1), plazma zarı (MEK1), çekirdek (Histon H3) ve sitozol (GAPDH) (şekil 4A) probed. PLIN2 ER kiti LD yalıtım hariç tüm örneklerinde algılandığı başına ve sukroz'ın PNS. LDs ER Seti'nden LD yalıtım türetilen ve sukroz degrade protokolü her iki eşit saflık vardı. Hiçbir grup ER (Sec61), mitokondri (VDAC1), lisosomlar (LAMP1), plazma zarı (Mek1) veya sitozol (GAPDH) için ortaya çıktı. CID plazma zarı ve sitozol kirlenme ama hiçbir belirgin kontaminasyonu ER, mitokondri veya organellerin vardı. ER Protokolü Sükroz Protokolü sixfold daha yüksek PLIN2 ifade varken LD kesir (PNS ile karşılaştırıldığında LD kesir bir yaklaşık 14-fold daha yüksek PLIN2 ifade vardı adapte ER Protokolü PLIN2 grupta yoğunluğunu gösterir veri) gösterilmez.
Bu iletişim kuralı da ER ve organellerin arındırmak için seçenek vardır çünkü bu organelleri saflığı değerlendirmek için western Blot da seslendirdi. (Bkz. Tablo reçetesi) acil servis kullanarak aynı örnekten arıtılmış ER immunoblots kit şekil 4B gösterir PLIN2 özgür ama ER Sec61A protein önemli düzeyde vardı. Lizozomal zenginleştirme kullanarak ( Tablo reçetesigörmek) kit, organellerin daha fazla yalıtılmış ve immunoblotted LD (PLIN2), ER (Sec61A) ve lysosome (LAMP1) işaretleri (şekil 4 c). Birlikte, bu veriler gösteriyor ki burada, piyasada bulunan lysosome arıtma kitleri ile birlikte sunulan protokolü, tek bir hayvan karaciğer LDs, ER ve organellerin saf yalıtımı için izin.
Şekil 1: başvuru sırasında çekilen fotoğraflar Bir ER izolasyon kit kullanarak LD yalıtım . (A) doğranmış 5 mm karaciğer parçalar halinde 5 cm Petri kabına. (B) karaciğer homogenate bir Dounce homogenizer homojenizasyon sonra. (C) karaciğer homogenate sonra Santrifüjü vasıl 1000 x g; üst, PNS ve hücre artıkları ve nükleer kesir içeren Pelet hafif lipid katmanda unutmayın. (D) LD katmanı ultrasantrifüj 100.000 x gde sonra; üst, PER ve ER kesir altındaki önemli lipid katmanda unutmayın. (E) yıkanmış LD kesir PBS son kaldırılmasını önce. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: test ve kantitatif analiz bir ER kiti ile izole LD kesir ve Sükroz ile izole LD kesir karşılaştırma. Bir ER kiti ve (B) LDs Sükroz ile izole izole temsilcisi 20 x (A) DPBDI lekeli LD kesir floresan test. (C) aydınlık alan test LD fraksiyonunun izole bir ER kit ve (D) Sükroz ile izole LD kesir. Ölçek çubuğu 20 fare ağırlık µm. (E) ve (F) = karaciğer ağırlığı. (G) TG verim arıtılmış LDs üzerinden karaciğer ağırlığı için normalleştirilmiş. (H) Protein verim arıtılmış LDs karaciğer ağırlığı için normalleştirilmiş gelen. Verileri ortalama ± SEM vardır (N = 4). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: LD boyutlarda frekans dağılımı. Dört farklı fareler örnekleri DPBDI ve temsilcisi ile 20 x alanları sayısal lekeli. Çapları bir görüntü analiz yazılımı kullanılarak ölçüldü. (A)bir ER-kit kullanarak izole bir LD fraksiyonu dağılımı frekans (kesir). (B) Sükroz degrade yoğunluğu kullanarak izole bir LD fraksiyonu dağılımı frekans (kesir). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: immunoblotting tarafından LD saflık analizi. (ER kiti LD yalıtım adapte Protokolü ve sukroz yalıtım protokolü, protein örnek başına 20 µg karşılaştırmak için,A) olduğunu immunoblotted. Aşağıdaki örnekleri yüklenen: postnuclear süpernatant (PNS), postmitochondrial süpernatant (PMS), postendoplasmic retikulum süpernatant (PER), ham LDs (CID) ve LDs (LD). LDs (PLIN2 ve PLIN3), ER (SEC61A), mitokondri (VDAC1), lysosome (LAMP1), hücre zarı (MEK1), çekirdek (Histon H3) ve sitozol (GAPDH) işaretleri için immunoblotted edildi. (B) bir ER fraksiyonu ER ER kiti LD yalıtım kullanarak daha fazla arıtma sonra saflık analizi protokol ( Tablo reçetesigörmek). PNS, PMS, ER ve LDs yüklü ve immunoblotted LDS (PLIN2) ve ER (SEC61A). (C) daha fazla lysosome zenginleştirme seti kullanarak organellerin arıtma sonra lizozomal bir kesir saflık analizi protokol ( Tablo reçetesigörmek). PNS ve lizozomal bir kısmını yüklendi ve LDs (PLIN2), ER (SEC61A) ve organellerin (LAMP1) için immunoblotted. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hepatik LD Biyoloji giderek kritik bir regülatör hepatosellüler Fizyoloji sağlığı ve hastalıkları olarak kabul. Olarak iyi niyetli organelleri, LDs dinamiktir, diğer Hücresel yapıları ile etkileşim ve biyoaktif bileşenler lipid ve glukoz homeostazı yer onları içinde içerir. Sükroz degrade LD yalıtım için rutin olarak kullanılan ve Müfettişler LD yapısı çalışma sağlar, ancak çok sayıda arabellekleri yapmak onlara gerektirir. Biz piyasada bulunan bir ER izolasyon kit kullanımı tandem yalıtım ER ve lysosome, ama sadece LD yalıtım için kullanılabilir başka bir araç olduğunu karşılık değişen hücre dinamiği daha kapsamlı bir görünümünü sağlayan göstermiştir deneysel koşullar, iş akışı önemli artış olmadan.
Bu yeni iletişim kuralı ticari olarak kullanarak kurulumu veya aynı anda birden fazla organelleri yalıtmak için onun yetenek ve hazır reaktifler kolaylığı gücüdür. Ancak, akılda tutulması gereken bu yeni yöntemin olası sakıncaları vardır. Bu iletişim kuralı birkaç adımda karaciğer supersized LDS'den yalıtım dezavantaj. Dounce homojenizasyon kesme stres aracılığıyla büyük LDs bozmak potansiyeline sahiptir. Gevşek uygun Dounce homogenizer Kur Ayrıca bazı stres için büyük LDs. hafifletmek, bir 100.000 x g spin istihdam, LD ve ER ayrılması için izin. 2.000 x g karaciğer LD arıtma2için bir rapor önerir bu hız da büyük LDs kaybına neden olabilir. Bu yordamı bir sınırlama LDs farklı boyutlarda son zamanlarda açıklanan16olarak izole etmek için kullanılamaz olduğunu. Sükroz arabellekleri kırılgan LDs nazik homojenizasyon2kullanımı ile bozulmamış saklayabilirsiniz, ancak buna ek olarak, 1 x IE önbellekle homojenizasyon benzer görünümdeki ve boyutu dağıtım bu Sükroz degrade izolasyonu elde edilen saf LDs verimleri . İleri çalışmalar biyolojik aktivitesi daha yaygın olarak kullanılan izotonik arabellekleri2daha az nazik bir PBS arabellek kullanımı ile etkilenen belirlemek için gerekli olacaktır. Bu potansiyel kısıtlamalar nedeniyle, bu tam olarak üst kısmında süpernatant aktarmadan önce toplanan lipid resuspend ve ampirik olarak LD verim için kontur numarası etkisini belirlemek için ilk iki santrifüj adımları sırasında önemlidir farklı doku. Burada sunulan karaciğer protokolü bir karşılaştırılabilir boyutu dağılımı diğer eseri2verimli 20 darbeleri kullanır.
Endoplazmik retikulum izolasyon kit kullanarak LD yalıtım ham ve saf LD yalıtır verir. CID yalıtır hücre zarı ve sitozol bileşenleri içerir ancak LD Morfoloji mikroskobu ile değerlendirilmesi gibi bazı uygulamalar için yeterli olduğunu kanıtlayabilir. Saf LD izole ER, mitokondri, lizozomal, hücre zarı veya sitozol kirlenme PLIN2 ifade tarafından belirlenen sahip değil. Gerçekten de, iki kat Sükroz LD yalıtım yöntemi ile karşılaştırıldığında daha fazla saf izole ER kitinden LD yalıtım Protokolü PLIN2 zenginleştirir. Bu fark benzerlik protein verilen beklenmedik, ve TG verim, ancak resuspension tampon yerine sukroz veya izotonik arabellek olarak PBS kullanımı nedeniyle olabilir.
LD yalıtım geleneksel yöntemlerle de plazma zarı2tarafından LD kesir kirlenme acı olabilir. Her ne kadar bu ortak yalıtım tüm LD yalıtım yöntemler yaygındır ve LD yalıtır2, burada sunulan veri çözümleme göstermek zaman CID izole etmek daha da o ultrasantrifüj akılda tutulmalıdır böyle kirletici maddeler ( örnek rids Şekil 4). Gelecekteki uyarlamalar bir kahve makinesi kullanımı içerebilir veya hücre zarı daha nazikçe bozabilir ve CID herhangi bir kirlenme daha da azaltmak için azot bomba izole etmek2.
Sonuç olarak, ER kiti LD yalıtım yöntemini bir sık kullanılan hücresel Biyoloji Aracı'nın roman bir uygulamadır. Bu yöntemi benzer şekilde Sükroz degrade izolasyon, daha az reaktif hazırlık yapar. Ayrıca, hazır reaktifler ER seti LD yalıtım Protokolü dahil titizlik ve tekrarlanabilirlik deneysel koşullar geliştirir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr. Carr müdahale ilaç araştırma desteği alır.
Acknowledgments
Abramson aile Kanser Araştırma Enstitüsü teşekkür ediyoruz. Bu eser aşağıdaki hibe tarafından desteklenir: NIH/NIAAA R01 AA026302-01, NIH/NIAAA K08-AA021424, Robert Wood Johnson Vakfı, Harold Amos Tıp Fakültesi geliştirme Ödülü, 7158, IDOM DRC Pilot Ödülü P30 DK019525 (R.M.C.); NIH/NIAAA F32-AA024347 (JC). Bu eser kısmen NIH P30-DK050306 tarafından desteklendi ve çekirdek tesisleri (Moleküler Patoloji ve Imaging Core, moleküler biyoloji/gen ifade çekirdek ve hücre kültür Core) ve pilot program verin. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmiyor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioExpress Vortex Mixer | GeneMate | S-3200-1 | Vortex Mixer |
| Centrifuge 54242 R | Eppendorf | 54242 R | Refrigerated Counter Microcentrifuge Rotor: FA-45-24-11 |
| Centrifuge Sorvall RC6 + | Thermo Scientific | RC6+ | Refrigerated High Speed Centrifuge Rotor: F21S-8x50y |
| Centrifuge Sorvall Legend RT+ | Thermo Scientific | Legend RT+ | Refrigerated High Capacity Centrifuge Rotor: 75006445 Bucket: 75006441 |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | 04 693 116 001 | Protease Inhibitor Tablets |
| Diagenode Bioruptur UCD-200 | Diagenode | UCD-200 | Sonication System |
| Dounce Tissue Grinder (45 mL) | Wheaton | 357546 | Use Loose pestle |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) | Corning | 21-031-CM | |
| Endoplasmic Reticulum Isolation Kit | Sigma Aldrich | ER0100 | For ER kit Extraction: Contains: Isotonic Extraction Buffer 5X 100 mL Hypotonic Extraction Buffer 10 mL Calcium chloride, 2.5 M solution 5 mL OptiPrep Density Gradient Medium 100 mL Blunt Nosed Needle 1 ea. |
| External light source for flourescent excitation | Leica | Leica EL6000 | |
| Hydrochloric acid | Sigma Aldrich | H1758 | Hydrochloric Acid |
| ImageJ | Image Analysis Software | ||
| Inverted Modulating Contrast Microscope | Leica | Leica DM IRB | |
| Lysosome Enrichment Kit for Tissues and Cultured Cells | Thermo Fisher Scientific | 89839 | For Lysosome Isolation |
| Microscope Camera | Qimaging | QICAM fast 1394 | |
| Optima XL-100K Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | XL-100K | Ultracentrifuge Rotor: SW41Ti |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 22-042817 | |
| Petri Dish 5 cm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| PhosSTOP | Sigma Aldrich | 04 906 845 001 | Phosphatase Inhibior Tablets |
| Sterile Surgical Blade #10 | Pioneer | S2646 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | Crystalline/Certified ACS |
| Triglyceride Liquicolor Kit | Stanbio | 2200-225 | Colorimetric Triglyceride kit |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | For TE buffer |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151-100 | 5%, Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether, Protein Lysis Reagent |
| UltraPure EDTA (0.5M, pH 8.0) | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | For TE buffer |
References
- Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Isolation of Lipid Droplets from Cells by Density Gradient Centrifugation. Current Protocols in Cell Biology. 72, (2016).
- Ding, Y., et al. Isolating lipid droplets from multiple species. Nature Protocols. 8 (1), 43-51 (2013).
- Gao, Q., Goodman, J. M. The lipid droplet-a well-connected organelle. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 49 (2015).
- Correnti, J. M., et al. Ethanol and C2 ceramide activate fatty acid oxidation in human hepatoma cells. Scientific Reports. 8 (1), 12923 (2018).
- Williams, B., et al. A novel role for ceramide synthase 6 in mouse and human alcoholic steatosis. FASEB Journal. 32 (1), 130-142 (2018).
- Carr, R. M., Ahima, R. S. Pathophysiology of lipid droplet proteins in liver diseases. Experimental Cell Research. 340 (2), 187-192 (2016).
- Carr, R. M., et al. Perilipin Staining Distinguishes Between Steatosis and Nonalcoholic. Steatohepatitis in Adults and Children. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 15 (1), 145-147 (2017).
- Carr, R. M., et al. Reduction of TIP47 improves hepatic steatosis and glucose homeostasis in mice. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (8), R996-R1003 (2012).
- Carr, R. M., Peralta, G., Yin, X., Ahima, R. S. Absence of perilipin 2 prevents hepatic steatosis, glucose intolerance and ceramide accumulation in alcohol-fed mice. PLoS One. 9 (5), e97118 (2014).
- Tsai, T. H., et al. The constitutive lipid droplet protein PLIN2 regulates autophagy in liver. Autophagy. 13 (7), 1130-1144 (2017).
- Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V. Jr, Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. Journal of Cell Science. 122 (Pt 6), 749-752 (2009).
- Liu, K., Czaja, M. J. Regulation of lipid stores and metabolism by lipophagy. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 3-11 (2013).
- Mannik, J., Meyers, A., Dalhaimer, P. Isolation of cellular lipid droplets: two purification techniques starting from yeast cells and human placentas. Journal of Visualized Experiments. (86), e509814 (2014).
- Sato, S., et al. Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein. Journal of Biochemistry. 139 (5), 921-930 (2006).
- Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R. 3rd, McManaman, J. L. Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells. Electrophoresis. 21 (16), 3470-3482 (2000).
- Zhang, S., et al. Morphologically and Functionally Distinct Lipid Droplet Subpopulations. Scientific Reports. 6, 29539 (2016).
