Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Hurtig Lipid Droplet Isolation protokollen ved hjælp af en almindelig Organelle isolering Kit

Published: April 19, 2019 doi: 10.3791/59290
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Division of Gastroenterology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokol fastsætter en roman metode af lipid droplet isolering og oprensning fra mus lever, ved hjælp af en veletableret endoplasmatiske reticulum isolering kit.

Abstract

Lipid dråber (LDs) er bioaktive organelles fundet i cytosol af den mest eukaryote og nogle Prokaryote celler. LDs er sammensat af neutrale lipider indkapslet af en éncellelag af fosfolipider og proteiner. Hepatisk LD lipider, ceramider og proteiner er involveret i flere sygdomme, der forårsager hepatisk steatose. Selvom tidligere metoder er blevet fastlagt for LD isolation, de kræver en tidskrævende forberedelse af reagenser og er ikke beregnet til isolering af flere subcellulært rum. Vi forsøgte at etablere en ny protokol for at aktivere isolering af LDs, endoplasmatiske reticulum (ER) og lysosomer fra en enkelt mus lever.

Yderligere, alle reagenser, der anvendes i den protokol, der præsenteres her er kommercielt tilgængelige og kræver minimal reagens uden at ofre LD renhed. Her præsenterer vi data sammenligner denne nye protokol til en standard saccharose gradient protokol, demonstrere sammenlignelige renhed, morfologi og udbytte. Derudover kan vi isolere ER og lysosomer ved hjælp af den samme prøve, giver detaljeret indsigt i dannelsen og intracellulære flux af lipider og deres tilknyttede proteiner.

Introduction

LDs er bioaktive organelles fundet i cytosol af mest eukaryote celler og nogle Prokaryote celler1,2,3. LD kernen er sammensat af neutrale lipider som triglycerid (TG) og kolesterol estere. De indeholder også ceramider, bioaktive lipider involveret i cellulære signaling veje4,5. LDs er omgivet af en phospholipid éncellelag og belagt med proteiner, herunder perilipin proteiner perilipin 2 (PLIN2) og 3 (PLIN3)1,5,6. Også til stede er lipogenic enzymer, lipaser og membran menneskehandel proteiner, der har været knyttet til flere hepatisk steatotic sygdomme, herunder ikke-alkoholiske fedtlever sygdom, alkoholisk leversygdom og hepatitis C3,5 ,6,7,8,9,10.

LDs menes at danne fra den ydre membran af Skadestuen og indeholde nyligt syntetiserede TG stammer fra ER-afledte frie fedtsyrer11. Men det er stadig ukendt om de poolede lipider bud, forblive tilsluttet, eller er skåret ud fra de ER6,11, at isolationen af LDs gratis fra ER teknisk udfordrende. Frie fedtsyrer kan blive befriet fra LDs ved hjælp af overflade lipaser at fastsaette energiproduktion eller membran syntese. Derudover kan LDs nedbrydes via lipophagy, som en reguleringsmekanisme og producere frie fedtsyrer12.

Udover ER og lysosomer, findes der andre organeller — som mitokondrier, endosomes, peroxisomer og plasmamembran — der findes inden for nære LDs11. Denne stramme polygami gør det vanskeligt at udføre en ren LD udvinding. Imidlertid kan neutral lipider medfødte lav tæthed udnyttes via centrifugering5.

LDs har traditionelt været isoleret ved hjælp af en saccharose tæthed gradient1,5,13. Men disse metoder ikke er designet til at isolere andre organeller. Desuden kræver de tidskrævende forberedelse af reagenser. Denne protokol tilpasser en kommercielt tilgængelig ER isolering kit (Se Tabel af materialer) for at muliggøre LD isolation. Vi bruger ekstraktionsbuffer leveres af kit, tilføje en LD isolation trin. Protokollen kan desuden også bruges til ER og lysosomale isolation ved hjælp af de samme prøver, giver mulighed for en mere omfattende billede af LDs livscyklus. Hvis du vil validere denne nye metode, assay vi LD udbytte, morfologi, størrelse og renhed. Vi sammenligner resultaterne præsenteres her til dem, der opnås med en udbredte protokol udnytter en saccharose gradient til LD isolation.

Vi brugte en 10 til 12-uger gamle, 20 g kvindelige C57BL/6 mus fastede for 16 h (mad fjernelse i 9:00 A.M. LD isolation tid kl) med fri adgang til vand. Det typiske afkast for TG er 0,6 mg/g lever, og for LD protein, det er 0,25 mg/g lever. Dette giver nok materiale til ~ 10 immunoblots af SDS side. Protokollen under detaljer de reagenser og en protokol, der er egnet til en enkelt 1 g lever. Saccharose gradient isolation protokol er tilpasset fra Sato14 og Wu15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimenter blev udført på et laboratoriebænk med personlige værnemidler, der er relevante for Biosikkerhed niveau 1, herunder en laboratoriekittel, handsker og beskyttelsesbriller. Eksperimenter blev udført efter protokoller, godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) fra University of Pennsylvania. Alle bestræbelser var at minimere animalske ubehag, og dyrene blev behandlet med human pleje.

1. LD isolation ved hjælp af en ER isolering kit

  1. Forberedelse
    NOTE: De anførte beløb er egnet til en enkelt 1 g mus lever.
    1. Forberede 10 mL af 1 x isotonisk ekstraktionsbuffer (IE buffer, fra ER isolering kit) ved fortynding af 2 mL af 5 x IE buffer med 8 mL i ultrarent vand. Cool bufferen ved at placere det på is.
    2. Forberede 100 mL 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS) ved at fortynde 10 mL 10 x PBS i 90 mL i ultrarent vand. Cool det ved at placere det på is.
    3. Forbered 10 mL 5% polyethylen glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl Eter (PGPE) ved at fortynde 500 µL af PGPE i 9,5 mL i ultrarent vand. Bruge en 1 mL sprøjte til at måle ud PGPE, da det er tyktflydende. Cool det ved at placere det på is.
    4. Cool alle rør ved at placere dem på is: 1,7 mL microcentrifuge rør, 15 mL centrifugeglas, 50 mL højhastigheds centrifugeglas og 13 mL ultracentrifuge rør.
    5. Cool alle nødvendige centrifuger til 4 ° C: et microcentrifuge, en høj kapacitet der centrifugeres i 15 mL rør, et højhastighedstog centrifugeres i 50 mL rør og en ultracentrifuge.
    6. Sterilisere pincet og dissektion saks ved autoklavering.
  2. Væv forberedelse
    1. Aflive mus ved at placere det i en sal fyldt med 100% CO2 i 10 min. Bekræft eutanasi ved at udføre cervikal dislokation.
    2. Ved hjælp af steril pincet og dissektion saks, klippe hud og muskel lag af maven på den posteriore/anteriore akse at eksponere leveren.
    3. Skære ledbånd forbinder leveren til mellemgulvet og tarmen. Bruge pincet til at trække i tarmen fra leveren, mod posterior, at eksponere ledbånd.
    4. Snit mellem leveren og den dorsale brystkasse, bevæger sig fra forreste til bageste indtil leveren er befriet.
    5. Overføre leveren til en kold 5 cm petriskål med 10 mL koldt 1 x PBS.
    6. Vaske leveren 2 x på en vuggende platform i 10 mL koldt 1 x PBS i 5 min. ved 4 ° C i 5 cm petriskål. Hæld 1 x PBS efter den sidste vask.
    7. Brug en størrelse-10 steril kirurgiske kniv (Se Tabel af materialer) til terninger leveren i 3 – 5 mm stykker i 5 cm petriskål (figur 1A).
    8. Vaske den hakkede lever 2 x med 10 mL koldt 1 x PBS i 5 min. ved 4 ° C i 5 cm petriskål.
      Bemærk: For lysosomet isolation, overføre 0,5 g af leveren til en ren 45 mL homogeniseringsapparat og følg vejledningen leveres af lysosomet udvinding kit (Se Tabel af materialer).
    9. Dekanteres 1 x PBS og overføre de hakkede lever stykker til de kolde 45 mL Dounce homogeniseringsapparat. Sikre, at alle stykker gå til bunden af homogeniseringsapparat.
    10. Tilføje 7 mL kold 1 x IE buffer (fra ER isolering kit) og homogeniseres på isen ved at flytte pistil op og ned ad 20 x. Sikre at pistil går til bunden af homogeniseringsapparat under hver slagtilfælde.
    11. Overføre homogenatet (figur 1B) til en kold 15 mL centrifugeglas.
    12. Skyl homogeniseringsapparat med 1 mL koldt 1 x IE buffer (fra ER isolering kit) og Tilføj dette til resten af homogenatet.
  3. LD isolation
    1. Fjern kerner ved centrifugering homogenatet i en højkapacitets centrifugen på 1.000 x g i 10 min. ved 4 ° C (figur 1 c).
    2. Overfør postnuclear supernatanten (PNS) til en ny, kold 50 mL-centrifugerør. For at forhindre LD tab, sikre at alle lipid samledes på toppen af 15 mL tube er genopslemmes før du overfører PNS.
    3. Tage en 100 µL alikvot af PNS for renhed analyse og placere den i en kold 1,7 mL microcentrifuge tube. Sæt det til side på is.
    4. Hvis du vil fjerne mitokondrier, centrifugeres PNS prøve, ikke alikvot, i en nedkølet højhastigheds centrifuger på 12.000 x g i 15 min. ved 4 ° C.
      1. Valgfrit: til rå LD (CLD) isolater (med cytosol og cellemembranen forurening), indsamle top lipid lag ved hjælp af et glas pipette og overføre det til en 1,7 mL microcentrifuge tube. Fortsætte til afsnit 1.4.
    5. Overfør postmitochondrial supernatanten (PMS) til et ultracentrifuge rør. For at forhindre LD tab, sikre at alle lipid samledes på toppen er genopslemmes før du overfører PMS.
    6. Tage en 100 µL alikvot af PMS for renhed analyse og placere den i en kold 1,7 mL microcentrifuge tube. Sæt det til side på is.
    7. Fyld en ultracentrifuge tube til randen med koldt 1 x IE buffer til at forhindre røret kollapse under ultracentrifugering.
    8. Balance prøverne og centrifugeres dem i en ultracentrifuge på 100.000 x g for 60 min. ved 4 ° C (figur 1 d).
    9. Hvis du vil fjerne LD lag, tilt rør i en 45° vinkel og bruge glas pipette til Aspirér. Overføre toerstoffet til en kold 1,7 mL microcentrifuge tube.
      Bemærk: Pellet indeholder isolerede ER. Brug denne fraktion neden for ER isoleret.
    10. Indsamle 100 µL af post-ER supernatanten (PER) under lipid lag for renhed analyse.
  4. LD vask
    1. Tilføje 1 x PBS til LD brøkdel indsamlet i en 1,7 microcentrifuge rør, til et samlet volumen på 1,3 mL.
    2. Vortex prøven.
    3. Der centrifugeres i et microcentrifuge på tophastighed i 5 min. ved 4 ° C til at pille enhver celle debris. Varme rør forsigtigt med hænderne til hjælp resuspend LD lag. Overføre supernatanten, herunder lipid lag, til en ny 1,7 mL microcentrifuge tube.
    4. Gentag trin 1.4.1–1.4.3 2 x-3 x, indtil pelleten er ikke længere synlig.
    5. Tilføje 1 x PBS til pellet-fri LD supernatanten til en afsluttende bind af 1,5 mL. Vask lipid brøkdel af centrifugering i en microcentrifuge på tophastighed i 5 min. ved 4 ° C.
    6. Fjerne 1 mL af 1 x PBS (nedenunder lipid lag) med et glas pipette uden at forstyrre lipid lag.
    7. Gentag trin 1.4.5 og 1.4.6 4 x-5 x, indtil 1 x PBS er visuelt gennemsigtig med ingen turbiditet.
    8. Fjern alle 1 x PBS under lipid lag, ved hjælp af et glas pipette (figur 1E).
    9. Brug resultatet, en ren LD brøkdel, for downstream analyse.
  5. LD protein kvantitering af bicinchoninic syre assay
    Bemærk: Brug ikke et bicinchoninic syre assay (BCA) Hvis LD morfologi skal vurderes.
    1. Resuspend LD i 500 μL af 5% PGPE.
    2. Kog prøver for 5 min. ved 95 ° C, vortex dem, og Inkuber prøverne ved stuetemperatur i 5 min. afkøles.
    3. Gentag trin 1.5.2 en ekstra 2 x.
    4. Der sonikeres prøver for 5 min med en 30 s tænd/sluk-cyklus, ved medium intensitet.
    5. Normalisere prøverne ved at måle proteinkoncentration i alle renhed analyse prøver og LD brøkdel af BCA assay.

2. LD isolation ved hjælp af saccharose tæthed farveforløb

  1. Forberedelse
    1. Gøre 200 mL af TE buffer (10 mM Tris-HCl [pH 7,4], 1 mM EDTA [pH 8,0]). Cool det ved at placere det på is.
    2. Fyldes 100 mL af 60% (w/v) rørsukkeropløsning i TE-buffer ved at opløse 60 g saccharose i TE buffer, at bringe de endelige rumfang på 100 mL. Cool det ved at placere det på is.
    3. Gøre 6 mL 40% (w/v) rørsukkeropløsning ved at tilføje 4 mL 60% saccharose til 2 mL af TE buffer. Cool det ved at placere det på is.
    4. Gøre 6 mL 25% (w/v) rørsukkeropløsning ved at tilføje 2,5 mL 60% saccharose 3,5 mL af TE buffer. Cool det ved at placere det på is.
    5. Gøre 4 mL 10% (w/v) rørsukkeropløsning ved at tilføje 0,7 mL 60% saccharose 3,3 mL af TE buffer. Cool det ved at placere det på is.
    6. Gøre 10 mL af protease og fosfatase hæmmer løsning ved at føje én tablet af både protease og fosfatase hæmmere til 10 mL af TE buffer.
    7. Forbered væv homogenatet buffer ved at tilføje 4 mL af protease og fosfatase hæmmer løsning til 50 mL af stamopløsningen 60% saccharose. Cool det ved at placere det på is.
    8. Forberede overlay buffer ved tilsætning 2 mL af protease og fosfatase hæmmer løsning til 50 mL af TE buffer. Cool det ved at placere det på is.
    9. Forberede 100 mL 1 x PBS ved at fortynde 10 mL 10 x PBS i 90 mL i ultrarent vand. Cool det ved at placere det på is.
    10. Forberede 10 mL 5% PGPE ved at fortynde 500 µL af PGPE i 9,5 mL i ultrarent vand. Bruge en 1 mL sprøjte til at måle ud PGPE, da det er tyktflydende. Cool det ved at placere det på is.
    11. Cool de følgende centrifugeglas ved at placere dem på is: 1,7 mL microcentrifuge rør, 15 mL centrifugeglas, 50 mL højhastigheds centrifugeglas og 13 mL ultracentrifuge rør.
    12. Cool de krævede centrifuger til 4 ° C: a microcentrifuge, en høj kapacitet centrifuge (for 15 mL rør), et højhastighedstog centrifuge (til 50 mL rør) og en ultracentrifuge.
  2. Væv forberedelse
    1. Brug trin 1.2.1–1.2.9 at forberede væv til homogenisering.
    2. Tilføje 7 mL kold væv homogenatet buffer og homogeniseres det på isen ved at flytte pistil op og ned ad 20 x. I løbet af de første fem slag, sikre pistil går til bunden af homogeniseringsapparat.
    3. Overførsel af homogenatet til et koldt 15 mL centrifugeglas.
    4. Skyl homogeniseringsapparat med 1 mL koldt væv homogenatet buffer og overføre det til tidligere anvendte 15 mL-centrifugerør.
    5. Bringe mængden af homogenatet op til 10 mL med væv homogenatet buffer.
    6. Centrifugeres prøven i en højkapacitets centrifugen på 1.000 x g i 10 min. ved 4 ° C.
    7. 8 mL af supernatanten overføres til en 50 mL-centrifugerør.
    8. Overfør 100 µL af de resterende supernatanten som PNS prøve for renhed analyse.
  3. Saccharose gradient
    1. Vippe 50 mL-centrifugerør indeholder 8 mL af PNS i en 45° vinkel. Forsigtigt tilføje 6 mL 40% rørsukkeropløsning, at sikre de to faser bo separat.
    2. I en lignende måde, langsomt tilføje 6 mL 25% rørsukkeropløsning; derefter tilsættes 4 mL 10% rørsukkeropløsning; Endelig, tilføje 8 mL af overlay buffer.
    3. Der centrifugeres prøven i et high-speed centrifuge på 30.000 x g ved 4 ° C i 30 min.
    4. Overføre det øverste lag, der indeholder LDs til en 1,7 mL microcentrifuge tube.
    5. LD vask, Følg vejledningen i afsnit 1.4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi har udført LD isolation ER Kit på ca. 30 mus og sammenlignet resultaterne med dem efter saccharose isolation protokol på ca 40 mus. De rapporterede resultater er typiske for begge protokoller. Mus blev fastede natten med fri adgang til vand, til at øge LD udbyttet. LD isolation ved hjælp af en saccharose gradient blev kørt sideløbende med ER kit LD isolation protokol. Prøver af PNS, PMS, PER, CLDs og LDs blev indsamlet i hele ER kit LD isolation protokol. På grund af arbejdsprocessen begrænsning af saccharose isolation protokollen, kun PNS og LD isolatet blev indsamlet.

For fluorescerende mikroskopi, 50 µL af isolerede LDs blev blandet med et lige saa stort volumen af 100 µM 4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene (DPBDI). Prøver var beskyttet mod lys og inkuberes ved stuetemperatur i 30 min. Prøverne blev vasket ved tilsætning af 1 mL af 1 x PBS, efterfulgt af centrifugering og fjernelse af overskydende buffer. LD fraktion, var 1 µL anbringes på et objektglas og coverslipped. Repræsentative 20 x lysstofrør og brightfield LD billeder blev taget fra både ER kit LD isolation og saccharose LD isolation (figur 2A-D) metoder, ved hjælp af en omvendt forskning mikroskop (Se Tabel af materialer). Brightfield billeder viser lignende niveauer af partikler, hvilket tyder på lignende purities ved hjælp af forskellige protokoller.

Bestem forskelle i udbyttet mellem de to protokoller brugte vi sammenligneligt mellemstore mus og musen lever (figur 2EF). Følgende rensning, LD TG og protein niveauer blev målt ved hjælp af kolorimetriske assays (Se Tabel af materialer) og dataene blev normaliseret til leveren vægt (figur 2 gH). Vi fandt, når vi normaliseret råvare, at LD protein og TG udbytte efter LD isolation ved hjælp af ER kit og saccharose var ens. Til at bestemme, hvis LD størrelse var også ens, vi kvantificeret LD diametre bruger billede analyse software (Se Tabel af materialer). LDs varierede fra 0,27 til 6,37 µm. Frekvens fordelingen af LD diameter viser, at de ER kit LD isolation (figur 3A) og saccharose LD isolation (figur 3B) giver LDs af lignende størrelse.

For at vurdere LD renhed, blev prøverne analyseret ved immunoblotting. Et beløb på 20 µg af protein pr. prøve blev analyseret af SDS side. Prøverne blev aftestede med antistof markører for LDs (PLIN2 og PLIN3), ER (Sec61), mitokondrier (VDAC), lysosomer (LAMP1), plasma membran (MEK1), kerner (Histon H3) og cytosol (GAPDH) (figur 4A). PLIN2 blev fundet i alle prøver undtagen ER kit LD isolation PER og den saccharose PNS. LDs stammer fra ER kit LD isolation og saccharose gradient protokollen begge havde lige renhed. Ingen bands dukkede op på Skadestuen (Sec61), mitokondrier (VDAC1), lysosomer (LAMP1), plasma membran (Mek1) eller cytosol (GAPDH). CLD havde plasma membran og cytosol forurening men ingen synlige forurening fra ER, mitokondrier eller lysosomer. Intensiteten af PLIN2 bandet i tilpasset ER protokollen angiver, at ER protokollen haft ca 14-fold højere PLIN2 udtryk i LD-fraktionen i forhold til PNS, mens saccharose protokol havde en seksdobling højere PLIN2 udtryk hos LD brøkdel ( data ikke vist).

Fordi denne protokol har også mulighed for at rense ER og lysosomer, udført vi også western blotting for at vurdere renhedsgraden af disse organeller. Figur 4B viser, at immunoblots af renset ER fra den samme prøve på Skadestuen kit (Se Tabel af materialer) var fri af PLIN2 men havde betydelige niveauer af Skadestuen Sec61A protein. Ved hjælp af den lysosomale berigelse kit (Se Tabel af materialer), lysosomer blev yderligere isoleret og immunoblotted for LD (PLIN2), ER (Sec61A) og lysosomet (LAMP1) markører (figur 4 c). Sammen, disse data viser, at den protokol, der præsenteres her, i kombination med kommercielt tilgængelige lysosomet rensning kits, tillade til ren isolering af leveren LDs, ER og lysosomer fra et enkelt dyr.

Figure 1
Figur 1: Reference billeder taget under den LD isolation ved hjælp af en ER isolering kit . (A) hakkede 5 mm lever stykker i en 5 cm petriskål. (B) lever homogenatet efter homogenisering i en Dounce homogeniseringsapparat. (C) lever homogenatet efter centrifugering ved 1.000 x g; Bemærk det lille lipid lag på toppen, PNS og pellet som indeholder celle debris og nukleare fraktion. (D) LD lag efter ultracentrifugering ved 100.000 x g; Bemærk det fremtrædende lipid lag på toppen, PER, og ER fraktion på bunden. (E) Washed LD brøkdel før den endelige fjernelse af PBS. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Mikrograf og kvantitativ analyse sammenligne LD brøkdel isoleret med en ER kit og LD brøkdel isoleret med saccharose. Repræsentant 20 x fluorescerende Mikrograf af (A) en DPBDI-farvede LD brøkdel isoleret med en ER kit og (B) LDs isoleret med saccharose. (C) Brightfield Mikrograf af LD brøkdel isoleret med en ER kit og (D) LD brøkdel isoleret med saccharose. Skalalinjen = 20 µm. (E) musen vægt og (F) lever vægt. (G) TG udbytte fra renset LDs normaliseret til leveren vægt. (H) Protein udbytte fra renset LDs normaliseret til leveren vægt. Dataene er gennemsnit ± SEM (N = 4). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Hyppighed distribution af LD størrelser. Prøver fra fire forskellige mus var farves med DPBDI og repræsentant 20 x felter blev kvantificeret. Diameteren blev målt ved hjælp af et billede analyse software. (A) hyppighed (fraktion) distribution af en LD brøkdel isoleret ved hjælp af en ER-kit. (B) frekvens (fraktion) distribution af en LD brøkdel isoleret ved hjælp af saccharose gradient tæthed. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: analyse af LD renhed immunoblotting. (A) at sammenligne tilpasset protokollen ER kit LD isolation og saccharose isolation protokol, 20 µg af protein pr. sample var immunoblotted. Følgende prøver blev indlæst: postnuclear supernatanten (PNS), postmitochondrial supernatanten (PMS), postendoplasmic reticulum supernatanten (PER), rå LDs (CLD) og LDs (LD). Prøver var immunoblotted for LDs (PLIN2 og PLIN3), ER (SEC61A), mitokondrier (VDAC1), lysosomet (LAMP1), cellemembranen (MEK1), kerner (Histon H3) og cytosol (GAPDH) markører. (B) renhed analyse af en ER brøkdel efter yderligere rensning af Skadestuen ved hjælp af ER kit LD isolation protokol (Se Tabel af materialer). PNS, PMS, ER og LDs blev indlæst og immunoblotted for LDs (PLIN2) og ER (SEC61A). (C) renhed analyse af en lysosomale brøkdel efter yderligere rensning af lysosomer ved hjælp af lysosomet berigelse kit protokol (Se Tabel af materialer). PNS og en lysosomale brøkdel blev indlæst og immunoblotted for LDs (PLIN2), ER (SEC61A) og lysosomer (LAMP1). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hepatisk LD biologi anerkendes i stigende grad som en kritisk regulator af hepatocellulært fysiologi i både sundhed og sygdom. Som bona fide organeller, LDs er dynamiske, interagere med andre cellulære strukturer og indeholde inden for dem bioaktive komponenter involveret i både lipid og glukose homøostase. Saccharose gradient bruges rutinemæssigt til LD isolation og gør det muligt for efterforskerne at studere LD struktur, men det kræver dem til at gøre mange buffere. Vi har vist, at brug af et kommercielt tilgængelige ER isolering kit er en anden værktøj at kan bruges ikke kun LD isolation men tandem isolation ER og lysosomet, giver mulighed for en mere omfattende visning af cellulære dynamics svar til forskellige eksperimentelle betingelser, uden betydelig forøgelse af arbejdsprocessen.

Styrken af denne nye protokol er er let at opsætning ved hjælp af kommercielt eller let tilgængelige reagenser og dens evne til at isolere flere organeller samtidigt. Men der er potentielle ulemper til denne nye metode til at huske. Flere trin i denne protokol kan ulempe isolering af supersized LDs fra leveren. Dounce homogenisering har potentiale til at forstyrre store LDs gennem shear stress. Et løst montering Dounce homogeniseringsapparat setup kan lindre nogle stress til store LDs. Desuden, en 100.000 x g spin er ansat, giver mulighed for adskillelse af LD og ER. Denne hastighed kan også forårsage tab af store LDs, som én rapport anbefaler 2.000 x g for leveren LD rensning2. En begrænsning af denne procedure er, at det ikke kan bruges til at isolere LDs i forskellige størrelser som nylig beskrevet16. Desuden, selvom saccharose buffere kan holde skrøbelige LDs intakt ved hjælp af blide homogenisering2, udbytter homogenisering med 1 x IE buffer ren LDs med lignende morfologi og størrelse distribution som hidroerer fra saccharose gradient isolation . Yderligere undersøgelse vil være nødvendigt at bestemme, hvis den biologiske aktivitet påvirkes ved brug af en PBS buffer, som er mindre blid end almindeligt anvendt isotonisk buffere2. På grund af disse potentielle begrænsninger, det er kritisk i løbet af de første to centrifuge skridt til fuldt resuspend lipid indsamlet på toppen før overførsel af supernatanten og til at bestemme empirisk effekten af slagtilfælde antallet på LD udbytte for forskellige væv. Leveren protokollen præsenteres her bruger 20 slag, hvilket giver en tilsvarende størrelse distribution til andre offentliggjorte arbejde2.

LD isolation ved hjælp af endoplasmatiske reticulum isolering kit udbytter både rå og ren LD isolater. CLD isolater indeholder cellemembranen og cytosol komponenter, men kan vise sig tilstrækkeligt for nogle programmer, som evalueringen af LD morfologi med mikroskopi. Ren LD isolatet, mangler som bestemmes af PLIN2 udtryk, ER, mitokondrie, lysosomale, cellens membran eller cytosol forurening. Faktisk, den ren isolat fra ER kit LD isolation protokol beriger PLIN2 mere end dobbelt sammenlignet med metoden saccharose LD isolation. Denne forskel var uventet, givet ligheden i protein og TG udbytte, men kan skyldes brugen af PBS som en ophvirvling buffer i modsætning til saccharose eller isotonisk buffer.

LD isolation af traditionelle metoder kan også lider af kontaminering af LD brøkdel af plasma membran2. Selv om denne Co isolation er fælles i alle LD isolation metoder og bør holdes for øje, når analysere LD isolater2, data præsenteres her dokumentere at yderligere ultracentrifugering af CLD isolat rids prøven af sådanne kontaminanter ( Figur 4). Fremtidige tilpasninger kan omfatte anvendelse af en fransk presse eller nitrogen bombe at forstyrre cellemembranen mere forsigtigt og yderligere reducere enhver forurening af CLD isolere2.

Afslutningsvis er ER kit LD isolation metode en roman anvendelse af et almindeligt anvendte cellebiologi værktøj. Denne metode udfører tilsvarende til saccharose gradient isolation, med mindre reagens. Desuden forbedrer medtagelsen af rede reagenser i ER kit LD isolation protokol stringens og reproducerbarhed af forsøgsbetingelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dr. Carr modtager forskningsstøtte fra opfange Pharmaceuticals.

Acknowledgments

Vi takker Abramson familie Cancer Research Institute. Dette arbejde støttes af følgende tilskud: NIH/NIAAA R01 AA026302-01, NIH/NIAAA K08-AA021424, Robert Wood Johnson Foundation, Harold Amos medicinske fakultet udvikling Award, 7158, IDOM DRC Pilot Award P30 DK019525 (R.M.C.); NIH/NIAAA F32-AA024347 (JC). Dette arbejde blev delvist understøttet af NIH P30-DK050306 og dens kerne faciliteter (Molekylær Patologi og Imaging Core, molekylær biologi/gen Expression kerne og celle kultur Core) og dens pilot tilskud program. Indholdet er udelukkende ansvarlig for forfattere og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter af National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BioExpress Vortex Mixer GeneMate S-3200-1 Vortex Mixer
Centrifuge 54242 R Eppendorf 54242 R Refrigerated Counter Microcentrifuge
Rotor: FA-45-24-11
Centrifuge Sorvall RC6 + Thermo Scientific RC6+ Refrigerated High Speed Centrifuge
Rotor: F21S-8x50y
Centrifuge Sorvall Legend RT+ Thermo Scientific Legend RT+ Refrigerated High Capacity Centrifuge
Rotor: 75006445 Bucket: 75006441
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Sigma Aldrich 04 693 116 001 Protease Inhibitor Tablets
Diagenode Bioruptur UCD-200 Diagenode UCD-200 Sonication System
Dounce Tissue Grinder (45 mL) Wheaton 357546 Use Loose pestle
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) Corning 21-031-CM
Endoplasmic Reticulum Isolation Kit Sigma Aldrich ER0100 For ER kit Extraction:
Contains:
Isotonic Extraction Buffer 5X 100 mL
Hypotonic Extraction Buffer 10 mL
Calcium chloride, 2.5 M solution 5 mL
OptiPrep Density Gradient Medium 100 mL
Blunt Nosed Needle 1 ea.
External light source for flourescent excitation Leica Leica EL6000
Hydrochloric acid Sigma Aldrich H1758 Hydrochloric Acid
ImageJ Image Analysis Software
Inverted Modulating Contrast Microscope Leica Leica DM IRB
Lysosome Enrichment Kit for Tissues and Cultured Cells Thermo Fisher Scientific 89839 For Lysosome Isolation
Microscope Camera Qimaging QICAM fast 1394
Optima XL-100K Ultracentrifuge Beckman-Coulter XL-100K Ultracentrifuge
Rotor: SW41Ti
Pasteur Pipettes Fisher Scientific 22-042817
Petri Dish 5 cm Fisher Scientific FB0875713A
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23225
PhosSTOP Sigma Aldrich 04 906 845 001 Phosphatase Inhibior Tablets
Sterile Surgical Blade #10 Pioneer S2646
Sucrose Fisher Scientific S5-500 Crystalline/Certified ACS
Triglyceride Liquicolor Kit Stanbio  2200-225 Colorimetric Triglyceride kit
Tris Base Fisher Scientific BP152-1 For TE buffer
Triton X-100 Fisher BioReagents BP151-100 5%, Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether, Protein Lysis Reagent
UltraPure EDTA (0.5M, pH 8.0) Thermo Fisher Scientific 15575-038 For TE buffer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Isolation of Lipid Droplets from Cells by Density Gradient Centrifugation. Current Protocols in Cell Biology. 72, (2016).
  2. Ding, Y., et al. Isolating lipid droplets from multiple species. Nature Protocols. 8 (1), 43-51 (2013).
  3. Gao, Q., Goodman, J. M. The lipid droplet-a well-connected organelle. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 49 (2015).
  4. Correnti, J. M., et al. Ethanol and C2 ceramide activate fatty acid oxidation in human hepatoma cells. Scientific Reports. 8 (1), 12923 (2018).
  5. Williams, B., et al. A novel role for ceramide synthase 6 in mouse and human alcoholic steatosis. FASEB Journal. 32 (1), 130-142 (2018).
  6. Carr, R. M., Ahima, R. S. Pathophysiology of lipid droplet proteins in liver diseases. Experimental Cell Research. 340 (2), 187-192 (2016).
  7. Carr, R. M., et al. Perilipin Staining Distinguishes Between Steatosis and Nonalcoholic. Steatohepatitis in Adults and Children. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 15 (1), 145-147 (2017).
  8. Carr, R. M., et al. Reduction of TIP47 improves hepatic steatosis and glucose homeostasis in mice. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (8), R996-R1003 (2012).
  9. Carr, R. M., Peralta, G., Yin, X., Ahima, R. S. Absence of perilipin 2 prevents hepatic steatosis, glucose intolerance and ceramide accumulation in alcohol-fed mice. PLoS One. 9 (5), e97118 (2014).
  10. Tsai, T. H., et al. The constitutive lipid droplet protein PLIN2 regulates autophagy in liver. Autophagy. 13 (7), 1130-1144 (2017).
  11. Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V. Jr, Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. Journal of Cell Science. 122 (Pt 6), 749-752 (2009).
  12. Liu, K., Czaja, M. J. Regulation of lipid stores and metabolism by lipophagy. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 3-11 (2013).
  13. Mannik, J., Meyers, A., Dalhaimer, P. Isolation of cellular lipid droplets: two purification techniques starting from yeast cells and human placentas. Journal of Visualized Experiments. (86), e509814 (2014).
  14. Sato, S., et al. Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein. Journal of Biochemistry. 139 (5), 921-930 (2006).
  15. Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R. 3rd, McManaman, J. L. Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells. Electrophoresis. 21 (16), 3470-3482 (2000).
  16. Zhang, S., et al. Morphologically and Functionally Distinct Lipid Droplet Subpopulations. Scientific Reports. 6, 29539 (2016).

Tags

Biologi spørgsmålet 146 Lipid droplet isolation lever perilipin 2 endoplasmatiske reticulum saccharose gradient isotonisk ekstraktionsbuffer
Hurtig Lipid Droplet Isolation protokollen ved hjælp af en almindelig Organelle isolering Kit
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brettschneider, J., Correnti, J. M., … More

Brettschneider, J., Correnti, J. M., Lin, C., Williams, B., Oranu, A., Kuriakose, A., McIver-Jenkins, D., Haba, A., Kaneza, I., Jeon, S., Scorletti, E., Carr, R. M. Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit. J. Vis. Exp. (146), e59290, doi:10.3791/59290 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter