Summary
Questo protocollo stabilisce un metodo novello di isolamento della gocciolina del lipido e la purificazione dai fegati del topo, utilizzando un kit di isolamento ben consolidata del reticolo endoplasmatico.
Abstract
Le goccioline del lipido (LDs) sono organelli bioattivi trovati all'interno del citosol delle più eucariotiche e alcune cellule procariotiche. LDs sono composte di lipidi neutri, racchiusi da un monostrato di fosfolipidi e proteine. Lipidi epatici di LD, come ceramidi e proteine sono implicati in diverse patologie che causano steatosi epatica. Anche se i metodi precedenti sono stati stabiliti per l'isolamento di LD, richiedono una lunga preparazione dei reagenti e non sono progettati per l'isolamento di più compartimenti subcellulari. Abbiamo cercato di stabilire un nuovo protocollo per consentire l'isolamento di LDs, reticolo endoplasmico (ER) e lisosomi da un fegato del mouse.
Ulteriormente, tutti i reagenti utilizzati nel protocollo presentato qui sono commercialmente disponibili e richiedono una preparazione minima reagente senza sacrificare la purezza di LD. Qui presentiamo i dati che confrontano questo nuovo protocollo per un protocollo di gradiente di saccarosio standard, dimostrando la resa, la morfologia e la purezza paragonabile. Inoltre, possiamo isolare ER e lisosomi utilizzando lo stesso esempio, fornendo informazioni dettagliate sulla formazione e flusso intracellulare di lipidi e le proteine associate.
Introduction
LDs sono organelli bioattivi trovati nel citosol delle cellule eucariotiche più e alcune cellule procariotiche1,2,3. Il nucleo di LD è composto da lipidi neutri come esteri del colesterolo e del trigliceride (TG). Inoltre contengono ceramidi, lipidi bioattivi coinvolti nella segnalazione cellulare vie4,5. LDs sono circondati da un monostrato di fosfolipidi e rivestito con proteine, tra cui la perilipina proteine perilipina 2 (PLIN2) e 3 (PLIN3)1,5,6. Sono presenti anche enzimi lipogenic, lipasi e proteine traffico di membrana che sono state collegate a parecchie malattie steatotic epatiche, tra cui la steatosi epatica, epatopatia alcolica e l'epatite C3,5 ,6,7,8,9,10.
LDs sono pensati per formare dalla membrana esterna dell'ER e contengono recentemente sintetizzato TG provenienti da ER-derivati di acidi grassi liberi11. Tuttavia, rimane sconosciuto se i lipidi in pool bud, rimanere connessi, o sono asportati dal ER6,11, rendendo l'isolamento di LDs esente da ER tecnicamente impegnativi. Gli acidi grassi liberi possono essere liberati da LDs dall'azione delle lipasi superficie per fornire per la produzione di energia o sintesi della membrana. Inoltre, LDs può essere degradata tramite lipophagy come un meccanismo di regolamentazione e di produrre acidi grassi liberi12.
Oltre alla ER e lisosomi, ci sono altri organelli — come i mitocondri, gli endosomi, peroxisomes e membrana plasmatica — che si trovano all'interno di stretta associazione di LDs11. Questa stretta poligamia rende difficile effettuare un'estrazione di LD pura. Tuttavia, densità bassa innata dei lipidi neutri può essere sfruttato tramite centrifugazione5.
Tradizionalmente, LDs sono state isolate utilizzando un saccarosio densità gradiente1,5,13. Tuttavia, questi metodi non sono stati progettati per isolare altri organelli. Inoltre, essi richiedono la preparazione che richiede tempo di reagenti. Questo protocollo si adatta un isolamento di ER disponibile in commercio kit (vedere la Tabella materiali) per consentire l'isolamento di LD. Usiamo il tampone di estrazione fornito dal kit, aggiunta di un passaggio di isolamento di LD. Inoltre, il protocollo può essere utilizzato anche per ER e lysosomal isolamento utilizzando gli stessi campioni, permettendo per un'immagine più completa del ciclo di vita di LDs. Per convalidare questo nuovo metodo, analisi di rendimento LD, morfologia, dimensioni e purezza. Confrontiamo i risultati presentati qui a quelli ottenuti con un protocollo ampiamente utilizzato utilizzando un gradiente di saccarosio per l'isolamento di LD.
Abbiamo usato un 10 a 12-week-old, mouse C57BL/6 femminile 20g digiunato per 16 h (rimozione di cibo alle 17 per un periodo di isolamento di 9 LD) con libero accesso all'acqua. La resa tipica per TG è di 0,6 mg/g di fegato, e per la proteina di LD, è 0,25 mg/g di fegato. Questo fornisce abbastanza materiale per ~ 10 immunoblots di SDS PAGE. Il protocollo sotto i dettagli dei reagenti utilizzati e un protocollo adatto per un singolo 1 g di fegato. Il protocollo di isolamento gradiente di saccarosio è adattato da Sato14 e Wu15.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sono stati condotti su un banco di laboratorio con dispositivi di protezione individuale appropriati per livello di biosicurezza 1, compreso un camice da laboratorio, guanti e occhiali di sicurezza. Gli esperimenti sono stati eseguiti secondo i protocolli approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) dell'Università della Pennsylvania. Tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre al minimo il disagio degli animali, e gli animali sono stati trattati con un'assistenza umana.
1. isolamento LD utilizzando un kit di isolamento ER
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Preparazione
Nota: Gli importi elencati sono adatti per un singolo 1 g di fegato di topo.- Preparare 10 mL di tampone di estrazione isotonica 1 x (buffer di IE, dal kit di isolamento ER) diluendo 2 mL di buffer di IE 5 x con 8 mL di acqua ultrapura. Raffreddare il buffer mettendo sul ghiaccio.
- Preparare 100 mL di tampone fosfato salino (PBS): 1x diluendo 10 mL di PBS 1x 10 in 90 mL di acqua ultrapura. Raffreddarlo mettendolo sul ghiaccio.
- Preparare 10 mL di 5% polietilene glicole p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-fenil etere (PGPE) diluendo 500 µ l di PGPE in 9,5 mL di acqua ultrapura. Utilizzare una siringa da 1 mL per misurare fuori PGPE in quanto è viscoso. Raffreddarlo mettendolo sul ghiaccio.
- Lasciare raffreddare tutte le provette posizionandoli sul ghiaccio: microcentrifuga 1,7 mL, provette per centrifuga da 15 mL, provette da 50 mL Centrifuga ad alta velocità e 13ml ultracentrifuga tubi.
- Fresco di tutte le necessarie centrifughe a 4 ° c: una microcentrifuga, una centrifuga ad alta capacità per 15 mL provette, una centrifuga ad alta velocità per provette da 50 mL e un'ultracentrifuga.
- Sterilizzare in autoclave forbici pinze e dissezione.
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Preparazione tessuto
- Eutanasia il mouse collocandolo in una camera piena di 100% CO2 per 10 min. Confirm eutanasia eseguendo dislocazione cervicale.
- Utilizzando pinze sterili e dissezione Forbici, tagliare gli strati di pelle e muscoli dell'addome sull'asse posteriore/anteriore per esporre il fegato.
- Tagliare i legamenti che collega il fegato al diaframma e intestino. Utilizzare pinze per tirare l'intestino dal fegato, verso il posteriore, per esporre i legamenti.
- Taglio tra il fegato e la gabbia toracica dorsale, lo spostamento dall'anteriore al posteriore fino a quando il fegato è liberato.
- Trasferire il fegato a un freddo 5cm Petri con 10 mL di PBS 1X freddo.
- Lavare il fegato 2 x su una piattaforma a dondolo in 10 mL di PBS 1X freddo per 5 min a 4 ° C ai 5 cm di Petri. Versa di PBS 1X dopo il lavaggio finale.
- Utilizzare una lama chirurgica sterile di dimensione-10 (Vedi la Tabella materiali) a dadi il fegato in pezzi di 3 – 5 mm nei 5 cm di Petri (Figura 1A).
- Lavare il fegato tagliato a dadini 2 x 10 ml di PBS 1X freddo per 5 min a 4 ° C ai 5 cm di Petri.
Nota: Per l'isolamento del lisosoma, trasferire 0,5 g di fegato di un omogeneizzatore 45ml pulito e seguire le indicazioni fornite dall'estrazione lisosoma kit (vedere la Tabella materiali). - Decantare 1X PBS e trasferire i pezzi di fegato a dadini al freddo 45 mL lisata omogeneizzatore. Garantire che tutti i pezzi vanno fino in fondo l'omogeneizzatore.
- Aggiungere 7 mL di tampone di IE 1x freddo (dal kit di isolamento ER) e omogeneizzare il ghiaccio spostando il pestello su e giù per 20 volte. Assicurarsi che il pestello vada fino in fondo l'omogeneizzatore durante ogni corsa.
- Trasferire l'omogeneizzato (Figura 1B) a una centrifuga a freddo 15 mL.
- Sciacquare l'omogeneizzatore con 1 mL di freddo 1x buffer di IE (dal kit di isolamento ER) e aggiungere questo al resto dell'omogenato.
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Isolamento di LD
- Rimuovere i nuclei mediante centrifugazione l'omogeneizzato in una centrifuga ad alta capacità a 1.000 x g per 10 min a 4 ° C (Figura 1).
- Trasferire il surnatante postnuclear (PNS) a un nuovo, freddo 50ml centrifuga. Per evitare perdita di LD, assicurarsi che qualsiasi dei lipidi raccolti nella parte superiore del tubo da 15 mL sono risospeso prima di trasferire il PNS.
- Prendere un 100 µ l aliquota del PNS per analisi della purezza e inserirlo in un tubo del microcentrifuge freddo 1,7 mL. Metterlo sul ghiaccio.
- Per rimuovere i mitocondri, centrifugare il campione PNS, non l'aliquota, in una centrifuga refrigerata ad alta velocità a 12.000 x g per 15 min a 4 ° C.
- Optional: per grezzo LD (CLD) isolati (con contaminazione cytosol e membrana cellulare), raccogliere il mantello lipidico superiore utilizzando una pipetta di vetro e trasferirlo in una provetta da microcentrifuga 1,7 mL. Continuare a sezione 1.4.
- Trasferire il surnatante postmitochondrial (PMS) in una provetta ultracentrifuga. Per evitare la perdita di LD, assicurarsi che qualsiasi dei lipidi raccolti nella parte superiore sono risospeso prima di trasferire il PMS.
- Prendere un 100 µ l aliquota delle POM per analisi della purezza e inserirlo in un tubo del microcentrifuge freddo 1,7 mL. Metterlo sul ghiaccio.
- Riempire una provetta ultracentrifuga fino all'orlo con freddo 1x IE per evitare che il tubo di collassare durante ultracentrifugazione.
- Bilanciare i campioni e li centrifugare in un'ultracentrifuga a 100.000 x g per 60 min a 4 ° C (Figura 1).
- Per rimuovere lo strato di LD, inclinare il tubo ad angolo di 45° e utilizzare una pipetta di vetro per aspirare. Trasferire il pellet a un tubo del microcentrifuge freddo 1,7 mL.
Nota: Il pellet contiene ER isolato. Utilizzare questa frazione a valle per l'isolamento di ER. - Raccogliere 100 µ l del surnatante post-ER (PER) sotto lo strato lipidico per analisi della purezza.
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Lavaggio di LD
- Aggiungere 1X PBS per la frazione di LD raccolta in un tubo del microcentrifuge 1,7, per un volume totale di 1,3 mL.
- Vortexare il campione.
- Centrifugare in una microcentrifuga alla massima velocità per 5 min a 4 ° C a pellet eventuali detriti cellulari. Riscaldare il tubo delicatamente con le mani per aiutare Risospendere lo strato di LD. Trasferire il surnatante, compreso lo strato lipidico, ad un nuovo tubo del microcentrifuge 1,7 mL.
- Ripetere i passaggi 1.4.1–1.4.3 2x x-3, fino a che il pellet non è più visibile.
- Aggiungere 1X PBS per il LD privo di pellet surnatante ad un volume finale di 1,5 mL. Lavare la frazione lipidica mediante centrifugazione in una microcentrifuga alla massima velocità per 5 min a 4 ° C.
- Rimuovere 1 mL di 1X PBS (sotto lo strato lipidico) con una pipetta di vetro senza alterare lo strato lipidico.
- Ripetere i passaggi 1.4.5 e 1.4.6 4x x-5, fino a quando il PBS 1X è visivamente trasparente con nessuna torbidità.
- Rimuovere tutti i PBS 1X sotto lo strato lipidico, utilizzando una pipetta di vetro (Figura 1E).
- Il risultato, una frazione pura di LD, utilizzato per l'analisi a valle.
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Quantificazione della proteina LD di dosaggio acido bicinconinico
Nota: Non utilizzare un dosaggio di acido bicinconinico (BCA) se morfologia LD deve essere valutata.- Risospendere il LD in 500 μL di PGPE 5%.
- Bollire i campioni per 5 min a 95 ° C, vortice e incubare i campioni a temperatura ambiente per 5 minuti raffreddare.
- Ripetere il passaggio 1.5.2 un addizionale x 2.
- Sottoporre ad ultrasuoni i campioni per 5 min con un 30 s on/off del ciclo, a media intensità.
- Normalizzare i campioni misurando la concentrazione nella proteina in tutti i campioni di analisi di purezza e nella frazione di LD dall'analisi di BCA.
2. isolamento LD mediante gradiente di densità di saccarosio
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Preparazione
- Fare 200 mL di buffer di TE (10 mM Tris-HCl [pH 7.4], 1 mM EDTA [pH 8,0]). Raffreddarlo mettendolo sul ghiaccio.
- Fai 100 mL di soluzione di saccarosio al 60% (p/v) in buffer di TE da sciogliere 60 g di saccarosio in buffer di TE, portando il volume finale a 100 mL. Raffreddarlo mettendolo sul ghiaccio.
- Fare 6 mL di soluzione di saccarosio al 40% (p/v) con l'aggiunta di 4 mL di saccarosio al 60% a 2 mL di buffer di TE. Raffreddarlo mettendolo sul ghiaccio.
- Fare 6 mL di soluzione di saccarosio al 25% (p/v) con l'aggiunta di 2,5 mL di saccarosio al 60% a 3,5 mL di buffer di TE. Raffreddarlo mettendolo sul ghiaccio.
- Fai 4 mL di soluzione di saccarosio al 10% (p/v) aggiungendo 0,7 mL di saccarosio al 60% a 3,3 mL di buffer di TE. Raffreddarlo mettendolo sul ghiaccio.
- Fai 10 mL di soluzione di inibitore di proteasi e fosfatasi aggiungendo una compressa di inibitori di proteasi e la fosfatasi a 10 mL di buffer di TE.
- Preparare buffer di omogenato di tessuto con l'aggiunta di 4 mL di soluzione di inibitore di proteasi e fosfatasi a 50 mL di soluzione madre di 60% saccarosio. Raffreddarlo mettendolo sul ghiaccio.
- Preparare il tampone di sovrapposizione con l'aggiunta di 2 mL di soluzione di inibitore di proteasi e fosfatasi a 50 mL di buffer di TE. Raffreddarlo mettendolo sul ghiaccio.
- Preparare 100 mL di 1X PBS diluendo 10 mL di PBS 1x 10 in 90 mL di acqua ultrapura. Raffreddarlo mettendolo sul ghiaccio.
- Preparare 10 mL di 5% PGPE di diluzione 500 µ l di PGPE in 9,5 mL di acqua ultrapura. Utilizzare una siringa da 1 mL per misurare fuori PGPE in quanto è viscoso. Raffreddarlo mettendolo sul ghiaccio.
- Raffreddare i seguenti provette da centrifuga posizionandoli sul ghiaccio: microcentrifuga 1,7 mL, provette per centrifuga da 15 mL, provette da 50 mL Centrifuga ad alta velocità e 13ml ultracentrifuga tubi.
- Raffreddare le centrifughe necessarie a 4 ° c: in una microcentrifuga, una centrifuga ad alta capacità (per provette da 15 mL), una centrifuga ad alta velocità (per provette da 50 mL) e un'ultracentrifuga.
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Preparazione tessuto
- Utilizzare 1.2.1–1.2.9 passaggi per preparare il tessuto per omogeneizzazione.
- Aggiungere 7 mL di tampone di omogenato di tessuto freddo e omogeneizzare esso su ghiaccio spostando il pestello su e giù per 20 volte. Durante i primi cinque tratti, garantire che il pestello va fino in fondo l'omogeneizzatore.
- Trasferire l'omogeneizzato a una centrifuga a freddo 15 mL.
- Sciacquare l'omogeneizzatore con 1 mL di tampone di omogenato di tessuto freddo e trasferirlo in provetta centrifugo 15ml utilizzato in precedenza.
- Portare il volume dell'omogenato fino a 10 mL con buffer di omogenato di tessuto.
- Centrifugare il campione in una centrifuga ad alta capacità a 1.000 x g per 10 min a 4 ° C.
- Trasferimento 8 mL di surnatante in una provetta da centrifuga 50 mL.
- Trasferire 100 µ l del surnatante rimanente come campione PNS per analisi della purezza.
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Gradiente di saccarosio
- Inclinare la provetta da centrifuga 50 mL contenente 8 mL di PNS un'angolazione di 45°. Aggiungere con cautela 6 mL di soluzione di saccarosio al 40%, garantendo che le due fasi soggiorno separate.
- In modo simile, lentamente aggiungere 6 mL di soluzione di saccarosio al 25%; quindi, aggiungere 4 mL di soluzione di saccarosio al 10%; Infine, aggiungere 8 mL di tampone di sovrapposizione.
- Centrifugare il campione in una centrifuga ad alta velocità a 30.000 x g a 4 ° C per 30 min.
- Trasferire lo strato superiore contenente il LDs per un tubo del microcentrifuge 1,7 mL.
- Per il lavaggio di LD, attenersi alla procedura nella sezione 1.4.
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Representative Results
Abbiamo effettuato l'isolamento di LD con il kit ER su circa 30 topi e confrontato i risultati con quelli che seguono il protocollo di isolamento del saccarosio su circa 40 topi. I risultati segnalati sono tipici per entrambi i protocolli. Topi sono stati tenuti a digiuno durante la notte con libero accesso all'acqua, per aumentare il rendimento di LD. Isolamento di LD utilizzando un gradiente di saccarosio è stato eseguito in parallelo con il kit di ER protocollo di isolamento del LD. Campioni di PNS, PMS, PER, epatopatie e LDs sono stati raccolti in tutto il kit ER protocollo di isolamento del LD. A causa della restrizione del flusso di lavoro del protocollo di isolamento di saccarosio, sono stati raccolti solo l'isolato di PNS e LD.
Per microscopia fluorescente, 50 µ l di LDs isolato sono stati mescolati con un volume uguale di 100 µM 4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene (DPBDI). I campioni erano al riparo dalla luce e incubati a temperatura ambiente per 30 min. I campioni sono stati lavati con l'aggiunta di 1 mL di PBS 1X, seguita da centrifugazione e la rimozione del tampone in eccesso. Della frazione LD, 1 µ l è stata posta su un vetrino da microscopio e coperti con. Rappresentante 20x immagini LD fluorescenti e campo chiaro sono state prese da sia l'isolamento di kit LD ER e saccarosio LD (Figura 2A-D) metodi, utilizzando un microscopio invertito ricerca (Vedi la Tabella materiali). Le immagini di campo chiaro rivelano simili livelli di particolato, suggerendo purezze simile utilizzando protocolli diversi.
Per determinare le differenze di resa tra i due protocolli, abbiamo usato topi di dimensioni comparabili e fegati del topo (Figura 2EF). Seguenti livelli di purificazione, LD TG e proteina sono stati misurati utilizzando saggi colorimetrici (Vedi la Tabella materiali) e i dati sono stati normalizzati al peso del fegato (Figura 2H). Abbiamo trovato, quando abbiamo normalizzato il materiale di partenza, che la proteina di LD e TG resa dopo isolamento LD utilizzando il kit di ER e saccarosio erano simili. Per determinare se la dimensione di LD era inoltre simile, abbiamo quantificato diametri LD utilizzando software di analisi di immagine (Vedi la Tabella materiali). LDs ha variato da 0,27 a 6,37 µm. La distribuzione di frequenza di diametro LD Mostra che l'isolamento di kit LD ER (Figura 3A) e saccarosio LD (Figura 3B) rendimento LDs di dimensioni simili.
Per valutare la purezza di LD, i campioni sono stati analizzati dall'immunoblotting. Un importo di 20 µ g di proteine per esempio è stato analizzato mediante SDS PAGE. I campioni sono stati sondati con marcatori di anticorpo per LDs (PLIN2 e PLIN3), ER (Sec61), mitocondri (VDAC), i lisosomi (LAMP1), membrana plasmatica (MEK1), nei nuclei (istone H3) e citosol (GAPDH) (Figura 4A). PLIN2 è stato rilevato in tutti i campioni tranne il kit ER isolamento LD PER e PNS di saccarosio. Il LDs derivato dal kit ER isolamento LD e il saccarosio di gradiente protocollo entrambi aveva purezza uguale. Nessuna band è apparso per ER (Sec61), mitocondri (VDAC1), i lisosomi (LAMP1), membrana plasmatica (Mek1) o nel citosol (GAPDH). Il CLD aveva della membrana plasmatica e citosol contaminazione ma nessuna contaminazione evidente dall'ER, i mitocondri o i lisosomi. L'intensità della banda PLIN2 nel protocollo adattato ER indica che il protocollo di ER ha avuto un' più alta espressione di PLIN2 circa 14-fold nella frazione di LD confrontata con il PNS, mentre il protocollo di saccarosio ha avuto un' più alta espressione di PLIN2 del sixfold nel LD (frazione dati non mostrati).
Perché questo protocollo ha anche la possibilità di purificare ER e lisosomi, abbiamo anche effettuato western blotting per valutare la purezza di questi organelli. Figura 4B Mostra che i immunoblots di ER purificata dallo stesso campione utilizzando ER kit (vedere la Tabella materiali) era liberi di PLIN2 ma aveva livelli significativi della proteina ER Sec61A. Utilizzando l'arricchimento lysosomal kit (vedere la Tabella materiali), i lisosomi sono state ulteriormente isolato e immunoblotted per LD (PLIN2), ER (Sec61A) e marcatori lisosoma (LAMP1) (Figura 4). Insieme, questi dati mostrano che il protocollo presentato qui, in combinazione con il kit di purificazione del lisosoma commercialmente disponibili, consentono l'isolamento puro del fegato LDs, ER e lisosomi da un singolo animale.
Figura 1: riferimento foto scattate durante il Isolamento di LD utilizzando un kit di isolamento ER . (A) a dadini 5 mm del fegato pezzi in una capsula di Petri di 5 cm. (B) omogenato di fegato dopo omogeneizzazione in un omogeneizzatore lisata. (C) omogenato di fegato dopo centrifugazione a 1.000 x g; Si noti lo strato lipidico lieve sulla parte superiore, il PNS e il pellet contenente detriti cellulari e frazione nucleare. (D) LD strato dopo ultracentrifugazione a 100.000 x g; Si noti lo strato lipidico prominente sulla parte superiore, il PER e la frazione di ER sul fondo. (E) lavato LD frazione prima della rimozione definitiva di PBS. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: microfotografia e analisi quantitativa confrontando la frazione di LD isolato con un kit di ER e la frazione di LD isolato con saccarosio. Rappresentante 20 x fluorescente micrografo di (A), una frazione di LD DPBDI-macchiato isolato con un kit di ER e LDs (B) isolato con saccarosio. (C) campo chiaro Micrografo della frazione LD isolato con un kit di ER e (D) la frazione di LD isolata con saccarosio. La barra della scala = 20 µm. (E) peso del Mouse e (F) peso del fegato. (G), TG resa da LDs purificata normalizzata per il peso del fegato. Proteina (H) resa da LDs purificata normalizzata per il peso del fegato. I dati sono la media ± SEM (N = 4). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Distribuzione di frequenza delle dimensioni LD. Campioni provenienti da quattro diversi topi erano macchiati con DPBDI e rappresentante x 20 campi sono stati quantificati. I diametri sono stati misurati utilizzando un software di analisi di immagine. (A) distribuzione di frequenza (frazione) di una frazione di LD isolata utilizzando un kit di ER. (B) distribuzione di frequenza (frazione) di una frazione di LD isolata utilizzando densità gradiente di saccarosio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: analisi della purezza, LD in immunoblotting. (A) per confrontare il protocollo adattato dell'isolamento kit LD ER e il protocollo di isolamento del saccarosio, 20 µ g di proteine per esempio era immunoblotted. Negli esempi seguenti sono stati caricati: postnuclear surnatante (PNS), postmitochondrial surnatante (PMS), surnatante del reticolo postendoplasmic (PER), greggio LDs (CLD) e LDs (LD). I campioni erano immunoblotted per LDs (PLIN2 e PLIN3), ER (SEC61A), mitocondri (VDAC1), lisosoma (LAMP1), membrana cellulare (MEK1), nuclei (istone H3) e marcatori citosol (GAPDH). (B) analisi della purezza di una frazione di ER dopo ulteriore purificazione dell'ER utilizzando l'isolamento di kit LD ER protocollo (Vedi la Tabella materiali). PNS, PMS, ER e LDs sono stati caricati e immunoblotted per LDs (PLIN2) ed ER (SEC61A). (C) analisi della purezza di una frazione lisosomiale dopo ulteriore purificazione dei lisosomi utilizzando il kit di arricchimento del lisosoma protocollo (Vedi la Tabella materiali). PNS e una frazione lisosomiale sono stati caricati e immunoblotted per LDs (PLIN2), ER (SEC61A) e lisosomi (LAMP1). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Biologia di LD epatica sempre più sta riconoscenda come regolatore critico della fisiologia epatocellulare in salute e malattia. Come buona fede organelli, LDs sono dinamici, interagire con altre strutture cellulari e contengono all'interno dei loro componenti bioattivi coinvolti nell'omeostasi del glucosio e del lipido. Il gradiente di saccarosio è usato ordinariamente per l'isolamento di LD e consente ai ricercatori di studiare la struttura della LD, ma richiede loro di fare numerosi buffer. Abbiamo dimostrato che l'uso di un kit di isolamento ER disponibile in commercio è un altro strumento che può essere utilizzato per l'isolamento di LD non solo, ma per l'isolamento del tandem di ER e lisosoma, consentendo una visione più completa della dinamica cellulare in risposta alle diverse condizioni sperimentali, senza significativo aumento nel flusso di lavoro.
La forza di questo nuovo protocollo è la sua facilità di installazione utilizzando commercialmente o reagenti prontamente disponibili e la capacità di isolare gli organelli multipli simultaneamente. Tuttavia, ci sono potenziali inconvenienti di questo nuovo metodo da tenere a mente. Diversi punti in questo protocollo possono svantaggiare l'isolamento di supersized LDs dal fegato. Lisata omogeneizzazione ha il potenziale per distruggere grandi LDs attraverso la sollecitazione di taglio. Un raccordo senza bloccare installazione omogeneizzatore lisata può alleviare alcuni degli stress a grandi LDs. Inoltre, è impiegato un 100.000 x g spin, consentendo per la separazione di LD ed ER. Questa velocità può anche causare una perdita di grandi LDs, come raccomanda una relazione 2.000 x g per fegato LD purificazione2. Una limitazione di questa procedura è che non può essere utilizzato per isolare LDs di diverse dimensioni come recentemente descritto16. Inoltre, anche se il buffer di saccarosio può mantenere intatta attraverso l'uso di omogeneizzazione delicata2LDs fragile, omogeneizzazione con tampone IE 1x produce puro LDs con la simile morfologia e distribuzione delle dimensioni come quelli derivati dall'isolamento di gradiente di saccarosio . Ulteriore studio è necessario per determinare se l'attività biologica è influenzata dall'uso di un tampone PBS, che è meno dolce che comunemente usato isotonico buffer2. A causa di queste limitazioni potenziali, è fondamentale durante i primi passi di due centrifuga per risospendere completamente il lipido raccolto in cima prima di trasferire il surnatante e determinare empiricamente l'effetto del numero di colpo sulla resa LD per diversi tessuti. Il protocollo del fegato presentato qui utilizza 20 colpi, ottenendo una distribuzione di dimensioni paragonabili ad altri lavori pubblicati2.
Isolamento di LD utilizzando il kit di isolamento del reticolo endoplasmatico produce isolati di LD sia grezzi e puri. CLD isolati contengono componenti cytosol e membrana cellulare ma potrebbero rivelarsi sufficienti per alcune applicazioni, come la valutazione della morfologia di LD con microscopia. L'isolato di LD puro, come determinato dall'espressione di PLIN2, manca ER, membrana cellulare mitocondriale, lisosomiale o contaminazione del citosol. Infatti, l'isolato puro dal kit ER protocollo di isolamento del LD arricchisce PLIN2 più che doppia rispetto al metodo di isolamento di saccarosio LD. Questa differenza è stata inaspettata, data l'analogia nella proteina e TG resa, ma può essere dovuto l'uso di PBS come un tampone di risospensione in contrasto con saccarosio o buffer isotonico.
Isolamento di LD con metodi tradizionali può anche soffrire di contaminazione della frazione LD nella membrana plasmatica2. Anche se questo Co-isolamento è comune in tutti i metodi di isolamento di LD e dovrebbe essere tenuto presente quando analizzando LD isolati2, i dati presentati qui dimostrano che ulteriore ultracentrifugazione dell'isolato CLD sbarazza il campione di tali contaminanti ( Figura 4). Futuri adattamenti possono includere l'uso di una pressa francese o bomba di azoto di distruggere la membrana cellulare più dolcemente e ridurre ulteriormente qualsiasi contaminazione del CLD isolare2.
In conclusione, il kit ER metodo di isolamento di LD è una nuova applicazione di uno strumento comunemente usato biologia cellulare. Questo metodo esegue Analogamente all'isolamento gradiente di saccarosio, con meno preparazione dei reagenti. Inoltre, l'inclusione di preparati i reagenti ER protocollo di isolamento del LD migliora il rigore e la riproducibilità delle condizioni sperimentali.
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Disclosures
Dr. Carr riceve il sostegno alla ricerca da intercettare Pharmaceuticals.
Acknowledgments
Ringraziamo la famiglia Abramson Cancer Research Institute. Questo lavoro è supportato dalle seguenti concessioni: NIH/NIAAA R01 AA026302-01, NIH/NIAAA K08-AA021424, Robert Wood Johnson Foundation, Harold Amos medica facoltà Development Award, 7158, IDOM DRC Pilot Award P30 DK019525 (r.m.c.); NIH/NIAAA F32-AA024347 (J.C.). Questo lavoro è stato sostenuto in parte da NIH P30-DK050306 e suoi servizi di nucleo (patologia molecolare e di Imaging, biologia molecolare/Gene Expression Core e cella cultura Core) e il suo pilota programma di sussidi. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioExpress Vortex Mixer | GeneMate | S-3200-1 | Vortex Mixer |
| Centrifuge 54242 R | Eppendorf | 54242 R | Refrigerated Counter Microcentrifuge Rotor: FA-45-24-11 |
| Centrifuge Sorvall RC6 + | Thermo Scientific | RC6+ | Refrigerated High Speed Centrifuge Rotor: F21S-8x50y |
| Centrifuge Sorvall Legend RT+ | Thermo Scientific | Legend RT+ | Refrigerated High Capacity Centrifuge Rotor: 75006445 Bucket: 75006441 |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | 04 693 116 001 | Protease Inhibitor Tablets |
| Diagenode Bioruptur UCD-200 | Diagenode | UCD-200 | Sonication System |
| Dounce Tissue Grinder (45 mL) | Wheaton | 357546 | Use Loose pestle |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) | Corning | 21-031-CM | |
| Endoplasmic Reticulum Isolation Kit | Sigma Aldrich | ER0100 | For ER kit Extraction: Contains: Isotonic Extraction Buffer 5X 100 mL Hypotonic Extraction Buffer 10 mL Calcium chloride, 2.5 M solution 5 mL OptiPrep Density Gradient Medium 100 mL Blunt Nosed Needle 1 ea. |
| External light source for flourescent excitation | Leica | Leica EL6000 | |
| Hydrochloric acid | Sigma Aldrich | H1758 | Hydrochloric Acid |
| ImageJ | Image Analysis Software | ||
| Inverted Modulating Contrast Microscope | Leica | Leica DM IRB | |
| Lysosome Enrichment Kit for Tissues and Cultured Cells | Thermo Fisher Scientific | 89839 | For Lysosome Isolation |
| Microscope Camera | Qimaging | QICAM fast 1394 | |
| Optima XL-100K Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | XL-100K | Ultracentrifuge Rotor: SW41Ti |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 22-042817 | |
| Petri Dish 5 cm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| PhosSTOP | Sigma Aldrich | 04 906 845 001 | Phosphatase Inhibior Tablets |
| Sterile Surgical Blade #10 | Pioneer | S2646 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | Crystalline/Certified ACS |
| Triglyceride Liquicolor Kit | Stanbio | 2200-225 | Colorimetric Triglyceride kit |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | For TE buffer |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151-100 | 5%, Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether, Protein Lysis Reagent |
| UltraPure EDTA (0.5M, pH 8.0) | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | For TE buffer |
References
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