Summary
该方案建立了一种新的方法, 从小鼠肝脏脂滴分离和纯化, 使用一个完善的内质网隔离试剂盒。
Abstract
脂质液滴 (Ld) 是在最真核细胞和一些原核细胞的细胞溶胶中发现的生物活性细胞器。Ld 由中性脂质组成, 由磷脂和蛋白质的单层包裹。肝 ld 脂 (如神经酰胺) 和蛋白质与导致肝脂肪变性的几种疾病有关。尽管以前已经建立了 LD 隔离的方法, 但它们需要耗时的试剂制备, 而不是为隔离多个亚细胞隔间而设计的。我们试图建立一个新的协议, 以便能够从一个小鼠肝脏分离 ld, 内质网 (ER) 和溶酶体。
此外, 此处介绍的协议中使用的所有试剂都可在商业上获得, 并且在不牺牲 LD 纯度的情况下需要最少的试剂制备。在这里, 我们提出的数据, 比较这个新的协议作为一个标准的蔗糖梯度协议, 证明了相当的纯度, 形态和产量。此外, 我们可以使用相同的样本分离 ER 和溶酶体, 提供详细的洞察脂质及其相关蛋白质的形成和细胞内通量。
Introduction
Ld 是大多数真核细胞和一些原核细胞 1, 2,3的细胞溶胶中发现的生物活性细胞器.LD 核心由中性脂质 (如甘油三酯 (TG) 和胆固醇酯组成。它们还含有神经酰胺, 参与细胞信号转导途径4,5的生物活性脂质。Ld 被磷脂单层包围, 并涂有蛋白质, 包括环素蛋白环素 2 (plin2) 和 3 (plin3)1,5, 6.此外, 还存在与几种肝性脂肪病有关的脂原酶、脂肪酶和膜贩运蛋白, 包括非酒精性脂肪肝疾病、酒精性肝病和丙型肝炎3-5 ,6,7,8,9, 10.
Ld 被认为是由 ER 的外膜形成的, 含有新合成的 TG, 来自 er 衍生的游离脂肪酸11。然而, 目前尚不清楚汇集的脂质是否芽, 保持连接, 或从 ER6,11被切除, 使 ld 从 er 摆脱技术上具有挑战性。通过表面脂肪酶的作用, 游离脂肪酸可以从 Ld 中释放, 从而提供能源生产或膜合成。此外, Ld 可以通过脂质体作为调节机制降解, 并产生游离脂肪酸12。
除了 ER 和溶酶体, 还有其他细胞器--如线粒体、内生体、过氧化物酶体和质膜--在 LDs11的紧密关联中发现。这种严格的一夫多妻制使得它很难执行一个纯粹的 LD 提取。然而, 中性脂的先天低密度可以通过离心5加以利用.
传统上, ld 是使用蔗糖密度梯度1,5,13隔离的。然而, 这些方法并没有被设计用来分离其他细胞器。此外, 它们还需要耗时的试剂制备。该协议调整了商业上可用的 ER 隔离套件 (请参阅材料表), 以允许 ld 隔离。我们使用套件提供的提取缓冲区, 添加 ld 隔离步骤。此外, 该协议还可用于使用相同样本的 ER 和溶酶体隔离, 从而更全面地了解 Ld 的生命周期。为了验证这一新方法, 我们对 LD 的收率、形态、大小和纯度进行了分析。我们将这里给出的结果与使用蔗糖梯度进行 LD 隔离的广泛使用的协议的结果进行了比较。
我们使用了一个10至12周的, 20 克女性 c57bl6 老鼠禁食16小时 (食物清除在下午5:00 上午 9:00 ld 隔离时间), 可以免费获得水。TG 的典型产率为 0.6 mgg 肝脏, ld 蛋白的典型产率为 0.25 mg g。这为 sds page 为 ~ 10个免疫细胞提供了足够的材料。下面的协议详细介绍了所使用的试剂和适用于单个1克肝脏的协议。蔗糖梯度隔离协议适用于佐藤14号和吴15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
所有实验都是在实验室的长凳上进行的, 配备了适合生物安全1级的个人防护设备, 包括实验室外套、手套和安全护目镜。实验是根据宾夕法尼亚大学动物护理和使用机构委员会 (IACUC) 批准的协议进行的。所有的努力都是为了尽量减少动物的不适, 动物们受到了人道的照顾。
1. 使用 ER 隔离套件进行 LD 隔离
-
制备
注: 列出的金额适用于单个1克小鼠肝脏。- 从 er 隔离套件中稀释2毫升的 5x ie 缓冲液和8毫升的超纯水, 制备1x 同位素提取缓冲液 (IE 缓冲液) 的10毫升。将缓冲区放在冰上冷却。
- 在90毫升的超纯水中稀释10毫升的 10倍 PBS, 制备100倍磷酸盐缓冲盐水 (PBS)。把它放在冰上冷却。
- 通过在9.5 毫升的超纯水中稀释500μl 的 pgpe, 制备5% 乙二醇 p-(1, 3, 3-四甲基丁基)-苯醚 (pgpe) 的10毫升。使用1毫升注射器测量 PGPE, 因为它是粘性的。把它放在冰上冷却。
- 将所有管放在冰上冷却: 1.7 mL 微型离心管、15毫升离心管、50毫升高速离心管和13毫升超离心管。
- 冷却所有所需的离心机至 4°C: 一台微型离心机、一台用于15毫升管的大容量离心机、一台用于 50 mL 管的高速离心机和一台超离心机。
- 消毒钳子和解剖剪刀高压灭菌。
-
组织制备
- 将鼠标放入充满 100% co2 的室内 10分钟, 使鼠标安乐死 10分钟 . 通过进行颈椎脱位确认安乐死。
- 使用无菌钳和解剖剪刀, 切断后部-前轴上的腹部皮肤和肌肉层, 以暴露肝脏。
- 切断连接肝脏与隔膜和肠道的韧带。使用钳子将肠子从肝脏拉到后部, 露出韧带。
- 在肝脏和背上的胸腔之间切割, 从前到后部移动, 直到肝脏被解放。
- 将肝脏转移到一个冷的5厘米培养皿与10毫升的冷 1x PBS。
- 在5厘米的 petri 培养皿中, 在 1 x Pbs 的10毫升的摇页上清洗肝脏 2倍, 在4°c 时清洗5分钟。最后洗完后倒出1x 的 p b s。
- 使用大小为10的无菌手术刀片 (参见材料表), 将肝脏切割成3-5 毫米的碎片, 在5厘米的 petri 培养皿中 (图 1 a)。
- 用10毫升的冷 1x PBS 清洗切碎的肝脏 2x, 在4°c 下, 在5厘米的培养皿中清洗5分钟。
注: 对于溶酶体分离, 将0.5 克肝脏转移到干净的45毫升均质机中, 并遵循溶酶体提取试剂盒提供的说明 (见材料表)。 - 分解 1x PBS, 并将切碎的肝脏块转移到冷的45毫升弹跳均质机。确保所有部件都进入均质机的底部。
- 加入7毫升冷 1x ie 缓冲液 (从 ER 隔离套件), 并通过上下移动 20x, 在冰上均匀化。确保在每次行程中, 伟囊都进入均质机的底部。
- 将均质体 (图 1b) 转移到冷的15毫升离心管中。
- 用1毫升冷 1x ie 缓冲液 (从 ER 隔离套件) 冲洗均质机, 并将其添加到均质体的其余部分。
-
LD 隔离
- 在 1, 000 x 克的大容量离心机中离心共质, 在 4°c 下 10分钟, 取出细胞核 (图 1c)。
- 将后核上清液 (PNS) 转移到新的、冷的50毫升离心管中。为了防止 LD 损失, 请确保在转移 Pns 之前, 在15毫升管的顶部聚集的任何脂质被重新悬浮。
- 取100μl 的 PNS, 进行纯度分析, 并将其放入冷 1.7 mL 的微离心管中。把它放在冰上。
- 在 12, 000 x g 的冷冻高速离心机中, 以 12, 000 x g的速度, 在4°c 下, 以15分钟的速度去除线粒体, 将 pns 样品而不是 aliquot 离心。
- 可选:对于粗 LD (cld) 分离物 (带有细胞溶胶和细胞膜污染), 使用玻璃移液器收集顶部脂质层, 并将其转移到1.7 毫升的微离心管中。继续执行第1.4 节。
- 将线粒体后上清液 (PMS) 转移到超离心管中。为了防止 LD 损失, 请确保在转移 PMS 之前, 在顶部收集的任何脂质都将重新悬浮。
- 取100Μl 的 PMS 进行纯度分析, 并将其放入冷 1.7 mL 的微离心管中。把它放在冰上。
- 用冷的 1x ie 缓冲液将超离心管填充到边缘, 以防止超离心过程中的管塌陷。
- 在4°c 条件下, 以 100, 000 x 克的超离心机将样品平衡并离心, 时间为 60分钟 (图 1d)。
- 要去除 LD 层, 请将管倾斜45°角, 然后使用玻璃移液器吸气。将颗粒转移到一个冷1.7 毫升的微离心管。
注: 颗粒含有隔离的 ER。使用此分数下游的 ER 隔离。 - 在脂质层下收集100μl 后 er 上清液 (PER), 用于纯度分析。
-
LD 洗涤
- 在1.7 微离心管中收集的 LD 分数中添加 1个 PBS, 总体积为 1.3 mL。
- 将样品旋涡。
- 在4°c 下, 以最高速度离心 5分钟, 将任何细胞碎片颗粒状。用双手轻轻加热管, 以帮助重新悬挂 LD 层。将上清液 (包括脂质层) 转移到新的 1.7 mL 微离心管中。
- 重复步骤 1.4.1-1.4.3 2x–3x, 直到颗粒不再可见。
- 在无颗粒 ld 上清液中加入 1个 PBS, 最终体积为 1.5 mL。在4°C 条件下, 用最高速度在微型离心机中离心5分钟清洗脂质分数。
- 用玻璃移液器取出1毫升的 1x PBS (脂质层下方), 而不会干扰脂质层。
- 重复步骤1.4.5 和 1.4.6 4x–5x, 直到 1x PBS 在视觉上是透明的, 没有浊度。
- 使用玻璃移液器取出脂质层下方的所有 1x PBS (图 1x)。
- 使用结果, 一个纯 LD 分数, 用于下游分析。
-
双链酸法测定 LD 蛋白
注: 如果要评估 LD 形态, 请不要使用双氯苯酸检测 (BCA)。- 将 LD 重新用于500μl 的 5% PGPE。
- 在95°c 下将样品煮沸 5分钟, 使其变热, 并在室温下孵育样品5分钟冷却。
- 重复步骤1.5.2 额外的2倍。
- 以中等强度的30秒循环对样品进行5分钟的取样。
- 通过 BCA 法测量所有纯度分析样品和 LD 组分中的蛋白质浓度, 使样品正常化。
2. 使用蔗糖密度梯度的 LD 隔离
-
制备
- 制造200毫升的 te 缓冲液 (10 mM Tris-HCl [pH 7.4], 1 mM EDTA [pH 8.0])。把它放在冰上冷却。
- 通过在 TE 缓冲液中溶解60克蔗糖, 使最终体积达到100毫升, 使 te 缓冲液中的蔗糖溶液达到100毫升。把它放在冰上冷却。
- 在 TE 缓冲液的2毫升中加入4毫升的60% 蔗糖溶液, 使 40% (w/v) 的蔗糖溶液为6毫升。把它放在冰上冷却。
- 在 TE 缓冲液 3.5 mL 中加入 2.5 mL 的60% 蔗糖溶液, 使 25% (w/v) 蔗糖溶液的6毫升。把它放在冰上冷却。
- 在 TE 缓冲液 3.3 ml 中加入 0.7 mL 的60% 蔗糖, 使 10% (w/v) 蔗糖溶液的4毫升。把它放在冰上冷却。
- 在 TE 缓冲液的10毫升中加入一片蛋白酶和磷酸酶抑制剂, 制备蛋白酶和磷酸酶抑制剂溶液10毫升。
- 在60% 蔗糖库存溶液的50毫升中加入4毫升蛋白酶和磷酸酶抑制剂溶液, 制备组织均质缓冲液。把它放在冰上冷却。
- 在 te 缓冲液的50毫升加入2毫升蛋白酶和磷酸酶抑制剂溶液, 制备覆盖缓冲液。把它放在冰上冷却。
- 在90毫升的超纯水中稀释 10倍 pbs 的10毫升, 制备100毫升的 1x PBS。把它放在冰上冷却。
- 在9.5 毫升的超纯水中稀释500Μl 的 PGPE, 制备10% 的 5% PGPE。使用1毫升注射器测量 PGPE, 因为它是粘性的。把它放在冰上冷却。
- 将下列离心管放在冰上冷却: 1.7 mL 微离心管、15毫升离心管、50毫升高速离心管和13毫升超离心管。
- 将所需的离心机冷却到 4°c: 微型离心机、大容量离心机 (适用于 15 mL 管)、高速离心机 (适用于 50 mL 管) 和超离心机。
-
组织制备
- 使用步骤1.2.1 –1.2.9 为组织的均质化做好准备。
- 加入7毫升的冷组织均质缓冲液, 并通过上下移动20x 将其在冰上均匀化。在前五次冲程中, 确保伟尼剂进入均质机的底部。
- 将均质化转移到冷的15毫升离心管中。
- 用1毫升的冷组织均质缓冲液冲洗均质机, 并将其转移到以前使用的15毫升离心管。
- 使均质体的体积高达10毫升与组织均质缓冲液。
- 在 1, 000 x克的大容量离心机中离心样品, 在4°c 下进行10分钟的离心。
- 将8毫升上清液转移到50毫升离心管中。
- 将剩余的上清液转移100Μl 作为 PNS 样品进行纯度分析。
-
蔗糖梯度
- 将含有8毫升 PNS 的50毫升离心管倾斜45°角。小心加入6毫升的40% 蔗糖溶液, 确保这两个阶段保持分离。
- 以类似的方式, 慢慢加入6毫升的25% 蔗糖溶液;然后加入4毫升的10% 蔗糖溶液;最后, 添加8毫升的覆盖缓冲区。
- 在4°c 条件下, 在 30, 000 x g 的高速离心机中离心样品30分钟。
- 将含有 Ld 的顶层转移到 1.7 mL 的微离心管中。
- 对于 LD 清洗, 请按照第1.4 节中的步骤操作。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
我们在大约30只小鼠身上用 ER 试剂盒进行了 LD 隔离, 并将结果与遵循蔗糖隔离协议的结果进行了比较。所报告的结果是典型的两个协议。小鼠连夜禁食, 可以自由获得水, 以增加 LD 产量。使用蔗糖梯度的 LD 隔离与 ER 套件 ld 隔离协议并行运行。在整个 ER 套件 LD 隔离协议中收集了 PNS、PMS、PER、Cld 和 Ld 的样本。由于蔗糖隔离协议的工作流限制, 只收集了 PNS 和 LD 隔离。
对于荧光显微镜, 将50μl 的分离 Ld 混合在一起, 体积相等 100Μm 4, 4-二氟-1, 3, 5, 7, 8-Pentamethyl-4-Bora--拉美--Diaza-s-indacene (DBDI)。样品被保护不受光线照射, 并在室温下孵育30分钟。通过添加 1x PBS 的1毫升对样品进行洗涤, 然后进行离心和去除多余的缓冲液。在 LD 分数中, 1μl 被放置在显微镜幻灯片上并覆盖。使用倒置研究显微镜 (见材料表), 从 ER 试剂盒 ld 隔离和蔗糖 ld 隔离 (图 2a- d) 方法中提取了具有代表性的20x 荧光和明亮场 ld 图像。明亮场图像显示了类似水平的颗粒物, 表明使用不同的协议具有相似的纯度。
为了确定这两个协议之间的产量差异, 我们使用了相对大小的小鼠和小鼠肝脏 (图 2e, f)。纯化后, 使用比色法测定 ld TG 和蛋白质水平 (见材料表), 并将数据归一化为肝脏重量 (图 2g, h)。我们发现, 当我们正常化的起始材料, ld 蛋白和 tg 产量后, LD 分离使用 er 试剂盒和蔗糖是相似的。为了确定 LD 大小是否也相似, 我们使用图像分析软件对 LD 直径进行了量化 (参见材料表)。Ld 的范围从0.27 到6.37 微米不等。LD 直径的频率分布表明, ER 套件 ld 隔离 (图 3a) 和蔗糖 ld 隔离 (图 3A) 产生了类似尺寸的 ld。
为了评估 LD 的纯度, 用免疫印迹法对样本进行了检测。用 SDS PAGE 检测每个样品20μg 的蛋白质。用 Ld (PLIN2 和 PLIN3)、ER (Sec61)、线粒体 (VDAC)、溶酶体 (LAMP1)、质膜 (MEK1)、细胞核 (组蛋白 H3) 和细胞溶胶 (GAPDH) 的抗体标记物 (图 4a) 对样本进行了研究。除 ER 试剂盒 ld 隔离 PER 和蔗糖 pns 外, 所有样品均检测到 PLIN2。从 ER 试剂盒 ld 隔离和蔗糖梯度协议中得到的 Ld 具有相同的纯度。ER (第61节)、线粒体 (VDAC1)、溶酶体 (LAMP1)、质膜 (Mek1) 或细胞溶胶 (GAPDH) 均未出现带。CLD 有质膜和细胞溶胶污染, 但没有明显的来自 ER、线粒体或溶酶体的污染。在适应 ER 协议中, PLIN2 波段的强度表明, ER 协议在 LD 分数中的 PLIN2 表达式比 PNS 高出约 14倍, 而蔗糖协议在 LD 分数中的 PLIN2 表达式高出六倍 (数据)。
因为这个协议也可以选择净化 ER 和溶酶体, 我们也进行了西方印迹, 以评估这些细胞器的纯度。图 4B显示, 使用 er 试剂盒 (见材料表) 从同一样品中纯化的 er 的免疫细胞不含 plin2, 但 er sec61a 蛋白含量显著。使用溶酶体富集试剂盒 (见材料表), 进一步分离溶酶体, 并为 LD (PLIN2)、Er (Sec61A) 和溶酶体 (LAMP1) 标记 (图 4c) 进行免疫印迹。这些数据表明, 这里介绍的协议, 结合商业上可用的溶酶体纯化试剂盒, 允许从单一动物的肝脏 ld, ER 和溶酶体的纯分离。
图 1: 在使用 er 隔离套件的 ld 隔离.(A) 将5毫米肝片切在5厘米的培养皿中。(B) 在 d盎司均质机中均质后的肝脏均质。(C) 1, 000 x 克离心后的肝脏均质;注意顶部的轻微脂质层, PNS, 以及含有细胞碎片和核部分的颗粒。(D) 超离心后的 ld 层, 为 100, 000 x 克;注意顶部突出的脂质层, PER, 底部的 ER 分数。(E) 在最终去除 pbs 之前清洗的 ld 分数。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 显微镜和定量分析, 比较与 er 试剂盒分离的 ld 分数和与蔗糖分离的 ld 分数.代表20x 荧光显微镜 (a) dpbdi 染色 ld 分数与 er 试剂盒分离和 (b) 用蔗糖分离的 ld。(C) 用 er 试剂盒分离的 ld 分数的明亮场显微图和 (d) 用蔗糖分离的 ld 分数。刻度杆 = 20μm. (e) 小鼠体重和 (f) 肝脏重量。(G) 纯化的 ld 的 tg 产量归一化为肝脏重量。(H) 纯化的 ld 蛋白质产量归一化为肝脏重量。数据为平均±SEM (n = 4)。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3:Ld 大小的频率分布.对4只不同小鼠的样本进行了 DPBDI 染色, 并对具有代表性的20x 数场进行了定量。使用图像分析软件对直径进行了测量。(A) 使用 er-kit 隔离的 ld 分数的频率 (分数) 分布。(B) 使用蔗糖梯度密度隔离的 ld 分数的频率 (分数) 分布。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 免疫印迹法分析 ld 纯度.(A) 比较 er 试剂盒 ld 分离的适应方案和蔗糖分离方案, 对每个样品20μg 的蛋白质进行免疫印迹。加载了以下样品: 后核上清液 (PNS)、线粒体后上清液 (PMS)、后质网上清液 (PER)、粗 ld (CLD) 和 Ld (LD)。样本为 Ld (PLIN2 和 PLIN3)、ER (SEC61A)、线粒体 (VDAC1)、溶酶体 (LAMP1)、细胞膜 (MEK1)、细胞核 (组蛋白 H3) 和细胞溶胶 (GAPDH) 标记。(B) 使用 ER 套件 ld 隔离协议进一步纯化 ER 后, 对 er 分数进行纯度分析 (见材料表)。为 Ld (PLIN2) 和 ER (SEC61A) 加载 PNS、PMS、ER 和 Ld 并绘制免疫图。(C) 利用溶酶体浓缩试剂盒协议进一步纯化溶酶体的纯度分析 (见材料表)。为 Ld (PLIN2)、er (SEC61A) 和溶酶体 (LAMP1) 加载 PNS 和溶酶体分数并进行免疫印迹。请点击这里查看此图的较大版本.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
肝 LD 生物学正日益被认为是健康和疾病中肝细胞生理学的关键调节剂。作为真正的细胞器, Ld 是动态的, 与其他细胞结构相互作用, 并包含在它们里面的生物活性成分参与脂质和葡萄糖的稳态。蔗糖梯度通常用于 LD 隔离, 使研究人员能够研究 LD 结构, 但它要求他们制造大量的缓冲。我们已经证明, 使用商用 ER 隔离套件是另一种工具, 不仅可用于 LD 隔离, 还可用于 ER 和溶酶体的串联隔离, 从而能够更全面地查看不同情况下的细胞动力学。在工作流程没有显著增加的情况下。
这一新协议的优点是它易于使用商业或现成的试剂进行设置, 并能够同时隔离多个细胞器。然而, 这种新方法有潜在的缺点, 需要记住。此协议中的几个步骤可能会使超大型 Ld 与肝脏的隔离处于不利地位。脱料均质有可能通过剪切应力破坏大型 Ld。松散拟合的溶出均质机设置可以减轻大型 Ld 的一些压力, 此外, 还采用了 100, 000 x 克的自旋, 允许分离 LD 和 er。这种速度也可能导致大型 Ld 的损失, 因为一份报告建议 2, 000 x 克肝脏 ld 纯化2。此过程的一个限制是, 它不能用于隔离最近描述的 16大小不同的 ld。此外, 虽然蔗糖缓冲液可以保持脆弱的 ld 完整, 通过使用温和的均质 2, 同质与 1x ie 缓冲液产生纯 ld 具有类似的形态和大小分布从蔗糖梯度隔离.需要进一步研究, 以确定生物活性是否受到使用 PBS 缓冲液的影响, pbs 缓冲液不如常用的同位素缓冲液 2温和。由于这些潜在的限制, 在前两个离心机步骤中, 在转移上清液之前完全重新悬浮顶部收集的脂质, 并从经验上确定行程数对不同地区 ld 产量的影响, 是至关重要的。组织。这里介绍的肝脏协议使用20个笔画, 产生了与其他已发表的作品相当的大小分布2。
使用内质网隔离试剂盒进行 LD 隔离, 可获得粗的和纯 LD 的分离物。CLD 分离物含有细胞膜和细胞溶胶成分, 但在某些应用中可能证明是足够的, 例如用显微镜评估 LD 形态。由 PLIN2 表达确定的纯 LD 分离体缺乏 ER、线粒体、溶酶体、细胞膜或细胞溶胶污染。事实上, 与蔗糖 ld 隔离方法相比, er 套件 ld 隔离协议中的纯隔离比双多丰富 PLIN2。这种差异是意想不到的, 考虑到相似的蛋白质和 TG 产量, 但可能是由于使用 PBS 作为再悬浮液缓冲液, 而不是蔗糖或同位素缓冲液。
传统方法的 LD 分离也会受到质膜2对 ld 分数的污染。尽管这种联合隔离在所有 LD 隔离方法中都很常见, 在分析 LD 隔离物2时应牢记,但此处提供的数据表明, cld 分离体的进一步超离心会使此类污染物的样品被提及 (图 4)。未来的适应可以包括使用法国的压力机或氮气炸弹, 以更温和地破坏细胞膜, 并进一步减少任何污染的 CLD 分离物2。
总之, ER 套件 LD 隔离方法是一种常用的细胞生物学工具的新应用。该方法类似于蔗糖梯度隔离, 试剂制备较少。此外, 在 ER 试剂盒 ld 隔离协议中加入制备的试剂, 提高了实验条件的严谨性和重现性。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
卡尔博士得到了拦截制药公司的研究支持。
Acknowledgments
我们感谢阿布兰森家族癌症研究所。这项工作得到以下赠款的支持: NIH/NIAAA R01 AA026302-01、NIH/NIAA K08-AA021424、Robert Wood johnson 基金会、harold Amos 医学院发展奖、7158, IDOM IRC 试点奖 P30 DK019525 (r. m. c.);NIHPAAA F32-AA024347 (J. C.)。这项工作得到了 NIH P30-DK050306 及其核心设施 (分子病理学和成像核心、分子生物学表达核和细胞培养核心) 及其试点赠款方案的部分支持。内容完全由作者负责, 不一定代表国家卫生研究院的官方观点。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioExpress Vortex Mixer | GeneMate | S-3200-1 | Vortex Mixer |
| Centrifuge 54242 R | Eppendorf | 54242 R | Refrigerated Counter Microcentrifuge Rotor: FA-45-24-11 |
| Centrifuge Sorvall RC6 + | Thermo Scientific | RC6+ | Refrigerated High Speed Centrifuge Rotor: F21S-8x50y |
| Centrifuge Sorvall Legend RT+ | Thermo Scientific | Legend RT+ | Refrigerated High Capacity Centrifuge Rotor: 75006445 Bucket: 75006441 |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | 04 693 116 001 | Protease Inhibitor Tablets |
| Diagenode Bioruptur UCD-200 | Diagenode | UCD-200 | Sonication System |
| Dounce Tissue Grinder (45 mL) | Wheaton | 357546 | Use Loose pestle |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) | Corning | 21-031-CM | |
| Endoplasmic Reticulum Isolation Kit | Sigma Aldrich | ER0100 | For ER kit Extraction: Contains: Isotonic Extraction Buffer 5X 100 mL Hypotonic Extraction Buffer 10 mL Calcium chloride, 2.5 M solution 5 mL OptiPrep Density Gradient Medium 100 mL Blunt Nosed Needle 1 ea. |
| External light source for flourescent excitation | Leica | Leica EL6000 | |
| Hydrochloric acid | Sigma Aldrich | H1758 | Hydrochloric Acid |
| ImageJ | Image Analysis Software | ||
| Inverted Modulating Contrast Microscope | Leica | Leica DM IRB | |
| Lysosome Enrichment Kit for Tissues and Cultured Cells | Thermo Fisher Scientific | 89839 | For Lysosome Isolation |
| Microscope Camera | Qimaging | QICAM fast 1394 | |
| Optima XL-100K Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | XL-100K | Ultracentrifuge Rotor: SW41Ti |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 22-042817 | |
| Petri Dish 5 cm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| PhosSTOP | Sigma Aldrich | 04 906 845 001 | Phosphatase Inhibior Tablets |
| Sterile Surgical Blade #10 | Pioneer | S2646 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | Crystalline/Certified ACS |
| Triglyceride Liquicolor Kit | Stanbio | 2200-225 | Colorimetric Triglyceride kit |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | For TE buffer |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151-100 | 5%, Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether, Protein Lysis Reagent |
| UltraPure EDTA (0.5M, pH 8.0) | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | For TE buffer |
References
- Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Isolation of Lipid Droplets from Cells by Density Gradient Centrifugation. Current Protocols in Cell Biology. 72, (2016).
- Ding, Y., et al. Isolating lipid droplets from multiple species. Nature Protocols. 8 (1), 43-51 (2013).
- Gao, Q., Goodman, J. M. The lipid droplet-a well-connected organelle. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 49 (2015).
- Correnti, J. M., et al. Ethanol and C2 ceramide activate fatty acid oxidation in human hepatoma cells. Scientific Reports. 8 (1), 12923 (2018).
- Williams, B., et al. A novel role for ceramide synthase 6 in mouse and human alcoholic steatosis. FASEB Journal. 32 (1), 130-142 (2018).
- Carr, R. M., Ahima, R. S. Pathophysiology of lipid droplet proteins in liver diseases. Experimental Cell Research. 340 (2), 187-192 (2016).
- Carr, R. M., et al. Perilipin Staining Distinguishes Between Steatosis and Nonalcoholic. Steatohepatitis in Adults and Children. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 15 (1), 145-147 (2017).
- Carr, R. M., et al. Reduction of TIP47 improves hepatic steatosis and glucose homeostasis in mice. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (8), R996-R1003 (2012).
- Carr, R. M., Peralta, G., Yin, X., Ahima, R. S. Absence of perilipin 2 prevents hepatic steatosis, glucose intolerance and ceramide accumulation in alcohol-fed mice. PLoS One. 9 (5), e97118 (2014).
- Tsai, T. H., et al. The constitutive lipid droplet protein PLIN2 regulates autophagy in liver. Autophagy. 13 (7), 1130-1144 (2017).
- Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V. Jr, Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. Journal of Cell Science. 122 (Pt 6), 749-752 (2009).
- Liu, K., Czaja, M. J. Regulation of lipid stores and metabolism by lipophagy. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 3-11 (2013).
- Mannik, J., Meyers, A., Dalhaimer, P. Isolation of cellular lipid droplets: two purification techniques starting from yeast cells and human placentas. Journal of Visualized Experiments. (86), e509814 (2014).
- Sato, S., et al. Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein. Journal of Biochemistry. 139 (5), 921-930 (2006).
- Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R. 3rd, McManaman, J. L. Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells. Electrophoresis. 21 (16), 3470-3482 (2000).
- Zhang, S., et al. Morphologically and Functionally Distinct Lipid Droplet Subpopulations. Scientific Reports. 6, 29539 (2016).
