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Biology

एक अच्छी तरह से स्थापित Organelle अलगाव किट का उपयोग रैपिड लिपिड छोटी बूंद आइसोलेशन प्रोटोकॉल

Published: April 19, 2019 doi: 10.3791/59290
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Division of Gastroenterology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल एक अच्छी तरह से स्थापित एंडोप्लाज्मिक जालिका आइसोलेशन किट का उपयोग कर, माउस livers से लिपिड छोटी बूंद अलगाव और शुद्धि की एक नवीन विधि स्थापित करता है ।

Abstract

लिपिड बूंदों (LDs) बायोएक्टिव organelles सबसे यूकैरियोटिक और कुछ प्रोकैरियोटिक कोशिकाओं के cytosol के भीतर पाए जाते हैं । LDs फॉस्फोलिपिड और प्रोटीन के एक monolayer द्वारा encased तटस्थ लिपिड से बना रहे हैं । यकृत LD lipids, जैसे चीनी मिट्टी की चीज़ें, और प्रोटीन कई रोगों है कि यकृत steatosis कारण में फंसाया जाता है । हालांकि पिछले तरीकों LD अलगाव के लिए स्थापित किया गया है, वे एक समय लेने की आवश्यकता होती है अभिकर्मकों की तैयारी और एकाधिक subcellular डिब्बों के अलगाव के लिए तैयार नहीं हैं । हम एक नया प्रोटोकॉल स्थापित करने के लिए एक एकल माउस जिगर से LDs, अंतर्द्रव्यी जालिका (ईआर), और lysosomes के अलगाव को सक्षम करने की मांग की ।

इसके अलावा, यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल में इस्तेमाल सभी अभिकर्मकों व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है और LD शुद्धता त्याग के बिना ंयूनतम अभिकर्मक तैयारी की आवश्यकता है । यहां हम एक मानक सुक्रोज ढाल प्रोटोकॉल के लिए इस नए प्रोटोकॉल की तुलना डेटा प्रस्तुत करते हैं, तुलनीय शुद्धता, आकारिकी का प्रदर्शन, और उपज । इसके अतिरिक्त, हम एक ही नमूने का उपयोग कर और lysosomes ईआर को अलग कर सकते हैं, और लिपिड और उनके जुड़े प्रोटीन के गठन और intracellular प्रवाह में विस्तृत जानकारी प्रदान ।

Introduction

LDs बायोएक्टिव organelles सबसे यूकैरियोटिक कोशिकाओं के cytosol में पाया जाता है और कुछ प्रोकेरियोटिक कोशिकाओं1,2,3। एलडी कोर तटस्थ लिपिड जैसे ट्राइग्लिसराइड (टीजी) और कोलेस्ट्रॉल esters से बना है । वे भी सिरेमिक, बायोएक्टिव लिपिड सेलुलर संकेत रास्ते4,5में शामिल होते हैं । LDs एक फॉस्फोलिपिड monolayer से घिरा हुआ है और प्रोटीन के साथ लेपित, perilipin प्रोटीन perilipin 2 (PLIN2) और 3 (PLIN3)1,5,6सहित । इसके अलावा मौजूद lipogenic एंजाइमों, lipases, और झिल्ली तस्करी प्रोटीन है कि कई यकृत steatotic रोगों से जोड़ा गया है, nonalcoholic फैटी लीवर रोग सहित, शराबी जिगर की बीमारी, और हेपेटाइटिस सी3,5 ,6,7,8,9,10।

LDs एर की बाहरी झिल्ली से फार्म करने के लिए लगा रहे हैं और नए संश्लेषित टीजी शामिल एर से sourced मुक्त फैटी एसिड11. हालांकि, यह अज्ञात है कि क्या पूल्ड लिपिड बड, जुड़े रहते हैं, या एर6,11से excised कर रहे हैं, एर से मुक्त LDs के अलगाव को तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण बना । नि: शुल्क फैटी एसिड के लिए ऊर्जा उत्पादन या झिल्ली संश्लेषण के लिए प्रदान करने के लिए सतह lipases की कार्रवाई से LDs से मुक्त किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, LDs एक नियामक तंत्र के रूप में lipophagy के माध्यम से अपमानित किया जा सकता है और मुक्त फैटी एसिड का उत्पादन12।

इसके अलावा, अन्य अंगकों-जैसे माइटोकॉन्ड्रिया, एंडोसोम्स, पेरोऑक्सिज्म और प्लाज्मा झिल्ली-जो LDs11के निकट सहयोग के भीतर पाए जाते हैं । यह तंग बहुविवाह एक शुद्ध LD निष्कर्षण करने के लिए मुश्किल बना देता है । हालांकि, तटस्थ ' lipids जंमजात कम घनत्व के माध्यम से अपकेंद्रण5का लाभ लिया जा सकता है ।

परंपरागत रूप से, LDs एक सुक्रोज घनत्व ढाल1,5,13का उपयोग कर अलग कर दिया गया है । हालांकि, इन पद्धतियों अंय organelles को अलग करने के लिए डिज़ाइन नहीं किया गया है । इसके अतिरिक्त, वे reagents के समय लेने वाली तैयारी की आवश्यकता है । इस प्रोटोकॉल एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ईआर आइसोलेशन किट adapts ( सामग्री की तालिकादेखें) LD अलगाव के लिए अनुमति देने के लिए. हम निष्कर्षण किट द्वारा प्रदान बफर, एक LD अलगाव कदम जोड़ने का उपयोग करें । इसके अलावा, प्रोटोकॉल भी एर और लाइसोसोमल एक ही नमूने का उपयोग अलगाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, LDs के जीवन चक्र के एक अधिक व्यापक छवि के लिए अनुमति दी । इस नई विधि को मांय करने के लिए, हम LD उपज, morphology, आकार, और शुद्धता परख । हम यहां प्रस्तुत परिणामों की तुलना एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल LD अलगाव के लिए एक सुक्रोज ढाल का उपयोग के साथ प्राप्त किया ।

हम एक 10-12-सप्ताह पुराने, 20 ग्राम महिला C57BL/6 माउस के लिए ५.०० बजे (भोजन को हटाने के लिए एक ९.०० A.M. के लिए पानी का उपयोग करने के साथ LD अलगाव समय) । टीजी के लिए ठेठ उपज ०.६ मिलीग्राम/जी जिगर है, और LD प्रोटीन के लिए, यह ०.२५ मिलीग्राम/ इस SDS पृष्ठ द्वारा ~ 10 immunoblots के लिए पर्याप्त सामग्री प्रदान करता है । नीचे प्रोटोकॉल का उपयोग किया अभिकर्मक और एक प्रोटोकॉल एक एकल 1 जी जिगर के लिए उपयुक्त है । सुक्रोज ढाल अलगाव प्रोटोकॉल सातो14 और वू15से अनुकूलित है ।

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Protocol

सभी प्रयोगों प्रयोगशाला कोट, दस्ताने, और सुरक्षा चश्में सहित जैव सुरक्षा स्तर 1 के लिए उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण के साथ एक लेबोरेटरी बेंच पर आयोजित किया गया । प्रयोग किया गया प्रोटोकॉल के अनुसार संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) के पेंसिल्वेनिया विश्वविद्यालय के द्वारा अनुमोदित । जानवरों की परेशानी को कम करने के लिए हरसंभव प्रयास किए गए और पशुओं के साथ मानवीय व्यवहार किया गया ।

1. LD अलगाव एक ईआर अलगाव किट का उपयोग

  1. तैयारी
    नोट: सूचीबद्ध राशि एक एकल 1 जी माउस जिगर के लिए उपयुक्त हैं ।
    1. 1x समपरासारी निष्कर्षण बफर (ie बफर, ईआर आइसोलेशन किट से) के 10 मिलीलीटर 5x IE बफर के 2 मिलीलीटर ultrapure पानी की 8 मिलीलीटर के साथ कमजोर द्वारा तैयार करते हैं । बफर को बर्फ पर रखकर ठंडा कर दे ।
    2. 1x फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) की १०० मिलीलीटर 10x PBS के ९० मिलीलीटर में ultrapure पानी की 10 मिलीलीटर को कमजोर करके तैयार करें । इसे बर्फ पर रखकर ठंडा कर के रख दीजिये ।
    3. 5% की 10 मिलीलीटर पॉलीएथीलीन ग्लाइकोल पी-(1, 1, 3, 3-टेट्रामेथिलब्यूटिल)-फिनाइल ईथर (पीजीपीई) ९.५ मिलीलीटर में पीजीपीई के ५०० μl को कमजोर करके अल्ट्राप्योर वॉटर तैयार करें । यह चिपचिपा है के रूप में PGPE बाहर मापने के लिए एक 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करें । इसे बर्फ पर रखकर ठंडा कर के रख दीजिये ।
    4. उन्हें बर्फ पर रखकर सभी ट्यूबों कूल: १.७ मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों, 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूबों, ५० मिलीलीटर उच्च गति अपकेंद्री ट्यूबों, और 13 मिलीलीटर ultracentrifuge ट्यूबों ।
    5. 4 डिग्री सेल्सियस के लिए सभी आवश्यक अपकेंद्रित्र शांत: एक microcentrifuge, 15 मिलीलीटर ट्यूबों के लिए एक उच्च क्षमता केंद्राभ, ५० मिलीलीटर ट्यूब के लिए एक उच्च गति केंद्राभ, और एक ultracentrifuge ।
    6. Autoclaving द्वारा संदंश और विच्छेदन कैंची जीवाणुरहित ।
  2. ऊतक तैयारी
    1. यह 10 मिनट के लिए १००% CO2 से भरा एक चैंबर में रखकर माउस euthanize. ग्रीवा अव्यवस्था प्रदर्शन द्वारा इच्छामृत्यु की पुष्टि करें ।
    2. बाँझ संदंश और विच्छेदन कैंची का प्रयोग, जिगर को बेनकाब करने के लिए त्वचा और पेट के पीछे की मांसपेशियों की परतों में कटौती.
    3. जिगर को डायाफ्राम और आंत से जोड़ने वाले स्नायुबंधन को काटें । उपयोग संदंश आंत को जिगर से दूर खींचने के लिए, पीछे की ओर, स्नायुबंधन का पर्दाफाश करने के लिए ।
    4. जिगर और पृष्ठीय ribcage के बीच कट, जिगर मुक्त है जब तक पूर्वकाल से आगे बढ़ रहा है ।
    5. एक ठंडी 5 सेमी पेट्री डिश के लिए जिगर ठंड 1x PBS के 10 मिलीलीटर के साथ स्थानांतरण ।
    6. 5 सेमी पेट्री डिश में 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ठंड 1x PBS के 10 मिलीलीटर में एक कमाल के मंच पर 2x जिगर धो लो । अंतिम धोने के बाद 1x PBS बंद डालो ।
    7. 5 सेमी पेट्री डिश में 3 – 5 मिमी टुकड़े में जिगर पासा करने के लिए एक आकार-10 बाँझ सर्जिकल ब्लेड ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करें (चित्र 1a) ।
    8. 5 सेमी पेट्री डिश में 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ठंड 1x PBS के 10 मिलीलीटर के साथ diced जिगर 2x धो लो ।
      नोट: लाइसोसोम अलगाव के लिए, एक स्वच्छ ४५ मिलीलीटर homogenizer के लिए जिगर के ०.५ ग्राम हस्तांतरण और लाइसोसोम निष्कर्षण किट द्वारा आपूर्ति की दिशाओं का पालन करें ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
    9. Decant 1x PBS और ठंड ४५ एमएल Dounce homogenizer को diced जिगर टुकड़े हस्तांतरण । सभी टुकड़ों homogenizer के नीचे करने के लिए जाना सुनिश्चित करें ।
    10. ठंड 1x IE बफर के 7 मिलीलीटर जोड़ें (ईआर अलगाव किट से) और बर्फ पर homogenize ऊपर और 20x नीचे मूसल चलती द्वारा । सुनिश्चित करें कि मूसल प्रत्येक स्ट्रोक के दौरान homogenizer के नीचे करने के लिए चला जाता है ।
    11. Homogenate (चित्र 1b) एक ठंडा करने के लिए स्थानांतरण 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब ।
    12. (ईआर अलगाव किट से) ठंड 1x IE बफर के 1 मिलीलीटर के साथ homogenizer कुल्ला और homogenizer के आराम करने के लिए इस जोड़ें ।
  3. LD अलगाव
    1. एक उच्च क्षमता वाले अपकेंद्रित्र में समांग को १,००० x ळ में 4 ° ब् पर 10 मि (चित्र 1c) के लिए अपकेंद्रण करके नाभिक को निकालें ।
    2. एक नया, ठंड ५० मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए postnuclear supernatant (PNS) स्थानांतरण । LD हानि को रोकने के लिए, सुनिश्चित करें कि किसी भी 15 मिलीलीटर ट्यूब के शीर्ष पर इकट्ठा किया गया लिपिड PNS स्थानांतरित करने से पहले resuspended है ।
    3. शुद्धता विश्लेषण के लिए PNS की एक १०० μL aliquot ले लो और यह एक ठंडा १.७ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में जगह है । इसे बर्फ पर अलग सेट करें ।
    4. माइटोकॉन्ड्रिया को हटाने के लिए, PNS नमूना, नहीं aliquot, १२,००० x g पर एक रेफ्रिगेरेटेड हाई-स्पीड अपकेंद्रित्र में 4 ° c पर 15 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र ।
      1. वैकल्पिक: क्रूड LD (cld) आइसोलेट्स (cytosol और कोशिका झिल्ली संदूषण के साथ) के लिए, एक गिलास पिपेट का उपयोग कर शीर्ष लिपिड परत इकट्ठा करने और यह एक १.७ मिलीलीटर माइक्रोअपकेंद्रित्र ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण । धारा १.४ को जारी रखें ।
    5. एक ultracentrifuge ट्यूब करने के लिए पोस्टमाइटोकॉन्ड्रियल supernatant (पीएमएस) स्थानांतरण । LD हानि को रोकने के लिए, यह सुनिश्चित करें कि किसी भी शीर्ष पर एकत्र लिपिड पीएमएस स्थानांतरित करने से पहले resuspended है ।
    6. शुद्धता विश्लेषण के लिए पीएमएस के एक १०० μL aliquot ले लो और यह एक ठंडा १.७ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में जगह है । इसे बर्फ पर अलग सेट करें ।
    7. Ultracentrifuge के दौरान ट्यूब ढहने को रोकने के लिए ठंड 1x IE बफर के साथ किनारा करने के लिए एक ultracentrifuge ट्यूब भरें ।
    8. शेष नमूनों और उंहें एक ultracentrifuge में १००,००० x g में 4 डिग्री सेल्सियस पर ६० मिनट के लिए अपकेंद्रित्र (चित्रा 1d) ।
    9. LD परत को हटाने के लिए, एक ४५ ° कोण पर ट्यूब झुकाव और aspirate करने के लिए एक गिलास पिपेट का उपयोग करें । एक ठंडी १.७ मिलीलीटर माइक्रोअपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए गोली स्थानांतरण ।
      नोट: पेलेट में इक्का-दुक्का ईआर होते हैं । ईआर आइसोलेशन के लिए इस अंश डाउनस्ट्रीम का उपयोग करें ।
    10. शुद्धता विश्लेषण के लिए लिपिड लेयर के तहत पोस्ट-एर सुपरनेटंट (प्रति) की १०० μL लीजिए ।
  4. एलडी धुलाई
    1. एक १.७ microcentrifuge ट्यूब में एकत्र LD अंश को 1x PBS जोड़ें १.३ मिलीलीटर की कुल मात्रा के लिए ।
    2. भंवर नमूना ।
    3. किसी भी सेल मलबे गोली करने के लिए 4 ° c पर 5 मिनट के लिए शीर्ष गति पर एक माइक्रोअपकेंद्रित्र में अपकेंद्रित्र । ट्यूब को हाथ से धीरे से गर्म करें ताकि एलडी लेयर को पुनः निलंबित किया जा सके । एक नए १.७ मिलीलीटर माइक्रोअपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए, लिपिड परत सहित supernatant स्थानांतरण ।
    4. दोहराएं कदम 1.4.1 – 1.4.3 2x-3x, जब तक गोली अब दिखाई नहीं है ।
    5. १.५ मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा के लिए गोली मुक्त LD supernatant के लिए 1x PBS जोड़ें । 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए शीर्ष गति पर एक microकेंद्राभिचार में अपकेंद्रण द्वारा लिपिड अंश धो लो ।
    6. लिपिड परत को परेशान किए बिना एक गिलास पिपेट के साथ 1x PBS (लिपिड परत के नीचे) के 1 मिलीलीटर निकालें ।
    7. दोहराएं कदम 1.4.5 और 1.4.6 4x-5x, जब तक 1x PBS नेत्रहीन कोई turbidity के साथ पारदर्शी है ।
    8. एक गिलास पिपेट (चित्र 1X) का उपयोग कर, लिपिड परत के नीचे सभी 1X pbs निकालें ।
    9. परिणाम का प्रयोग करें, एक शुद्ध LD अंश, डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए ।
  5. एलडी प्रोटीन बिसीनचिनिनिक एसिड परख द्वारा क्वांटीकरण
    नोट: एक bicinchoninic एसिड परख (बीसीए) अगर एलडी आकारिकी का आकलन किया जाना है का उपयोग न करें ।
    1. 5% PGPE के ५०० μL में LD को निलंबित ।
    2. ९५ डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए नमूनों उबाल लें, उन्हें भंवर, और 5 मिनट के लिए शांत करने के लिए कमरे के तापमान पर नमूनों सेबेट.
    3. 1.5.2 कदम एक अतिरिक्त 2x दोहराएं ।
    4. एक 30 एस के साथ 5 मिनट के लिए नमूने sonicate/
    5. सभी शुद्धता विश्लेषण के नमूनों में प्रोटीन एकाग्रता को मापने और बीसीए परख द्वारा LD अंश में नमूनों को सामान्य ।

2. LD आइसोलेशन सुक्रोज घनत्व ढाल का उपयोग

  1. तैयारी
    1. TE बफर के २०० मिलीलीटर बनाओ (10 मिमी Tris-एचसीएल [पीएच ७.४], 1 मिमी EDTA [पीएच ८.०]) । इसे बर्फ पर रखकर ठंडा कर के रख दीजिये ।
    2. ६०% की १०० मिलीलीटर (w/) सुक्रोज समाधान te बफर में ६० ग्राम सुक्रोज के te बफ़र में भंग, १०० मिलीलीटर के लिए अंतिम मात्रा लाने के द्वारा बनाओ । इसे बर्फ पर रखकर ठंडा कर के रख दीजिये ।
    3. ४० (w/v) सुक्रोज समाधान के 6 मिलीलीटर ६०% सुक्रोज से 2 मिलीलीटर ते बफर के 4 मिलीलीटर जोड़कर बनाओ । इसे बर्फ पर रखकर ठंडा कर के रख दीजिये ।
    4. ६०% सुक्रोज के ३.५ मिलीलीटर से २.५ मिलीलीटर जोड़ कर 25% की 6 मिलीलीटर (w/ इसे बर्फ पर रखकर ठंडा कर के रख दीजिये ।
    5. ६०% सुक्रोज के ३.३ मिलीलीटर से ०.७ मिलीलीटर को जोड़कर 10% की 4 मिलीलीटर (w/ इसे बर्फ पर रखकर ठंडा कर के रख दीजिये ।
    6. प्रोटीज़ और फॉस्फेट अवरोधक घोल के 10 मिलीलीटर के लिए दोनों प्रोटीज और फॉस्फेट अवरोधकों की एक गोली जोड़ने के द्वारा 10 मिलीलीटर ते बफर बनाओ ।
    7. ६०% सुक्रोज स्टॉक समाधान के ५० मिलीलीटर के लिए प्रोटीज और फॉस्फेट अवरोध करनेवाला समाधान के 4 मिलीलीटर जोड़कर ऊतक homogenate बफर तैयार । इसे बर्फ पर रखकर ठंडा कर के रख दीजिये ।
    8. 2 मिलीलीटर प्रोटीज़ और फॉस्फेट अवरोधक घोल को ५० मिलीलीटर ते बफर से जोड़कर ओवरले बफर तैयार करें । इसे बर्फ पर रखकर ठंडा कर के रख दीजिये ।
    9. 10x PBS की 10 मिलीलीटर की ९० मिलीलीटर में ultrapure पानी को कमजोर करके 1x PBS की १०० मिलीलीटर तैयार करें । इसे बर्फ पर रखकर ठंडा कर के रख दीजिये ।
    10. ९.५ मिलीलीटर अल्ट्राप्योर वाटर में पीजीपीई के ५०० μL को कमजोर करके 5% पीजीपीई का 10 मिलीलीटर तैयार करें । यह चिपचिपा है के रूप में PGPE बाहर मापने के लिए एक 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करें । इसे बर्फ पर रखकर ठंडा कर के रख दीजिये ।
    11. उन्हें बर्फ पर रखकर निम्न अपकेंद्रित्र ट्यूबों शांत: १.७ मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रलाइज ट्यूबों, 15 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूजी ट्यूबों, ५० मिलीलीटर उच्च गति केंद्राभ ट्यूबों, और 13 मिलीलीटर ultracentrifuge ट्यूबों ।
    12. 4 डिग्री सेल्सियस के लिए आवश्यक अपकेंद्रित्र कूल: एक माइक्रोअपकेंद्री, एक उच्च क्षमता केंद्राभ (15 मिलीलीटर ट्यूब के लिए), एक उच्च गति के अपकेंद्री (५० मिलीलीटर ट्यूब के लिए), और एक ultracentrifuge ।
  2. ऊतक तैयारी
    1. उपयोग 1.2.1 कदम-1.2.9 homogenization के लिए ऊतक तैयार करने के लिए ।
    2. ठंड ऊतक homogenate बफर के 7 मिलीलीटर जोड़ें और यह बर्फ पर मूसल ऊपर और नीचे 20x ले जाकर homogenate । पहले पांच स्ट्रोक के दौरान, सुनिश्चित मूसल homogenizer के नीचे करने के लिए चला जाता है ।
    3. एक ठंडा करने के लिए homogenate स्थानांतरण 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब ।
    4. ठंडे ऊतक homogenizer बफर के 1 मिलीलीटर के साथ homogenizer कुल्ला और यह पहले इस्तेमाल किया 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए स्थानांतरण ।
    5. Homogenate की मात्रा 10 मिलीलीटर ऊतक homogenate बफर के साथ लाने के लिए ।
    6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए १,००० x g पर एक उच्च क्षमता के अपकेंद्रित्र में नमूने को अपकेंद्रित्र करते हैं ।
    7. Supernatant के 8 मिलीलीटर एक ५० मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए स्थानांतरण ।
    8. शुद्धता विश्लेषण के लिए पीएन नमूना के रूप में शेष supernatant के १०० μL स्थानांतरण ।
  3. सुक्रोस प्रवणता
    1. एक ४५ ° कोण पर PNS के 8 मिलीलीटर युक्त ५० मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब झुकाव । ध्यान से ४०% सुक्रोज समाधान के 6 मिलीलीटर जोड़ने के लिए, दो चरणों को सुनिश्चित करने के अलग रहते हैं ।
    2. इसी तरह, धीरे से 25% सुक्रोज समाधान के 6 मिलीलीटर जोड़ें; फिर, 10% सुक्रोज समाधान के 4 मिलीलीटर जोड़ें; अंत में, ओवरले बफर के 8 मिलीलीटर जोड़ें ।
    3. 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ३०,००० x g पर एक उच्च गति के अपकेंद्रित्र में नमूने को अपकेंद्रित्र ।
    4. एक १.७ मिलीलीटर माइक्रोअपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए LDs युक्त शीर्ष परत स्थानांतरण ।
    5. LD धोने के लिए, अनुभाग १.४ में दिए गए चरणों का पालन करें ।

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Representative Results

हम लगभग 30 चूहों पर एर किट के साथ LD अलगाव प्रदर्शन किया है और लगभग ४० चूहों पर सुक्रोज अलगाव प्रोटोकॉल का पालन उन लोगों के साथ परिणामों की तुलना में । रिपोर्ट किए गए निष्कर्ष दोनों प्रोटोकॉल के लिए विशिष्ट हैं । चूहों पानी के लिए स्वतंत्र पहुंच के साथ रातोंरात उपवास किया गया, LD उपज में वृद्धि । LD आइसोलेशन एक सुक्रोज ढाल का उपयोग कर समानांतर में ईआर किट LD आइसोलेशन प्रोटोकॉल के साथ चलाया गया था. PNS, पीएमएस, प्रति, CLDs, और LDs के नमूने ईआर किट LD अलगाव प्रोटोकॉल भर में एकत्र किए गए । सुक्रोज आइसोलेशन प्रोटोकॉल के वर्कफ़्लो प्रतिबंध के कारण, केवल pns और LD आइसोलेट संग्रहीत किए गए थे ।

फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के लिए ५० μL अलग LDs के १०० μM 4, 4-Difluoro-1, 3, 5, 7, 8-पेंटामेथिल-4-बोरा-3a, 4a-Diaza-s-Indacene (DPBDI) की एक समान मात्रा के साथ मिलाया गया था । नमूने प्रकाश से संरक्षित और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेटिड थे । नमूनों 1x PBS के 1 मिलीलीटर जोड़कर धोया गया, और अपकेंद्रण और अतिरिक्त बफर के हटाने के बाद । एलडी अंश की, 1 μL माइक्रोस्कोप स्लाइड पर रखा गया था और coverslipped । प्रतिनिधि 20x फ्लोरोसेंट और ब्राइटफील्ड ld छवियों दोनों एर किट ld अलगाव और सुक्रोज ld अलगाव से लिया (चित्रा 2aडी) तरीकों, एक औंधा अनुसंधान माइक्रोस्कोप का उपयोग कर रहे थे ( सामग्री की मेजदेखें) । उपकरण छवियों के कण पदार्थ के समान स्तर प्रकट, विभिंन प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए इसी तरह प्यूरिटीज सुझाव ।

दो प्रोटोकॉलों के बीच उपज में अंतर निर्धारित करने के लिए हमने तुलनात्मक रूप से चूहों और माउस लिवर्स (चित्र 2E, F) का उपयोग किया । शुद्धि के बाद, LD टीजी और प्रोटीन का स्तर वर्णमितीय assays हैं ( सामग्री की मेजदेखें) का उपयोग कर मापा गया और डेटा जिगर वजन के लिए सामान्यीकृत थे (चित्रा 2 जी, एच). हमने पाया, जब हम शुरू सामग्री को सामान्यीकृत, कि एलडी प्रोटीन और टीजी उपज के बाद ld अलगाव एर किट का उपयोग कर और सुक्रोज समान थे । यह निर्धारित करने के लिए यदि ld आकार भी समान था, हम एलडी व्यास छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग मात्रा निर्धारित । LDs ०.२७ से लेकर ६.३७ μm । Ld व्यास के आवृत्ति वितरण से पता चलता है कि एर किट ld अलगाव (चित्रा 3a) और सुक्रोज ld अलगाव (चित्रा 3b) इसी तरह के आकार की उपज LDs ।

एलडी शुद्धता का आकलन करने के लिए, नमूनों को इम्यूनोलोटिंग द्वारा अनिर्धारित किया गया था । नमूना प्रति प्रोटीन की 20 माइक्रोग्राम की राशि एसडीएस पृष्ठ द्वारा assayed था । नमूनों की जांच एलडीएस (PLIN2 और PLIN3), ईआर (Sec61), माइटोकॉन्ड्रिया (VDAC), लायसोसोमस (LAMP1), प्लाज्मा झिल्ली (MEK1), नाभिक (histone H3), और cytosol (GAPDH) (चित्रा 4a) के लिए एंटीबॉडी मार्कर के साथ की गई । सभी नमूनों में ईआर किट एलडी आइसोलेशन प्रति और सूक्रोज पीएन के अलावा PLIN2 का पता लगाया गया । एर किट LD अलगाव और सुक्रोज ढाल प्रोटोकॉल से व्युत्पंन LDs दोनों बराबर शुद्धता थी । ईआर (Sec61), माइटोकॉन्ड्रिया (VDAC1), लाइसोसोम्स (LAMP1), प्लाज्मा झिल्ली (Mek1), या cytosol (GAPDH) के लिए कोई बैंड दिखाई दिया । CLD प्लाज्मा झिल्ली और cytosol संदूषण था, लेकिन ईआर, mitochondria, या lysosomes से कोई स्पष्ट संदूषण. अनुकूलित ईआर प्रोटोकॉल में PLIN2 बैंड की तीव्रता यह दर्शाती है कि ईआर प्रोटोकॉल में लगभग 14 गुणा अधिक PLIN2 की अभिव्यक्ति थी जो पीएन के साथ तुलना में एलडी अंश में थी, जबकि सुक्रोज प्रोटोकॉल के एलडी अंश में एक साठगुना अधिक PLIN2 अभिव्यक्ति थी । डेटा नहीं दिखाया गया है) ।

इस प्रोटोकॉल भी एर और lysosomes शुद्ध करने का विकल्प है, क्योंकि हम भी इन organelles की शुद्धता का आकलन करने के लिए पश्चिमी सोख्ता प्रदर्शन किया । चित्रा 4B से पता चलता है कि एक ही ईआर किट का उपयोग कर नमूना से शुद्ध एर के immunoblots ( सामग्री की मेजदेखें) PLIN2 से मुक्त थे, लेकिन ईआर Sec61A प्रोटीन के महत्वपूर्ण स्तर पर था । लाइसोसोमल संवर्धन किट ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करते हुए, लाइसोसोमल आगे अलग और LD के लिए immunoblotted थे (PLIN2), ईआर (Sec61A), और lysoand (LAMP1) मार्करों (चित्रा 4c). साथ में, इन आंकड़ों से पता चलता है कि प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लाइसोसोम शुद्धि किट के साथ संयोजन में, जिगर LDs, एर के शुद्ध अलगाव के लिए अनुमति देते हैं, और एक ही जानवर से lysosomes ।

Figure 1
चित्रा 1: संदर्भ चित्रों के दौरान लिया LD अलगाव एक ईआर अलगाव किट का उपयोग . (क) 5 सेमी पेट्री डिश में 5 एमएम लिवर के टुकड़ों को diced किया । (ख) एक दलन homogenate में homogenate के बाद जिगर homogenate । (ग) १,००० x gपर अपकेंद्रण के बाद यकृत homogenate; शीर्ष पर मामूली लिपिड परत, PNS, और सेल मलबे और परमाणु अंश युक्त गोली ध्यान दें । (घ) १००,००० x जीपर अल्ट्रासेट रिफ्यूगेशन के बाद एलडी लेयर; शीर्ष पर प्रमुख लिपिड परत, प्रति, और नीचे पर ईआर अंश ध्यान दें । (ङ) पीबीएस को अंतिम रूप से हटाने से पहले धोया गया एलडी अंश । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2: माइक्रोग्राफ और मात्रात्मक विश्लेषण एक ईआर किट के साथ अलग ld अंश और sucrose के साथ अलग ld अंश की तुलना । प्रतिनिधि 20x के फ्लोरोसेंट सूक्ष्मालेख (क) एक ईआर किट के साथ अलग एक dpbdi-दाग LD अंश और (ख) के साथ अलग LDs sucrose । (ग) एक ईआर किट के साथ अलग एलडी अंश का ब्राइटफील्ड माइक्रोग्राफ और (घ) सुक्रोज के साथ अलग किया गया एलडी अंश । पैमाने बार = 20 μm. (ई) माउस वजन और (च) जिगर वजन । (छ) शुद्ध एलडीएस से यकृत भार को सामान्यीकृत टीजी उपज । (ज) शुद्घ एलडीएस से प्रोटीन की पैदावार को यकृत भार तक सामान्य बनाया जाता है । डेटा का अर्थ है ± SEM (N = 4) । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: LD आकार के आवृत्ति वितरण । चार विभिंन चूहों से नमूने DPBDI और प्रतिनिधि 20x क्षेत्रों के साथ दाग रहे थे मात्रा निर्धारित थे । व्यास एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर मापा गया । (क) किसी ईआर-किट के उपयोग से अलग एलडी अंश का बारंबारता (अंश) वितरण । (ख) सुक्रोज प्रवणता घनत्व के उपयोग से पृथक एलडी अंश का बारंबारता (अंश) वितरण । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4: इम्यूनोलोटिंग द्वारा LD शुद्धता का विश्लेषण । (क) ईआर किट एलडी आइसोलेशन और सुक्रोज आइसोलेशन प्रोटोकॉल के अनुकूलित प्रोटोकॉल की तुलना करने के लिए प्रति नमूना 20 माइक्रोग्राम प्रोटीन इम्यूनोलोडीड था । निम्नलिखित नमूने लोड किए गए: postnuclear supernatant (पीएन), पोस्टमाइटोकॉन्ड्रियल supernatant (पीएमएस), पोस्टएंडोप्लाज्मिक रेप्लिका supernatant (प्रति), क्रूड LDs (CLD), और LDs (LD) । नमूने LDs (PLIN2 और PLIN3), ईआर (SEC61A), माइटोकॉन्ड्रिया (VDAC1), लाइसोसोम (LAMP1), कोशिका झिल्ली (MEK1), नाभिक (histone H3) और cytosol (gapdh) मार्कर के लिए immunoblotted थे । (ख) ईआर किट एलडी आइसोलेशन प्रोटोकॉल ( सामग्री तालिकादेखें) का उपयोग कर ईआर के और शुद्धिकरण के बाद किसी ईआर अंश का शुद्धता विश्लेषण । PNS, पीएमएस, ईआर, और LDs थे लोड और LDs (PLIN2) और ईआर (SEC61A) के लिए immunoblotted । (ग) लाइसोसोमल के और अधिक शुद्धिकरण के बाद एक लाइसोसोमल अंश का शुद्धता विश्लेषण लिसोकुछ संवर्धन किट प्रोटोकॉल का उपयोग कर ( सामग्री तालिकादेखें) । (PLIN2), ईआर (SEC61A), और लाइसोसोमल (LAMP1) के लिए pns और एक लाइसोसोमल अंश लोड और immunoblotted थे । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यकृत LD जीवविज्ञान तेजी से दोनों स्वास्थ्य और रोग में hepatocellular शरीर क्रिया विज्ञान के एक महत्वपूर्ण नियामक के रूप में मांयता प्राप्त किया जा रहा है । सदाशयी organelles के रूप में, LDs गतिशील हैं, अंय सेलुलर संरचनाओं के साथ बातचीत, और उंहें बायोएक्टिव दोनों लिपिड और ग्लूकोज homeostasis में शामिल घटकों के भीतर होते हैं । सुक्रोज ढाल नियमित रूप से एलडी अलगाव के लिए इस्तेमाल किया जाता है और जांचकर्ताओं ld संरचना का अध्ययन करने के लिए सक्षम बनाता है, लेकिन यह उन्हें कई buffers बनाने के लिए की आवश्यकता है । हम प्रदर्शन किया है कि एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ईआर अलगाव किट का उपयोग एक और उपकरण है कि न केवल LD अलगाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन एर और lysosome के अग्रानुक्रम अलगाव के लिए, सेलुलर गतिशीलता के एक और अधिक व्यापक दृष्टिकोण के लिए अनुमति देने में बदलती प्रायोगिक शर्तों, कार्यप्रवाह में महत्वपूर्ण वृद्धि के बिना ।

इस नए प्रोटोकॉल की ताकत व्यावसायिक या आसानी से उपलब्ध अभिकर्मकों और एक साथ कई organelles अलग करने की क्षमता का उपयोग कर सेटअप के अपने आसानी है । हालांकि, इस नई विधि को ध्यान में रखने के लिए संभावित कमियां हैं । इस प्रोटोकॉल में कई कदम नुकसान हो सकता है जिगर से supersized LDs के अलगाव । Dounce homogenization कतरनी तनाव के माध्यम से बड़े LDs को बाधित करने की क्षमता है । एक ढीला फिटिंग दंस homogenizer सेटअप बड़े LDs के लिए तनाव के कुछ कम हो सकता है । इसके अतिरिक्त, एक १००,००० x जी स्पिन कार्यरत है, LD और एर के जुदाई के लिए अनुमति देता है । इस गति भी बड़े LDs के एक नुकसान का कारण हो सकता है, के रूप में एक रिपोर्ट २,००० x g जिगर LD शुद्धि2के लिए अनुशंसा करता है । इस प्रक्रिया की एक सीमा है कि यह हाल ही में16वर्णित के रूप में विभिंन आकारों के LDs को अलग करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, हालांकि सुक्रोज बफ़र्स नाजुक homogenization2, 1x IE बफर पैदावार इसी तरह की आकृति विज्ञान और सुक्रोज ढाल अलगाव से व्युत्पंन के रूप में आकार वितरण के साथ शुद्ध LDs के साथ homogenization के उपयोग के माध्यम से बरकरार रख सकते है . इसके अलावा अध्ययन जैविक गतिविधि एक pbs बफर के उपयोग से प्रभावित है, तो यह निर्धारित करने के लिए आवश्यक हो जाएगा, जो आमतौर पर इस्तेमाल किया समपरासारी बफ़र्स2से कम कोमल है. क्योंकि इन संभावित सीमाओं के, यह पहली बार दो केंद्रान्तरित कदम के दौरान महत्वपूर्ण है के लिए पूरी तरह से supernatant स्थानांतरित करने से पहले शीर्ष पर एकत्र लिपिड को निलंबित करने के लिए और अलग ऊतकों. यकृत प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत 20 स्ट्रोक का उपयोग करता है, अंय प्रकाशित2काम करने के लिए एक तुलनीय आकार वितरण उपज ।

LD अलगाव एंडोप्लाज्मिक रेटीक्यूलम आइसोलेशन किट का उपयोग कर दोनों क्रूड और शुद्ध LD आइसोलेट्स पैदावार । Cld आइसोलेट्स कोशिका झिल्ली और cytosol घटक होते हैं, लेकिन इस तरह के microscopy के साथ LD आकारिकी के मूल्यांकन के रूप में कुछ अनुप्रयोगों के लिए पर्याप्त साबित हो सकता है. शुद्ध LD अलग, के रूप में PLIN2 अभिव्यक्ति द्वारा निर्धारित, एर, mitochondrial, lysosomal, कोशिका झिल्ली, या cytosol संदूषण का अभाव है । दरअसल, शुद्ध एर किट ld अलगाव प्रोटोकॉल से अलग PLIN2 से अधिक दोहरा सुक्रोज LD अलगाव विधि के साथ तुलना में समृद्ध । यह अंतर अप्रत्याशित था, प्रोटीन और टीजी उपज में समानता दी है, लेकिन एक resuspension बफर के रूप में pbs के उपयोग के कारण हो सकता है के रूप में सुक्रोज या समपरासारी बफर के लिए विरोध किया ।

एलडी पृथक्करण पारंपरिक तरीकों से भी प्लाज्मा की झिल्ली2द्वारा ld अंश के संदूषण से ग्रस्त कर सकते हैं । हालांकि इस सह अलगाव सभी LD अलगाव के तरीकों में आम है और मन में रखा जाना चाहिए जब LD का विश्लेषण2, डेटा यहां प्रस्तुत प्रदर्शन है कि आगे cld अलग ऐसे contaminants के नमूने rids का ultracentrifugation ( चित्रा 4) । भविष्य रूपांतरों के एक फ्रांसीसी प्रेस या नाइट्रोजन बम के उपयोग के लिए सेल झिल्ली को और अधिक धीरे से बाधित और आगे CLD वियोजक2के किसी भी संदूषण को कम करने के लिए शामिल कर सकते हैं ।

अंत में, एर किट LD अलगाव विधि एक आम तौर पर इस्तेमाल सेलुलर जीव विज्ञान उपकरण के एक उपंयास अनुप्रयोग है । यह पद्धति इसी प्रकार सुक्रोज ग्रैडिएंट आइसोलेशन करने के लिए, कम अभिकर्मक तैयारी के साथ करता है । इसके अलावा, ईआर किट एलडी आइसोलेशन प्रोटोकॉल में तैयार अभिकर्मकों को शामिल करने से प्रायोगिक स्थितियों की कठोरता और पुनरुत्प्रासियता में सुधार होता है ।

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Disclosures

Dr. Carr अवरोधन फार्मास्यूटिकल्स से अनुसंधान सहायता प्राप्त करता है ।

Acknowledgments

हम अब्रामसन फैमिली कैंसर रिसर्च इंस्टीट्यूट का शुक्रिया अदा करते हैं । यह काम निम्नलिखित अनुदान द्वारा समर्थित है: NIH/निएएए R01 AA026302-01, NIH/निएएए K08-AA021424, रॉबर्ट वुड जॉनसन फाउंडेशन, हेरोल्ड अमोस चिकित्सा संकाय विकास पुरस्कार, ७१५८, IDOM DRC पायलट पुरस्कार P30 DK019525 (R.M.C.); NIH/निएएए F32-AA024347 (जेसी) । इस काम के हिस्से में NIH P30-DK050306 और उसके प्रमुख सुविधाओं (आणविक पैथोलॉजी और इमेजिंग कोर, आणविक जीवविज्ञान/जीन अभिव्यक्ति कोर, और सेल संस्कृति कोर) और इसके पायलट अनुदान कार्यक्रम द्वारा समर्थित था । सामग्री केवल लेखकों की जिंमेदारी है और जरूरी स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के सरकारी विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करता है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BioExpress Vortex Mixer GeneMate S-3200-1 Vortex Mixer
Centrifuge 54242 R Eppendorf 54242 R Refrigerated Counter Microcentrifuge
Rotor: FA-45-24-11
Centrifuge Sorvall RC6 + Thermo Scientific RC6+ Refrigerated High Speed Centrifuge
Rotor: F21S-8x50y
Centrifuge Sorvall Legend RT+ Thermo Scientific Legend RT+ Refrigerated High Capacity Centrifuge
Rotor: 75006445 Bucket: 75006441
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Sigma Aldrich 04 693 116 001 Protease Inhibitor Tablets
Diagenode Bioruptur UCD-200 Diagenode UCD-200 Sonication System
Dounce Tissue Grinder (45 mL) Wheaton 357546 Use Loose pestle
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) Corning 21-031-CM
Endoplasmic Reticulum Isolation Kit Sigma Aldrich ER0100 For ER kit Extraction:
Contains:
Isotonic Extraction Buffer 5X 100 mL
Hypotonic Extraction Buffer 10 mL
Calcium chloride, 2.5 M solution 5 mL
OptiPrep Density Gradient Medium 100 mL
Blunt Nosed Needle 1 ea.
External light source for flourescent excitation Leica Leica EL6000
Hydrochloric acid Sigma Aldrich H1758 Hydrochloric Acid
ImageJ Image Analysis Software
Inverted Modulating Contrast Microscope Leica Leica DM IRB
Lysosome Enrichment Kit for Tissues and Cultured Cells Thermo Fisher Scientific 89839 For Lysosome Isolation
Microscope Camera Qimaging QICAM fast 1394
Optima XL-100K Ultracentrifuge Beckman-Coulter XL-100K Ultracentrifuge
Rotor: SW41Ti
Pasteur Pipettes Fisher Scientific 22-042817
Petri Dish 5 cm Fisher Scientific FB0875713A
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23225
PhosSTOP Sigma Aldrich 04 906 845 001 Phosphatase Inhibior Tablets
Sterile Surgical Blade #10 Pioneer S2646
Sucrose Fisher Scientific S5-500 Crystalline/Certified ACS
Triglyceride Liquicolor Kit Stanbio  2200-225 Colorimetric Triglyceride kit
Tris Base Fisher Scientific BP152-1 For TE buffer
Triton X-100 Fisher BioReagents BP151-100 5%, Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether, Protein Lysis Reagent
UltraPure EDTA (0.5M, pH 8.0) Thermo Fisher Scientific 15575-038 For TE buffer

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References

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जीवविज्ञान अंक १४६ लिपिड छोटी बूंद अलगाव जिगर perilipin 2 एंडोप्लाज्मिक रेटीक्यूलम सुक्रोज ढाल समपरासारी निष्कर्षण बफर
एक अच्छी तरह से स्थापित Organelle अलगाव किट का उपयोग रैपिड लिपिड छोटी बूंद आइसोलेशन प्रोटोकॉल
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Brettschneider, J., Correnti, J. M., … More

Brettschneider, J., Correnti, J. M., Lin, C., Williams, B., Oranu, A., Kuriakose, A., McIver-Jenkins, D., Haba, A., Kaneza, I., Jeon, S., Scorletti, E., Carr, R. M. Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit. J. Vis. Exp. (146), e59290, doi:10.3791/59290 (2019).

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