Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Rask Lipid slippverktøy isolasjon protokollen bruker en Well-established Organelle isolering Kit

Published: April 19, 2019 doi: 10.3791/59290
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Division of Gastroenterology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokollen etablerer en ny metode for lipid slippverktøy isolasjon og rensing fra musen lever, bruker en veletablert endoplasmatiske retikulum isolering kit.

Abstract

Lipid dråper (LDs) er bioaktive organelles funnet i stoffer i de fleste eukaryotic og noen prokaryote celler. LDs består av nøytrale lipider omsluttet av en monolayer av fosfolipider og proteiner. Hepatic LD lipider, som ceramides og proteiner er innblandet i flere sykdommer som forårsaker nedsatt Steatose. Selv om tidligere metoder har blitt opprettet for LD isolasjon, de krever en tidkrevende forberedelse av reagenser og er ikke utformet for isolering av flere subcellular rom. Vi forsøkte å etablere en ny protokoll for å aktivere isolering av LDs, endoplasmatiske retikulum (ER) og lysosomer fra en enkelt musen lever.

Videre, reagenser i protokollen presenteres her er kommersielt tilgjengelig og krever minimal reagens forberedelse uten å ofre LD renhet. Her presenterer vi data sammenligne denne nye protokollen til en standard sukrose gradient protokoll, demonstrere sammenlignbare renhet, morfologi og avkastning. I tillegg kan vi isolere ER og lysosomer bruker samme prøven, gir innsikt i dannelsen og intracellulær fluks av lipider og deres tilhørende proteiner.

Introduction

LDs er bioaktive organelles funnet i stoffer i de fleste eukaryotic celler og noen prokaryote celler1,2,3. LD kjernen består av nøytrale lipider som triglyserider (TG) og kolesterol estere. De inneholder også ceramides, bioaktive lipider involvert i cellulær signalnettverk trasé4,5. LDs er omgitt av en phospholipid monolayer og belagt med proteiner, inkludert perilipin proteiner perilipin 2 (PLIN2) og 3 (PLIN3)1,5,6. Også tilstede er lipogenic enzymer og lipases membran menneskehandel proteiner som er koblet til flere hepatisk steatotic sykdommer, inkludert alkoholfrie fatty leversykdom, alkoholholdige leversykdom og hepatitt C3,5 ,,6,,7,,8,,9,,10.

LDs er tenkt å danne fra den ytre membranen av ER og inneholder nylig syntetisert TG fra ER-avledet frie fettsyrer11. Men det er ukjent om de grupperte lipider bud, forbli tilkoblet eller er forbrukeravgift fra ER6,11, gjør isolasjon av LDs fri fra ER teknisk utfordrende. Frie fettsyrer kan være frigjort fra LDs av overflate lipases å gi for energiproduksjon eller membran syntese. I tillegg kan LDs være dårligere via lipophagy som en regulerende mekanisme og produsere frie fettsyrer12.

I tillegg ER og lysosomer, finnes det andre-som mitokondrier, endosomes, peroxisomes og plasma membranen, som finnes i nært samarbeid med LDs11. Denne stramt polygami gjør det vanskelig å utføre en ren LD utvinning. Men kan nøytral lipider medfødte lav tetthet bli tatt nytte av via sentrifugering5.

LDs har tradisjonelt vært isolert bruker en sukrose tetthet gradert1,5,13. Disse metodene har imidlertid ikke utviklet å isolere andre. I tillegg krever de tidkrevende forberedelse av reagenser. Denne protokollen tilpasser en kommersielt tilgjengelig ER isolering kit (se Tabell for materiale) for å tillate LD isolasjon. Vi bruker utvinning bufferen fra settet, legge en LD isolasjon trinn. Videre kan protokollen også brukes for ER og lysosomale isolasjon de samme utvalg, muliggjør en mer omfattende bilde av livet syklus av LDs. For å validere denne nye metoden, analysen vi LD avkastning, morfologi, størrelse og renhet. Vi sammenligne resultatene presenteres her for de med en brukte protokollen utnytter sucrose gradering LD isolering.

Vi brukte en 10 - 12 uke-gamle, 20 g kvinnelige C57BL/6 musen fastet 16 h (mat fjerning på 5 kl. 9: am LD isolasjon tid) med gratis tilgang til vann. Den typiske avkastningen for TG er 0.6 mg/g leveren, og LD protein, er det 0,25 mg/g leveren. Dette gir nok materiale til ~ 10 immunoblots SDS side. Protokollen nedenfor detaljer reagensene brukes og en protokoll som er egnet for en enkelt 1 g lever. Sukrose gradient isolasjon protokollen er tilpasset fra Sato14 og Wu15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimentene ble utført på en laboratoriebenk med personlig verneutstyr passer for biosikkerhet nivå 1, inkludert en labfrakk, hansker og vernebriller. Eksperimenter ble utført i henhold til protokoller godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved University of Pennsylvania. Alle forsøk ble gjort for å minimere dyr ubehag, og dyrene ble behandlet med human omsorg.

1. LD isolasjon bruker en ER isolering kit

  1. Forberedelse
    Merk: Oppførte beløpene er egnet for en enkelt 1 g musen lever.
    1. Klargjør 10 mL 1 x isotonic utvinning buffer (IE buffer, fra ER isolering kit) ved å fortynne 2 mL 5 x IE buffer med 8 mL ultrapure vann. Cool bufferen ved å plassere den på is.
    2. Klargjør 100 mL 1 x fosfat-bufret saltvann (PBS) ved å fortynne 10 mL 10 x PBS i 90 mL ultrapure vann. Avkjøle den ved å plassere den på is.
    3. Klargjør 10 mL av 5% polyetylenglykol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-fenyl Eter (PGPE) ved utvannende 500 µL av PGPE i 9,5 mL ultrapure vann. Bruk en 1 mL sprøyte måle ut PGPE som det er tyktflytende. Avkjøle den ved å plassere den på is.
    4. Cool alle rør ved å plassere dem på is: 1,7 mL microcentrifuge rør, 15 mL sentrifuge rør, 50 mL høyhastighets sentrifuge rør og 13 mL ultracentrifuge rør.
    5. Cool alle nødvendige sentrifuger 4 ° C: en microcentrifuge, en høykapasitets centrifuge for 15 mL rør, en høyhastighets sentrifuge for 50 mL rør og en ultracentrifuge.
    6. Sterilisere tang og disseksjon saks av autoklavering.
  2. Vev forberedelse
    1. Euthanize musen ved å plassere den i et kammer fylt med 100% CO2 for 10 min. Bekreft euthanasia ved å utføre cervical forvridning.
    2. Bruke sterilt tang og disseksjon saks, kuttet hud og muskel lagene i magen på bakre/fremre aksen å avsløre leveren.
    3. Kuttet båndene koble leveren til membran og tarmen. Bruk tang til å trekke i tarmen fra lever, mot den bakre, å avsløre leddbånd.
    4. Klipp opp mellom leveren og dorsal brystkasse, flytte fra fremre bakre til leveren er frigjort.
    5. Overføre leveren til en kald 5 cm Petriskål med 10 mL kaldt 1 x PBS.
    6. Vask leveren 2 x på en rocking plattform i 10 mL kaldt 1 x PBS i 5 min på 4 ° C i 5 cm Petriskål. Hell av 1 x PBS etter siste vask.
    7. Bruk en størrelse-10 sterile kirurgisk blad (se Tabell for materiale) å terningene leveren i 3 – 5 mm biter i 5 cm Petriskål (figur 1A).
    8. Vask terninger leveren 2 x med 10 mL kaldt 1 x PBS i 5 min på 4 ° C i 5 cm Petriskål.
      Merk: Lysosome isolering, overføre 0,5 g av leveren til en ren 45 mL homogenizer og følg instruksjonene levert av lysosome utvinning kit (se Tabell for materiale).
    9. Dekanter 1 x PBS og overføre terninger leveren bitene til det kalde 45 mL Dounce homogenizer. Sikre alle gå til bunnen av homogenizer.
    10. Legg 7 mL kaldt 1 x IE bufferen (fra ER isolering kit) og homogenize på isen ved å flytte støter opp og ned 20 x. Kontroller at støter går til bunnen av homogenizer under hvert strøk.
    11. Overføre homogenate (figur 1B) til en kald 15 mL sentrifuge rør.
    12. Skyll homogenizer med 1 mL kaldt 1 x IE buffer (fra ER isolering kit) og legge denne til resten av homogenate.
  3. LD isolasjon
    1. Fjern kjerner ved sentrifugering homogenate i en høykapasitets centrifuge 1000 x g for 10 min på 4 ° C (figur 1 c).
    2. Overføre postnuclear nedbryting (PNS) til en ny, kald 50 mL sentrifuge rør. For å hindre LD tap, sikrer du at eventuelle lipid samlet på toppen av 15 mL tube er resuspended før du overfører PNS.
    3. Ta en 100 µL aliquot av PNS for renhet analyse og plassere det i et kaldt 1,7 mL microcentrifuge rør. Sett den til side på is.
    4. Hvis du vil fjerne mitokondrier, sentrifuge PNS prøven, ikke aliquot, i en nedkjølt høyhastighets sentrifuge 12.000 x g i 15 min på 4 ° C.
      1. Valgfri: For råolje LD (CLD) isolerer (med stoffer og cellemembranen forurensning), samle topp lipid laget med en glass pipette og overføre den til en 1,7 mL microcentrifuge tube. Fortsette til delen 1.4.
    5. Overføre postmitochondrial nedbryting (PMS) til en ultracentrifuge tube. For å hindre LD tap, sikrer du at eventuelle lipid samlet på toppen er resuspended før du overfører PMS.
    6. Ta en 100 µL aliquot av PMS for renhet analyse og plassere det i et kaldt 1,7 mL microcentrifuge rør. Sett den til side på is.
    7. Fyll en ultracentrifuge rør til randen med kaldt 1 x IE buffer for å hindre røret kollapset under ultracentrifugation.
    8. Balanse prøvene og sentrifuge dem i en ultracentrifuge på 100.000 x g for 60 min på 4 ° C (figur 1 d).
    9. Hvis du vil fjerne LD laget, tilt røret i 45° vinkel og bruke en glass pipette inneholder. Overføre pellet til en kald 1,7 mL microcentrifuge tube.
      Merk: Pellet inneholder isolert ER. Bruk denne fraksjonen nedstrøms ER isolering.
    10. Samle 100 µL av post-ER nedbryting (PER) under lipid laget for renhet analyse.
  4. LD vask
    1. Legge til 1 x PBS LD brøken samlet i en 1,7 microcentrifuge tube, til et totalt volum på 1,3 mL.
    2. Vortex prøven.
    3. Virvel i en microcentrifuge i full fart i 5 min på 4 ° C pellets noen celle rusk. Varme rør forsiktig med hender for å hjelpe resuspend LD laget. Overføre nedbryting, inkludert lipid laget, til en ny 1,7 mL microcentrifuge tube.
    4. Gjenta trinn 1.4.1–1.4.3 2 x-3 x, til pellet er ikke lenger synlig.
    5. Legge til 1 x PBS pellet-gratis LD supernatant til et siste volum på 1,5 mL. Vask lipid brøkdel av sentrifugering i en microcentrifuge i full fart i 5 min på 4 ° C.
    6. Fjerne 1 mL 1 x PBS (under lipid laget) med et glass pipette uten å forstyrre lipid laget.
    7. Gjenta trinn 1.4.5 og 1.4.6 4 x-5 x, til 1 x PBS er visuelt gjennomsiktig med ingen turbiditet.
    8. Fjerne alle 1 x PBS under lipid-laget ved hjelp av en glass pipette (figur 1E).
    9. Bruke resultatet, en ren LD brøk, for nedstrøms.
  5. LD protein kvantifisering av bicinchoninic syre analysen
    Merk: Ikke bruk en bicinchoninic syre analysen (BCA) hvis LD morfologi skal vurderes.
    1. Resuspend LD på 500 μL 5% PGPE.
    2. Kok prøvene i 5 min på 95 ° C, vortex dem, og Inkuber prøvene ved romtemperatur for 5 min å kjøle.
    3. Gjenta trinn 1.5.2 en ekstra 2 x.
    4. Sonicate prøvene i 5 min med 30 s av/på-syklus, middels intensitet.
    5. Normalisere prøvene ved å måle protein konsentrasjonen i alle renhet analyse prøver og LD brøkdel av BCA analysen.

2. LD isolasjon bruker sukrose tetthet gradert

  1. Forberedelse
    1. Gjøre 200 mL TE buffer (10 mM Tris-HCl [pH 7.4], 1 mM EDTA [pH 8.0]). Avkjøle den ved å plassere den på is.
    2. Gjøre 100 mL 60% (w/v) sucrose løsning i TE buffer ved oppløsning 60 g av sukrose i TE buffer, bringe det siste bindet til 100 mL. Avkjøle den ved å plassere den på is.
    3. Gjøre 6 mL av 40% (w/v) sucrose løsning ved å legge til 4 mL av 60% sukrose 2 mL TE buffer. Avkjøle den ved å plassere den på is.
    4. Gjøre 6 mL av 25% (w/v) sucrose løsning ved å legge til 2,5 mL av 60% sukrose 3,5 mL TE bufferen. Avkjøle den ved å plassere den på is.
    5. Gjør 4 mL 10% (w/v) sucrose løsning ved å legge til 0,7 mL av 60% sukrose 3.3 mL TE bufferen. Avkjøle den ved å plassere den på is.
    6. Gjøre 10 mL av protease og fosfatase hemmer løsning ved å legge til en tablett på både protease og fosfatase hemmere 10 mL av TE buffer.
    7. Forberede vev homogenate buffer ved å legge protease og fosfatase hemmer løsning 4 mL til 50 mL av 60% sukrose lagerløsning. Avkjøle den ved å plassere den på is.
    8. Forberede overlegg bufferen ved å legge 2 mL protease og fosfatase hemmer løsning til 50 mL av TE buffer. Avkjøle den ved å plassere den på is.
    9. Forberede 100 mL 1 x PBS fortynne 10 mL 10 x PBS i 90 mL ultrapure vann. Avkjøle den ved å plassere den på is.
    10. Forberede 10 mL av 5% PGPE ved utvannende 500 µL av PGPE i 9,5 mL ultrapure vann. Bruk en 1 mL sprøyte måle ut PGPE som det er tyktflytende. Avkjøle den ved å plassere den på is.
    11. Cool følgende sentrifuge rør ved å plassere dem på is: 1,7 mL microcentrifuge rør, 15 mL sentrifuge rør, 50 mL høyhastighets sentrifuge rør og 13 mL ultracentrifuge rør.
    12. Avkjøle den nødvendige sentrifuger 4 ° C: en microcentrifuge, en høykapasitets sentrifuge (for 15 mL rør), en høyhastighets sentrifuge (for 50 mL rør) og en ultracentrifuge.
  2. Vev forberedelse
    1. Bruk trinnene 1.2.1–1.2.9 for å forberede vevet homogenisering.
    2. Legg 7 mL kaldt vev homogenate buffer og homogenize det på isen ved å flytte støter opp og ned 20 x. Under de fem første slag, sikre pistil går til bunnen av homogenizer.
    3. Overføre til homogenate til en kald 15 mL sentrifuge rør.
    4. Skyll homogenizer med 1 mL kaldt vev homogenate buffer og overføre den til tidligere brukte 15 mL sentrifuge røret.
    5. Bringe volumet av homogenate opptil 10 mL med vev homogenate buffer.
    6. Sentrifuge eksemplet i en høykapasitets centrifuge 1000 x g for 10 min på 4 ° C.
    7. Overføring 8 mL av nedbryting slik 50 mL sentrifuge.
    8. Overføre 100 µL gjenværende nedbryting av som PNS utvalg for renhet analyse.
  3. Sukrose gradering
    1. Vipp 50 mL sentrifuge røret som inneholder den 8 mL PNS i 45° vinkel. Forsiktig legge 6 mL av 40% sukrose løsning, sikre de to fasene bo separat.
    2. I en lignende måte, sakte Legg 6 mL av 25% sukrose løsning; Legg deretter til 4 mL 10% sukrose løsning; til slutt Legg 8 mL overlegg bufferen.
    3. Sentrifuge eksemplet i en høyhastighets sentrifuge 30.000 x g på 4 ° C i 30 min.
    4. Overføre det øverste laget som inneholder ld slik 1,7 mL microcentrifuge.
    5. For LD vasking, følger du trinnene i delen 1.4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi har utført LD isolasjon med ER kit på ca 30 mus og sammenlignet resultatene med de følgende sukrose isolasjon protokollen på ca 40 mus. Rapporterte funnene er typisk for begge protokollene. Mus var fastet natten med fri tilgang til vann, øke LD avkastningen. LD isolasjon bruker sukrose gradering var kjøre parallelt med ER kit LD isolasjon protokollen. Prøver av PNS, PMS, PER CLDs og LDs var samlet gjennom ER settet LD isolasjon protokollen. På grunn av arbeidsflyten begrensning av sukrose isolasjon protokollen, bare den PNS og LD isolere ble samlet.

For fluorescerende mikroskopi, 50 µL av isolerte LDs ble blandet med en like volum på 100 µM 4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene (DPBDI). Prøvene var beskyttet fra lys og ruges i romtemperatur i 30 min. Prøvene ble vasket ved å legge til 1 mL 1 x PBS, etterfulgt av sentrifugering og fjerning av overflødig buffer. LD brøkdel, ble 1 µL plassert på en microscope skyve og coverslipped. Representant 20 x fluorescerende og brightfield LD bilder ble tatt fra både ER kit LD isolasjon og sukrose LD isolasjon (figur 2A-D) metoder, bruker et omvendt oppslag mikroskopet (se Tabell for materiale). Brightfield bildene viser lignende nivåer av svevestøv, tyder tilsvarende purities ved hjelp av forskjellige protokoller.

Hvis du vil finne forskjellen i avkastning mellom de to protokollene, brukte vi høytaler størrelse mus og mus lever (figur 2EF). Følgende rensing, LD vs og protein nivåer ble målt ved hjelp kolorimetrisk analyser (se Tabell for materiale) og dataene var normalisert leveren vekt (figur 2 gH). Vi fant, når normalisert utgangsmaterialet, at LD protein og TG gi etter LD isolasjon bruke ER kit og sukrose var lik. Å avgjøre hvis LD størrelsen var også lignende, vi kvantifisert LD diameter med analyseprogramvare (se Tabell for materiale). LDs varierte fra 0,27 til 6,37 µm. Frekvens distribusjon av LD diameter viser at ER kit LD isolasjon (figur 3A) og sukrose LD isolasjon (figur 3B) gi LDs av lignende størrelse.

For å vurdere LD renhet, var prøvene assayed av immunoblotting. En mengde 20 µg protein per eksempel var assayed av SDS side. Prøvene ble undersøkt med antistoff indikatorer for LDs (PLIN2 og PLIN3), ER (Sec61), mitokondrier (VDAC), lysosomer (LAMP1), plasma membran (MEK1), kjerner (histone H3) og stoffer (GAPDH) (figur 4A). PLIN2 ble oppdaget i alle prøver bortsett fra ER settet LD isolasjon PER og den sukrose PNS. Ld avledet fra ER kit LD isolasjon og sukrose gradient protokollen begge hadde like renhet. Ingen band opptrådte for ER (Sec61), mitokondrier (VDAC1), lysosomer (LAMP1), plasma membran (Mek1) eller stoffer (GAPDH). CLD hadde plasma membranen og stoffer forurensning, men ingen tydelig forurensning fra ER, mitokondrier eller lysosomer. Intensiteten av PLIN2 bandet tilpasset ER protokollen angir at protokollen ER hadde ca 14-fold høyere PLIN2 uttrykk i LD fraksjonen sammenlignet med PNS, mens sukrose protokollen hadde et sixfold høyere PLIN2 uttrykk i LD brøkdel ( data ikke vist).

Fordi denne protokollen har også muligheten til å rense ER og lysosomer, har vi også utført vestlige blotting å vurdere renheten av disse organeller. Figur 4B viser at immunoblots av renset ER fra samme eksempel bruker ER kit (se Tabell for materiale) var PLIN2 men hadde betydelige nivåer av proteinet som ER Sec61A. Bruke lysosomale anriking kit (se Tabell for materiale), lysosomer var ytterligere isolert og immunoblotted for LD (PLIN2), ER (Sec61A) og lysosome (LAMP1) markører (figur 4C). Sammen disse dataene viser at protokollen presenteres her, i kombinasjon med kommersielt tilgjengelig lysosome rensing kits, tillater ren isolering av leveren LDs ER og lysosomer fra en enkelt dyr.

Figure 1
Figur 1: referanse bilder tatt under den LD isolasjon bruker en ER isolering kit . (A) terninger 5 mm leveren brikker i en 5 cm Petriskål. (B) lever homogenate etter homogenisering i en Dounce homogenizer. (C) lever homogenate etter sentrifugering 1000 x g; Merk det liten lipid laget på toppen, PNS og pellets inneholder celle rusk og kjernefysiske fraksjon. (D) LD lag etter ultracentrifugation på 100.000 x g; Merk fremtredende lipid-lag på toppen og PER ER brøken på bunnen. (E) Washed LD brøk før endelig fjerning av PBS. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: mikroskop-bilde og kvantitativ analyse sammenligne LD brøken isolert med en ER kit og LD brøken isolert med sukrose. Representant 20 x fluorescerende mikroskop-bilde av (A) en DPBDI-farget LD brøkdel isolert med en ER kit og (B) LDs isolert med sukker. (C) Brightfield mikroskop-bilde av LD brøken isolert ER kit og (D) LD brøken isolert med sukker. Baren skala = 20 µm. (E) musen vekt og (F) lever vekt. (G) TG avkastning fra renset LDs normalisert leveren vekt. (H) Protein avkastning fra renset LDs normalisert leveren vekt. Dataene er gjennomsnittlig ± SEM (N = 4). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Frekvensfordeling LD størrelser. Prøver fra fire forskjellige mus var farget med DPBDI og representant 20 x felt kvantifisert. Diameter ble målt ved hjelp av en analyseprogramvare. (A) frekvensen (brøkdel) distribusjon av en LD brøkdel isolert bruker en ER-kit. (B) (brøkdel) fordelingen av en LD fraksjon isolert bruker sukrose gradient tetthet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: analyse av LD renhet av immunoblotting. (A) å sammenligne tilpasset protokollen ER kit LD isolasjon og sukrose isolasjon protokollen, 20 µg protein per eksempel var immunoblotted. Følgende eksempler ble lastet: postnuclear nedbryting (PNS), postmitochondrial nedbryting (PMS), postendoplasmic retikulum nedbryting (PER), råolje LDs (CLD) og LDs (LD). Prøvene var immunoblotted for LDs (PLIN2 og PLIN3), ER (SEC61A), mitokondrier (VDAC1), lysosome (LAMP1), celle membran (MEK1), kjerner (histone H3) og stoffer (GAPDH) markører. (B) renhet analyse av en ER brøk etter ytterligere rensing er bruker ER kit LD isolasjon protokollen (se Tabell for materiale). PNS, PMS, ER og LDs var lastet og immunoblotted for LDs (PLIN2) og ER (SEC61A). (C) renhet analyse av en lysosomale brøkdel etter ytterligere rensing av lysosomer ved hjelp av lysosome berikelse kit protokollen (se Tabell for materiale). PNS og en lysosomale brøkdel var lastet og immunoblotted for LDs (PLIN2), ER (SEC61A) og lysosomer (LAMP1). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hepatic LD biologi er stadig blir anerkjent som en viktig regulator av hepatocellulært fysiologi i både helse og sykdom. Som bona fide organeller, LDs er dynamiske, samhandle med andre cellulære strukturer og inneholde innenfor dem bioaktive komponenter involvert i både lipid og glukose homeostase. Sukrose forløpningen brukes rutinemessig LD isolering og aktiverer etterforskerne å studere LD struktur, men det krever dem til å gjøre flere buffere. Vi har vist at bruk av en kommersielt tilgjengelig ER isolering kit er en annen verktøyet det kan brukes ikke bare LD isolering men tandem isolering ER og lysosome, slik at for en mer omfattende visning av mobilnettet dynamics svar på varierende eksperimentelle forhold, uten betydelig økning i arbeidsflyten.

Styrken i denne nye protokollen er dens lette av installasjon ved hjelp av kommersielt eller lett tilgjengelig reagenser og dens evne til å isolere flere organeller samtidig. Men er det potensielle ulemper til denne nye metoden å huske. Flere trinn i denne protokollen kan ulempe isolering av supersized LDs fra leveren. Dounce homogenisering har potensial til å forstyrre store LDs gjennom skjæring stress. En løst passer Dounce homogenizer oppsett kan lindre noen av stresset store LDs. i tillegg, en 100.000 x g spinn er ansatt, slik at skillet mellom LD og ER. Denne hastigheten kan også forårsake tap av store LDs, som rapporten anbefaler 2000 x g for leveren LD rensing2. En begrensning i denne fremgangsmåten er at det ikke kan brukes til å isolere LDs av forskjellige størrelser som nylig beskrevet16. I tillegg, selv om sukrose buffere kan holde skjøre LDs intakt gjennom bruk av mild homogenisering2, gir homogenisere med 1 x IE buffer ren LDs med lignende morfologi og størrelsesDistribusjon som avledet fra sukrose gradient isolasjon . Videre studier vil være nødvendig å avgjøre hvis den biologiske aktiviteten påvirkes ved bruk av en PBS buffer, som er mindre skånsom enn vanlig isotonic buffere2. På grunn av disse mulige begrensninger, er det avgjørende i de første to sentrifuge trinnene til å fullt resuspend lipid samlet øverst før du overfører nedbryting og bestemme empirisk effekten av hjerneslag nummeret på LD avkastningen for ulike vev. Leveren protokollen presenteres her bruker 20 slag, gir en tilsvarende størrelsesDistribusjon til andre publisert arbeid2.

LD isolasjon bruke endoplasmatiske retikulum isolering kit gir både olje og ren LD isolater. CLD isolerer inneholder celle membran og stoffer komponenter, men kan være tilstrekkelig for noen programmer, for eksempel evalueringen av LD morfologi med mikroskopi. Den rene LD isolere, mangler som bestemmes av PLIN2 uttrykk, ER, mitokondrie, lysosomale, cellen membran eller stoffer forurensning. Faktisk beriker den ren isolere fra ER kit LD isolasjon protokollen PLIN2 mer enn todelt sammenlignet med metoden sukrose LD isolasjon. Denne forskjellen var uventet, gitt likheten i protein og TG gi, men kan skyldes bruk av PBS som rørets bufferen i motsetning til sukrose eller isotonic buffer.

LD isolasjon av tradisjonelle metoder kan også lider forurensning av LD brøkdel av plasma membranen2. Selv om denne co isolasjon er vanlig i alle LD isolasjon metoder og bør holdes i bakhodet når analysere LD isolerer2, dataene som presenteres her viser at ytterligere ultracentrifugation av CLD isolere rids utvalget av slike ( Figur 4). Fremtidige tilpasninger kan inkludere bruk av en fransk trykk eller nitrogen bombe å forstyrre cellemembranen mer forsiktig og redusere eventuelle forurensning av CLD isolere2.

Avslutningsvis er ER kit LD isolasjon metoden en roman anvendelse av et brukte mobilnettet biologi verktøy. Denne metoden utfører tilsvarende til sukrose gradient isolasjon, med mindre forberedelse av reagenser. I tillegg forbedrer inkludering av forberedt reagenser i ER kit LD isolasjon protokollen rigor og reproduserbarhet av eksperimentelle forhold.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dr. Carr mottar forskningsstøtte fra avskjære legemidler.

Acknowledgments

Vi takker Abramson familie Cancer Research Institute. Dette arbeidet er støttet av følgende bevilgninger: NIH/NIAAA R01 AA026302-01, NIH/NIAAA K08-AA021424, Robert Wood Johnson Foundation, Harold Amos medisinske fakultet Development Award, 7158, IDOM DRC Pilot Award P30 DK019525 (R.M.C.); NIH/NIAAA F32-AA024347 (JC). Dette arbeidet var støttes delvis av NIH P30-DK050306 og fasilitetene kjernen (molekylær patologi og Imaging Core molekylærbiologi/Gene Expression kjernen og celle kultur kjernen) og sin pilot gi programmet. Innholdet er ansvar forfattere og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synet til National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BioExpress Vortex Mixer GeneMate S-3200-1 Vortex Mixer
Centrifuge 54242 R Eppendorf 54242 R Refrigerated Counter Microcentrifuge
Rotor: FA-45-24-11
Centrifuge Sorvall RC6 + Thermo Scientific RC6+ Refrigerated High Speed Centrifuge
Rotor: F21S-8x50y
Centrifuge Sorvall Legend RT+ Thermo Scientific Legend RT+ Refrigerated High Capacity Centrifuge
Rotor: 75006445 Bucket: 75006441
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Sigma Aldrich 04 693 116 001 Protease Inhibitor Tablets
Diagenode Bioruptur UCD-200 Diagenode UCD-200 Sonication System
Dounce Tissue Grinder (45 mL) Wheaton 357546 Use Loose pestle
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) Corning 21-031-CM
Endoplasmic Reticulum Isolation Kit Sigma Aldrich ER0100 For ER kit Extraction:
Contains:
Isotonic Extraction Buffer 5X 100 mL
Hypotonic Extraction Buffer 10 mL
Calcium chloride, 2.5 M solution 5 mL
OptiPrep Density Gradient Medium 100 mL
Blunt Nosed Needle 1 ea.
External light source for flourescent excitation Leica Leica EL6000
Hydrochloric acid Sigma Aldrich H1758 Hydrochloric Acid
ImageJ Image Analysis Software
Inverted Modulating Contrast Microscope Leica Leica DM IRB
Lysosome Enrichment Kit for Tissues and Cultured Cells Thermo Fisher Scientific 89839 For Lysosome Isolation
Microscope Camera Qimaging QICAM fast 1394
Optima XL-100K Ultracentrifuge Beckman-Coulter XL-100K Ultracentrifuge
Rotor: SW41Ti
Pasteur Pipettes Fisher Scientific 22-042817
Petri Dish 5 cm Fisher Scientific FB0875713A
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23225
PhosSTOP Sigma Aldrich 04 906 845 001 Phosphatase Inhibior Tablets
Sterile Surgical Blade #10 Pioneer S2646
Sucrose Fisher Scientific S5-500 Crystalline/Certified ACS
Triglyceride Liquicolor Kit Stanbio  2200-225 Colorimetric Triglyceride kit
Tris Base Fisher Scientific BP152-1 For TE buffer
Triton X-100 Fisher BioReagents BP151-100 5%, Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether, Protein Lysis Reagent
UltraPure EDTA (0.5M, pH 8.0) Thermo Fisher Scientific 15575-038 For TE buffer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Isolation of Lipid Droplets from Cells by Density Gradient Centrifugation. Current Protocols in Cell Biology. 72, (2016).
  2. Ding, Y., et al. Isolating lipid droplets from multiple species. Nature Protocols. 8 (1), 43-51 (2013).
  3. Gao, Q., Goodman, J. M. The lipid droplet-a well-connected organelle. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 49 (2015).
  4. Correnti, J. M., et al. Ethanol and C2 ceramide activate fatty acid oxidation in human hepatoma cells. Scientific Reports. 8 (1), 12923 (2018).
  5. Williams, B., et al. A novel role for ceramide synthase 6 in mouse and human alcoholic steatosis. FASEB Journal. 32 (1), 130-142 (2018).
  6. Carr, R. M., Ahima, R. S. Pathophysiology of lipid droplet proteins in liver diseases. Experimental Cell Research. 340 (2), 187-192 (2016).
  7. Carr, R. M., et al. Perilipin Staining Distinguishes Between Steatosis and Nonalcoholic. Steatohepatitis in Adults and Children. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 15 (1), 145-147 (2017).
  8. Carr, R. M., et al. Reduction of TIP47 improves hepatic steatosis and glucose homeostasis in mice. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (8), R996-R1003 (2012).
  9. Carr, R. M., Peralta, G., Yin, X., Ahima, R. S. Absence of perilipin 2 prevents hepatic steatosis, glucose intolerance and ceramide accumulation in alcohol-fed mice. PLoS One. 9 (5), e97118 (2014).
  10. Tsai, T. H., et al. The constitutive lipid droplet protein PLIN2 regulates autophagy in liver. Autophagy. 13 (7), 1130-1144 (2017).
  11. Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V. Jr, Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. Journal of Cell Science. 122 (Pt 6), 749-752 (2009).
  12. Liu, K., Czaja, M. J. Regulation of lipid stores and metabolism by lipophagy. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 3-11 (2013).
  13. Mannik, J., Meyers, A., Dalhaimer, P. Isolation of cellular lipid droplets: two purification techniques starting from yeast cells and human placentas. Journal of Visualized Experiments. (86), e509814 (2014).
  14. Sato, S., et al. Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein. Journal of Biochemistry. 139 (5), 921-930 (2006).
  15. Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R. 3rd, McManaman, J. L. Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells. Electrophoresis. 21 (16), 3470-3482 (2000).
  16. Zhang, S., et al. Morphologically and Functionally Distinct Lipid Droplet Subpopulations. Scientific Reports. 6, 29539 (2016).

Tags

Biologi problemet 146 Lipid slippverktøy isolasjon lever perilipin 2 endoplasmatiske retikulum sukrose gradient isoton utvinning buffer
Rask Lipid slippverktøy isolasjon protokollen bruker en Well-established Organelle isolering Kit
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brettschneider, J., Correnti, J. M., … More

Brettschneider, J., Correnti, J. M., Lin, C., Williams, B., Oranu, A., Kuriakose, A., McIver-Jenkins, D., Haba, A., Kaneza, I., Jeon, S., Scorletti, E., Carr, R. M. Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit. J. Vis. Exp. (146), e59290, doi:10.3791/59290 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter