Summary
Este protocolo estabelece um novo método de isolamento de gotículas lipídicas e purificação do fígado de rato, usando um kit de isolamento bem-estabelecida retículo endoplasmático.
Abstract
Gotículas lipídicas (LDs) são bioativas organelas encontradas no citosol do mais eucarióticas e algumas células procarióticas. LDs é composto de lipídios neutros, envolvidos por uma monocamada de fosfolipídios e proteínas. Lipídios de LD hepáticos, tais como as ceramidas e as proteínas estão implicados em várias doenças que causam esteatose hepática. Embora métodos anteriores tenham sido estabelecidos para isolamento de LD, exigem uma preparação demorada dos reagentes e não são projetados para o isolamento de vários compartimentos subcellular. Procuramos estabelecer um novo protocolo para permitir o isolamento de LDs, retículo endoplasmático (ER) e lisossomos de um fígado de rato único.
Além disso, todos os reagentes utilizados no protocolo aqui apresentado estão disponíveis comercialmente e exigem preparação do reagente mínima sem sacrificar a pureza de LD. Aqui nós apresentamos dados comparando este novo protocolo para um protocolo de gradiente de sacarose padrão, demonstrando rendimento, morfologia e pureza comparável. Além disso, podemos isolar ER e lisossomos usando a mesma amostra, fornecendo uma visão detalhada para a formação e o fluxo intracelular de lipídios e suas proteínas associadas.
Introduction
LDs são bioativas organelas encontradas no citosol de células eucarióticas mais e algumas células procarióticas1,2,3. O núcleo de LD é composto de lipídios neutros como triglicérides (TG) e ésteres de colesterol. Eles também contêm ceramidas, lipídios bioativos envolvidos em vias sinalização celular4,5. LDs estão rodeados por uma monocamada de fosfolípidos e revestidos com proteínas, incluindo a perilipin de proteínas perilipin 2 (PLIN2) e 3 (PLIN3)1,5,6. Também presentes estão as enzimas lipogénicos, lipases e proteínas de membrana de tráfico que têm sido associadas a várias doenças steatotic hepáticas, incluindo doença hepática gordurosa não alcoólica, doença hepática alcoólica e hepatite C3,5 ,6,7,8,9,10.
LDs é pensado para formar a membrana exterior do PS e conter recentemente sintetizada TG proveniente de ácidos graxos livres de ER-derivado11. No entanto, continua a ser desconhecido se os lipídios em pool Brote, permanecem conectados, ou são extirpado da ER6,11, fazendo o isolamento do LDs livre de ER tecnicamente desafiador. Ácidos graxos livres podem ser liberto de LDs pela ação de lipases superfície para fornecer para a produção de energia ou síntese de membrana. Além disso, LDs pode ser degradado através de lipophagy como um mecanismo regulatório e para a produção de ácidos graxos livres12.
Além do ER e lisossomos, existem outras organelas — tais como endossomos, mitocôndrias, peroxissomos e a membrana plasmática — que são encontrados dentro de estreita associação de LDs11. Esta poligamia apertada dificulta a realizar uma extração LD pura. No entanto, densidade de baixo inata dos lípidos neutros pode ser aproveitada através de de centrifugação5.
Tradicionalmente, LDs têm sido isolado usando um sacarose densidade gradiente1,5,13. No entanto, estes métodos não foram concebidos para isolar outras organelas. Além disso, eles exigem a demorada preparação dos reagentes. Este protocolo se adapta a um isolamento de ER comercialmente disponível kit (veja a Tabela de materiais) para permitir o isolamento de LD. Nós usamos o buffer de extração fornecido pelo kit, adicionando uma etapa de isolamento de LD. Além disso, o protocolo também pode ser usado para ER e isolamento dos lisossomos, usando as mesmas amostras, permitindo uma imagem mais abrangente do ciclo de vida do LDs. Para validar este novo método, nós do ensaio rendimento LD, morfologia, tamanho e pureza. Comparamos os resultados aqui apresentados aos obtidos com um protocolo amplamente usado, utilizando um gradiente de sacarose para isolamento de LD.
Usamos um 10 de 12-semanas, 20 g feminino C57BL/6 rato jejuou por 16 h (remoção de comida às 17:00 por um tempo de isolamento do LD de 09:00), com livre acesso à água. O rendimento típico de TG é de 0,6 mg/g fígado, e por proteínas de LD, é 0,25 mg/g fígado. Isto fornece material suficiente para ~ 10 immunoblots por SDS PAGE. O protocolo abaixo detalha os reagentes usados e um protocolo apropriado para um fígado único 1G. O protocolo de isolamento gradiente de sacarose é adaptado do Sato14 e Wu15.
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Protocol
Todos os experimentos foram realizados em uma bancada de laboratório com equipamento de proteção pessoal apropriado para o nível de biossegurança 1, incluindo um jaleco, luvas e óculos de segurança. Experimentos foram realizados de acordo com os protocolos aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da Universidade da Pensilvânia. Foram envidados todos os esforços para minimizar o desconforto do animal, e os animais foram tratados com crueldade.
1. isolamento de LD usando um kit de isolamento de ER
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Preparação
Nota: Os valores listados são adequados para um fígado de rato único 1G.- Prepare-se 10 mL de 1 x isotónica solução tampão (buffer de IE, do kit de isolamento de ER) diluindo-se 2 mL de tampão de IE x 5 com 8 mL de água ultrapura. Legal o buffer, colocando-o no gelo.
- Prepare 100 mL de tampão fosfato salino (PBS) de 1x diluindo-se 10 mL de PBS de x 10 em 90 mL de água ultrapura. Calma, colocando-o no gelo.
- Prepare-se 10 mL de 5% polietileno glicol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-fenil éter (PGPE) diluição 500 µ l do PGPE em 9,5 mL de água ultrapura. Use uma seringa de 1 mL para medir PGPE como é viscoso. Calma, colocando-o no gelo.
- Legal todos os tubos, colocando-os no gelo: 1,7 mL microcentrifuge tubos, tubos de centrífuga de 15 mL, tubos de centrífuga de alta velocidade de 50 mL e tubos de se de 13 mL.
- Legal todas as centrífugas de 4 ° c: microcentrifuga, uma centrífuga de alta capacidade para 15 mL de tubos, uma centrífuga de alta velocidade para tubos de 50 mL e um se.
- Esterilize a tesoura pinça e dissecação em autoclave.
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Preparação do tecido
- Eutanásia o mouse, colocando-o em uma câmara cheia de 100% de CO2 por 10 min. Confirm eutanásia realizando deslocamento cervical.
- Usando Pinças esterilizadas e tesoura de dissecação, cortar as camadas de pele e músculo do abdome no eixo posterior/anterior para expor o fígado.
- Corte os ligamentos conectando o fígado ao diafragma e intestino. Use pinça para puxar o intestino longe do fígado, em direção posterior, para expor os ligamentos.
- Corte entre o fígado e a caixa torácica dorsal, movendo-se do anterior posterior até o fígado é libertado.
- Transferi o fígado a um frio 5 cm placa de Petri com 10 mL de PBS 1x frio.
- Lave o fígado 2 x em uma plataforma de balanço em 10 mL de PBS 1x fria por 5 min a 4 ° C, na prato de Petri de 5 cm. Despeje 1X PBS após a lavagem final.
- Use uma lâmina cirúrgica estéril de tamanho-10 (consulte a Tabela de materiais) para cortar o fígado em pedaços de 3 a 5 mm na 5cm de Petri (figura 1A).
- Lave o fígado picado 2 x com 10 mL de PBS 1x fria por 5 min a 4 ° C, na prato de Petri de 5 cm.
Nota: Para o isolamento do lisossoma, transferir 0,5 g de fígado de um homogeneizador de 45ml limpo e siga as instruções fornecidas pela extração lisossoma kit (veja a Tabela de materiais). - Decantar 1X PBS e transfira os pedaços de fígado picados para o frio 45 mL homogenizacao homogenizador. Certifique-se de todas as peças vão ao fundo do homogenizador.
- Adicionar 7 mL de tampão de IE frio 1x (do kit de isolamento de ER) e homogeneizar no gelo, movendo o pilão e descer 20 x. Certifique-se de que o pilão vai ao fundo do homogenizador durante cada braçada.
- Transferi o homogeneizado (figura 1B) para um tubo de centrífuga 15ml frio.
- Enxágue o homogenizador com 1 mL de frio 1x buffer de IE (do kit de isolamento de ER) e adicione isto ao resto do homogeneizado.
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Isolamento de LD
- Remova núcleos por centrifugação o homogeneizado em uma centrífuga de alta capacidade a 1.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C (Figura 1).
- Transferi o sobrenadante pós-nucleares (PNS) para um tubo de centrífuga de 50ml novo, frio. Para evitar a perda de LD, certifique-se de que qualquer lipídico reuniram-se na parte superior do tubo 15ml é resuspended antes de transferir o PNS.
- Levar um 100 µ l alíquota do PNS para análise de pureza e colocá-lo em um tubo de microcentrifugadora frio 1,7 mL. Coloque-a em gelo.
- Para remover as mitocôndrias, centrifugar a amostra PNS, não a alíquota, numa centrifugadora refrigerada de alta velocidade a 12.000 x g por 15 min a 4 ° C.
- Opcional: para isolados de LD (CLD) bruto (com contaminação do citosol e membrana celular), recolher a camada lipídica superior utilizando uma pipeta de vidro e transferi-lo para um tubo de microcentrifugadora 1,7 mL. Continue a secção 1.4.
- Transferi o sobrenadante postmitochondrial (PMS) para um tubo de se. Para evitar a perda de LD, certifique-se de que qualquer lipídico reuniram-se na parte superior é resuspended antes de transferir o PMS.
- Levar um 100 µ l alíquota das POM para análise de pureza e colocá-lo em um tubo de microcentrifugadora frio 1,7 mL. Coloque-a em gelo.
- Encha um tubo se até a borda com frio 1x buffer de IE para evitar que o tubo em colapso durante a ultracentrifugação.
- Equilibrar as amostras e centrifugue-los em um se a 100.000 x g durante 60 min a 4 ° C (Figura 1).
- Para remover a camada de LD, incline o tubo em um ângulo de 45° e usar uma pipeta de vidro para aspirar. Transferi o sedimento para um tubo de microcentrifugadora frio 1,7 mL.
Nota: A pelota contém ER isolada. Use esta fração a jusante para isolamento de ER. - Colete 100 µ l do sobrenadante post-ER (PER) sob a camada lipídica para análise de pureza.
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Lavagem de LD
- Adicione a fração LD coletada em um tubo de microcentrifugadora 1.7, para um volume total de 1,3 mL 1X PBS.
- A amostra de vórtice.
- Centrifugue em microcentrifuga em alta velocidade por 5 min a 4 ° C para quaisquer detritos de célula de Pelotas. Aquecer o tubo delicadamente com as mãos para ajudar Ressuspender a camada de LD. Transferi o sobrenadante, incluindo a camada lipídica, para um novo tubo de microcentrifuga 1,7 mL.
- Repita as etapas 1.4.1–1.4.3 2 x x-3, até que o sedimento não é mais visível.
- Adicione o LD da pelota-livre sobrenadante para um volume final de 1,5 mL 1X PBS. Lavagem da fração lipídica por centrifugação em microcentrifuga em alta velocidade por 5 min a 4 ° C.
- Retire 1 mL de 1X PBS (por baixo da camada lipídica) com uma pipeta de vidro sem perturbar a camada lipídica.
- Repita as etapas 1.4.5 e 1.4.6 4 x x-5, até o PBS 1x é visualmente transparente com nenhuma turbidez.
- Remover todos os 1X PBS abaixo da camada de lipídios, usando uma pipeta de vidro (Figura 1E).
- Use o resultado, uma fração LD puro, para análise a jusante.
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Quantificação de proteína LD por ensaio de ácido bicinchoninic
Nota: Não utilize um ensaio de ácido bicinchoninic (BCA) se LD morfologia é para ser avaliado.- Resuspenda o LD em 500 μL de PGPE 5%.
- Ferva por 5 min a 95 ° C, as amostras de vórtice-los e incubar as amostras à temperatura ambiente por 5 min esfriar.
- Repita a etapa 1.5.2 um adicional x 2.
- Proceda à sonicação das amostras por 5 min com um 30 s ligar/desligar o ciclo, a intensidade média.
- Normalize as amostras por medir a concentração de proteína em todas as amostras de análise de pureza e na fração LD por ensaio BCA.
2. isolamento de LD usando gradiente de densidade de sacarose
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Preparação
- Fazer 200 mL de tampão TE (10 mM Tris-HCl [pH 7,4], 1 mM EDTA [pH 8.0]). Calma, colocando-o no gelo.
- Fazer 100 mL de solução de sacarose de 60% (p/v) em tampão TE dissolvendo-se 60 g de sacarose em tampão TE, trazendo o volume final de 100 mL. Calma, colocando-o no gelo.
- Fazer 6 mL de solução de sacarose de 40% (p/v) adicionando-se 4 mL de 60% de sacarose para 2 mL de tampão TE. Calma, colocando-o no gelo.
- Fazer 6 mL de solução de sacarose de 25% (p/v) adicionando 2,5 mL de 60% de sacarose para 3,5 mL de tampão TE. Calma, colocando-o no gelo.
- Fazer 4 mL de solução de sacarose 10% (p/v) adicionando 0,7 mL de 60% de sacarose para 3,3 mL de tampão TE. Calma, colocando-o no gelo.
- Fazer 10 mL da solução de inibidor de protease e fosfatase adicionando um comprimido de inibidores de protease e fosfatase para 10 mL de tampão TE.
- Prepare o buffer de homogeneizado de tecido, acrescentando 4 mL de solução de inibidor de protease e fosfatase a 50 mL de solução de sacarose a 60%. Calma, colocando-o no gelo.
- Prepare o buffer de sobreposição, acrescentando 2 mL de solução de inibidor de protease e fosfatase para 50 mL de tampão TE. Calma, colocando-o no gelo.
- Prepare 100 mL de 1X PBS diluindo-se 10 mL de PBS de x 10 em 90 mL de água ultrapura. Calma, colocando-o no gelo.
- Prepare-se 10 mL de 5% PGPE por diluição 500 µ l do PGPE em 9,5 mL de água ultrapura. Use uma seringa de 1 mL para medir PGPE como é viscoso. Calma, colocando-o no gelo.
- Legal os seguintes tubos de centrífuga, colocando-os no gelo: 1,7 mL microcentrifuge tubos, tubos de centrífuga de 15 mL, tubos de centrífuga de alta velocidade de 50 mL e tubos de se de 13 mL.
- Legal os centrifugadores exigidos para 4 ° c: um microcentrifuga, uma centrífuga de alta capacidade (para tubos de 15 mL), uma centrífuga de alta velocidade (para tubos de 50 mL) e uma se.
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Preparação do tecido
- Use 1.2.1–1.2.9 de passos para preparar o tecido para homogeneização.
- Adicionar 7 mL de tampão de homogeneizado de tecido frio e homogeneizá-lo no gelo, movendo o pilão e descer 20 x. Durante os primeiros cinco traços, certifique-se do que pilão vai para o fundo do homogenizador.
- Transferi o homogeneizado para um tubo de centrífuga 15ml frio.
- Enxágue o homogenizador com 1 mL de tampão de homogeneizado de tecido frio e transferir para tubo de centrífuga 15ml utilizado anteriormente.
- Trazer o volume do homogeneizado até 10 mL com tampão de homogeneizado de tecido.
- Centrifugar a amostra em uma centrífuga de alta capacidade a 1.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C.
- Transferência 8 mL do sobrenadante para um tubo de centrífuga de 50 mL.
- Transferi 100 µ l do sobrenadante restante como amostra PNS para análise de pureza.
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Gradiente de sacarose
- Incline o tubo de centrifugação de 50 mL contendo o 8mL de PNS em um ângulo de 45°. Cuidadosamente, adicione 6 mL de solução de 40% de sacarose, garantindo que as duas fases fiquem separadas.
- De forma semelhante, lentamente adicione 6 mL de solução de sacarose de 25%; em seguida, adicione 4 mL de solução de sacarose 10%; Finalmente, adicione 8 mL de tampão de sobreposição.
- Centrifugar a amostra em uma centrífuga de alta velocidade a 30.000 x g a 4 ° C por 30 min.
- Transferi a camada superior que contém o LDs para um tubo de microcentrifugadora 1,7 mL.
- Para lavagem de LD, siga os passos na secção 1.4.
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Representative Results
Nós temos realizado o isolamento LD com o kit de ER em aproximadamente 30 ratos e comparados os resultados com aqueles que seguem o protocolo de isolamento de sacarose em aproximadamente 40 ratos. Os resultados relatados são típicos para ambos os protocolos. Os ratos foram jejuou durante a noite com livre acesso à água, para aumentar o rendimento de LD. Isolamento de LD, usando um gradiente de sacarose foi executado em paralelo com o kit de ER protocolo de isolamento de LD. Amostras de PNS, PMS, PER, CLDs e LDs foram coletado em todo o kit de ER protocolo de isolamento de LD. Devido à restrição do fluxo de trabalho do protocolo de isolamento de sacarose, apenas o isolado PNS e LD foram coletados.
Para a microscopia fluorescente, 50 µ l de LDs isolado foram misturadas com um volume igual de 100 µM de 4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene (DPBDI). As amostras foram protegidas da luz e incubadas à temperatura ambiente por 30 min. As amostras foram lavadas, adicionando 1 mL de 1X PBS, seguido por centrifugação e remoção do excesso buffer. Da fração LD, 1 µ l foi colocada sobre uma lâmina de microscópio e coverslipped. Representante 20 x fluorescentes e brightfield imagens LD foram tirados tanto o isolamento de kit LD ER e o isolamento de sacarose LD métodos (Fig. 2A-D), usando um microscópio invertido de pesquisa (ver a Tabela de materiais). As imagens de brightfield revelam níveis semelhantes de partículas em suspensão, sugerindo purezas semelhantes usando os protocolos diferentes.
Para determinar diferenças de rendimento entre os dois protocolos, usamos ratos comparàvel tamanhos e fígado de rato (Figura 2EF). Seguintes níveis de purificação, LD TG e proteína foram medidos utilizando ensaios colorimétricos (consulte a Tabela de materiais) e os dados foram normalizados para peso de fígado (Figura 2H). Descobrimos, quando nós normalizado de matérias-primas, que a proteína LD e TG rendimento após o isolamento de LD, usando o kit de ER e sacarose foram semelhantes. Para determinar se o tamanho do LD também foi semelhante, nós quantificada diâmetros de LD, usando software de análise de imagem (consulte a Tabela de materiais). LDs variaram de 0,27 a 6.37 µm. A distribuição de frequência de diâmetro LD mostra que o isolamento de kit LD ER (Figura 3A) e isolamento de LD de sacarose (Figura 3B) rendimento LDs de tamanhos semelhantes.
Para avaliar a pureza de LD, as amostras foram doseadas por immunoblotting. Uma quantidade de 20 µ g de proteína por amostra foi analisada por SDS PAGE. As amostras foram analisadas com marcadores de anticorpo LDs (PLIN2 e PLIN3), ER (Sec61), mitocôndrias (proporção), lisossomos (LAMP1), membrana plasmática (MEK1), núcleos (histona H3) e citoplasma (GAPDH) (Figura 4A). PLIN2 foi detectado em todas as amostras, exceto para o kit de ER isolamento LD PER e PNS a sacarose. Os LDs derivado o kit ER isolamento LD e o gradiente de sacarose protocolo ambos teve igual pureza. Não há bandas apareceram para o ER (Sec61), mitocôndrias (VDAC1), lisossomos (LAMP1), membrana plasmática (Mek1) ou o citosol (GAPDH). O CID tinha membrana plasmática e contaminação do citosol mas sem contaminação aparente da ER, mitocôndrias, lisossomos ou. A intensidade da banda PLIN2 no protocolo de ER adaptado indica que o protocolo de ER teve aproximadamente 14-fold PLIN2 maior expressão na fração LD em comparação com o PNS, enquanto o protocolo de sacarose tinha uma expressão de PLIN2 maior sêxtupla na fração (LD dados não mostrados).
Porque este protocolo também tem a opção para purificar ER e lisossomos, realizamos também mancha ocidental para avaliar a pureza destas organelas. Figura 4B mostra que o immunoblots de ER purificado da mesma amostra usando a ER kit (veja a Tabela de materiais) estava livre de PLIN2 mas tinha níveis significativos da proteína Sec61A ER. Usando o enriquecimento dos lisossomos kit (veja a Tabela de materiais), lisossomos estavam mais isoladas e immunoblotted para LD (PLIN2), ER (Sec61A) e marcadores lisossoma (LAMP1) (Figura 4). Juntos, estes dados mostram que o protocolo apresentado aqui, em combinação com kits de purificação lisossoma comercialmente disponível, permitem o isolamento puro de fígado LDs, ER e lisossomos de um único animal.
Figura 1: referência a fotos tiradas durante o Isolamento de LD, usando um kit de isolamento de ER . (A) em cubos de 5 mm de fígado pedaços em um prato de Petri de 5 cm. (B) fígado homogeneizado após homogeneização em um homogeneizador de homogenizacao. (C) fígado homogeneizado após centrifugação a x 1.000 g; Observe a camada lipídica ligeiro na parte superior, o PNS e a pelota contendo restos celulares e fração nuclear. (D) LD camada após ultracentrifugação a 100.000 x g; Observe a camada lipídica proeminente na parte superior, o PER e a fração de ER na parte inferior. (E) lavado LD fração antes da remoção final da PBS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Micrografia e análise quantitativa, comparando a fração LD isolado com um kit de ER e a fração LD isolado com sacarose. Representante 20 x fluorescente micrografia do (A), uma fração LD DPBDI-manchado isolado com um kit de ER e LDs (B) isolado com sacarose. (C) Brightfield Micrografia da fração LD isolado com um kit de ER e (D) a fração LD isolada com sacarose. Barra de escala = 20 µm. (E) o peso do rato e (F) peso do fígado. Rendimento (G) TG do LDs purificado normalizada para o peso do fígado. Proteína (H) rendimento do LDs purificado normalizado para o peso do fígado. Os dados são média ± SEM (N = 4). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Distribuição de frequência de tamanhos LD. Amostras de quatro diferentes ratos estavam manchadas com DPBDI e representante x 20 campos foram quantificados. Os diâmetros foram medidos usando um software de análise de imagem. (A) distribuição de frequência (fração) de uma fração LD isolada usando um kit de ER. (B) distribuição de frequência (fração) de uma fração LD isolada usando densidade gradiente de sacarose. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: análise de pureza, LD em immunoblotting. (A) para comparar o protocolo adaptado do isolamento kit LD ER e o protocolo de isolamento de sacarose, 20 µ g de proteína por exemplo era immunoblotted. Os exemplos a seguir foram carregados: pós-nucleares sobrenadante (PNS), postmitochondrial sobrenadante (PMS), sobrenadante retículo postendoplasmic (PER), LDs bruto (CLD) e LDs (LD). As amostras foram immunoblotted por LDs (PLIN2 e PLIN3), ER (SEC61A), mitocôndrias (VDAC1), lisossoma (LAMP1), membrana celular (MEK1), núcleos (histona H3) e marcadores do citosol (GAPDH). (B) análise de pureza de uma fração de ER depois mais purificação do PS usando o isolamento de kit LD ER protocolo (consulte a Tabela de materiais). PNS, PMS, ER e LDs foram carregados e immunoblotted para o LDs (PLIN2) e ER (SEC61A). (C) análise de pureza de uma fração dos lisossomos após purificação mais de lisossomos usando o kit de enriquecimento do lisossoma protocolo (consulte a Tabela de materiais). PNS e uma fração dos lisossomos foram carregados e immunoblotted para LDs (PLIN2), ER (SEC61A) e lisossomos (LAMP1). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Hepática biologia LD está cada vez mais sendo reconhecida como um regulador crítico da fisiologia hepatocelular na saúde e na doença. Como organelas de boa-fé, LDs são dinâmico, interagem com outras estruturas celulares e conter dentro os componentes bioativos envolvidos na homeostase lipídica e a glicose. O gradiente de sacarose é usado rotineiramente para isolamento de LD e permite que os investigadores estudar a estrutura da LD, mas os obriga a fazer vários buffers. Nós demonstramos que o uso de um kit de isolamento ER comercialmente disponível é outra ferramenta que pode ser usada para isolamento de LD não somente, mas para isolamento em tandem de ER e lisossomo, permitindo uma visão mais abrangente da dinâmica celular em resposta a diferentes condições experimentais, sem aumento significativo no fluxo de trabalho.
A força deste novo protocolo é sua facilidade de instalação usando comercialmente ou reagentes prontamente disponíveis e sua capacidade de isolar organelas múltiplos simultaneamente. No entanto, existem desvantagens potenciais para este novo método para manter em mente. Várias etapas neste protocolo podem prejudicam o isolamento de supersized LDs do fígado. Homogeneização de homogenizacao tem o potencial de perturbar a grande LDs através de tensão de cisalhamento. Um frouxamente montagem instalação do homogenizador homogenizacao pode aliviar um pouco do stress para grandes LDs. Além disso, é empregado um 100.000 x g girar, permitindo a separação de LD e ER. Esta velocidade também pode causar uma perda de LDs grande, como um relatório recomenda 2.000 x g de fígado de purificação LD2. Uma limitação deste procedimento é que não pode ser usado para isolar LDs de tamanhos diferentes, como recentemente descrito16. Além disso, apesar de buffers de sacarose podem manter LDs frágil intacta através do uso de homogeneização suave2, homogeneizando com 1 buffer de IE x produz LDs puro com morfologia semelhante e distribuição de tamanho, como aqueles derivados de isolamento gradiente de sacarose . Mais estudos serão necessários para determinar se a atividade biológica é afectada pelo uso de um tampão PBS, que é menos suave do que comumente usado amortecedores isotônica2. Devido a essas limitações potenciais, é fundamental durante os primeiros passos do dois centrifugador totalmente resuspenda o lipídeo coletado no topo antes de transferir o sobrenadante e determinar empiricamente o efeito do número curso sobre o rendimento de LD para diferentes tecidos. O fígado protocolo aqui apresentado usa 20 cursos, gerando uma distribuição de tamanho comparável a outros trabalhos publicados2.
Isolamento de LD, usando o kit de isolamento do retículo endoplasmático produz isolados de LD cru e puros. Isolados de CID contêm componentes do citosol e membrana celular, mas podem ser suficientes para algumas aplicações, tais como a avaliação da morfologia de LD com microscopia. O isolado puro de LD, conforme determinado pela expressão PLIN2, carece de ER, mitocondrial, dos lisossomos, membrana celular ou contaminação do citosol. Com efeito, o isolado puro do kit ER protocolo de isolamento LD enriquece PLIN2 mais do que a dupla em comparação com o método de isolamento de sacarose LD. Essa diferença era esperada, dada a semelhança em proteína e TG render, mas pode ser devido ao uso de PBS como um buffer de ressuspensão em oposição à sacarose ou tampão isotônico.
Isolamento de LD por métodos tradicionais também pode sofrer de contaminação da fração LD pela membrana plasmática2. Embora este isolamento co é comum em todos os métodos de isolamento de LD e deve ser mantido em mente quando analisando LD isolados2, os dados aqui apresentados demonstram que mais ultracentrifugação do isolado CID livra a amostra de tais contaminantes ( Figura 4). Adaptações futuras podem incluir o uso de uma imprensa francesa ou bomba de nitrogênio para romper a membrana celular mais suavemente e reduzir qualquer contaminação do CID isolar2.
Em conclusão, o kit de ER método de isolamento do LD é um aplicativo romance de uma ferramenta comumente usada biologia celular. Esse método executa de forma semelhante ao isolamento gradiente de sacarose, com menos preparação do reagente. Além disso, a inclusão de reagentes preparados no kit de ER protocolo de isolamento LD melhora a rigidez e a reprodutibilidade das condições experimentais.
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Disclosures
Dr. Carr recebe apoio de pesquisa Pharmaceuticals interceptar.
Acknowledgments
Agradecemos a família Abramson Cancer Research Institute. Este trabalho é apoiado por subsídios seguintes: NIH/tinham R01 AA026302-01, NIH/tinham K08-AA021424, Fundação Robert Wood Johnson, Harold Amos Medical faculdade desenvolvimento Award, 7158, IDOM RDC piloto prêmio P30 DK019525 (R.M.C.); NIH/TINHAM F32-AA024347 (JC). Este trabalho foi financiado em parte pelo NIH P30-DK050306 e programa de concessão de suas instalações de núcleo (Patologia Molecular e Imaging Core, núcleo de expressão de Gene/Biologia Molecular e celular núcleo de cultura) e o seu piloto. O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do institutos nacionais da saúde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioExpress Vortex Mixer | GeneMate | S-3200-1 | Vortex Mixer |
| Centrifuge 54242 R | Eppendorf | 54242 R | Refrigerated Counter Microcentrifuge Rotor: FA-45-24-11 |
| Centrifuge Sorvall RC6 + | Thermo Scientific | RC6+ | Refrigerated High Speed Centrifuge Rotor: F21S-8x50y |
| Centrifuge Sorvall Legend RT+ | Thermo Scientific | Legend RT+ | Refrigerated High Capacity Centrifuge Rotor: 75006445 Bucket: 75006441 |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | 04 693 116 001 | Protease Inhibitor Tablets |
| Diagenode Bioruptur UCD-200 | Diagenode | UCD-200 | Sonication System |
| Dounce Tissue Grinder (45 mL) | Wheaton | 357546 | Use Loose pestle |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) | Corning | 21-031-CM | |
| Endoplasmic Reticulum Isolation Kit | Sigma Aldrich | ER0100 | For ER kit Extraction: Contains: Isotonic Extraction Buffer 5X 100 mL Hypotonic Extraction Buffer 10 mL Calcium chloride, 2.5 M solution 5 mL OptiPrep Density Gradient Medium 100 mL Blunt Nosed Needle 1 ea. |
| External light source for flourescent excitation | Leica | Leica EL6000 | |
| Hydrochloric acid | Sigma Aldrich | H1758 | Hydrochloric Acid |
| ImageJ | Image Analysis Software | ||
| Inverted Modulating Contrast Microscope | Leica | Leica DM IRB | |
| Lysosome Enrichment Kit for Tissues and Cultured Cells | Thermo Fisher Scientific | 89839 | For Lysosome Isolation |
| Microscope Camera | Qimaging | QICAM fast 1394 | |
| Optima XL-100K Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | XL-100K | Ultracentrifuge Rotor: SW41Ti |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 22-042817 | |
| Petri Dish 5 cm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| PhosSTOP | Sigma Aldrich | 04 906 845 001 | Phosphatase Inhibior Tablets |
| Sterile Surgical Blade #10 | Pioneer | S2646 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | Crystalline/Certified ACS |
| Triglyceride Liquicolor Kit | Stanbio | 2200-225 | Colorimetric Triglyceride kit |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | For TE buffer |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151-100 | 5%, Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether, Protein Lysis Reagent |
| UltraPure EDTA (0.5M, pH 8.0) | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | For TE buffer |
References
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