Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

تنقية الكسر الدندي الغنية فيلبوديا

doi: 10.3791/59292 Published: May 2, 2019

Summary

في هذا البروتوكول، نقدم طريقة لتنقية الكسر الغنية بالفيلوبوديا الدرورية من بنية البروز الشبيهة بالأكواب الفاغوية على الخلايا العصبية الفرسامة المستزرعة من خلال الاستفادة من التقارب المحدد والقوي بين الفيلوبودي الدندرية جزيء التصاق، TLCN، وجزيء مصفوفة خارج الخلية، فيتورينيكستين.

Abstract

فيلبوديا الددرية رقيقة وطويلة على أساس خيوط الأكتين، وأنها تمتد وتتراجع كما لو كان البحث عن محور الهدف. عندما ينشئ الفيلبوديا الددرية الاتصال مع محور الهدف، فإنها تبدأ في النضج في العمود الفقري، مما يؤدي إلى تشكيل متشابك. يتم توطين Telencephalin (TLCN) بوفرة في فيلوبوديا الددرية ويتم استبعاده تدريجيا من العمود الفقري. الإفراط في التعبير عن TLCN في الخلايا العصبية فرس النهر المستزرعة يحفز تشكيل فيلبوديا dendritic. أظهرنا أن التيلجيزين يرتبط بقوة بجزيء مصفوفة خارج الخلية، فيتورينيكستين. فيترونيكستين المغلفة microbeads الناجمة عن تشكيل كأس phagocytic على dendrites الخلايا العصبية. في الكأس phagocytic، TLCN، TLCN ملزمة البروتينات مثل الفسفوريلاتيد إزرين / راديكسين / موسين (فوسفو-ERM)، وF-أكتين تتراكم، مما يشير إلى أن مكونات الكأس phagocytic مماثلة لتلك التي من filopodia dendritic. وهكذا، قمنا بتطوير طريقة لتنقية الكأس phagocytic بدلا من فيلبوديا dendritic. كانت مغلفة الخرز البوليسترين المغناطيسي مع فيتوريتكن، الذي هو موجود بوفرة في وسط الثقافة من الخلايا العصبية فرس النهر والتي تحفز تشكيل كأس phagocytic على dendrites الخلايا العصبية. بعد 24 ساعة من الحضانة، كانت الكؤوس phagocytic الذوبان أقل ما يقال مع المنظفات وجمعها باستخدام فاصل المغناطيس. بعد غسل الخرز، تم تلطخ البروتينات الملزمة وتحليلها من قبل تلطيخ الفضة والنشاف الغربية. في الكسر ملزمة, [تلكن] و [أكتين] كان بوفرة حاضرة. وبالإضافة إلى ذلك، تم توطين العديد من البروتينات التي تم تحديدها من الكسر إلى فيلوبوديا الدندية. وهكذا، أطلقنا على الكسر الملزم كجزء غني بالفيلوبوديا الدندية. توضح هذه المقالة تفاصيل فيما يتعلق بطريقة تنقية للكسر الغنية بالفيلوبوديا dendritic.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ويعتقد أن فيلبوديا الددرية هي سلائف العمود الفقري. خيوط أكتين في فيلوبوديا dendritic تنظيمتمديدها والتراجع 1،3. بعد الاتصال مع محور، فيلوبوديا dendritic مختارة تبدأ نضجها في العمود الفقري، ويتم تشكيل متشابك4،5. وقد تم تحديد مكونات العمود الفقري من التحليل الشامل للكسور الكثافة المشاركات6،7، في حين أن مكونات filopodia dendritic لا تزال غير معروفة إلى حد كبير. وقد تبين أن telencephalin (TLCN)، ERM، SynGAP، راس، PI3 كيناز، Akt، mTOR، البولو مثل كيناز 2، CaMKII، syndecan-2، paralemin-1، ARF6، وEphB تنظيم تشكيل فيلبوديا dendritic5،8،9 ،10،11، في حين لم يتم تطوير طريقة للتحليل الشامل للجزيئات الموجودة في فيلبوديا dendritic.

يتم التعبير عن TLCN (ICAM-5) على وجه التحديد من قبل الخلايا العصبية الشائكة في الجزء الدماغ الأكثر rostral, وtelencephalon12. TLCN لديها 9 مجالات مثل Ig في منطقتها خارج الخلية، ومنطقة عبر الغشاء، والذيل السيتوبلازمي13. TLCN يربط إلى فيتورينيكستين (VN) وLFA-1 integrin في منطقتها خارج الخلية، إلى presenilin في منطقتها عبر الغشاء، وphospho-ERM وα-actinin في منطقتها السيتوبلازمية14،15 ،16. TLCN يربط إلى الهيكل السيتوني الأكتين من خلال PHOSPHo-ERM في نصائح من فيلبوديا dendritic وα-actinin في العمود الفقري ومهاوي dendritic8،16.

أظهرنا أن الإفراط في التعبير عن TLCN تعزيز تشكيل فيلبوديا dendritic وحفزت على إعادة العمود الفقري إلى filopodia10. الشكل التأسيسي النشط من ezrin ملزمة لمنطقة السيتوبلازمية TLCN وتعزيز تشكيل فيلبوديا dendritic8. وهكذا، ينظم TLCN تشكيل فيلبوديا الدندرية من خلال البروتينات الملزمة للأكتين. وقد أثبت Esselens وآخرون أن الخرز الصغير الناجم عن تراكم TLCN على الخلايا العصبية المستزرعة17. أظهرنا أن هياكل كأس phagocytic تشكلت على dendrites الخلايا العصبية حول الخرز الصغير المغلفة VN بطريقة تعتمد على TLCN15. مكونات فيلبوديا dendritic مماثلة لتلك التي من كأس phagocytic. من الصعب جمع فيلبوديا dendritic، ولكن من الأسهل نسبيا لجمع الكأس phagocytic باستخدام microbeads المغناطيسي. وهكذا، قمنا بتطوير طريقة لتنقية الكأس phagocytic بدلا من فيلبوديا dendritic18. هنا، ونحن نصف طريقة تنقية للجزء الفيلوبوديا الدندي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وقد تمت الموافقة على جميع الأساليب الموصوفة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها من RIKEN واكو.

1. ثقافة الخلايا العصبية فرس النهر

  1. إعداد وسط الثقافة
    1. إعداد مزيج فيتامين 200x. حل 100 ملغ من حمض البانتوثيك ملح الهيميكالسيوم، 100 ملغ من كلوريد الكولين، 100 ملغ من حمض الفوليك، 180 ملغ من i-inositol، 100 ملغ من النياسيناميد، 100 ملغ من حمض الهيدروكلوريك البيريدوكسال، و 100 ملغ من حمض الهيدروكلوريك الثيامين في 500 مل من المياه النقية باستخدام النمام المغناطيسي. الحل لا يذوب تماما. يُمزج بعناية، ويُخلط في أنابيب 50 مل ويُخزن عند -20 درجة مئوية.
    2. إعداد محلول الريبوفلافين. حل 100 ملغ من الريبوفلافين في 500 مل من المياه فائقة النقية باستخدام النمام المغناطيسي. الحل لا يذوب تماما. يُمزج بعناية، ويُخلط في أنابيب 50 مل ويُخزن عند -20 درجة مئوية.
    3. إعداد 1 M CaCl2. حل 7.35 غرام من CaCl2·2H2O في 50 مل من المياه النقية باستخدام النمام المغناطيسي.
    4. إعداد الحد الأدنى من المتوسط الأساسي (MEM). حل 400 ملغ من كل شيء، 6800 ملغ من حمض الكلس، 2200 ملغ من NaHCO158 ملغ من NaH2PO4·2H2O، 7000 ملغ من D-الجلوكوز، و 200 ملغ من MgSO4-7H2O في 950 مل من المياه النقية باستخدام النمام المغناطيسي.
    5. Titrate 1.8 مل من 1 M CaCl2 إلى MEM بطريقة قطرة بقطرة باستخدام أنبوب 1 مل مع التحريض المستمر على النمام المغناطيسي. ضبط الوظيفة الهيدروجينية للMEM إلى pH 7.25 مع 1 مول / لتر حمض الهيدروكلوريك.
    6. إضافة 5 مل من مزيج فيتامين 200X و 200 ميكرولتر من محلول الريبوفلافين إلى MEM. ضبط حجم الحل إلى 1000 مل مع المياه فائقة النقاء. قم بتصفية الحل باستخدام نظام فلتر بمقدار 0.22 متر وتخزينه عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
    7. إعداد 10X DNase-I حلول الأسهم. حل 100 ملغ من DNase-I في 12.5 مل من حل الملح المتوازن هانكس (HBSS)، تصفية من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر، aliquot في أنابيب 1.5 مل، وتخزين الأنابيب في -20 درجة مئوية.
    8. إعداد السيتوسين β-D-أرابينومورانوسيد (آرا-C) حل الأسهم. حل 25 ملغ من Ara-C في 8.93 مل من المياه فائقة النقاء (التركيز النهائي من 10 MM)، مرشح من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر، aliquot في أنابيب 1.5 مل وتخزينها في -20 درجة مئوية
    9. إعداد وسط الطلاء. مزيج 1 مل من محلول الأحماض الأمينية MEM، 750 ميكرولتر من 1 م HEPES، 1 مل من B27، 125 ميكرولتر من 200 مل الجلوتامين، 250 ميكرولتر من البنسلين / العقديات، 2.5 مل من المصل البقري الجنيني (FBS)، و 44.375 مل من MEM في أنبوب 50 مل.
    10. إعداد وقف المتوسطة. مزيج 1 مل من حل الأحماض الأمينية MEM، 750 درجة مئوية من 1 م HEPES، 5 مل من FBS (النهائي 10٪)، و 43.25 مل من MEM في أنبوب 50 مل.
  2. إعداد الأطباق المغلفة بولي-L-يسين
    1. معطف 35 ملم أطباق زراعة الخلايا البلاستيكية مع 0.2 ملغ / مل من بولي-L-يسين هيدروبروميد لمدة يوم واحد في 25 درجة مئوية.
      ملاحظة: ولا ينبغي استخدام بروميد البولي -L-يسين بدلاً من بروميد مائي متعدد الليسين.
    2. اغسل الأطباق بـ 2 مل من الماء النقي 3 مرات. تحضن الأطباق مع 1.5 مل من إيقاف المتوسطة في 25 درجة مئوية حتى استخدامها.
  3. تشريح الخلايا العصبية الحصية من جنين الماوس
    1. مصدر أنسجة الخلايا العصبية الحصية. تشريح الحصين من الفئران من النوع البري وTLCN ناقص C57BL6/J في الأيام الجنينية 16-17 وفقا لطريقة لو وآخرون19.
    2. احتضان تشريح فرس النهر في 0.25٪ تريبسين و 1X DNaseI في HBSS تحتوي على 15 M HEPES، درجة الحموضة 7.2 لمدة 15 دقيقة في 37 درجة مئوية مع التحريض كل 3 دقائق. حضانة فرس النهر في 10 مل من وقف المتوسطة لتعطيل التربسين في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    3. نقل hippocampi إلى 10 مل من المتوسطة توقف الطازجة وحضانة في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. أنبوب مل. فصل فرس النهر في الخلايا العصبية المعزولة عن طريق الأنابيب 20 مرة باستخدام أنبوب 1 مل.
      ملاحظة: طرف الأنابيب 1 مل يمس قليلا الجزء السفلي من أنبوب 15 مل خلال تفكك فرس النهر.
    4. إضافة 9 مل من الطلاء المتوسطة، وتصفية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب 50 مل. عد عدد الخلايا باستخدام مقياس الهيموكيمتر وضبط إلى 3.5 × 104 خلايا / مل في الطلاء المتوسطة.
    5. أسطاب وقف المتوسطة من الأطباق المغلفة بولي-L-يسين. تُصفيح الخلايا على الأطباق المغلفة بالبولي-إل-ليسين في 7 × 104 خلايا/طبق (2 مل/طبق).
    6. بعد 60-64 ساعة من الحضانة تحت 5٪ CO2 في 37 درجة مئوية، إضافة 2 ميكرولتر من حل الأسهم Ara-C (النهائي 10 μM) إلى الخلايا العصبية، ويهز الطبق ببطء. الحفاظ على أطباق الثقافة في مربع رطب دون تغيير وسط الثقافة تحت 5٪ CO2 في 37 درجة مئوية.

2. تنقية الكسر الدندية الغنية فيلبوديا

  1. بعد 13 يوما في المختبر (DIV)، إضافة microbeads البوليسترين المغناطيسي (3 × 106 الجسيمات / طبق) إلى 20 أطباق تحتوي على الخلايا العصبية المستزرعة. بعد يوم واحد، وغسل الخلايا العصبية في 1 مل من PBS مع التحريض 3 مرات لإزالة microbeads المتوسطة وغير منضم. بعد إزالة PBS، lyse الخلايا العصبية مع 500 درجة مئوية / طبق من العازلة lysis (PBS تحتوي على 0.01٪ تريتون X-100، EDTA خالية من البروتياز كوكتيل المانع، وكوكتيل مثبطات الفوسفاتيز).
  2. جمع lysate مع مكشطة الخلية ونقل lysate إلى الأنابيب الدقيقة منخفضة البروتين ملزمة (10 أنابيب). تعيين الأنابيب على فاصل المغناطيس والانتظار لمدة 1 دقيقة.
  3. نقل الخرز إلى ميكروتوب جديدة منخفضة البروتين ملزمة، وضعت على فاصل المغناطيسي، وإزالة تماما supernatant. إضافة 500 درجة مئوية من العازلة lysis وغسل الخرز باستخدام خلاط دوامة لمدة 15 ق. تعيين الأنبوب على فاصل المغناطيس، والانتظار لمدة 1 دقيقة، وإزالة supernatant، وإضافة 500 درجة مئوية من العازلة lysis. كرر غسل الخرز 10 مرات وإزالة supernatant.
  4. البروتينات المنضمة إلى الخرز (الكسر المنضم) بإضافة 50 ميكرولتر من 1x SDS عينة العازلة (62.5 mM Tris HCl، ودرجة الحموضة 6.8، 2.5٪ SDS، و 10٪ الجلسرين) ويغلي الأنبوب في 98 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. على فاصل مغناطيسي لمدة دقيقة واحدة.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً هنا.
  5. قياس تركيزات البروتين من الكسور غير المنضمة والمقيدة عن طريق تحليل البروتين BCA. تصور حلول البروتين مع بروموفينول الأزرق وضبط التركيز إلى 5 نانوغرام / ميكرولتر لSDS-PAGE.

3. تلطيخ الفضة وتحليل وصمة عار الغربية

  1. افصل الكسور المنضمة وغير المنضمة (50 نانوغرام) بواسطة SDS-PAGE باستخدام جل متدرج بنسبة 5-20%. الفضة وصمة عار هلام.
  2. وصمة عار الغربية باستخدام المضادة لTLCN-C (1/3,000), مكافحة البقر فيترونيكستين (1/5,000), المضادة للأكتين (1/1,000), ومكافحة α-tubulin (1/1,000) كالأجسام المضادة الأولية وHRP-مترافق الماعز المضادة للأرنب IgG (1/5,000) كالأجسام المضادة الثانوية. تصور المستضدات باستخدام الكاشف الكشف عن النشاف الغربية chemiluminescent وصورة chemiluminescence.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

في الخلايا العصبية فرس النهر المستزرعة، تم توطين TLCN بوفرة إلى فيلبوديا dendritic، رمح، وسوما وcolocalized مع F-actin (الشكل1A،B). عندما أضيفت microbeads البوليسترين إلى الخلايا العصبية فرس النهر المستزرعة، كانت مغلفة تلقائيا الخرز مع فيتورينيكستين (VN) المستمدة من مصل البقر الجنيني (FBS) في وسط الثقافة. كانت ملزمة أساسا إلى dendrites، وأنها دفعت تشكيل أكوابphagocytic (الشكل 1B-E). واستندت أكواب الفيوسيتيك على خيوط الأكتين على شكل ورقة حول microbeads على dendrites. TLCN، فوسفو-ERM، وPI (4،5) Pوالتي هي علامات لfilopodia dendritic، وتراكمت للغاية حول الخرز (الشكل1D)15. تم تشكيل أكواب Phagocytic فقط على الخلايا العصبية فرس النهر البرية من نوع، ولكن ليس على الخلايا العصبية فرس النهر التي تعاني من نقص TLC (الشكل2A-D). وهكذا، كان تشكيل الكأس الفيغوسية يعتمد بشكل حاسم على وجود TLCN في dendrites.

يبدو أن مكونات الفيلوبوديا الددرية مشابهة لتلك التي من أكواب phagocytic. بعد ذلك، قمنا بتنقية أكواب phagocytic بدلا ً من فيلوبوديا الددرية. يظهر بروتوكول تنقية الأكواب الفاغورية بشكل تخطيطي في الشكل 3. تمت إضافة microbeads المغناطيسي إلى الخلايا العصبية فرس النهر المستزرعة البرية، مما يحفز على تشكيل هياكل كأس phagocytic. تم وضع هياكل الكأس الفيوسية مع المنظفات ضعيفة. تم جمع microbeads بعد lysis باستخدام فاصل المغناطيس. بعد غسل الخرز، تم غلي البروتينات الملزمة الخاصة بهم وeluted في المخزن المؤقت عينة SDS.

تم قياس كمية البروتينات في الكسر المقيد وغير المنضم باستخدام مجموعة اختبار بروتين BCA. تم فصل نفس الكمية من البروتينات في الكسور غير المنضمة والمنضمة بواسطة SDS-PAGE وملطخة بتلطيخ الفضة (الشكل4A). وكانت أنماط نطاق البروتين هي نفسها تقريبا بالنسبة للكسور غير المنضمة والمقيدة، ولكن الكثافات عند 50 و 70 كيلودا في الكسر المقيد كانت أقل من تلك الموجودة في الكسر غير المنضم. ومع ذلك، لم تكن كثافة الفرقة مختلفة بشكل واضح بين الكسور غير المنضمة والمنضمة التي تم إعدادها من الخلايا العصبية الحصوكامبال الثقافية التي تعاني من نقص في TLCN. لتأكيد تنقية هياكل كأس phagocytic، قمنا بإجراء النشاف الغربية باستخدام المضادة لTLCN-C، المضادة للبوفية فيتوريتكنين، المضادة للأكتين، ومكافحة α-tubulin (الشكل4B). تم الكشف عن TLCN وVN بشكل رئيسي في الكسر منضم. تم الكشف عن أكتين، إزرين، غاق، PLCβ1، MAP-2، وspectrin في كل من الكسور المنضمة وغير المنضمة. تم الكشف عن Moesin، PSD-95، α-أكتينين، وα-tubulin في جزء غير منضم.

Figure 1
الشكل 1: توطين TLCN و F-actin في فيلبوديا الدندية وأكواب phagocytic. (أ) تلطيخ مناعة dendrites من الخلايا العصبية فرس النهر المستزرعة التعبير gapVenus مع الأجسام المضادة للGFP (الأزرق في صورة مدمجة)، ومكافحة TLCN الأجسام المضادة (الأحمر في صورة مدمجة)، وphalloidin (الأخضر في صورة مدمجة). ويلاحظ بوفرة TLCN وF-أكتين في filopodia dendritic. (باء، جيم) تشكيل هياكل كأس الفيوسيديتيك على dendrites الخلايا العصبية. microbeads الفلورسنت (الأزرق في الصور المدمجة من B، C) وأضاف إلى الخلايا العصبية فرس النهر المستزرعة تلتزم بقوة على dendrites والحث على تراكم TLCN (الأحمر في الصور المدمجة من B، C) وF-أكتين (الأخضر في الصور المدمجة من B، C). (D) منظر جانبي لكأس phagocytic dendritic أعيد بناؤها من الصور البؤرية يكشف TLCN (الأحمر في الصور المدمجة من D) المحيطة حبة الفلورسنت (الأزرق في الصور المدمجة من D). (E) كوب phagocytic dendritic الناجمة عن microbead المغناطيسي تعلق على dendrite الخلايا العصبية والمناعية ملطخة بالأجسام المضادة للVN (الأزرق في الصور المدمجة من E)، المضادة للTLCN (الأحمر في الصور المدمجة من E)، وphalloidin (الأخضر في الصور المدمجة من E). قضبان مقياس = 1 ميكرومتر في (D)؛ 2 ميكرومتر في (A) و (C) و (E)؛ و20 ميكرومتر في (ب). وقد تم تعديل هذا الرقم من دراسة سابقة18. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تشكيل تعتمد على TLCN من هيكل يشبه الأكواب الفاغورية. (ألف-دال) صور الفلورة الثلاثية من النوع البري (WT; A, C) وTLCN ناقص (KO; C، D) الخلايا العصبية تعامل مع الخرز الفلورسنت المغلفة VN (الأحمر في الصور المدمجة من A، B، C، D) ووصفت مع الأجسام المضادة لTLCN (الأخضر في الصور المدمجة من A، B، C، D) ومكافحة phospho-ERM الأجسام المضادة (الأزرق في الصور المدمجة من A، B) أو Alexa488-phalloidin (الأزرق في دمجها صور C، D). قضبان مقياس = 5 ميكرومتر. وقد تم تعديل هذا الرقم من دراسة سابقة15. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: رسم تخطيطي يوضح إجراء تنقية الكسر الغني بالفيلوبوديا الدندرية. تمت إضافة microbeads المغناطيسي ة إلى الخلايا العصبية الفرسامة المستزرعة للحث على تشكيل أكواب phagocytic dendritic. بعد يوم واحد من الحضانة، تم الذوبان الخلايا العصبية مع العازلة lysis التي تحتوي على 0.01٪ تريتون X-100. تم فصل الخرز من الكسر غير المنضم باستخدام فاصل مغناطيسي. بعد الغسيل، تم استخدام البروتينات المنضمة مع المخزن المؤقت عينة SDS واستخدامها ككسر منضم. الأحمر: VN، الأخضر: TLCN، ألوان أخرى: البروتينات ملزمة. وقد تم تعديل هذا الرقم من دراسة سابقة18. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تأكيد كسر كأس phagocytic. (أ) تلطيخ الفضة من البروتينات في الكسور غير المنضمة وملزمة من microbeads. نفس الكمية (50 نانوغرام) من البروتينات في الكسور غير المنضمة والمنضمة المنقاة من النوع البري (WT) والخلايا العصبية الحصبية الناقصة TLCN (TLCN KO) تم فصلها بواسطة SDS-PAGE وتصور مع تلطيخ الفضة. (ب) تحليل وصمة عار الغربية من الكسور غير المنضمة والمنضمة. تم فصل نفس الكمية (50 نانوغرام) من البروتينات بواسطة SDS-PAGE وخضع لتحليل وصمة عار الغربية باستخدام المضادة للTLCN، ومكافحة VN، ومكافحة الأكتين، ومكافحة إزرين، ومكافحة moesin، ومكافحة Gαq، ومكافحة PLCβ1، ومكافحة MAP-2، ومكافحة spectrin، ومكافحة PSD-95، ومكافحة α الأكتينين، و الأجسام المضادة لـ α-tubulin. لاحظ أن TLCN، VN، أكتين، إزرين، PLCβ1، MAP-2، وspectrin لوحظت في الكسر الغنية بالفيلوبوديا dendritic. وقد تم تعديل هذا الرقم من دراسة سابقة18. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

قمنا بتطوير طريقة تنقية للجزء الغنية بالفيلوبوديا الددرية باستخدام التقارب بين جزيء التصاق الخلية TLCN وبروتين بروتين فيترونيكستين المصفوفة خارج الخلية. بالمقارنة مع كسر PSD، يمكن أن يكون من الممكن تحديد البروتينات متشابك تعمل على متشابك غير ناضجة من الكسر الفيلوبوديا الدندي الغنية. وهكذا، فإن مكونات الكسر الغنية بالفيلوبوديا الددرية تختلف عن تلك الموجودة في كسر PSD بنسبة 74٪. مختلفة عن كسر PSD، استخدمنا الخلايا العصبية فرس النهر المستزرعة لتشكيل بنشاط أكواب phagocytic، والخلايا تحتاج إلى أن تكون على قيد الحياة. لتشكيل كأس phagocytic، استخدمنا التفاعل بين TLCN وvitronectin. التعبير TLCN محدود في telencephalon. وبالتالي، لا يمكننا استخدام الخلايا العصبية المستزرعة المستمدة من المخيخ. ومع ذلك، إذا كنا معطف الخرز مع بروتينات مختلفة، ويمكن تطبيق هذه الطريقة تنقية تعتمد على النشاط على الخلايا العصبية المخيخ. على سبيل المثال، عندما يتم تطبيق المجال N-المحطة الطرفية من مستقبلات الغلوتامات delta2 المغلفة microbeads إلى خلايا الحبيبية المخيخ، تم تحديد neurexin presynaptic وcbln1 من البروتينات ملزمة. لذلك، يمكن استخدام هذه الطريقة المعتمدة على النشاط، إذا تم تغيير بروتينات الطلاء. منذ وصول microbeads المغلفة فيفيترونيكسين يقتصر على شريحة الدماغ وأنسجة الدماغ، لا يتم تشكيل أكواب phagocytic بكفاءة. وهكذا، تشمل المهام المستقبلية تطوير طريقة تنقية الكسر الغنية بالفيلوبوديا الددرية من شريحة الدماغ والأنسجة.

في هذا البروتوكول ، يتم استخدام حالة ثقافة منخفضة الكثافة للخلايا العصبية فرس النهر ، ويتم تثبيط نمو الخلايا الدبقية بإضافة Ara-C10،20،21. يتم زراعة الخلايا العصبية فرس النهر في MEM التي أعدها أنفسنا، ولكن ليس في وسط neurobasal، والذي يستخدم على نطاق واسع لثقافة الخلايا العصبية فرس النهر. الخلايا العصبية فرس النهر غالبا ما تموت من قبل 14 DIV عندما مثقف على المتوسطة العصبية القاعدية، مما يشير إلى أن المتوسطة العصبية غير مناسبة لحالتها الثقافية منخفضة الكثافة. وبالإضافة إلى ذلك، هناك جانب هام من جوانب الثقافة المنخفضة الكثافة هو طلاء الطبق ببروميد مائي بولي-L-يسين، الذي لا يمكن استبداله ببروميد بولي-L-يسين.

للحصول على كمية كافية من البروتينات من الكسر الغنية بالفيلوبوديا، فإن أعداد الخلايا العصبية الحصيبة والخرز المغناطيسي هي عوامل هامة. لفيلوبوديا dendritic تلطيخ المناعة، تم طلاء الخلايا العصبية فرس النهر على طبق 35 ملم في 5.6 × × 104 خلايا / طبق، في حين تم مطلي الخلايا العصبية في 7.0 × 104 خلايا / طبق لتنقية الكسر الفيلبوديا الدندرية الغنية. في 14 DIV، تقريبا أي الخلايا العصبية فرس النهر تتداخل في 5.6 × 104 الخلايا / طبق لتلطيخ المناعة، في حين أن العديد من الخلايا العصبية فرس النهر تتداخل جزئيا مع الخلايا العصبية الأخرى في 7.0 × 104 خلايا / طبق لتنقية فيلبوديا dendritic الغنية جزء. ومع ذلك، كانت فيلبوديا التقشرية موجودة بوفرة في كل من الكثافات من الخلايا العصبية فرس النهر. الثقافات عالية الكثافة من الخلايا العصبية فرس النهر غالبا ما تنضج أسرع من الخلايا العصبية فرس النهر المستزرعة منخفضة الكثافة; وبالتالي، فإن ضبط كثافة الخلايا العصبية الحصيبة إلى ثقافة منخفضة الكثافة أمر لا غنى عنه للحصول على جزء من الفيلبوديا الدندية الغنية. وأضيفت حبات صغيرة في 1 × 106 microbeads / طبق لتلطيخ المناعة وفي 3 × 106 microbeads / طبق لتنقية الكسر الفيلبوديا الدندي. لتنقية الكسر، وبمجرد إضافة كمية كافية من الخرز، تم غسل الخرز غير منضم من الخلايا العصبية فرس النهر.

في هذا البروتوكول، كانت مغلفة microbeads تلقائيا مع VN، وهو موجود في وسط الثقافة. ومع ذلك، يمكن أن تكون مغلفة microbeads مع VN المؤتلف وتضاف إلى الخلايا العصبية فرس النهر. لأن VN هو بروتين لزجة جدا، والخرز الصغير المغلفة VN تشكل بسهولة المجاميع. وهكذا، يتم sonicated وsonicated microbeads المغلفة VN وpipetted للانفصال عن بعضها البعض فقط قبل إضافة إلى الخلايا العصبية فرس النهر.

أظهرنا سابقا أن الخرز الصغير المغلفة VN يحفز الفوسفور ERM، PI(4،5) P 2، وF-actin جنبا إلى جنب مع تراكم TLCN15. عندما تم تحليل الكسر الغنية بالفيلوبيديا الددرية من قبل النشاف الغربي، لم يتم الكشف عن فوسفو-ERM من قبل الأجسام المضادة للفوسفو-ERM متعددة النسيلة وتم الكشف عنها قليلا من قبل الأجسام المضادة للإزرين والمضادة للمحسن أحادية النسيلة. ويبدو أن حساسية الأجسام المضادة أحادية النسيلة كانت أعلى من الأجسام المضادة للفوسفو-ERM متعددة النسيلة. وبالإضافة إلى ذلك، تم توطين بروتينات إدارة الكوارث إلى جميع مناطق الخلايا العصبية في فرس النهر تقريباً، ولكن تم ترجمة بروتينات فوسفو-إرم فقط إلى طرف الفيلوبوديا الددرية والكوب الفيغوسي. ويعتبر أن كمية الزامفوس-ERM الملزمة لـ TLCمحدودة بالمقارنة مع كمية ERM غير الفوسفورية. وهكذا، يبدو من الصعب اكتشاف الفوسفو-إدارة النماء في إدارة النماء في إدارة الموارد في الكسر الغني بالفيلوبوديا.

لفصل microbeads من غشاء الخلية، استخدمنا المنظفات ضعيفة، 0.01٪ تريتون X-100. ويرتبط TLCN خيوط الأكتين من خلال PHOSPHo-ERM في هياكل الفيلوبوديا وكوب phagocytic. لتنقية البروتينات المرتبطة بشكل غير مباشر إلى TLCN من خلال خيوط الأكتين، استخدمنا المنظفات ضعيفة في هذا البروتوكول. ومع ذلك، يمكن تغيير تركيز تريتون X-100 إلى تركيز أعلى اعتمادا على الغرض من التجربة.

وقد أظهرت Esselens وآخرون أن التناول phagocytic من microbeads الناجمة عن TLCN, PIP2, وF-actin تراكم في الخلايا العصبية فرس النهر المستزرعة17. وفقا لتحليلنا عن طريق الفحص المجهري البؤري بعد 24 ساعة من الحضانة مع microbeads، لم يتم تناول microbeads تماما في السيتوبلازم. TLCN وPIP2، والتي يتم توطينها إلى غشاء الخلية ، والمترجمة حول الخرز ، وخاصة في الجزء السفلي من microbeads. وبالإضافة إلى ذلك، تم تحليل 319 بروتين تم تحديدها من الكسر الغني بالفيلوبوديا الددرية باستخدام تحليل مسار KEGG. لم يتم الكشف عن الفوسيليات ومسارات autophagy، ولكن تنظيم الهيكل الخلوي، exocytosis، عملية المستندة إلى خيوط الأكتين، والعملية القائمة على microtubule تم إثراؤها بشكل كبير في الكسر18.

الآلية الجزيئية لتكوين فيلوبوديا الدندي لا يزال غير معروف إلى حد كبير. تحليل هيكل الكأس phagocytic يمكن أن تساعد على فهم المكونات الجزيئية والوظائف الديناميكية للفيلوبوديا dendritic. سيكون من المثير للاهتمام لتحليل الكسر الغنية بالفيلوبوديا الدنيدرية المعدة من نماذج الماوس من الاضطرابات العصبية التنموية والنفسية العصبية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

نشكر شيجيو أوكابي وهيتومي ماتسونو على الثقافة المنخفضة الكثافة للخلايا العصبية في فرس النهر، وماسايوشي ميشينا للفئران التي تعاني من نقص في الـ TLCN، وساكيكو ميتسوي وموموكو شيوزاكي على المساعدة التقنية، وأعضاء مختبر يوشيهارا لإجراء مناقشات مفيدة . وقد حظي هذا العمل بدعم من اللجنة المشتركة بين الأفراد والرابطة. JP20700307, JP22700354, و JP24500392 وMEXT KAKENHI منحة Nos. JP23123525 إلى YF و JP20022046 و JP18H04683 و JP18H05146 إلى YY.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 M HEPES Gibco 15630-080
1.7 mLl Low Binding MCT Sorenson BioScience 39640T
200 mM L-Glutamine Gibco 2530149
35 mm plastic cell culture dishes Corning 430165
Anti-actin Sigma-Aldrich A-5060
Anti-alpha-Actinin Sigma-Aldrich A-5044
Anti-alpha-tubulin Sigma-Aldrich T-9026
Anti-Ezrin Sigma-Aldrich clone3C12, SAB4200806
Anti-Galphaq Santacruz sc-393
Anti-MAP2 Chemicon clone AP20, MAB3418
Anti-Moesin Sigma-Aldrich clone 38/87, M7060
Anti-PLCbeta1 Santacuz sc-5291
Anti-PSD95 MA2 ABR
Anti-Spectrin beta Chemicon MAB1622
B27 Gibco 0080085SA
BCA protein assay kit Thermo 23227
Bromophenol blue Merck 1.08122.0005
Calcium chrolide, hydrous Wako 038-19735
Cell scraper Falcon 353085
Cell strainer Falcon 352350
Choline chloride Sigma-Aldrich C7527
Complete EDTA free protease inhibitor cocktail Roche 11873580001
Cytosine beta-D-arabinofuranoside Sigma-Aldrich C-6645
DNase-I Sigma-Aldrich DN-25
D-Pantothenic acid hemicalcium salt Sigma-Aldrich P5155
DynaMag-2 Magnet Thermo 12321D
ECL Prime Western Blotting Detection Reagent GE RPN2232
e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gradient gel ATTO E-T520L
Folic acid Sigma-Aldrich F8758
HBSS Gibco 14175095
HRP-conjugated anti-rabbit IgG Jackson ImmunoResearch 111-035-144
i-Inositol Sigma-Aldrich I7508
LAS-1000 mini Fuji Film LAS-1000 mini For detection of luminescence from WB membrane
Magnetic polystyrene microbeads Sperotech PM-20-10
MEM amino acid solution Gibco 11130-051 30 mM L-Arginine hydrochloride, 5 mM L-Cystine, 10 mM L-Histidine hydrochloride-H2O, 20 mM L-Isoleucine, 20 mM L-Leucine, 19.8 mM L-Lysine hydrochloride, 5.1 mM L-Methionine, 10 mM L-Phenylalanine, 20 mM L-Threonine, 2.5 mM L-Tryptophan, 10 mM L-Tyrosine, and 20 mM L-Valine
Mini-slab size electrophoresis system ATTO AE-6530
Niacinamide Sigma-Aldrich N0636
Penicilin / Streptomycin Gibco 15070063
PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail Roche 4906845001
Poly-L-lysine hydrobromide Nacali 28360-14
Pyridoxal HCl Sigma-Aldrich P6155
Riboflavin Sigma-Aldrich R9504
Silver Stain 2 Kit wako Wako 291-5031
Thiamine HCl Sigma-Aldrich T1270
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell Bio-rad 1703940JA
Ultra pure water MilliQ For production of ultra pure water

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fiala, J. C., Feinberg, M., Popov, V., Harris, K. M. Synaptogenesis via dendritic filopodia in developing hippocampal area CA1. Journal of Neuroscience. 18, (21), 8900-8911 (1998).
  2. Portera-Cailliau, C., Pan, D. T., Yuste, R. Activity-regulated dynamic behavior of early dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia. Journal of Neuroscience. 23, (18), 7129-7142 (2003).
  3. Ziv, N. E., Smith, S. J. Evidence for a role of dendritic filopodia in synaptogenesis and spine formation. Neuron. 17, (1), 91-102 (1996).
  4. Lohmann, C., Bonhoeffer, T. A role for local calcium signaling in rapid synaptic partner selection by dendritic filopodia. Neuron. 59, (2), 253-260 (2008).
  5. Yoshihara, Y., De Roo, M., Muller, D. Dendritic spine formation and stabilization. Current Opinion in Neurobiology. 19, (2), 146-153 (2009).
  6. Bayes, A., et al. Comparative study of human and mouse postsynaptic proteomes finds high compositional conservation and abundance differences for key synaptic proteins. PLoS One. 7, (10), e46683 (2012).
  7. Bayes, A., et al. Characterization of the proteome, diseases and evolution of the human postsynaptic density. Nature Neuroscience. 14, (1), 19-21 (2011).
  8. Furutani, Y., et al. Interaction between telencephalin and ERM family proteins mediates dendritic filopodia formation. Journal of Neuroscience. 27, (33), 8866-8876 (2007).
  9. Mao, Y. T., et al. Filopodia Conduct Target Selection in Cortical Neurons Using Differences in Signal Kinetics of a Single Kinase. Neuron. 98, (4), 767-782 (2018).
  10. Matsuno, H., et al. Telencephalin slows spine maturation. Journal of Neuroscience. 26, (6), 1776-1786 (2006).
  11. Raemaekers, T., et al. ARF6-mediated endosomal transport of Telencephalin affects dendritic filopodia-to-spine maturation. The EMBO Journal. 31, (15), 3252-3269 (2012).
  12. Mori, K., Fujita, S. C., Watanabe, Y., Obata, K., Hayaishi, O. Telencephalon-specific antigen identified by monoclonal antibody. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, (11), 3921-3925 (1987).
  13. Yoshihara, Y., Mori, K. Telencephalin: a neuronal area code molecule? Neuroscience Research. 21, (2), 119-124 (1994).
  14. Annaert, W. G., et al. Interaction with telencephalin and the amyloid precursor protein predicts a ring structure for presenilins. Neuron. 32, (4), 579-589 (2001).
  15. Furutani, Y., et al. Vitronectin induces phosphorylation of ezrin/radixin/moesin actin-binding proteins through binding to its novel neuronal receptor telencephalin. Journal of Biological Chemistry. 287, (46), 39041-39049 (2012).
  16. Nyman-Huttunen, H., Tian, L., Ning, L., Gahmberg, C. G. alpha-Actinin-dependent cytoskeletal anchorage is important for ICAM-5-mediated neuritic outgrowth. Journal of Cell Biology. 119, (Pt 15), 3057-3066 (2006).
  17. Esselens, C., et al. Presenilin 1 mediates the turnover of telencephalin in hippocampal neurons via an autophagic degradative pathway. Journal of Cell Biology. 166, (7), 1041-1054 (2004).
  18. Furutani, Y., Yoshihara, Y. Proteomic Analysis of Dendritic Filopodia-Rich Fraction Isolated by Telencephalin and Vitronectin Interaction. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 10, 27 (2018).
  19. Lu, Z., Piechowicz, M., Qiu, S. A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture. Journal of Visualized Experiments. (109), (2016).
  20. Okabe, S., Miwa, A., Okado, H. Alternative splicing of the C-terminal domain regulates cell surface expression of the NMDA receptor NR1 subunit. The Journal of Neuroscience. 19, (18), 7781-7792 (1999).
  21. Okabe, S., Vicario-Abejon, C., Segal, M., McKay, R. D. Survival and synaptogenesis of hippocampal neurons without NMDA receptor function in culture. European Journal of Neuroscience. 10, (6), 2192-2198 (1998).
تنقية الكسر الدندي الغنية فيلبوديا
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Furutani, Y., Yoshihara, Y. Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction. J. Vis. Exp. (147), e59292, doi:10.3791/59292 (2019).More

Furutani, Y., Yoshihara, Y. Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction. J. Vis. Exp. (147), e59292, doi:10.3791/59292 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter