Summary
이 프로토콜에서는 수지상 필로포디알 사이의 특이적이고 강한 친화력을 활용하여 배양된 해마 뉴런상의 식수컵형 돌출 구조로부터 수지상 필로포디아가 풍부한 분획을 정화하는 방법을 소개합니다. 접착 분자, TLCN, 및 세포외 매트릭스 분자, vitronectin.
Abstract
수지상 필로포디아는 액틴 필라멘트에 기초하여 얇고 긴 돌출부이며, 표적 축색을 찾는 것처럼 확장하고 후퇴합니다. 수지상 필로포디아가 표적 축색과 접촉하면 척추로 성숙하기 시작하여 시냅스의 형성으로 이어집니다. 텔렌세팔린 (TLCN)은 수지상 필로포디아에 풍부하게 국한되어 있으며 점차 척추에서 제외됩니다. 배양된 해마 뉴런에서 TLCN의 과발현은 수지상 우포ODIa 형성을 유도한다. 우리는 텔렌스팔린이 세포외 매트릭스 분자인 비트로네틴에 강하게 결합한다는 것을 보여주었습니다. Vitronectin 코팅된 마이크로비드는 신경 모수석에 식세포 컵 형성을 유도했습니다. 식세포 컵, TLCN, 인산화 된 에즈린 / 라디신 / 모에신 (포스포 - ERM) 및 F-액틴과 같은 TLCN 결합 단백질이 축적되어 식세포 컵의 성분이 수지상 필로포디아와 유사하다는 것을 시사합니다. 따라서 수지상 필로포디아 대신 식세포 컵을 정화하는 방법을 개발했습니다. 마그네틱 폴리스티렌 구슬은 비트론틴으로 코팅되었고, 이는 해마 뉴런의 배양 배지에 풍부하게 존재하며 뉴런 모수석에 식세포 컵 형성을 유도합니다. 24시간 배양 후, 식세포 컵을 세제로 경미하게 용해시키고 자석 분리기를 사용하여 수집했습니다. 구슬을 세척한 후, 결합 단백질을 용출하고 은 염색 및 웨스턴 블로팅에 의해 분석시켰다. 결합 분획에서, TLCN 및 액틴은 풍부하게 존재했다. 또한, 분획으로부터 확인된 많은 단백질은 수지상 필로포디아로 국소화되었다; 따라서, 우리는 수지상 filopodia 풍부한 분획으로 결합 분획을 명명했다. 이 기사에서는 수지상 필로포디아 가풍부한 분획에 대한 정제 방법에 관한 세부 사항을 설명합니다.
Introduction
수지상 필로포디아는 척추의 전구체로 생각됩니다. 수지상 필로포디아의 액틴 필라멘트는 확장 및철회를조절1,2,3. 축축액과 접촉 한 후 선택된 수지상 필로포디아가 척추로 성숙을 시작하고 시냅스가4,5로형성됩니다. 척추의 성분은 후진성 밀도 분획6,7의포괄적 인 분석에서 결정되었으며 수지상 필로포디아의 구성 요소는 크게 알려지지 않았습니다. 텔렌스팔린(TLCN), ERM, SynGAP, Ras, PI3 키나아제, Akt, mTOR, 폴로유사 키나아제 2, CaMKII, 신데칸-2, 파라레민-1, ARF6 및 EphB가 수지상 필로포디아 형성 5,8,9를 조절하는 것으로 나타났습니다. ,10,도 11,수지상 필로포디아에 존재하는 분자의 포괄적인 분석을 위한 방법이 개발되지 않은 반면.
TLCN(ICAM-5)은 특히 가장 로스트랄 뇌 세그먼트에서 가시 뉴런에 의해발현되며, 텔렌세판론(12). TLCN은 세포외 영역, 막막 영역 및 세포질 꼬리13에9 개의 Ig 유사 도메인을 가지고 있습니다. TLCN은 세포외 영역에서 비트로넥틴(VN) 및 LFA-1 인테그린에 결합하고, 세포막 영역에서 프레세닐린을, 세포질 영역에서 인광-ERM 및 α-액티닌에 결합합니다 5,8,14,15 ,16. TLCN은 수지상 필로포디아 및 α-액티닌의 끝에서 인광-ERM을 통해 세포골격에 결합하고 척추 및 수지상샤프트 8,16.
우리는 TLCN의 과발현이 수지상 필로포디아 형성을 강화하고 가시가 필로포디아(10)로 복귀하도록 유도하는 것을 보여주었다. TLCN 세포질 영역에 결합된 에즈린의 구성활성 형태및 강화된 수지상 필로포디아형성 8. 따라서 TLCN은 액틴 결합 단백질을 통해 수지상 필로포디아 형성을 조절합니다. Esselens 외. 마이크로비드가 배양된 뉴런에 TLCN 축적을 유도한다는 것을 입증했다17. 우리는 식세포 컵 구조가 TLCN 의존적인 방식으로 VN 코팅 된 마이크로 비드 주위의 신경 모수석에 형성되었다는 것을 보여주었다15. 수지상 필로포디아의 성분은 식세포 컵과 유사합니다. 수지상 필로포디아를 수집하는 것은 어렵지만 자기 마이크로 비드를 사용하여 식세포 컵을 수집하는 것이 상대적으로 쉽습니다. 따라서 수지상 필로포디아(18) 대신 식수구컵을 정화하는 방법을개발하였다. 여기서, 수지상 필로포디아 풍부 분획에 대한 정제 방법을 설명한다.
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Protocol
여기에 설명된 모든 방법은 RIKEN Wako의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다.
1. 해마 뉴런의 문화
- 배양 배지의 준비
- 200x 비타민 믹스의 준비. D-판토텐산 헤미칼슘 염 100 mg, 콜린 염화물 100 mg, 엽산 100 mg, 이노시톨 180 mg, 나이아신아미드 100 mg, 피리독살 HCl 100 mg, 그리고 500 mL의 초순수 수분 으로 티아민 HCl 100 mg을 용해하십시오. 용액이 완전히 용해되지 는 않습니다. 조심스럽게 혼합, 50 mL 튜브에 aliquot및 -20 °C에서 저장.
- 리보플라빈 용액의 준비. 자기 교반기로 500 mL의 초순수에 리보플라빈 100 mg을 녹입니다. 용액이 완전히 용해되지 는 않습니다. 조심스럽게 혼합, 50 mL 튜브에 aliquot및 -20 °C에서 저장.
- 1 M CaCl2의 준비 . 자기 교반기로 50 mL의 초순수에 CaCl2·2H2O7.35 g을 용해시.
- 최소 필수 배지 (MEM)의 준비. 자기 교반기950mL에서 KCl 400 mg, NaCl 6800 mg, NaHCO3,NaH2 PO 158 mg, 4·2H2O,7000 mg의 D-글루코스, 200 mg의 MgSO4-7H2O를 용해한다.
- 자기 교반기상 일정한 교반을 가진 1 mL 파이펫을 사용하여 MEM에 1.8 mL의 적정 1.8 mL을 드롭 바이 드롭 방식으로. MEM의 pH를 1 몰/L HCl로 pH 7.25로 조정합니다.
- MEM에 5 mL의 200x 비타민 믹스와 200 μL의 리보플라빈 용액을 첨가하십시오. 초순수로 용액의 부피를 1,000mL로 조정합니다. 0.22 μm 필터 시스템을 사용하여 용액을 걸과 4°C에 보관하십시오.
- 10x DNase-I 재고 솔루션 준비. 행크스의 균형 잡힌 소금 용액 (HBSS)의 12.5 mL에 DNase-I 100 mg을 용해하고 0.22 μm 필터를 통해 필터, 1.5 mL 튜브의 aliquot를 통해 튜브를 -20 °C에 보관하십시오.
- 시토신 β-D-아라비노노사이드(Ara-C) 스톡 용액의 제조. 8.93 mL의 초순수(최종 농도 10mM)에 25mg의 아라-C를 용해하고, 0.22 μm 필터를 통해 필터를 적용하고, 1.5mL 튜브에 aliquot를 적용하고 -20°C에서 보관하십시오.
- 도금 매체의 준비. MEM 아미노산 용액 1 mL, 750 μL 의 1 M HEPES, B27의 1 mL, 200 mM 글루타민의 125 μL, 페니실린/스트렙토마이신 250 μL, 태아 소 혈청 2.5 mL(FBS), MEM 의 44.375 mL을 혼합합니다.
- 중지 매체의 준비. MEM 아미노산 용액 1 mL, 1 M HEPES 750 μL, FBS 5 mL (최종 10%), 그리고 50 mL 튜브에 MEM 43.25 mL을 혼합합니다.
- 폴리-L-리신 코팅 요리 준비
- 25 °C에서 1 일 동안 폴리 L-리신 하이드로 브로마이드0.2 mg / mL로 35mm 플라스틱 세포 배양 접시를 코팅하십시오.
참고: 폴리-L-리신 대신 폴리-L-리신 하이드로마이드를 사용해서는 안 됩니다. - 2 mL의 초순수로 3 회 설거지하십시오. 1.5 mL의 스톱 배지를 25°C에서 사용 후 배양합니다.
- 25 °C에서 1 일 동안 폴리 L-리신 하이드로 브로마이드0.2 mg / mL로 35mm 플라스틱 세포 배양 접시를 코팅하십시오.
- 마우스 배아에서 해마 뉴런의 해부
- 해마 뉴런의 조직 소스. 루 외19의방법에 따라 16-17일 동안 야생형 및 TLCN 결핍 C57BL6/J 마우스로부터 해마를 해부한다.
- 배양해 해마를 0.25% 트립신과 1x DNaseI에서 15 mM HEPES를 함유하고, pH 7.2를 37°C에서 37°C에서 교반하여 3분마다 용액을 제거한다. 해마를 10 mL의 STOP 배지에서 배양하여 4°C에서 트립신을 5분 동안 비활성화한다.
- 해마를 신선한 STOP 배지 의 10 mL로 이동하고 5 분 동안 4 °C에서 4 °C로 배양하고 4 °C에서 4 °C로 배양하십시오. mL 튜브. 1 mL 파이펫을 사용하여 20 회 파이펫팅하여 해마를 고립 된 뉴런으로 해리하십시오.
참고: 1 mL 파이펫의 끝은 해마의 해리 동안 15 mL 튜브의 바닥에 약간 닿습니다. - 도금 매체의 9 mL를 추가하고, 50 mL 튜브에 70 μm 세포 스트레이너를 통해 필터링합니다. 혈세포계를 사용하여 셀 수를 계산하고 도금 매체에서 3.5 x 104 셀 /mL로 조정합니다.
- 폴리-L-리신 코팅 접시에서 STOP 매체를 흡인합니다. 7 x 104 세포 / 접시 (2 mL / 접시)에서 폴리 L-리신 코팅 접시에 세포를 접시.
- 37°C에서 5% CO2 미만의 배양 60-64시간 후, 2 μL의 아라-C 스톡 용액(최종 10 μM)을 뉴런에 넣고 천천히 접시를 흔들어 줍니다. 배양접시를 37°C에서 5% CO2 미만의 배양배지를 변경하지 않고 가습상자에 보관한다.
2. 수지상 필로포디아 풍부한 분획의 정화
- 13일 간 시험관 내(DIV)를 마친 후, 배양된 뉴런을 함유한 20가지 접시에 마그네틱 폴리스티렌 마이크로비드(3 x 106 입자/접시)를 추가합니다. 1일 후, PBS의 1 mL에서 뉴런을 교반으로 3회 세척하여 배지 및 언바운드 마이크로비드를 제거하였다. PBS를 제거 한 후, 용해 완충액의 500 μL / 접시로 뉴런을 용해시 (0.01 % 트리톤 X-100, EDTA 프리 프로테아제 억제제 칵테일 및 인산염 억제제 칵테일를 함유한 PBS).
- 세포 스크레이퍼로 용해액을 수집하고 용해액을 저단백 결합 마이크로튜브(10튜브)로 이동시다. 자석 분리기에 튜브를 설정하고 1 분 동안 기다립니다. 상류를 수집하고 은 염색 및 웨스턴 블롯 분석을위한 언 바운드 분수로 사용합니다.
- 비드를 새로운 저단백 결합 마이크로튜브로 옮기고, 자기 분리기 상에 설정하고, 상층체를 완전히 제거한다. 용해 완충액 500 μL을 추가하고 15 s. 자석 분리기에 튜브를 설정하고, 1 분 동안 기다렸다가 상구를 제거하고, 용해 완충액 500 μL을 추가하십시오. 구슬의 세척을 10 번 반복하고 상한을 제거합니다.
- 1x SDS 샘플 버퍼(62.5mTris HCl, pH 6.8, 2.5% SDS 및 10% 글리세롤)의 50 μL을 첨가하여 비드(경계 분수)에 결합된 용황 단백질을 5분 동안 98°C에서 끓이고, 10s에 대해 860 x gg의 튜브를 원심분리하고 10s튜브를 설정합니다. 1 분 동안 자기 분리기에서 상한체를 수집하고 바운드 분수로 사용합니다.
참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. - BCA 단백질 분석방법으로 결합되지 않은 분획의 단백질 농도를 측정합니다. 브로모페놀 블루로 단백질 용액을 시각화하고 SDS-PAGE의 농도를 5 ng/μL로 조정합니다.
3. 은 염색 및 웨스턴 블롯 분석
- 5-20% 그라데이션 겔을 사용하여 SDS-PAGE에 의해 바운드 및 언바운드 분획(50 ng)을 분리한다. 젤을 은색으로 얼룩.
- 항 TLCN-C (1/3,000), 항소 비트론틴 (1/5,000), 항 액틴 (1/1,000), 및 항 α-tubulin (1/1,000)을 1 차 항체및 HRP-접포 염소 항 토끼 IgG (1/5,000)를 사용하여 서쪽 얼룩. 화학 발광 웨스턴 블로팅 검출 시약 및 화학 발광 이미저를 사용하여 항원을 시각화합니다.
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Representative Results
배양된 해마 뉴런에서, TLCN은 수지상 필로포디아, 샤프트 및 소마에 풍부하게 국소화되었고 F-액틴(도1A,B)으로 국소화되었다. 폴리스티렌 마이크로비드가 배양된 해마 뉴런에 첨가되었을 때, 구슬은 배양 배지에서 태아 소 혈청(FBS)으로부터 유래된 비트로넥틴(VN)으로 자동 코팅되었다; 그들은 주로 수상돌기와 결합되었고, 식세포 컵의 형성을 유도하였다 (그림 1B-E). 식세포 컵은 수상돌기위에 마이크로비드 주위의 시트 모양의 액틴 필라멘트를 기반으로 했습니다. 수지상 필로포디아의 마커인 TLCN, 포스포-ERM 및 PI(4,5)P2는 비드 주위에서 고도로 축적된다(도1D)8,15. 식세포 컵은 야생형 해마 뉴런에서만 형성되었지만 TLCN 결핍 해마 뉴런에는 형성되지 않았습니다(그림 2A-D). 따라서, 식세포 컵 형성은 치수에 TLCN의 존재에 결정적으로 의존했다.
수지상 필로포디아의 성분은 식세포 컵과 유사하게 나타났습니다. 다음으로, 수지상 필로포디아 대신 식기압 컵을 정제했습니다. 식세포 컵의 정제를 위한 프로토콜은 도3에 개략적으로 도시되어 있다. 자기 마이크로비드는 야생형 배양 해마 뉴런에 첨가되어 식세포 컵 구조의 형성을 유도합니다. 식세포 컵 구조는 약한 세제로 용해되었다. 마이크로비드는 자석 분리기를 사용하여 용해 후 수집되었다. 구슬을 세척한 후, 그들의 결합 단백질을 SDS 샘플 버퍼에서 삶아 용출하였다.
결합 및 언바운드 분획내의 단백질의 양을 BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 측정하였습니다. 언바운드 및 바운드 분획에서 동일한 양의 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분리하고 은 염색으로 염색하였다(도4A). 단백질 밴드 패턴은 언바운드 및 바운드 분획에 대해 거의 동일했지만, 결합 분획에서 50 및 70 kDa의 강도는 언바운드 분획의 강도보다 낮았다. 그러나, 밴드 강도는 TLCN 결핍 배양 해마 뉴런으로부터 제조된 언바운드 및 바운드 분획 사이에 명백하게 다르지 않았다. 식기컵 구조의 정제를 확인하기 위해, 우리는 안티 TLCN-C, 안티 소 비트로넥틴, 안티 액틴 및 항 α-tubulin (그림4B)를사용하여 서양 블로팅을 수행했습니다. TLCN 및 VN은 주로 경계 분획에서 검출되었다. 액틴, 에즈린, Gαq, PLCβ1, MAP-2 및 스펙트린은 바운드 및 언바운드 분획 모두에서 검출되었다. 모에신, PSD-95, α-액티닌 및 α-튜불린은 언바운드 분획에서 검출되었다.
그림 1: 수지상 필로포디아 및 식세포 컵에서 TLCN 및 F-액틴의 국소화. (a) 배양된 해마 뉴런의 모수석의 면역형광 염색은 반GFP 항체(병합된 이미지에서 파란색), 반대로 TLCN 항체(병합된 이미지에서 빨간색), 및 팔로이드(병합된 이미지에서 녹색)로 gapVenus를 발현한다. TLCN 및 F-액틴은 수지상 필로포디아에서 풍부하게 관찰된다. (B, C) 신경 모수석에 식세포 컵 구조의 형성. 형광 마이크로비드(B, C의 병합된 이미지에서 파란색)를 배양된 해마 뉴런에 강하게 부착하고 TLCN(B, C의 병합된 이미지에서 빨간색)과 F-액틴(B, C의 병합된 이미지에서 녹색)의 축적을 유도한다. (D) 공초점 이미지로부터 재구성된 수지상 식세포 컵의 측면 보기는 형광 비드를 둘러싼 TLCN(D의 병합된 이미지에서 빨간색)을 드러낸다(D의 병합된 이미지에서 파란색). (E) 신경 성 수반에 부착된 자기 미생물에 의해 유도된 수지상 식균 컵과 항-VN 항체(E의 병합된 이미지에서 파란색), 항-TLCN 항체(E의 병합된 이미지에서 빨간색), 그리고 팔로이드(병합된 이미지의 녹색)로 면역염색 E). 배율 막대 = 1 μm in (D); 2 μm 에서 (A), (C), 및 (E); (B)에서 20 μm. 이 수치는 이전 연구18에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 식세포 컵 유사 구조의 TLCN 의존성 형성. (A-D) 야생형의 삼중 형광 이미지(WT; A, C) 및 TLCN 결핍 (KO; C, D) VN 코팅 형광 비드로 처리된 뉴런(A, B, C, D의 병합된 이미지에서 빨간색) 및 항 TLCN 항체(A, B, C, D의 병합된 이미지에서 녹색) 및 항포스-ERM 항체(A, B의 병합된 이미지에서 파란색) 또는 Alexa488-phalloid(파란색 병합)로 표시 C, D)의 이미지)를 참조하십시오. 배율 막대 = 5 μm. 이 수치는 이전 연구15에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 수지상 필로포디아 풍부 분획의 정제 절차를 보여주는 회로도 다이어그램. 마그네틱 마이크로비드는 배양된 해마 뉴런에 첨가되어 수지상 식세포 컵의 형성을 유도한다. 1일 배양 후, 뉴런은 0.01% 트리톤 X-100을 함유하는 용해 완충액으로 용해시켰다. 비드는 자기 분리기를 사용하여 언바운드 분획으로부터 분리되었다. 세척 후, 결합된 단백질을 SDS 샘플 버퍼로 용출하고 결합 분획으로 사용하였다. 빨간색: VN, 녹색: TLCN, 다른 색상: 바운드 단백질. 이 수치는 이전 연구18에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 식세포 컵 분획의 확인. (A) 마이크로비드의 언바운드 및 바운드 분획에 있는 단백질의 은색 염색. 야생형(WT) 및 TLCN 결핍(TLCN KO) 해마 뉴런으로부터 정제된 언바운드 및 결합 분획내의 단백질의 동일한 양(50 ng)을 SDS-PAGE에 의해 분리하고 은염색으로 시각화하였다. (B) 언바운드 및 바운드 분수의 웨스턴 블롯 분석. 동일한 양의 단백질(50 ng)을 SDS-PAGE에 의해 분리하고 항TLCN, 안티-VN, 안티액틴, 안티에즈린, 안티모에신, 안티-Gαq, 안티-PLCβ1, 안티-MAP-2, 안티-스펙트린, 안티-PSD-95, 항-α-α를 사용하여 서양 얼룩 분석을 실시하였다. 항 α-tubulin 항체. TLCN, VN, 액틴, 에즈린, PLCβ1, MAP-2 및 스펙트린은 수지상 필로포디아가 풍부한 분획에서 관찰된다. 이 수치는 이전 연구18에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우리는 세포 부착 분자 TLCN과 세포 외 매트릭스 단백질 비트로넥틴 사이의 친화성을 사용하여 수지상 필로포디아가 풍부한 분획에 대한 정제 방법을 개발했습니다. PSD 분획에 비해, 수지상 필로포디아 가 풍부한 분획으로부터 미성숙 시냅스상에 작용하는 시냅스 단백질을 식별할 수 있었다. 따라서, 수지상 필로포디아-풍부한 분획의 성분은 74%에 의해 PSD 분획의 성분과 상이하다. PSD 분획과는 달리, 우리는 배양 된 해마 뉴런을 사용하여 식세포 컵을 적극적으로 형성했으며 세포는 살아 있어야합니다. 식세포 컵을 형성하기 위해, 우리는 TLCN과 vitronectin 사이의 상호 작용을 사용했다. TLCN 발현은 텔렌세팔론에서 제한된다. 따라서, 우리는 소뇌에서 파생 된 배양 뉴런을 사용할 수 없습니다. 그러나, 우리가 다른 단백질로 구슬을 코팅하는 경우에, 이 활동 의존적인 정제 방법은 소뇌 신경에 적용될 수 있었습니다. 예를 들어, 글루타메이트 수용체 delta2-코팅된 마이크로비드의 N-말단 도메인이 소뇌 과립 세포에 적용될 때, 시냅스 뉴렉신 및 cbln1은 결합 단백질로부터 확인되었다. 따라서, 코팅 단백질이 변경되는 경우, 이러한 활성 의존적 방법이 사용될 수 있다. vitronectin 코팅 된 마이크로 비드의 접근은 뇌 슬라이스와 뇌 조직으로 제한되기 때문에 식세포 컵은 효율적으로 형성되지 않습니다. 따라서, 미래의 과제는 뇌 슬라이스 및 조직에서 수지상 필로포디아 풍부 분획의 정제 방법을 개발하는 것을 포함한다.
이 프로토콜에서, 저밀도 배양 조건은 해마 뉴런에 사용되며, 신경교 세포의 성장은 Ara-C10,20,21의첨가에 의해 억제된다. 해마 뉴런은 우리 자신에 의해 준비 된 MEM에서 배양되지만, 해마 뉴런의 문화에 널리 사용되는 신경 기저 배지에서는 배양되지 않습니다. 해마 뉴런은 종종 신경 기저 배지에 배양 할 때 14 DIV에 의해 죽는다, 이는 신경 기저 매질이 우리의 저밀도 배양 조건에 적합하지 않다는 것을 나타냅니다. 또한 저밀도 배양물의 중요한 측면은 폴리-L-리신으로 대체할 수 없는 폴리-L-리신 하이드로브로마이드로 접시를 코팅하는 것입니다.
수지상 필로포디아가 풍부한 분획에서 충분한 양의 단백질을 얻으려면 해마 뉴런과 자기 마이크로 비드의 수가 중요한 요소입니다. 면역 염색 수지상 필로포디아의 경우, 해마 뉴런은 5.6 x× 104 세포 / 접시에서 35mm 접시에 도금되었고, 뉴런은 수지상 필로포디아가 풍부한 분획의 정화를 위해 7.0 x 104 세포 / 접시에서 도금되었습니다. 14 DIV에서 면역 염색을 위한 5.6 x 104 세포/접시에 중첩된 해마 뉴런이 거의 없으며, 수지상 필로포디아가 풍부한 지수체의 정화를 위해 다른 뉴런과 부분적으로 겹치는 해마 뉴런은 7.0 x 104 세포/접시로 겹쳐져 있습니다. 분수. 그러나, 수지상 filopodia 는 해마 뉴런의 두 밀도에 풍부하게 존재했다. 해 마 뉴런의 고밀도 문화는 종종 저밀도 배양 해 마 뉴런 보다 더 빨리 성숙; 따라서, 해마 뉴런의 밀도를 저밀도 배양물로 조정하는 것은 수지상 필로포디아가 풍부한 분획을 얻는 데 필수적이다. 마이크로비드는 면역 염색을 위해 1 x 106 마이크로비드/접시에 추가되었고, 수지상 필로포디아가 풍부한 분획의 정제를 위해 3 x 106 마이크로비드/접시에 첨가하였다. 분획의 정화를 위해, 일단 충분한 양의 구슬이 첨가되면, 언바운드 비드는 해마 뉴런으로부터 씻어냈다.
이 프로토콜에서, 마이크로비드는 배양 배지에 존재하는 VN으로 자동으로 코팅되었다. 그러나, 마이크로비드는 재조합 VN으로 코팅되고 해마 뉴런에 첨가될 수 있다. VN은 매우 끈적끈적한 단백질이기 때문에 VN 코팅 된 마이크로 비드는 쉽게 응집체를 형성합니다. 따라서, VN 코팅 된 마이크로 비드는 해마 뉴런에 추가되기 직전에 서로 해리되도록 초음파 처리 및 피펫처리됩니다.
이전에는 VN 코팅 된 마이크로 비드가 TLCN 축적15와함께 인광체 ERM, PI (4,5)P2및 F-액틴을 유도한다는 것을 보여주었습니다. 수지상 필로포디아가 풍부한 분획을 서양 블로팅에 의해 분석했을 때, 포스포-ERM은 항포스-ERM 폴리클로날 항체에 의해 검출되지 않았고, 항에즈린 및 항모에신 모노클로날 항체에 의해 약간 검출되었다. 단일클론 항체의 민감도가 항인-ERM 폴리클로날 항체보다 높았던 것으로 나타났다. 또한, ERM 단백질은 해마 뉴런의 거의 모든 부위에 국한되었지만, 인포스-ERM 단백질은 수지상 필로포디아 및 식세포 컵의 끝부분만 국한되었다. TLCN에 결합하는 인광-ERM의 양은 비인인지질 ERM의 양에 비해 제한되는 것으로 간주된다. 따라서, 수지상 필로포디아-풍부한 분획에서 인-ERM의 검출이 어려워 보인다.
세포막에서 마이크로 비드를 분리하기 위해 약한 세제인 0.01% 트리톤 X-100을 사용했습니다. TLCN은 수지상 필로포디아 및 식세포 컵 구조에서 인산화를 통해 액틴 필라멘트에 연결됩니다. 액틴 필라멘트를 통해 TLCN에 간접적으로 연결된 단백질을 정제하기 위해 이 프로토콜에서 약한 세제를 사용했습니다. 그러나, 트리톤 X-100의 농도는 실험의 목적에 따라 더 높은 농도로 변경될 수 있다.
Esselens 외. 배양 된 해마 뉴런에서 TLCN, PIP2및 F-액틴 축적을 유도한 마이크로비드의 식세포 섭취가17로나타났습니다. 마이크로비드를 가진 배양의 24 시간 후에 공초점 현미경 검사법을 통해 우리의 분석에 따르면, 마이크로비드는 세포질로 완전히 채택되지 않았습니다. 세포막에 국한되는 TLCN 및 PIP2는구슬 주위, 특히 마이크로비드 의 바닥에 국한되었습니다. 또한, 수지상 필로포디아-리치 분획으로부터 확인된 319개의 단백질을 KEGG 경로 분석을 사용하여 분석했다. 식세포증 및 자가포식 경로는 검출되지 않았지만, 세포골격 조직, 외세포증, 액틴 필라멘트 기반 공정 및 미세관 계과정은 분획18에서유의하게 농축되었다.
수지상 필로포디아 형성의 분자 메커니즘은 크게 알려지지 않은 상태로 남아 있습니다. 식세포 컵 구조의 분석은 수지상 필로포디아의 분자 성분 및 동적 기능을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 신경 발달 및 신경 정신 장애의 마우스 모델에서 제조 된 수지상 필로포디아풍부한 분획을 분석하는 것이 흥미로워질 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
해마 뉴런의 저밀도 배양, TLCN 결핍 마우스를 위한 미시나 마사요시, 기술 지원을 위한 미쓰이 사치코, 시오자키 모모코, 요시하라 연구소 회원에게 도움이 되는 토론에 대해 감사합니다. . 이 작품은 JSPS 카켄히 그랜트 노스에 의해 지원되었다. JP20700307, JP22700354, JP24500392 및 MEXT 카켄히 그랜트 노스. JP23123525 ~ YF 및 JP20022046, JP18H04683 및 JP18H05146 ~ YY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 1.7 mLl Low Binding MCT | Sorenson BioScience | 39640T | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | 2530149 | |
| 35 mm plastic cell culture dishes | Corning | 430165 | |
| Anti-actin | Sigma-Aldrich | A-5060 | |
| Anti-alpha-Actinin | Sigma-Aldrich | A-5044 | |
| Anti-alpha-tubulin | Sigma-Aldrich | T-9026 | |
| Anti-Ezrin | Sigma-Aldrich | clone3C12, SAB4200806 | |
| Anti-Galphaq | Santacruz | sc-393 | |
| Anti-MAP2 | Chemicon | clone AP20, MAB3418 | |
| Anti-Moesin | Sigma-Aldrich | clone 38/87, M7060 | |
| Anti-PLCbeta1 | Santacuz | sc-5291 | |
| Anti-PSD95 | MA2 | ABR | |
| Anti-Spectrin beta | Chemicon | MAB1622 | |
| B27 | Gibco | 0080085SA | |
| BCA protein assay kit | Thermo | 23227 | |
| Bromophenol blue | Merck | 1.08122.0005 | |
| Calcium chrolide, hydrous | Wako | 038-19735 | |
| Cell scraper | Falcon | 353085 | |
| Cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Choline chloride | Sigma-Aldrich | C7527 | |
| Complete EDTA free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Cytosine beta-D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich | C-6645 | |
| DNase-I | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma-Aldrich | P5155 | |
| DynaMag-2 Magnet | Thermo | 12321D | |
| ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE | RPN2232 | |
| e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gradient gel | ATTO | E-T520L | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
| HBSS | Gibco | 14175095 | |
| HRP-conjugated anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | |
| i-Inositol | Sigma-Aldrich | I7508 | |
| LAS-1000 mini | Fuji Film | LAS-1000 mini | For detection of luminescence from WB membrane |
| Magnetic polystyrene microbeads | Sperotech | PM-20-10 | |
| MEM amino acid solution | Gibco | 11130-051 | 30 mM L-Arginine hydrochloride, 5 mM L-Cystine, 10 mM L-Histidine hydrochloride-H2O, 20 mM L-Isoleucine, 20 mM L-Leucine, 19.8 mM L-Lysine hydrochloride, 5.1 mM L-Methionine, 10 mM L-Phenylalanine, 20 mM L-Threonine, 2.5 mM L-Tryptophan, 10 mM L-Tyrosine, and 20 mM L-Valine |
| Mini-slab size electrophoresis system | ATTO | AE-6530 | |
| Niacinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Penicilin / Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail | Roche | 4906845001 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Nacali | 28360-14 | |
| Pyridoxal HCl | Sigma-Aldrich | P6155 | |
| Riboflavin | Sigma-Aldrich | R9504 | |
| Silver Stain 2 Kit wako | Wako | 291-5031 | |
| Thiamine HCl | Sigma-Aldrich | T1270 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-rad | 1703940JA | |
| Ultra pure water | MilliQ | For production of ultra pure water |
References
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