Summary
Bu protokolde, dendritik filopodial arasında belirli ve güçlü bir yakınlık yararlanarak kültürlü hipokampal nöronlar üzerinde fagositik fincan benzeri protrüzyon yapısı dendritik filopodia zengin fraksiyonu arındırmak için bir yöntem tanıtmak yapışma molekül, TLCN, ve bir ekstrasellüler matris molekül, vitronektin.
Abstract
Dendritik filopodia akinin filament dayalı ince ve uzun çıkıntılar, ve onlar uzatmak ve bir hedef Axon ararken gibi geri çekin. Dendritik filopodia bir hedef Akon ile temas kurduğunda, bir sinaps oluşumuna yol açan, spines içine olgunlaşmak başlar. Telencephalin (TLCN) oldukça dendritik filopodia lokalize ve yavaş yavaşça spines hariç tutulur. Kültürlü hipokampal nöronlar içinde TLCN aşırı ifade dendritik filopodia oluşumu indükler. Biz telencephalin güçlü bir hücre içi matris molekül, vitronektin bağlar gösterdi. Vitronectin kaplı mikrobilyeleri nöronal dendrites üzerinde fagositik fincan oluşumu kaynaklı. Phagositik kupada, TLCN, fosforilated ezrin/Radixin/Moesin (phospho-ERM) ve F-actin gibi TLCN-bağlayıcı proteinler birikir, bu da fagositik kupanın bileşenlerinin dendritik filopodia 'ya benzer olduğunu göstermektedir. Böylece, dendritik filopodia yerine fagositik kupayı arındırmak için bir yöntem geliştirdik. Manyetik polistiren boncuklar, hipokampal nöronların kültür ortamında bulunan ve nöronal dendrites üzerinde fagositik bardak oluşumunu tetikleyen vitronektin ile kaplanmıştır. 24 saat inkübasyon yapıldıktan sonra, fagositik bardak deterjan ile hafif bir şekilde çözünmeli ve mıknatıs ayırıcı kullanılarak toplanır. Boncukları yıkadıktan sonra, bağlayıcı proteinler gümüş boyama ve Batı bloplama ile incelenmiş ve analiz edilmiştir. Bağlayıcı fraksiyonda, tlcn ve aktin bol miktarda mevcut. Buna ek olarak, kesir tespit birçok protein dendritik filopodia lokalize edildi; Bu nedenle, biz dendritik filopodia-zengin fraksiyonu olarak bağlayıcı fraksiyonu adı. Bu makalede, dendritik filopodia zengin kesir için arıtma yöntemi ile ilgili ayrıntıları açıklar.
Introduction
Dendritik filopodia, spines öncüleri olduğu düşünülmektedir. Dendritik filopodia içinde actin filamin uzatma ve retraksiyon1,2,3düzenler. Bir Axon ile temas ettikten sonra, seçilmiş dendritik filopodia, olgunlaşmasını spines içine başlar ve bir sinaps4,5oluşur. Dikenler bileşenleri postsinaptik yoğunluk kesirler6,7kapsamlı analizinden belirlendi, dendritik filopodia bileşenleri büyük ölçüde bilinmeyen kalır süre. Bu, telencephalin (tlcn), erm, syngap, RAS, pıkinaz, AKT, mTOR, Polo benzeri kinaz 2, camkii, syndecan-2, paralemin-1, ARF6 ve ephb, dendritik filopodia oluşumu5,8,9 düzenleyen gösterildi ,10,11, bir yöntem ise dendritik filopodia mevcut moleküllerin kapsamlı analizi için geliştirilmiştir değil.
Tlcn (ICAM-5) özellikle en rostral beyin segmentinde dikenli nöronlar tarafından ifade edilir, telencephalon12. TLCN, hücre dışı bölgesinde 9 IG benzeri etki alanı, bir transmembran bölgesi ve sitoplazmik kuyruk13' ü vardır. Tlcn, hücre dışı bölgesinde vitronektin (VN) ve LFA-1 integrine, transmembran bölgesinde presenilin 'e, sitoplazmik bölgesinde fosho-ERM ve α-actinin 'e bağlar5,8,14,15 ,16. Tlcn, dikenler ve dendritik şaftlar içinde dendritik filopodia ve α-actinin iplerinde phospho-ERM yoluyla akin sitoiskelet bağlar8,16.
Biz tlcn gelişmiş dendritik filopodia oluşumu ekspresyonu gösterdi ve filopodia10için dikenler reversion indüklenmiş. Teknikerleriniz 'in kurucu aktif formu tlcn sitoplazmik bölgeye bağlı ve gelişmiş dendritik filopodia oluşumu8. Böylece TLCN, akin bağlayıcı proteinlerle dendritik filopodia oluşumunu düzenler. Esselens ve ark. mikroboncuklar kültürsüz nöronlar üzerinde TLCN birikimi kaynaklı gösterdi17. Fagositik fincan yapısının, VN kaplı mikroboncuk etrafında nöronal dendritler üzerinde, TLCN-bağımlı bir biçimde15' te oluştuğunu gösterdik. Dendritik filopodia bileşenleri fagositik kupalar benzer. Dendritik filopodia toplamak zordur, ama manyetik mikroboncuk kullanarak fagositik fincan toplamak nispeten daha kolaydır. Böylece, dendritik filopodia18yerine fagositik kupayı arındırmak için bir yöntem geliştirdik. Burada, dendritik filopodia zengin fraksiyonu için arıtma yöntemi açıklanmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan tüm yöntemler RıKEN Wako kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. hipokampal nöronların kültürü
- Kültür ortamının hazırlanması
- 200x Vitamin karışımı hazırlanması. Çözülür 100 mg D-pantothenic asit hemicalcium tuz, 100 Kolin klorür mg, 100 mg folik asit, 180 mg i-inositol, 100 mg Niacinamide, 100 mg piridoksal HCL, ve 100 mg Thiamin HCL içinde 500 ml Ultra saf su manyetik karıştırıcı kullanarak. Çözüm tamamen çözülür değil. 50 ml tüplerde dikkatle karıştırın, kısım ve-20 °c ' de saklayın.
- Riboflavin çözeltisi hazırlanması. Çözünür 100 manyetik karıştırıcı kullanarak 500 ml Ultra saf su içinde riboflavin mg. Çözüm tamamen çözülür değil. 50 ml tüplerde dikkatle karıştırın, kısım ve-20 °c ' de saklayın.
- 1 M CaCl2hazırlanması. Çözünür 7,35 g CAcl2· 2H2O 50 ml 'de manyetik karıştırıcı kullanarak ultra saf su.
- Minimum temel Orta (MEM) hazırlanması. Çözülür 400 mg KCL, 6800 mg NaCl, 2.200 mg NaHCO3, 158 mg Nah2Po4· 2H2O, 7000 mg D-glikoz ve 200 mg MgSO4-7h2o içinde 950 ml Ultra saf su manyetik karıştırıcı kullanarak.
- Titrat 1,8 mL 1 M CaCl2 ' ye bir damla-by-Drop şekilde bir manyetik karıştırıcı üzerinde sabit bir ajitasyon Ile 1 ml pipet kullanarak. 1 mol/L HCl ile MEM için pH 7,25 pH değerini ayarlayın.
- Ekle 5 mL 200x Vitamin karışımı ve 200 Me riboflavin solüsyonu μL. Çözümün hacmini Ultra Saf suyla 1.000 ml 'ye ayarlayın. Solüsyonu 0,22 μm filtre sistemi kullanarak filtreleyin ve 4 °C ' de saklayın.
- 10X DNase-ı stok çözümlerinin hazırlanması. 100 mg DNase-ı, Hanks ' dengeli tuz çözeltisi (HBSS) 12,5 ml 'de çözülür, 0,22 μm filtre ile filtre, 1,5 ml tüplerde kısım ve tüpleri-20 °c ' de saklayın.
- Sitozin β-D-arabinofuranoside (ara-C) stok çözeltisi hazırlanması. 8,93 ml Ultra saf su (10 mm son konsantrasyonu), 0,22 μm filtre aracılığıyla filtre, 1,5 ml tüpler ve mağaza-20 °c ' de 25 mg ara-C çözülür.
- Kaplama orta hazırlanması. Mix 1 mL MEM amino asit çözeltisi, 750 μL 1 M HEPES, 1 mL B27, 125 μL 200 mM glutamin, 250 μL penisilin/streptomisin, 2,5 ml fetal sığır serumu (FBS), ve 44,375 ml, bir 50 mL tüpte MEM.
- Stop orta hazırlama. Mix 1 mL MEM amino asit çözeltisi, 750 μL 1 M HEPES, 5 mL FBS (son 10%), ve 43,25 mL MEM bir 50 mL tüp.
- Poly-L-Lysine kaplı yemeklerin hazırlanması
- Coat 35 mm plastik hücre kültürü yemekleri 0,2 mg/mL Poly-L-lizin hidrobromür ile 1 gün 25 °C ' de.
Not: Poly-l-lizin, poli-L-lizin hidrobromür yerine kullanılmamalıdır. - 2 ml Ultra Saf suyla 3 kez yıkayın. Kullanım süresi 25 °C ' de 1,5 mL stop medyası ile yemekleri kulbe etme.
- Coat 35 mm plastik hücre kültürü yemekleri 0,2 mg/mL Poly-L-lizin hidrobromür ile 1 gün 25 °C ' de.
- Fare embriyo hipokampal nöronların diseksiyon
- Hipokampal nöronların doku kaynağı. Hippocampus vahşi tipi ve TLCN-eksikliği C57BL6/J fareler embriyonik günlerde 16-17 lu ve al.19yöntemine göre incelemek.
- 15 mm HEPES içeren HBSS 'de% 0,25 tripsin ve 1x dnasei 'de disseke hipokampi, 37 °c ' de 15 dk, her 3 dakikada bir ajitasyon ile pH 7,2. çözümü çıkarın. 5 dakika boyunca 4 °C ' de tripsin inaktive etmek için 10 mL STOP medyası içinde hipokampi 'yi kulbe etmek.
- Hippocampi 'yi 10 mL taze STOP ortamına taşıyın ve 5 dakika boyunca 4 °C ' de Inküye yapın. hipokampi 'yi 10 mL taze STOP ortamına taşıyın ve 5 dakika daha 4 °C ' de Inküye yapın. hipokampi 'yi 900 μL STOP orta ve 100 μL 'lik 10X DNaseI 'ye 15 mL tüp. 1 mL pipet kullanarak 20 kez pipetleme yaparak Hippocampi 'yi izole nöronlar haline yerleştirin.
Not: 1 mL pipet ucu, Hippocampi 'nin dağılma sırasında 15 mL tüpün altına hafifçe dokunur. - 9 mL kaplama orta ekleyin ve 70 μm hücre süzgeci ile 50 mL 'Lik bir tüpün içine filtre uygulayın. Bir hemokytometer kullanarak hücre sayısını saymak ve 3,5 x 104 hücreler/ml kaplama orta ayarlayın.
- Poly-L-Lysine kaplı yemeklerden aspirate STOP orta. Poly-L-Lysine kaplı yemeklerle ilgili hücreleri 7 x 104 hücreli/çanak (2 ml/çanak) olarak plakaya atın.
- 37 °C ' de% 5 CO2 altında inkübasyon 60-64 h sonra, nöronlara 2 μL ara-C stok solüsyonu (son 10 μM) ekleyin ve yemeği yavaşça sallayın. 37 °C ' de% 5 CO2 ' nin altında kültür ortamını değiştirmeden, kültür yemeklerini nemlendirilmiş bir kutuda tutun.
2. Dendritic Filopodia arıtma-zengin kesir
- 13 gün içinde vitro (DıV) sonra, kültür nöronları içeren 20 yemeklere manyetik polistiren mikroboncuk (3 x 106 parçacıklar/çanak) ekleyin. 1 gün sonra, orta ve ilişkisiz mikroboncuk kaldırmak için 3 kez ajitasyon ile PBS 1 mL nöronlar yıkayın. PBS 'yi kaldırdıktan sonra 500 μL/Dish liziz tamponu (0,01% Triton X-100, EDTA-ücretsiz proteaz inhibitörü kokteyli ve fosfataz inhibitörü kokteyli) içeren nöronlar ile Lyse.
- Bir hücre kazıyıcı ile lysate toplamak ve düşük protein bağlayıcı mikrotüpler (10 tüpler) için lysate taşıyın. Bir mıknatıs ayırıcı üzerinde tüpler ayarlayın ve 1 dakika bekleyin. süpernatant toplamak ve gümüş boyama ve Batı leke analizi için ilişkisiz fraksiyonu olarak kullanın.
- Yeni bir düşük protein bağlayıcı mikrotüp için boncuklar aktarmak, bir manyetik ayırıcı ayarlamak, ve tamamen supernatant kaldırmak. 500 μL liziz tampon ekleyin ve 15 s için bir Vortex karıştırıcı kullanarak boncuklar yıkayın. bir mıknatıs ayırıcı üzerinde tüp ayarlayın, 1 dakika bekleyin, supernatant kaldırmak ve 500 μL liziz tampon ekleyin. Boncuklar 10 kez yıkamak ve supernatant kaldırmak tekrarlayın.
- 50 μL 1x SDS örnek tampon (62,5 mM Tris HCl, pH 6,8,% 2,5 SDS ve% 10 gliserol) ilavesi ile boncuklar (bağlı fraksiyonu) bağlı elute proteinleri ve 5 dakika için 98 °C ' de tüp kaynatın. 10 s için 860 x g boru santrifüj ve tüp ayarlamak 1 dakika için bir manyetik ayırıcı üzerinde süpernatant toplamak ve bağlı fraksiyonu olarak kullanın.
Not: Protokol burada duraklatılmış olabilir. - BCA protein tahlil tarafından ilişkisiz ve bağlı fraksiyonları protein konsantrasyonları ölçmek. Protein çözümlerini bromophenol mavisi ile görselleştirin ve konsantrasyonu SDS-PAGE için 5 NG/μL olarak ayarlayın.
3. gümüş boyama ve Batı Blot Analizi
- Bağlı ve ilişkisiz kesirleri (50 ng) SDS-PAGE tarafından% 5-20 gradyan jeli kullanarak ayırın. Jel gümüş leke.
- Batı leke Anti-tlcn-C (1/3000) kullanarak, Anti-sığır vitronektin (1/5000), Anti-aksin (1/1000), ve anti-α-tubulin (1/1000) Primer antikorlar ve HRP-konjuze keçi Anti-tavşan IgG (1/5000) ikincil antikor olarak. Antijenleri chemiluminesans Batı blotting algılama Reakajına ve bir kemiluminesans görüntüleyiciler kullanarak görselleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kültürlü hipokampal nöronlar, TLCN oldukça dendritik filopodia, şaft lokalize ve Soma ve F-actin ile kolokalize (Şekil 1a, B). Kültürlü hipokampal nöronlara polistiren mikroboncuk eklendiğinde, boncuklar otomatik olarak kültür ortamında fetal sığır serumu (FBS) elde edilen vitronektin (VN) ile kaplanmıştır; temelde dendrites bağlı ve onlar fagositik bardak oluşumu indüklenen (Şekil 1B-E). Fagositik bardak dendrites üzerinde mikroboncuk etrafında sac şekilli aksini filamin dayanmaktadır. Dendritik filopodia için işaretçiler olan tlcn, phospho-ERM ve PI (4, 5) P2, boncuk etrafında son derece birikmiş (Şekil 1D)8,15. Phagositik bardak sadece vahşi tip hipokampal nöronlar üzerinde oluşmuş, ancak TLCN eksikliği hipokampal nöronlar (Şekil 2a-D). Böylece, fagositik fincan oluşumu dendrites içinde TLCN varlığına en fazla bağımlıdır.
Dendritik filopodia bileşenleri fagositik bardaklara benzer şekilde ortaya çıkmıştır. Sonra, dendritik filopodia yerine fagositik bardakları saflaştırdık. Fagositik bardakların arıtılması için protokol Şekil 3' te şematik olarak gösterilir. Manyetik mikroboncuk, phagositik fincan yapıların oluşumunu tetikleyen vahşi tip kültürlü hipokampal nöronlara eklenmiştir. Fagositik fincan yapıları zayıf bir deterjan ile lysed edildi. Mikroboncuk bir mıknatıs ayırıcı kullanarak lizis sonra toplandı. Boncuklar yıkandıktan sonra, bağlayıcı proteinleri haşlanmış ve SDS örnek tampon içinde elüe.
Bağlı ve ilişkisiz fraksiyonda protein miktarı BCA protein tahlil kiti kullanılarak ölçülmüştür. İlişkisiz ve bağlı fraksiyonları aynı miktarda proteinler SDS-PAGE ile ayrıldı ve gümüş boyama tarafından lekelenmiş (Şekil 4A). Protein bandı desenleri neredeyse ilişkisiz ve bağlı kesirler için aynı, ama yoğunlukları 50 ve 70 kDa bağlı fraksiyonda Bu ilişkisiz fraksiyonda daha düşüktür. Ancak, bant yoğunluğu açıkça TLCN eksikliği kültür hipokampal nöronların hazırlanan ilişkisiz ve bağlı kesirler arasında farklı değildi. Phagositik fincan yapıların arıtılmasını onaylamak için, Anti-TLCN-C, Anti-sığır vitronectin, Anti-aksin ve anti-α-tubulin (Şekil 4b) kullanarak Batı blokasyonu gerçekleştirdik. TLCN ve VN esas olarak bağlı fraksiyonda tespit edildi. Actin, ezrin, Gαq, PLCβ1, harıta-2 ve spectrin hem bağlı hem de ilişkisiz kesirler içinde tespit edildi. İlişkisiz fraksiyonda moesin, PSD-95, α-actinin ve α-tubulin tespit edildi.
Resim 1: dendritik filopodia ve fagositik bardakların içinde TLCN ve F-actin lokalizasyonu. (A) Anti-Gfp antikor (birleştirilmiş bir resimde mavi), Anti-tlcn antikor (birleştirilmiş bir görüntü kırmızı) ve phalloidin (birleştirilmiş bir görüntü yeşil) ile gapvenus ifade eden bir kültürlü hipokampal nöron dendritler immünofluorescence boyama. TLCN ve F-actin dendritik filopodia içinde oldukça görülür. (B, C) Nöronal dendrites üzerinde fagositik fincan yapıların oluşumu. Floresan mikroboncuk (b, c birleştirilmiş görüntülerde mavi) kültürlü hipokampal nöronlara ekledi güçlü dendritler üzerine uyur ve tlcn birikimi (b, c birleştirilmiş görüntüleri kırmızı) ve F-actin (b, c birleştirilmiş görüntüleri yeşil) teşvik. (D) Konfokal görüntülerden yeniden oluşturulmuş bir dendritik fagositik bardağın lateral görünümü, floresan boncuğu çevreleyen (d 'nin birleştirilmiş görüntülerinde mavı) tlcn 'Yi (d 'nin birleştirilmiş görüntülerinde kırmızı) ortaya çıkarır. (E) bir nöronal dendrit üzerine bağlı ve anti-vn antikor (e birleştirilmiş görüntülerde mavi), Anti-tlcn antikor (e birleştirilmiş görüntülerde kırmızı), ve phalloidin (yeşil birleştirilmiş görüntüler içinde bir manyetik mikroboncuk tarafından indüklenen bir dendritik fagositik fincan E). ölçek çubukları = 1 μm in (D); 2 μm in (A), (C) ve (E); ve 20 μm in (B). Bu rakam bir önceki çalışmada18değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: tlcn-fagositik Cup benzeri yapının oluşumuna bağımlıdır. (A-D) Vahşi tip üç floresan görüntüleri (WT; A, C) ve TLCN eksikliği (KO; C, D) VN kaplı floresan boncuklarla tedavi edilen nöronlar (A, B, C, D 'nin birleştirilmiş görüntülerde kırmızı) ve anti-TLCN antikor ile etiketlenmiş (A, B, C, D 'nin birleştirilmiş görüntülerde yeşil) ve anti-phospho-ERM antikor (A, B 'nin birleştirilmiş görüntülerde mavi) veya Alexa488-phalloidin (birleştirilmiş mavi C, D) görüntüler. Ölçek çubukları = 5 μm. Bu rakam bir önceki çalışmada15değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: dendritik filopodia zengin fraksiyonunun arıtma prosedürünü gösteren bir şematik diyagram. Manyetik mikroboncuk dendritik fagositik bardak oluşumunu teşvik etmek için kültürlü hipokampal nöronlar üzerine eklendi. İnkübasyon 1 gün sonra, nöronlar% 0,01 Triton X-100 içeren liziz tampon ile çözünen edildi. Boncuk, bir manyetik ayırıcı kullanarak ilişkisiz kesir ayrıldı. Yıkamadan sonra, bağlı proteinler SDS örnek tampon ile elüe ve bağlı fraksiyonu olarak kullanılır. Kırmızı: VN, yeşil: TLCN, diğer renkler: bağlı proteinler. Bu rakam bir önceki çalışmada18değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: fagositik kupa fraksiyonu onayı. (A) mikroboncuk ilişkisiz ve bağlı fraksiyonları proteinlerin gümüş boyama. Vahşi tip (WT) ve TLCN-eksikliği (TLCN KO) hipokampal nöronlardan arındırılmış olan ilişkisiz ve bağlı fraksiyonlar içindeki proteinlerin aynı miktarda (50 ng) SDS-PAGE ile ayrılır ve gümüş boyama ile görselleştirildi. (B) ilişkisiz ve bağlı kesirler Batı leke analizi. Proteinler aynı miktarda (50 ng) SDS-sayfa ile ayrıldı ve anti-tlcn kullanarak Batı leke Analizi maruz kaldı, Anti-vn, Anti-actin, Anti-ezrin, Anti-moesin, Anti-gαq, Anti-plcβ1, Anti-harita-2, Anti-spectrin, Anti-PSD-95, Anti-α-actinin, ve Anti-α-tubulin antikorları. Bu tlcn, vn, actin, ezrin, plcβ1, harita-2 ve spectrin dendritik filopodia zengin kesir gözlenen unutmayın. Bu rakam bir önceki çalışmada18değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz, hücre yapışma molekül TLCN ve ekstrasellüler matris protein vitronektin arasında benzeşimi kullanarak dendritik filopodia zengin fraksiyonu için bir arıtma yöntemi geliştirdi. PSD kesir ile karşılaştırıldığında, dendritik filopodia zengin fraksiyondan olgunlaşmamış sinaps üzerinde hareket sinaptik proteinlerin tanımlamak mümkün olabilir. Böylece, dendritik filopodia zengin fraksiyonu bileşenleri% 74 tarafından PSD kesir olandan farklıdır. PSD kesir farklı, biz aktif fagositik bardak oluşturmak için kültürlü hipokampal nöronlar kullanılan ve hücrelerin hayatta olması gerekir. Fagositik kupayı oluşturmak için TLCN ile vitronektin arasındaki etkileşimi kullandık. TLCN ifadesi telencephalon 'da sınırlıdır. Böylece, biz serebellar türetilen kültürlü nöronlar kullanamazsınız. Ancak, boncuklar farklı proteinler ile ceket, bu aktivite bağımlı arıtma yöntemi serebellar nöronlara uygulanabilir. Örneğin, glutamat reseptörünün N-terminal etki alanı delta2-kaplı mikroboncuk serebellar granül hücrelerine uygulandığında, presinaptik neurexin ve cbln1 bağlayıcı proteinlerden tespit edildi. Bu nedenle, kaplama proteinlerinin değiştirilmesi durumunda bu etkinliğe bağımlı yöntem kullanılabilir. Vitronektin kaplı mikroboncuk erişim beyin dilim ve beyin dokusu ile sınırlı olduğundan, fagositik bardak verimli oluşturulmaz. Böylece, gelecekteki görevleri beyin dilim ve doku dendritik filopodia-zengin fraksiyonu arıtma yöntemi geliştirilmesi içerir.
Bu protokolde, hipokampal nöronlar için düşük yoğunluklu kültür durumu kullanılır ve glial hücrelerin büyümesi ara-C10,20,21ilavesi ile engellenir. Hipokampal nöronlar MEM kendimizi tarafından hazırlanan kültürlü, ama nörobazal orta değil, yaygın hipokampal nöronların kültürü için kullanılır. Hipokampal nöronlar genellikle ölmek 14 DıV zaman nörobazal orta kültürlü, nörobazal orta bizim düşük yoğunluklu kültür durumu için uygun olmadığını gösterir. Buna ek olarak, düşük yoğunluklu kültürün önemli bir yönü poli-l-lizin hidrobromür ile yemek kaplama, Poly-L-lizin ile değiştirilemez.
Dendritik filopodia zengin fraksiyondan protein yeterli miktarda elde etmek için, hipokampal nöronlar ve manyetik mikroboncuk numaraları önemli faktörlerdir. Hipokampal nöronlar bir 35 mm yemek üzerinde kaplama edildi immünostatik dendritik filopodia için, 5,6 x × 104 hücreler/çanak, nöronlar olarak kaplama iken 7,0 x 104 hücreler/yemek dendritik filopodia zengin fraksiyonu için temizleme. At 14 DIV, neredeyse hiçbir hipokampal nöronlar 5,6 x 104 hücreler veya immünostatik için çanak, hipokampal nöronların birçok kısmen 7,0 x 104 hücreler/çanak dendritik filopodia-zengin arıtma için diğer nöronlar ile çakışan iken Kesir. Ancak, dendritik filopodia oldukça hipokampal nöronların her iki yoğunlukta mevcut oldu. Hipokampal nöronların yüksek yoğunluklu kültürler genellikle düşük yoğunluklu kültürlü hipokampal nöronların daha hızlı Olgun; Böylece, hipokampal nöronların yoğunluğunu düşük yoğunluklu kültüre ayarlamak dendritik filopodia zengin kesir elde etmek için vazgeçilmez. Microbeads, 1 x 106 mikroboncuk/çanak immünostatik ve 3 x 106 mikroboncuk/yemek dendritik filopodia zengin fraksiyonu arıtma için eklendi. Kesenin arıtılması için, yeterli miktarda boncuk eklendikten sonra, ilişkisiz boncuklar hipokampal nöronlardan yıkıldı.
Bu protokolde, mikroboncuk otomatik olarak kültür ortamında mevcut VN ile kaplanmıştır. Ancak mikroboncuk rekombinant VN ile kaplanabilir ve hipokampal nöronlara eklenebilir. VN çok yapışkan bir protein olduğundan, VN kaplı mikroboncuk kolayca toplamları oluşturur. Böylece, vn kaplı mikroboncuk sonicated ve hipokampal nöronlara ek olarak hemen önce birbirlerinden ayırmak için pipetli.
Daha önce VN kaplı mikroboncuk phosphor-ERM, PI (4, 5) P2ve F-actin ile birlikte tlcn birikimi15ile ortaya çıktı. Ne zaman dendritik filopodia-zengin fraksiyonu Western blotting tarafından analiz edildi, phospho-ERM Anti-fosho-ERM poliklonal antikor tarafından tespit edilmedi ve biraz anti-ezrin ve anti-moesin monoklonal antikorlar tarafından tespit edildi. Bu monoklonal antikorların duyarlılık Anti-phospho-ERM poliklonal antikor daha yüksek olduğunu görünür. Buna ek olarak, ERM proteinleri hipokampal nöronların neredeyse tüm bölgelerine lokalizedir, ancak phospho-ERM proteinlerinin sadece dendritik filopodia ve fagositik bardak ucuna lokalizedir. Bu TLCN için phospho-ERM bağlayıcı miktarı fosforli olmayan ERM miktarına kıyasla sınırlıdır olarak kabul edilir. Böylece, dendritik filopodia-zengin fraksiyonda phospho-ERM tespiti zor görünüyor.
Mikroboncukları hücre membrandan ayırmak için,% 0,01 Triton X-100 olan zayıf bir deterjan kullandık. Tlcn, dendritik filopodia ve fagositik fincan yapılarında phospho-ERM ile aktin filament ile bağlantılıdır. Aktin filament aracılığıyla tlcn ile dolaylı olarak bağlantılı proteinleri arındırmak için bu protokolde zayıf bir deterjan kullandık. Ancak, Triton X-100 konsantrasyonu, denemenin amacına bağlı olarak daha yüksek bir konsantrasyona değiştirilebilir.
Esselens ve ark. mikroboncuk fagositik alımı indüklenen TLCN, PıP2, ve F-akin birikimi kültürlü hipokampal nöronlar17göstermiştir. Mikro boncuklar ile 24 h İnkübasyon sonrasında Konfokal mikroskopiye göre analizimizde, mikroboncuk tamamen sitoplazmada alınmadı. Hücre zarına lokalize olan TLCN ve PıP2, özellikle mikroboncuk altındaki boncuklar etrafında lokalizedir. Buna ek olarak, dendritik filopodia zengin fraksiyondan tanımlanan 319 proteinleri KEGG yol analizi kullanılarak analiz edildi. Fagositoz ve otoptal yollar algılanmadı, ancak sitoiskelet organizasyonu, exocytosis, akin-filament bazlı süreç ve mikrotubül bazlı süreç18.
Dendritik filopodia oluşumunun moleküler mekanizması büyük ölçüde bilinmemektedir. Fagositik fincan yapısının analizi, dendritik filopodia 'nın moleküler bileşenlerini ve dinamik fonksiyonlarını anlamanıza yardımcı olabilir. Nörogelişimsel ve nöropsikiyatrik bozuklukların fare modellerinden hazırlanan dendritik filopodia zengin fraksiyonu analiz etmek ilginç olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz hipokampal nöronların düşük yoğunluklu kültürü için Shigeo Okabe ve Hitomi Matsuno teşekkür, tlcn eksikliği fareler için Masayoshi Mishina, teknik yardım için Sachiko Mitsui ve Momoko Shiozaki ve yararlı tartışmalar için Yoshihara Laboratuvarı üyeleri . Bu çalışma JSPS KAKENHI Grant NOS tarafından desteklenmektedir. JP20700307, JP22700354 ve JP24500392 ve MEXT KAKENHI Grant Nos. JP23123525 için YF ve JP20022046, JP18H04683 ve JP18H05146 YY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 1.7 mLl Low Binding MCT | Sorenson BioScience | 39640T | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | 2530149 | |
| 35 mm plastic cell culture dishes | Corning | 430165 | |
| Anti-actin | Sigma-Aldrich | A-5060 | |
| Anti-alpha-Actinin | Sigma-Aldrich | A-5044 | |
| Anti-alpha-tubulin | Sigma-Aldrich | T-9026 | |
| Anti-Ezrin | Sigma-Aldrich | clone3C12, SAB4200806 | |
| Anti-Galphaq | Santacruz | sc-393 | |
| Anti-MAP2 | Chemicon | clone AP20, MAB3418 | |
| Anti-Moesin | Sigma-Aldrich | clone 38/87, M7060 | |
| Anti-PLCbeta1 | Santacuz | sc-5291 | |
| Anti-PSD95 | MA2 | ABR | |
| Anti-Spectrin beta | Chemicon | MAB1622 | |
| B27 | Gibco | 0080085SA | |
| BCA protein assay kit | Thermo | 23227 | |
| Bromophenol blue | Merck | 1.08122.0005 | |
| Calcium chrolide, hydrous | Wako | 038-19735 | |
| Cell scraper | Falcon | 353085 | |
| Cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Choline chloride | Sigma-Aldrich | C7527 | |
| Complete EDTA free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Cytosine beta-D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich | C-6645 | |
| DNase-I | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma-Aldrich | P5155 | |
| DynaMag-2 Magnet | Thermo | 12321D | |
| ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE | RPN2232 | |
| e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gradient gel | ATTO | E-T520L | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
| HBSS | Gibco | 14175095 | |
| HRP-conjugated anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | |
| i-Inositol | Sigma-Aldrich | I7508 | |
| LAS-1000 mini | Fuji Film | LAS-1000 mini | For detection of luminescence from WB membrane |
| Magnetic polystyrene microbeads | Sperotech | PM-20-10 | |
| MEM amino acid solution | Gibco | 11130-051 | 30 mM L-Arginine hydrochloride, 5 mM L-Cystine, 10 mM L-Histidine hydrochloride-H2O, 20 mM L-Isoleucine, 20 mM L-Leucine, 19.8 mM L-Lysine hydrochloride, 5.1 mM L-Methionine, 10 mM L-Phenylalanine, 20 mM L-Threonine, 2.5 mM L-Tryptophan, 10 mM L-Tyrosine, and 20 mM L-Valine |
| Mini-slab size electrophoresis system | ATTO | AE-6530 | |
| Niacinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Penicilin / Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail | Roche | 4906845001 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Nacali | 28360-14 | |
| Pyridoxal HCl | Sigma-Aldrich | P6155 | |
| Riboflavin | Sigma-Aldrich | R9504 | |
| Silver Stain 2 Kit wako | Wako | 291-5031 | |
| Thiamine HCl | Sigma-Aldrich | T1270 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-rad | 1703940JA | |
| Ultra pure water | MilliQ | For production of ultra pure water |
References
- Fiala, J. C., Feinberg, M., Popov, V., Harris, K. M. Synaptogenesis via dendritic filopodia in developing hippocampal area CA1. Journal of Neuroscience. 18 (21), 8900-8911 (1998).
- Portera-Cailliau, C., Pan, D. T., Yuste, R. Activity-regulated dynamic behavior of early dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia. Journal of Neuroscience. 23 (18), 7129-7142 (2003).
- Ziv, N. E., Smith, S. J. Evidence for a role of dendritic filopodia in synaptogenesis and spine formation. Neuron. 17 (1), 91-102 (1996).
- Lohmann, C., Bonhoeffer, T. A role for local calcium signaling in rapid synaptic partner selection by dendritic filopodia. Neuron. 59 (2), 253-260 (2008).
- Yoshihara, Y., De Roo, M., Muller, D. Dendritic spine formation and stabilization. Current Opinion in Neurobiology. 19 (2), 146-153 (2009).
- Bayes, A., et al. Comparative study of human and mouse postsynaptic proteomes finds high compositional conservation and abundance differences for key synaptic proteins. PLoS One. 7 (10), e46683 (2012).
- Bayes, A., et al. Characterization of the proteome, diseases and evolution of the human postsynaptic density. Nature Neuroscience. 14 (1), 19-21 (2011).
- Furutani, Y., et al. Interaction between telencephalin and ERM family proteins mediates dendritic filopodia formation. Journal of Neuroscience. 27 (33), 8866-8876 (2007).
- Mao, Y. T., et al. Filopodia Conduct Target Selection in Cortical Neurons Using Differences in Signal Kinetics of a Single Kinase. Neuron. 98 (4), 767-782 (2018).
- Matsuno, H., et al. Telencephalin slows spine maturation. Journal of Neuroscience. 26 (6), 1776-1786 (2006).
- Raemaekers, T., et al. ARF6-mediated endosomal transport of Telencephalin affects dendritic filopodia-to-spine maturation. The EMBO Journal. 31 (15), 3252-3269 (2012).
- Mori, K., Fujita, S. C., Watanabe, Y., Obata, K., Hayaishi, O. Telencephalon-specific antigen identified by monoclonal antibody. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (11), 3921-3925 (1987).
- Yoshihara, Y., Mori, K. Telencephalin: a neuronal area code molecule? Neuroscience Research. 21 (2), 119-124 (1994).
- Annaert, W. G., et al. Interaction with telencephalin and the amyloid precursor protein predicts a ring structure for presenilins. Neuron. 32 (4), 579-589 (2001).
- Furutani, Y., et al. Vitronectin induces phosphorylation of ezrin/radixin/moesin actin-binding proteins through binding to its novel neuronal receptor telencephalin. Journal of Biological Chemistry. 287 (46), 39041-39049 (2012).
- Nyman-Huttunen, H., Tian, L., Ning, L., Gahmberg, C. G. alpha-Actinin-dependent cytoskeletal anchorage is important for ICAM-5-mediated neuritic outgrowth. Journal of Cell Biology. 119 (Pt 15), 3057-3066 (2006).
- Esselens, C., et al. Presenilin 1 mediates the turnover of telencephalin in hippocampal neurons via an autophagic degradative pathway. Journal of Cell Biology. 166 (7), 1041-1054 (2004).
- Furutani, Y., Yoshihara, Y. Proteomic Analysis of Dendritic Filopodia-Rich Fraction Isolated by Telencephalin and Vitronectin Interaction. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 10, 27 (2018).
- Lu, Z., Piechowicz, M., Qiu, S. A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture. Journal of Visualized Experiments. (109), (2016).
- Okabe, S., Miwa, A., Okado, H. Alternative splicing of the C-terminal domain regulates cell surface expression of the NMDA receptor NR1 subunit. The Journal of Neuroscience. 19 (18), 7781-7792 (1999).
- Okabe, S., Vicario-Abejon, C., Segal, M., McKay, R. D. Survival and synaptogenesis of hippocampal neurons without NMDA receptor function in culture. European Journal of Neuroscience. 10 (6), 2192-2198 (1998).
