Summary
Dans ce protocole, nous introduisons une méthode pour purifier la fraction dendritique filopodia-riche de la structure phagocytic de la coupe-comme la saillie sur les neurones hippocampiques cultivés en profitant de l'affinité spécifique et forte entre un filopodial dendritique la molécule d'adhérence, TLCN, et une molécule extracellulaire de matrice, vitronectin.
Abstract
La filodée dendritique sont des saillies minces et longues basées sur le filament d'actine, et elles s'étendent et se rétractent comme si la recherche d'un axone cible. Lorsque la filodée dendritique établir le contact avec un axone cible, ils commencent à mûrir dans les épines, conduisant à la formation d'une synapse. La télencéphale (TLCN) est abondamment localisée dans la filodée dendritique et est progressivement exclue des épines. La surexpression de TLCN dans les neurones hippocampiques cultivés induit la formation de filopodia dendritique. Nous avons montré que la téencéphale se lie fortement à une molécule de matrice extracellulaire, la vitronectin. Les microbilles vitronectin-enduites ont induit la formation phagocytic de tasse sur les dendrites neuronales. Dans la tasse phagocytique, TLCN, les protéines tlcN-contraignantes telles que l'Ezrin/Radixin/Moesin phosphorylé (phospho-ERM), et F-actine sont accumulées, ce qui suggère que les composants de la tasse phagocytique sont semblables à ceux de la filodasie dendritique. Ainsi, nous avons développé une méthode pour purifier la tasse phagocytique au lieu de filopodia dendritique. Des perles magnétiques de polystyrène ont été enduites avec la vitronectin, qui est abondamment présente dans le milieu de culture des neurones hippocampiques et qui induit la formation phagocytic de tasse sur les dendrites neuronales. Après 24 h d'incubation, les tasses phagocytiques ont été légèrement solubilisées avec le détergent et rassemblées utilisant un séparateur d'aimant. Après avoir lavé les perles, les protéines de liaison ont été élucées et analysées par la coloration argentée et le ballonnement occidental. Dans la fraction contraignante, Le TLCN et l'actine étaient très présents. En outre, beaucoup de protéines identifiées de la fraction ont été localisées à la filopodia dendritique ; ainsi, nous avons nommé la fraction de liaison comme la fraction dendritique filopodia-riche. Cet article décrit des détails concernant la méthode de purification pour la fraction dendritique filopodia-riche.
Introduction
La filodée dendritique sont considérées comme des précurseurs des épines. Les filaments d'actine dans la filopodia dendritique règlent leur extension et rétractation1,2,3. Après contact avec un axone, la filodée dendritique sélectionnée commence leur maturation dans les épines, et une synapse est formée4,5. Les composants des épines ont été déterminés à partir de l'analyse complète des fractions de densité postsynaptic6,7, tandis que les composants de la filodée dendritique restent largement inconnus. Il a été démontré que la télencéphaline (TLCN), ERM, SynGAP, Ras, PI3 kinase, Akt, mTOR, polo-like kinase 2, CaMKII, syndecan-2, paralemin-1, ARF6, et EphB régulent la formation de filopodia dendritique5,8,9 ,10,11, alors qu'une méthode n'a pas été développée pour l'analyse complète des molécules présentes dans la filodée dendritique.
TLCN (ICAM-5) est spécifiquement exprimé par les neurones épineux dans le segment le plus rostral du cerveau, le telencephalon12. TLCN a 9 domaines Ig-like dans sa région extracellulaire, une région transmembrane, et une queue cytoplasmique13. TLCN lie à la vitronectin (VN) et LFA-1 integrin dans sa région extracellulaire, à la présénilin e dans sa région transmembrane, et à la phospho-ERM et à l'actinine dans sa région cytoplasmique5,8,14,15 ,16. TLCN se lie au cytosquelette d'actine par phospho-ERM aux extrémités de la filodée dendritique et de l'actinine dans les épines et les arbres dendritiques8,16.
Nous avons montré que la surexpression de TLCN a amélioré la formation de filopodia dendritique et a induit le retour des épines à la filopodia10. La forme active constitutive de l'ezrin lié à la région cytoplasmiquede TLCN et la formation améliorée de filopodia dendritique 8. Ainsi, TLCN régule la formation de filopodia dendritique par des protéines actin-contraignantes. Esselens et coll. ont démontré que les microbilles induisaient l'accumulation de TLCN sur les neurones cultivés17. Nous avons montré que les structures phagocytiques de tasse ont été formées sur les dendrites neuronales autour des microbilles VN-enduites dans une manière TLCN-dépendante15. Les constituants de la filodée dendritique sont semblables à ceux de la tasse phagocytique. Il est difficile de recueillir la filodée dendritique, mais il est relativement plus facile de recueillir la tasse phagocytique à l'aide de microbilles magnétiques. Ainsi, nous avons développé une méthode pour purifier la tasse phagocytique au lieu de filopodia dendritique18. Ici, nous décrivons la méthode de purification pour la fraction dendritique filopodia-riche.
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Protocol
Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de RIKEN Wako.
1. Culture des neurones hippocampiques
- Préparation du milieu de culture
- Préparation du mélange de vitamine 200x. Dissoudre 100 mg de sel hémicalcium acide D-pantothénique, 100 mg de chlorure de choline, 100 mg d'acide folique, 180 mg d'i-inositol, 100 mg de niiacinamide, 100 mg de HCl pyridoxal et 100 mg de thiamine HCl dans 500 ml d'eau ultrapure à l'aide d'un remuant magnétique. La solution n'est pas complètement dissoute. Mélanger délicatement, l'aliquot dans des tubes de 50 ml et le conserver à -20 oC.
- Préparation de la solution Riboflavin. Dissoudre 100 mg de Riboflavine dans 500 ml d'eau ultrapure à l'aide d'un agitateur magnétique. La solution n'est pas complètement dissoute. Mélanger délicatement, l'aliquot dans des tubes de 50 ml et le conserver à -20 oC.
- Préparation de 1 M CaCl2. Dissoudre 7,35 g de CaCl2x 2H2O dans 50 ml d'eau ultrapure à l'aide d'un agitateur magnétique.
- Préparation du médium essentiel minimum (MEM). Dissoudre 400 mg de KCl, 6800 mg de NaCl, 2 200 mg de NaHCO3, 158 mg de NaH2PO4o 2H2O, 7000 mg de D-glucose, et 200 mg de MgSO4-7H2O dans 950 mL d'eau ultrapure à l'aide d'un agitateur magnétique.
- Titrate 1,8 ml de 1 M CaCl2 au MEM d'une manière goutte à goutte à l'aide d'une tuyauterie de 1 ml avec une agitation constante sur un agitateur magnétique. Ajuster le pH du MEM à pH 7,25 avec 1 mol/L HCl.
- Ajouter 5 ml de mélange de vitamine 200x et 200 l de solution Riboflavin au MEM. Ajuster le volume de la solution à 1000 ml avec de l'eau ultrapure. Filtrer la solution à l'aide d'un système de filtre de 0,22 m et la stocker à 4 oC.
- Préparation de solutions de stock 10x DNase-I. Dissoudre 100 mg de DNase-I dans 12,5 ml de la solution de sel équilibrée (HBSS) de Hanks, filtrer à travers un filtre de 0,22 m, aliquot dans des tubes de 1,5 ml, et stocker les tubes à -20 oC.
- Préparation de la solution de stock cytosine-D-arabinofuranoside (Ara-C). Dissoudre 25 mg d'Ara-C dans 8,93 ml d'eau ultrapure (concentration finale de 10 mM), filtrer à travers un filtre de 0,22 m, aliquot dans des tubes de 1,5 ml et conserver à -20 oC
- Préparation du milieu de placage. Mélanger 1 ml de solution d'acide aminé MEM, 750 l de 1 M HEPES, 1 ml de B27, 125 oL de glutamine de 200 mM, 250 l de pénicilline/streptomycine, 2,5 mL de sérum bovin fœtal (FBS) et 44,375 mL de MEM dans un tube de 50 ml.
- Préparation du milieu d'arrêt. Mélanger 1 mL de solution d'acide aminé MEM, 750 l de 1 M HEPES, 5 mL de FBS (finale 10%) et 43,25 ml de MEM dans un tube de 50 ml.
- Préparation de plats enduits de poly-L-Lysine
- Enrober les plats de culture de cellules en plastique de 35 mm de 0,2 mg/ml d'hydrobromure de poly-L-lysine pendant 1 jour à 25 oC.
REMARQUE: La poly-l-lysine ne doit pas être utilisée au lieu de l'hydrobromure de poly-L-lysine. - Laver la vaisselle avec 2 ml d'eau ultrapure 3 fois. Incuber les plats avec 1,5 ml de milieu d'arrêt à 25 oC jusqu'à utilisation.
- Enrober les plats de culture de cellules en plastique de 35 mm de 0,2 mg/ml d'hydrobromure de poly-L-lysine pendant 1 jour à 25 oC.
- Dissection des neurones hippocampiques de l'embryon de souris
- Source tissulaire des neurones hippocampiques. Disséquer l'hippocampe de type sauvage et TLCN-déficientcc C57BL6/J souris sur les jours embryonnaires 16-17 selon la méthode de Lu et al.19.
- Incubate disséqué hippocampi en trypsine 0,25% et 1x DNaseI en HBSS contenant 15 mM HEPES, pH 7,2 pour 15 min à 37 oC avec agitation toutes les 3 min. Supprimer la solution. Incuber l'hippocampe dans 10 ml de milieu STOP pour inactiver la trypsine à 4 oC pendant 5 min.
- Déplacer l'hippocampe dans 10 ml de milieu FRAIS STOP et incuber à 4 oC pendant 5 min. Déplacer l'hippocampe dans 10 ml de milieu STOP frais et incuber à 4 oC pendant 5 min. Déplacez l'hippocampe en 900 oL de milieu STOP et 100 l de 10x DNaseI dans un 15 mL tube. Dissocier les hippocampes en neurones isolés en pipetting 20 fois à l'aide d'un tuyautde de 1 ml.
REMARQUE: La pointe de la tuyauterie de 1 ml touche légèrement le fond du tube de 15 ml lors de la dissociation de l'hippocampe. - Ajouter 9 ml de milieu de placage et filtrer à travers une passoire cellulaire de 70 m dans un tube de 50 ml. Comptez le nombre de cellules à l'aide d'un hémocytomètre et ajustez-les à 3,5 x 104 cellules/mL dans le milieu de placage.
- Aspirez LE milieu STOP des plats enrobés de poly-L-lysine. Déposer les cellules sur des plats enduits de poly-L-Lysine à 7 x 104 cellules/plat (2 ml/plat).
- Après 60-64 h d'incubation sous 5% co2 à 37 oC, ajouter 2 'L de solution de stock Ara-C (finale 10 'M) aux neurones, et secouer le plat lentement. Gardez les plats de culture dans une boîte humidifiée sans changer le milieu de culture en dessous de 5% CO2 à 37 oC.
2. Purification de La fraction riche en Filopodia dendritique
- Après 13 jours in vitro (DIV), ajouter des microbilles magnétiques de polystyrène (3 x 106 particules/plat) à 20 plats contenant les neurones cultivés. Après 1 jour, lavez les neurones dans 1 ml de PBS avec l'agitation 3 fois pour enlever les microbilles moyennes et non liées. Après avoir enlevé le PBS, lysez les neurones avec un tampon de lyse de 500 l/l (PBS contenant 0,01 % de Triton X-100, cocktail inhibiteur de la protéase sans EDTA et cocktail inhibiteur de la phosphatase).
- Recueillir le lysate à l'eau à l'œil d'un grattoir cellulaire et déplacer le lysate vers des microtubes à faible teneur en protéines (10 tubes). Placez les tubes sur un séparateur d'aimant et attendez 1 min. Recueillir le supernatant et l'utiliser comme la fraction non liée pour la coloration d'argent et l'analyse de tache occidentale.
- Transférer les perles dans un nouveau microtube à faible teneur en protéines, réglé sur un séparateur magnétique, et retirer complètement le supernatant. Ajouter 500 l de tampon de lyse et laver les perles à l'aide d'un mélangeur à vortex pendant 15 s. Mettre le tube sur un séparateur d'aimant, attendre 1 min, retirer le supernatant et ajouter 500 l de tampon de lyse. Répéter le lavage des perles 10 fois et retirer le supernatant.
- Protéines d'Elute liées aux perles (la fraction liée) par l'ajout de 50 'L de tampon d'échantillon sDS 1x (62,5 mM Tris HCl, pH 6,8, 2,5% SDS, et 10% glycérol) et faire bouillir le tube à 98 oC pendant 5 min. Centrifugeuse le tube à 860 x g pour 10 s et a mis le tube sur un séparateur magnétique pendant 1 min. Recueillir le supernatant et l'utiliser comme fraction liée.
REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici. - Mesurer les concentrations protéiques des fractions non liées et liées par l'évaluation des protéines BCA. Visualisez des solutions protéiques avec du bleu bromophénol et ajustez la concentration à 5 ng/L pour SDS-PAGE.
3. Silver Staining et Western Blot Analysis
- Séparez les fractions liées et non liées (50 ng) par SDS-PAGE à l'aide d'un gel de gradient de 5 à 20 %. Tache d'argent le gel.
- Western blot utilisant l'anti-TLCN-C (1/3 000), la vitronctine anti-bovine (1/5 000), l'anti-actine (1/1 000) et l'anti-tubulin (1/1 000) comme anticorps primaires et l'anti-lapin de chèvre hrP-conjugué IgG (1/5 000) comme anticorps secondaires. Visualisez les antigènes à l'aide d'un réactif de détection de blotting occidental chemiluminescent et d'un imageur de chemiluminescence.
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Representative Results
Dans les neurones hippocampiques cultivés, TLCN a été abondamment localisé à la filodée dendritique, l'arbre, et le soma et colocalisé avec F-actin (Figure 1A, B). Lorsque des microbilles de polystyrène ont été ajoutées aux neurones hippocampiques cultivés, les perles ont été automatiquement enduites de vitronectin (VN) dérivée du sérum bovin foetal (FBS) dans le milieu de culture; ils étaient principalement liés à des dendrites, et ils ont induit la formation de tasses phagocytiques (Figure 1B-E). Les tasses phagocytiques ont été basées sur des filaments d'actinen en forme de feuille autour des microbilles sur des dendrites. TLCN, phospho-ERM, et PI(4,5)P2, qui sont des marqueurs pour la filodée dendritique, sont fortement accumulés autour des perles (Figure 1D)8,15. Les tasses phagocytiques n'ont été formées que sur les neurones hippocampiques de type sauvage, mais pas sur les neurones hippocampiques déficients de TLCN (figure2A-D). Ainsi, la formation de tasse phagocytic était crucialement dépendante de la présence de TLCN dans les dendrites.
Les constituants de la filopodia dendritique sont apparus semblables à ceux des tasses phagocytic. Ensuite, nous avons purifié les tasses phagocytiques au lieu de filopodia dendritique. Le protocole pour la purification des gobelets phagocytiques est schématiquement montré dans la figure 3. Des microbilles magnétiques ont été ajoutées aux neurones hippocampiques cultivés de type sauvage, qui induit la formation des structures phagocytic de tasse. Les structures phagocytic de tasse ont été lysed avec un détergent faible. Les microbilles ont été recueillies après la lyse à l'aide d'un séparateur d'aimant. Après le lavage des perles, leurs protéines de liaison ont été bouillies et élucées dans un tampon d'échantillon de SDS.
La quantité de protéines dans la fraction liée et non liée a été mesurée à l'aide du kit d'évaluation des protéines BCA. La même quantité de protéines dans les fractions non liées et liées a été séparée par SDS-PAGE et tachée par des taches d'argent (Figure 4A). Les modèles de bande de protéine étaient presque les mêmes pour les fractions non liées et liées, mais les intensités à 50 et 70 kDa dans la fraction liée étaient inférieures à ceux dans la fraction non liée. Cependant, l'intensité de la bande n'était évidemment pas différente entre les fractions non liées et liées préparées à partir de neurones hippocampiques de culture déficients tLCN. Pour confirmer la purification des structures phagocytic de tasse, nous avons exécuté le blotting occidental utilisant l'anti-TLCN-C, la vitronctine anti-bovine, l'anti-actin, et l'anti-tubulin (figure 4B). TLCN et VN ont été principalement détectés dans la fraction liée. Actine, ezrin, Gôq, PLC1, MAP-2, et spectrin ont été détectés dans les fractions liées et non liées. Moesin, PSD-95, '-actinin, et '-tubulin ont été détectés dans la fraction non liée.
Figure 1 : Localisation du TLCN et de l'actine F dans la filopodia dendritique et les tasses phagocytiques. (A) La coloration immunofluorescence des dendrites d'un neurone hippocampal cultivé exprimant gapVenus avec anticorps anti-GFP (bleu dans une image fusionnée), anticorps anti-TLCN (rouge dans une image fusionnée), et phalloidin (vert dans une image fusionnée). TLCN et F-actin sont abondamment observés dans la filodée dendritique. (B, C) Formation des structures phagocytic de tasse sur les dendrites neuronales. Les microbilles fluorescentes (bleues dans les images fusionnées de B, C) ajoutées aux neurones hippocampiques cultivés adhèrent fortement aux dendrites et induisent l'accumulation de TLCN (rouge dans les images fusionnées de B, C) et de F-actin (vert dans les images fusionnées de B, C). (D) Une vue latérale d'une tasse phagocytique dendritique reconstruite à partir d'images confocales révèle TLCN (rouge dans les images fusionnées de D) entourant la perle fluorescente (bleu dans les images fusionnées de D). (E) Une tasse phagocytique dendritique induite par une microbille magnétique attachée à un dendrite neuronal et immunostained avec anticorps anti-VN (bleu dans les images fusionnées de E), anticorps anti-TLCN (rouge dans les images fusionnées de E), et phalloidin (vert dans les images fusionnées de E). Barres d'échelle à 1 m (D); 2 m (A), (C) et (E); et 20 m (B). Ce chiffre a été modifié par rapport à une étude précédente18. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Formation dépendante de TLCN d'une structure phagocytique ressemblant à une tasse. (A-D) Images de fluorescence triple de type sauvage (WT; A, C) et TLCN-déficient (KO; C, D) neurones traités avec des perles fluorescentes enduites de VN (rouges dans des images fusionnées de A, B, C, D) et étiquetés avec des anticorps anti-TLCN (verts en images fusionnées de A, B, C, D) et d'anticorps antiphospho-ERM (bleu dans les images fusionnées de A, B) ou Alexa488-phaloidin (bleu en fusion images de C, D). Barres d'échelle de 5 m. Ce chiffre a été modifié à partir d'une étude précédente15. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Diagramme schématique illustrant la procédure de purification de la fraction riche en filopodia dendritiques. Des microbilles magnétiques ont été ajoutées sur les neurones hippocampiques cultivés pour induire la formation des tasses phagocytic dendritiques. Après 1 jour d'incubation, les neurones ont été solubilisés avec le tampon de lyse contenant 0.01% Triton X-100. Les perles ont été séparées de la fraction non liée à l'aide d'un séparateur magnétique. Après le lavage, les protéines liées ont été élucées avec le tampon d'échantillon de SDS et employées comme fraction liée. Rouge: VN, vert: TLCN, autres couleurs: protéines liées. Ce chiffre a été modifié par rapport à une étude précédente18. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Confirmation de la fraction de tasse phagocytique. (A) Coloration argentée des protéines dans les fractions non liées et liées des microbilles. La même quantité (50 ng) de protéines dans les fractions non liées et liées purifiées à partir de neurones hippocampiques de type sauvage (WT) et TLCN -déficients (TLCN KO) ont été séparées par SDS-PAGE et visualisées avec des taches d'argent. (B) Analyse de la tache occidentale des fractions non liées et liées. La même quantité (50 ng) de protéines ont été séparées par SDS-PAGE et soumises à l'analyse de tache occidentale utilisant anti-TLCN, anti-VN, anti-actine, anti-ezrin, anti-moesin, anti-Gôq, anti-PLC1, anti-MAP-2, anti-spectrin, anti-PSD-95, anti-actine, et anticorps anti-tubulin. Notez que TLCN, VN, actine, ezrin, PLC1, MAP-2, et spectrin sont observés dans la fraction dendritique filopodia-riche. Ce chiffre a été modifié par rapport à une étude précédente18. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Nous avons développé une méthode de purification pour la fraction dendritique filopodia-riche en utilisant l'affinité entre la molécule d'adhérence cellulaire TLCN et la protéine extracellulaire de protéine vitronectin. Par rapport à la fraction DEP, il pourrait être possible d'identifier les protéines synaptiques agissant sur la synapse immature de la fraction dendritique filopodia-riche. Ainsi, les constituants de la fraction dendritique filopodia-riche sont différents de ceux de la fraction PSD par 74%. Différent de la fraction de PSD, nous avons employé les neurones hippocampiques cultivés pour former activement des tasses phagocytic, et les cellules doivent être vivantes. Pour former la coupe phagocytique, nous avons utilisé l'interaction entre TLCN et vitronectin. L'expression de TLCN est limitée dans le telencephalon. Ainsi, nous ne pouvons pas utiliser les neurones cultivés dérivés du cérécolar. Cependant, si nous enduisons les perles avec différentes protéines, cette méthode de purification activité-dépendante pourrait être appliquée aux neurones céréveleux. Par exemple, lorsque le domaine N-terminal des microbilles enduites de delta2 des récepteurs du glutamate est appliqué sur les cellules granules cérévelaires, la neurexine présynaptique et le cbln1 ont été identifiés à partir des protéines de liaison. Par conséquent, cette méthode dépendante de l'activité pourrait être utilisée, si les protéines de revêtement sont modifiées. Puisque l'accès des microbilles vitronectin-enduite est limité à la tranche de cerveau et au tissu de cerveau, les tasses phagocytic ne sont pas formées efficacement. Ainsi, les tâches futures incluent le développement de la méthode de purification de la fraction dendritique riche en filopodia de la tranche de cerveau et des tissus.
Dans ce protocole, l'état de culture de basse densité est employé pour les neurones hippocampiques, et la croissance des cellules gliales sont inhibées par l'addition de Ara-C10,20,21. Les neurones hippocampiques sont cultivés dans MEM préparé par nous-mêmes, mais pas dans le milieu neurobasal, qui est largement utilisé pour la culture des neurones hippocampiques. Les neurones hippocampiques meurent souvent par 14 DIV lorsqu'ils sont cultivés sur le milieu neurobasal, ce qui indique que le milieu neurobasal n'est pas adapté à notre condition de culture de faible densité. En outre, un aspect important de la culture de faible densité est l'enrobage du plat avec de l'hydrobromure de poly-L-lysine, qui ne peut pas être remplacé par de la poly-L-lysine.
Pour obtenir une quantité suffisante de protéines à partir de la fraction dendritique riche en filopodia, le nombre de neurones hippocampiques et de microbilles magnétiques sont des facteurs importants. Pour la filodée dendritique immunostaining, les neurones hippocampiques ont été plaqués sur un plat de 35 mm à 5.6 x '104 cellules/plat, tandis que les neurones ont été plaqués à 7.0 x 104 cellules/plat pour la purification de la fraction dendritique filopodia-riche. À 14 DIV, presque aucun neurone hippocampal chevauché à 5.6 x 104 cellules/plat pour immunostaining, alors que beaucoup de neurones hippocampal se chevauchaient partiellement avec les autres neurones à 7.0 x 104 cellules/plat pour la purification du filopodia-riche dendritique fraction. Cependant, la filodée dendritique étaient abondamment présentes aux deux densités des neurones hippocampiques. Les cultures à haute densité des neurones hippocampiques mûrissent souvent plus rapidement que les neurones hippocampiques cultivés de faible densité; ainsi, l'ajustement de la densité des neurones hippocampiques à la culture de basse densité est indispensable pour obtenir la fraction dendritique filopodia-riche. Des microbilles ont été ajoutées à 1 x 106 microbilles/plat pour immunostaining et à 3 x 106 microbilles/plat pour la purification de la fraction dendritique filopodia-riche. Pour la purification de la fraction, une fois qu'une quantité suffisante de perles a été ajoutée, les perles non liées ont été lavées des neurones hippocampiques.
Dans ce protocole, les microbilles étaient automatiquement recouvertes de VN, qui est présent dans le milieu de culture. Cependant, les microbilles peuvent être enduites de VN recombinant et ajoutées aux neurones hippocampiques. Parce que le VN est une protéine très collante, les microbilles enduites de VN forment facilement des agrégats. Ainsi, les microbilles enduites de VN sont sonicated et pipetted pour se dissocier les uns des autres juste avant l'addition aux neurones hippocampal.
Nous avons précédemment montré que les microbilles enduites vN induit le phosphore-ERM, PI(4,5)P2, et F-actin avec l'accumulation de TLCN15. Quand la fraction dendritique filopodia-riche a été analysée par le ballonnement occidental, phospho-ERM n'a pas été détecté par l'anticorps polyclonal anti-phospho-ERM et a été légèrement détectée par des anticorps monoclonaux d'anti-ézitine et d'anti-moesin. Il semble que la sensibilité des anticorps monoclonaux était plus élevée que l'anticorps polyclonal antiphopho-ERM. En outre, les protéines d'ERM ont été localisées à presque toutes les régions des neurones hippocampiques, mais les protéines de phospho-ERM ont été localisées seulement à la pointe de la filopodia dendritique et de la tasse phagocytic. On considère que la quantité de phospho-ERM liant à TLCN est limitée par rapport à la quantité d'ERM non phosphorylé. Ainsi, la détection de phospho-ERM dans la fraction dendritique riche en filopodia semble être difficile.
Pour détacher les microbilles de la membrane cellulaire, nous avons utilisé un détergent faible, 0,01% Triton X-100. TLCN est lié au filament d'actine par phospho-ERM dans les structures de filodie dendritique et de tasse phagocytic. Pour purifier les protéines indirectement liées à TLCN par le filament d'actine, nous avons employé un détergent faible dans ce protocole. Cependant, la concentration de Triton X-100 pourrait être changée à une concentration plus élevée selon le but de l'expérience.
Esselens et coll. a montré que l'apport phagocytique des microbilles induit TLCN, PIP2, et F-actin accumulation dans les neurones hippocampiques cultivés17. Selon notre analyse par microscopie confocale après 24 h d'incubation avec des microbilles, les microbilles n'ont pas été complètement prises dans le cytoplasme. TLCN et PIP2, qui sont localisés à la membrane cellulaire, ont été localisés autour des perles, en particulier sur le fond des microbilles. En outre, 319 protéines identifiées à partir de la fraction dendritique riche en filopodia ont été analysées à l'aide de l'analyse de la voie KEGG. La phagocytose et les voies d'autophagie n'ont pas été détectées, mais l'organisation du cytosquelette, l'exocytose, le processus à base d'actine-filament et le processus à base de microtubules ont été considérablement enrichis dans la fraction18.
Le mécanisme moléculaire de la formation de filopodia dendritique reste largement inconnu. L'analyse de la structure de tasse phagocytic pourrait aider à comprendre les constituants moléculaires et les fonctions dynamiques de filopodia dendritique. Il serait intéressant d'analyser la fraction dendritique riche en filopodia préparée à partir de modèles murins de troubles neurodéveloppementaux et neuropsychiatriques.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous remercions Shigeo Okabe et Hitomi Matsuno pour la culture de faible densité des neurones hippocampiques, Masayoshi Mishina pour les souris déficientes TLCN, Sachiko Mitsui et Momoko Shiozaki pour l'assistance technique, et les membres du laboratoire Yoshihara pour des discussions utiles . Ce travail a été soutenu par JSPS KAKENHI Grant Nos. JP20700307, JP22700354, et JP24500392 et MEXT KAKENHI Grant Nos. JP23123525 à YF et JP20022046, JP18H04683, et JP18H05146 à YY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 1.7 mLl Low Binding MCT | Sorenson BioScience | 39640T | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | 2530149 | |
| 35 mm plastic cell culture dishes | Corning | 430165 | |
| Anti-actin | Sigma-Aldrich | A-5060 | |
| Anti-alpha-Actinin | Sigma-Aldrich | A-5044 | |
| Anti-alpha-tubulin | Sigma-Aldrich | T-9026 | |
| Anti-Ezrin | Sigma-Aldrich | clone3C12, SAB4200806 | |
| Anti-Galphaq | Santacruz | sc-393 | |
| Anti-MAP2 | Chemicon | clone AP20, MAB3418 | |
| Anti-Moesin | Sigma-Aldrich | clone 38/87, M7060 | |
| Anti-PLCbeta1 | Santacuz | sc-5291 | |
| Anti-PSD95 | MA2 | ABR | |
| Anti-Spectrin beta | Chemicon | MAB1622 | |
| B27 | Gibco | 0080085SA | |
| BCA protein assay kit | Thermo | 23227 | |
| Bromophenol blue | Merck | 1.08122.0005 | |
| Calcium chrolide, hydrous | Wako | 038-19735 | |
| Cell scraper | Falcon | 353085 | |
| Cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Choline chloride | Sigma-Aldrich | C7527 | |
| Complete EDTA free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Cytosine beta-D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich | C-6645 | |
| DNase-I | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma-Aldrich | P5155 | |
| DynaMag-2 Magnet | Thermo | 12321D | |
| ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE | RPN2232 | |
| e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gradient gel | ATTO | E-T520L | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
| HBSS | Gibco | 14175095 | |
| HRP-conjugated anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | |
| i-Inositol | Sigma-Aldrich | I7508 | |
| LAS-1000 mini | Fuji Film | LAS-1000 mini | For detection of luminescence from WB membrane |
| Magnetic polystyrene microbeads | Sperotech | PM-20-10 | |
| MEM amino acid solution | Gibco | 11130-051 | 30 mM L-Arginine hydrochloride, 5 mM L-Cystine, 10 mM L-Histidine hydrochloride-H2O, 20 mM L-Isoleucine, 20 mM L-Leucine, 19.8 mM L-Lysine hydrochloride, 5.1 mM L-Methionine, 10 mM L-Phenylalanine, 20 mM L-Threonine, 2.5 mM L-Tryptophan, 10 mM L-Tyrosine, and 20 mM L-Valine |
| Mini-slab size electrophoresis system | ATTO | AE-6530 | |
| Niacinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Penicilin / Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail | Roche | 4906845001 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Nacali | 28360-14 | |
| Pyridoxal HCl | Sigma-Aldrich | P6155 | |
| Riboflavin | Sigma-Aldrich | R9504 | |
| Silver Stain 2 Kit wako | Wako | 291-5031 | |
| Thiamine HCl | Sigma-Aldrich | T1270 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-rad | 1703940JA | |
| Ultra pure water | MilliQ | For production of ultra pure water |
References
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