Summary
In diesem Protokoll führen wir eine Methode zur Reinigung der dendritischen filopodiareichen Fraktion aus der phagozytischen Cup-ähnlichen Vorsprungstruktur auf kultivierten Hippocampus-Neuronen ein, indem wir die spezifische und starke Affinität zwischen einem dendritischen Filopodialen Adhäsionsmolekül, TLCN, und ein extrazelluläres Matrixmolekül, vitronectin.
Abstract
Dendritische Filopodia sind dünne und lange Vorsprünge, die auf dem Actin-Filament basieren, und sie dehnen sich aus und ziehen sich zurück, als ob sie nach einem Zielaxon suchen. Wenn die dendritischen Filopodia Kontakt mit einem Zielaxon herstellen, beginnen sie, zu Stacheln zu reifen, was zur Bildung einer Synapse führt. Telencephalin (TLCN) ist reichlich in dendritischen Filopodien lokalisiert und wird nach und nach von Stacheln ausgeschlossen. Die Überexpression von TLCN in kultivierten Hippocampus-Neuronen induziert die dendritische Filopodia-Bildung. Wir zeigten, dass Telencephalin stark an ein extrazelluläres Matrixmolekül, vitronectin, bindet. Vitronectin-beschichtete Mikroperlen induzierten phagozytische Tasse Bildung auf neuronalen Dendriten. In der phagozytischen Tasse, TLCN, TLCN-bindende Proteine wie phosphorylierte Sezrin/Radixin/Moesin (Phospho-ERM), und F-Actin sind angesammelt, was darauf hindeutet, dass Komponenten der phagozytischen Tasse denen der dendritischen Filopodia ähneln. So entwickelten wir eine Methode zur Reinigung der phagozytischen Tasse anstelle der dendritischen Filopodia. Magnetische Polystyrolperlen wurden mit Vitronectin beschichtet, das im Kulturmedium der Hippocampus-Neuronen reichlich vorhanden ist und phagozytische Becherbildung bei neuronalen Dendriten induziert. Nach 24 h Inkubation wurden die phagozytischen Becher leicht mit Waschmittel verwoben und mit einem Magnetabscheider gesammelt. Nach dem Waschen der Perlen wurden die Bindungsproteine eluiert und durch Silberfärbung und Western-Blotting analysiert. In der Bindungsfraktion waren TLCN und Actin reichlich vorhanden. Darüber hinaus wurden viele Proteine, die aus der Fraktion identifiziert wurden, auf die dendritische Filopodia lokalisiert; Daher nannten wir die Bindungsfraktion die dendritische filopodiareiche Fraktion. Dieser Artikel beschreibt Details über die Reinigungsmethode für die dendritische filopodiareiche Fraktion.
Introduction
Dendritische Filopodia werden als Vorläufer von Stacheln angenommen. Actin Filamente in der dendritischen Filopodia regulieren ihre Ausdehnung und Rückzug1,2,3. Nach Kontakt mit einem Axon beginnen ausgewählte dendritische Filopodien ihre Reifung in Stacheln, und eine Synapse wirdgebildet 4,5. Komponenten der Stacheln wurden aus einer umfassenden Analyse der postsynaptischen Dichtefraktionen6,7bestimmt, während Komponenten der dendritischen Filopodia weitgehend unbekannt bleiben. Es hat sich gezeigt, dass Telencephalin (TLCN), ERM, SynGAP, Ras, PI3 Kinase, Akt, mTOR, Polo-ähnliche Kinase 2, CaMKII, Syndecan-2, Paralemin-1, ARF6 und EphB die dendritische Filopodiabildung regulieren5,8,9 ,10,11, während eine Methode für die umfassende Analyse von Molekülen in der dendritischen Filopodia nicht entwickelt wurde.
TLCN (ICAM-5) wird speziell durch stachelige Neuronen im rostralsten Hirnsegment, dem Telencephalon12,exprimiert. TLCN hat 9 Ig-ähnliche Domänen in seiner extrazellulären Region, eine Transmembranregion und einen zytoplasmatischen Schwanz13. TLCN bindet in seiner extrazellulären Region an Vitronectin (VN) und LFA-1-Integrin, an Presenilin in seiner Transmembranregion und an Phospho-ERM und -Actinin in seiner zytoplasmatischen Region5,8,14,15 ,16. TLCN bindet an das Aktin-Zytoskelett durch Phospho-ERM an den Spitzen der dendritischen Filopodia und des Actinins in Stacheln und dendritischen Wellen8,16.
Wir zeigten, dass die Überexpression der TLCN-verstärkten dendritischen Filopodia-Bildung und die Umkehrung der Wirbelsäule zu Filopodia10induzierte. Die konstitutive aktive Form von Ezrin, die an die tLCN-Zytoplasma-Region gebunden ist, und verbesserte dendritische Filopodia-Bildung8. So reguliert TLCN die dendritische Filopodiabildung durch aktinbindende Proteine. Esselens et al. zeigten, dass Mikroperlen die TLCN-Akkumulation an kultivierten Neuronen17induzierten. Wir zeigten, dass phagozytische Becherstrukturen auf neuronalen Dendriten um VN-beschichtete Mikroperlen in einer TLCN-abhängigen Weise gebildet wurden15. Bestandteile der dendritischen Filopodia ähneln denen der phagozytischen Tasse. Es ist schwierig, dendritische Filopodia zu sammeln, aber es ist relativ einfacher, die phagozytische Tasse mit magnetischen Mikroperlen zu sammeln. So haben wir eine Methode entwickelt, um den phagozytischen Becher anstelle der dendritischen Filopodia18zu reinigen. Hier beschreiben wir die Reinigungsmethode für die dendritische filopodiareiche Fraktion.
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Protocol
Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee von RIKEN Wako genehmigt.
1. Kultur der Hippocampus-Neuronen
- Vorbereitung des Kulturmediums
- Zubereitung von 200x Vitaminmischung. Lösen Sie 100 mg D-Pantothensäure-Hemicalciumsalz, 100 mg Cholinchlorid, 100 mg Folsäure, 180 mg I-Inositol, 100 mg Niacinamid, 100 mg Pyridoxal HCl und 100 mg Thiamin HCl in 500 ml Reinstwasser mit einem magnetischen Rührer. Die Lösung ist nicht vollständig aufgelöst. Sorgfältig mischen, in 50 ml-Rohren aliquotieren und bei -20 °C lagern.
- Vorbereitung der Riboflavin-Lösung. 100 mg Riboflavin in 500 ml Reinstwasser mit einem Magnetrührer auflösen. Die Lösung ist nicht vollständig aufgelöst. Sorgfältig mischen, in 50 ml-Rohren aliquotieren und bei -20 °C lagern.
- Zubereitung von 1 M CaCl2. 7,35 g CaCl22H2 O in 50 ml Reinstwasser mit einem Magnetrührer auflösen.
- Vorbereitung des minimalen grundnotwendigen Mediums (MEM). 400 mg KCl, 6800 mg NaCl, 2.200 mg NaHCO3, 158 mg NaH2PO42 H2O, 7000 mg D-Glucose und 200 mg MgSO4-7H2O in 950 ml reinem Wasser mit einem magnetischen Rührer auflösen.
- 1,8 ml von 1 M CaCl2 tropfenweise mit einer 1 ml Pipette mit konstanter Rührung an einem Magnetrührer zum MEM titerieren. Stellen Sie den pH-Wert des MEM auf pH 7,25 mit 1 mol/L HCl ein.
- Fügen Sie dem MEM 5 ml 200x Vitaminmischung und 200 l Riboflavin-Lösung hinzu. Stellen Sie das Volumen der Lösung mit Reinstwasser auf 1.000 ml ein. Filtern Sie die Lösung mit einem 0,22 m Filtersystem und lagern Sie sie bei 4 °C.
- Vorbereitung von 10x DNase-I Lagerlösungen. 100 mg DNase-I in 12,5 ml von Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) auflösen, durch einen 0,22 m Filter filtern, in 1,5 ml-Rohren aliquoten, und die Rohre bei -20 °C lagern.
- Herstellung der Cytosin-Lagerlösung -D-Arabinofuranosid (Ara-C). 25 mg Ara-C in 8,93 ml Reinstwasser (Endkonzentration von 10 mM) auflösen, durch einen 0,22 m Filter filtern, in 1,5 ml-Rohren aliquotenfrei machen und bei -20 °C lagern
- Vorbereitung des Platting-Mediums. Mischen Sie 1 ml MEM-Aminosäurelösung, 750 l von 1 M HEPES, 1 ml B27, 125 l von 200 ml Glutamin, 250 l Penicillin/Streptomycin, 2,5 ml fetales Rinderserum (FBS) und 44,375 ml MEM in einem 50 ml-Rohr.
- Vorbereitung des Stop-Mediums. Mischen Sie 1 ml MEM-Aminosäurelösung, 750 l 1 M HEPES, 5 ml FBS (endend 10%) und 43,25 ml MEM in einem 50 ml-Rohr.
- Zubereitung von poly-L-Lysin-beschichteten Gerichten
- 35 mm Kunststoffzellkulturschalen mit 0,2 mg/ml Poly-L-Lysinhydrobromid für 1 Tag bei 25 °C anschichten.
HINWEIS: Poly-L-Lysin sollte nicht anstelle von Poly-L-Lysin-Hydrobromid verwendet werden. - Waschen Sie das Geschirr mit 2 ml Reinstwasser 3 mal. Inkubieren Sie die Gerichte mit 1,5 ml Stop Medium bei 25 °C bis zum Gebrauch.
- 35 mm Kunststoffzellkulturschalen mit 0,2 mg/ml Poly-L-Lysinhydrobromid für 1 Tag bei 25 °C anschichten.
- Zerlegung von Hippocampus-Neuronen aus Maus-Embryon
- Gewebequelle von Hippocampus-Neuronen. Sezieren Sie den Hippocampus von Wildtyp- und TLCN-defizienten C57BL6/J-Mäusen an den embryonalen Tagen 16-17 nach der Methode von Lu et al.19.
- Inkubieren Sie seziertes Hippocampi in 0,25% Trypsin und 1x DNaseI in HBSS mit 15 mM HEPES, pH 7,2 für 15 min bei 37 °C mit Rührung alle 3 min. Entfernen Sie die Lösung. Inkubieren Sie das Hippocampi in 10 ml STOP-Medium, um Trypsin bei 4 °C für 5 min zu inaktivieren.
- Das Hippocampi in 10 ml frisches STOP-Medium bewegen und bei 4 °C 5 min inkubieren. Das Hippocampi in 10 ml frisches STOP-Medium bewegen und bei 4 °C weitere 5 min inkubieren. mL-Rohr. Dissoziieren Sie die Hippocampi in isolierte Neuronen durch Pipettieren 20 Mal mit einer 1 ml Pipette.
HINWEIS: Die Spitze der 1 ml Pipette berührt leicht den Boden des 15 ml Rohres während der Dissoziation des Hippocampi. - Fügen Sie 9 ml Beschichtungsmedium hinzu und filtern Sie durch ein 70 m Zellsieb in ein 50 ml Rohr. Zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Hämozytometer und passen Sie sich in einem Beschichtungsmedium auf 3,5 x 104 Zellen/ml an.
- Aspirieren STOP Medium aus Poly-L-Lysin-beschichteten Gerichten. Die Zellen auf poly-L-Lysin-beschichteten Schalen mit 7 x 104 Zellen/Schale (2 ml/Schale) aufteilen.
- Nach 60-64 h Inkubation unter 5% CO2 bei 37 °C 2 L Ara-C-Stammlösung (endgültige 10 M) in die Neuronen geben und die Schale langsam schütteln. Bewahren Sie die Kulturgerichte in einer befeuchteten Box auf, ohne das Kulturmedium bei 37 °C unter 5% CO2 zu senken.
2. Reinigung der dendritischen Filopodia-reichen Fraktion
- Nach 13 Tagen in vitro (DIV) fügen Sie magnetische Polystyrol-Mikroperlen (3 x 106 Partikel/Schale) zu 20 Gerichten hinzu, die die kultivierten Neuronen enthalten. Nach 1 Tag, waschen Sie die Neuronen in 1 ml PBS mit Agitation 3 mal, um die mittelgroßen und ungebundenen Mikroperlen zu entfernen. Nach dem Entfernen von PBS lysieren Sie die Neuronen mit 500 L/Schale Lysepuffer (PBS mit 0,01% Triton X-100, EDTA-freier Protease-Hemmer-Cocktail und Phosphatase-Inhibitor-Cocktail).
- Das Lysat mit einem Zellschaber sammeln und das Lysat in eiweißbindende Mikroröhren (10 Tuben) bewegen. Stellen Sie die Rohre auf einen Magnetabscheider und warten Sie 1 min. Sammeln Sie den Überstand und verwenden Sie ihn als ungebundenen Bruch für Silberfärbung und Western Blot-Analyse.
- Übertragen Sie die Perlen auf ein neues proteinarmes Mikrorohr, das auf einen magnetischen Separator gesetzt ist, und entfernen Sie den Überstand vollständig. Fügen Sie 500 l Lysepuffer hinzu und waschen Sie die Perlen mit einem Wirbelmischer für 15 s. Stellen Sie das Rohr auf einen Magnetabscheider, warten Sie 1 min, entfernen Sie den Überstand, und fügen Sie 500 L Lysepuffer hinzu. Wiederholen Sie das Waschen der Perlen 10 Mal und entfernen Sie den Überstand.
- Elute-Proteine, die durch Zugabe von 50 l 1x SDS-Probenpuffer (62,5 mM Tris HCl, pH 6,8, 2,5% SDS und 10% Glycerin) an die Perlen gebunden sind, und das Rohr bei 98 °C für 5 min kochen. Zentrieren Sie das Rohr bei 860 x g für 10 s und stellen Sie das Rohr auf auf einem magnetischen Separator für 1 min. Sammeln Sie den Überstand und verwenden Sie ihn als gebundenen Bruch.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. - Messen Sie die Proteinkonzentrationen der ungebundenen und gebundenen Fraktionen durch den BCA-Proteintest. Visualisieren Sie Proteinlösungen mit Bromphenolblau und passen Sie die Konzentration für SDS-PAGE auf 5 ng/L an.
3. Silberfärbung und Western Blot Analyse
- Trennen Sie die gebundenen und ungebundenen Brüche (50 ng) durch SDS-PAGE mit einem 5-20% Gradientengel. Silber-Färbung das Gel.
- Westlicher Blot mit Anti-TLCN-C (1/3.000), Anti-Rinder-vitronectin (1/5.000), Anti-Actin (1/1.000) und Anti-A-Tubulin (1/1.000) als primäre Antikörper und HRP-konjugiertes Ziegenanti-Kaninchen-IgG (1/5.000) als sekundärer Antikörper. Visualisieren Sie die Antigene mit chemiluminescent Western Blotting Detection Reagenz und einem Chemilumineszenz-Imager.
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Representative Results
In kultivierten Hippocampus-Neuronen wurde TLCN reichlich auf die dendritische Filopodia, Welle und Soma lokalisiert und mit F-Actin kolokalisiert (Abbildung 1A, B). Wenn Polystyrol-Mikroperlen kultivierten Hippocampus-Neuronen zugesetzt wurden, wurden die Perlen automatisch mit Vitronectin (VN) beschichtet, das aus fetalem Rinderserum (FBS) im Kulturmedium gewonnen wurde; sie waren hauptsächlich an Dendriten gebunden, und sie induzierten die Bildung von phagozytischen Bechern (Abbildung 1B-E). Phagozytische Becher basierten auf blattförmigen Aktinfilamenten um Mikroperlen auf Dendriten. TLCN, Phospho-ERM und PI(4,5)P2 , die Marker für dendritische Filopodia sind, sind um Perlen hoch angesammelt (Abbildung 1D)8,15. Phagozytische Becher wurden nur auf wildtypen Hippocampus-Neuronen gebildet, aber nicht auf TLCN-defizienten Hippocampus-Neuronen (Abbildung 2A-D). So war die phagozytische Cup-Bildung entscheidend von der Anwesenheit von TLCN in Dendriten abhängig.
Die Bestandteile der dendritischen Filopodia erschienen denen von phagozytischen Bechern ähnlich. Als nächstes reinigten wir phagozytische Tassen anstelle von dendritischen Filopodia. Das Protokoll zur Reinigung phagozytischer Becher ist schematisch in Abbildung 3dargestellt. Magnetische Mikroperlen wurden wild-typkultivierten Hippocampus-Neuronen hinzugefügt, die die Bildung phagozytischer Becherstrukturen induziert. Die phagozytischen Becherstrukturen wurden mit einem schwachen Waschmittel lysiert. Die Mikroperlen wurden nach der Lyse mit einem Magnetabscheider gesammelt. Nach dem Waschen der Perlen wurden ihre Bindungsproteine in einem SDS-Probenpuffer gekocht und eluiert.
Die Menge der Proteine in der gebundenen und ungebundenen Fraktion wurde mit dem BCA-Protein-Assay-Kit gemessen. Die gleiche Menge an Proteinen in den ungebundenen und gebundenen Fraktionen wurde durch SDS-PAGE getrennt und durch Silberfärbung gebeizt (Abbildung 4A). Die Proteinbandmuster waren für die ungebundenen und gebundenen Fraktionen fast gleich, aber die Intensitäten bei 50 und 70 kDa in der gebundenen Fraktion waren niedriger als die in der ungebundenen Fraktion. Die Bandintensität war jedoch nicht offensichtlich anders zwischen den ungebundenen und gebundenen Brüchen, die aus TLCN-mangelhaften Kultur-Hippocampus-Neuronen hergestellt wurden. Um die Reinigung phagozytischer Becherstrukturen zu bestätigen, führten wir Western Blotting mit Anti-TLCN-C, Anti-Rinder-Vitronectin, Anti-Actin und Anti-A-Tubulin durch (Abbildung 4B). TLCN und VN wurden hauptsächlich im gebundenen Bruch nachgewiesen. Actin, ezrin, G'q, PLC-1, MAP-2 und Spectrin wurden sowohl in den gebundenen als auch in den ungebundenen Fraktionen nachgewiesen. Moesin, PSD-95, A-Actinin und S-Tubulin wurden in der ungebundenen Fraktion nachgewiesen.
Abbildung 1: Lokalisation von TLCN und F-Actin in dendritischen Filopodia- und phagozytischen Bechern. (A) Immunfluoreszenzfärbung von Dendriten eines kultivierten Hippocampus-Neurons, das GapVenus mit Anti-GFP-Antikörper (blau in einem zusammengeführten Bild), Anti-TLCN-Antikörper (rot in einem verschmolzenen Bild) und Phalloidin (grün in einem verschmolzenen Bild) ausdrückt. TLCN und F-Actin sind bei dendritischen Filopodien reichlich beobachtet. (B, C) Bildung von phagozytischen Becherstrukturen auf neuronalen Dendriten. Fluoreszierende Mikroperlen (blau in zusammengeführten Bildern von B, C), die kultivierten Hippocampus-Neuronen hinzugefügt werden, haften stark an Dendriten und induzieren die Ansammlung von TLCN (rot in verschmolzenen Bildern von B, C) und F-Actin (grün in zusammengeführten Bildern von B, C). (D) Eine seitliche Ansicht eines dendritischen phagozytischen Bechers, der aus konfokalen Bildern rekonstruiert wurde, zeigt TLCN (rot in verschmolzenen Bildern von D) um die fluoreszierende Perle (blau in zusammengeführten Bildern von D). (E) Ein dendritischer phagozytischer Becher, der durch eine magnetische Mikroperle induziert wird, die an einem neuronalen Dendrit befestigt und mit Anti-VN-Antikörper (blau in zusammengeführten Bildern von E), Anti-TLCN-Antikörper (rot in zusammengeführten Bildern von E) und Phalloidin (grün in E). Skalenstäbe = 1 m in (D); 2 m in (A), (C) und (E); und 20 m in (B). Diese Zahl wurde gegenüber einer früheren Studie18geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: TLCN-abhängige Bildung phagozytischer Cup-ähnlicher Struktur. (A-D) Dreifachfluoreszenzbilder von Wildtyp (WT; A, C) und TLCN-mangelhaft (KO; C, D) Mit VN-beschichteten fluoreszierenden Perlen (rot in zusammengeführten Bildern von A, B, C, D) und mit Anti-TLCN-Antikörper (grün in zusammengeführten Bildern von A, B, C, D) und Anti-Phospho-ERM-Antikörper (blau in zusammengeführten Bildern von A, B) oder Alexa488-Phalloidin (blau in Bilder von C, D). Skalenbalken = 5 m. Diese Zahl wurde gegenüber einer früheren Studie15geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Ein schematisches Diagramm, das das Reinigungsverfahren der dendritischen filopodiareichen Fraktion veranschaulicht. Magnetische Mikroperlen wurden kultivierten Hippocampus-Neuronen hinzugefügt, um die Bildung von dendritischen phagozytischen Bechern zu induzieren. Nach 1 Tag inkubationszeit, die Neuronen wurden mit Lysepuffer mit 0,01% Triton X-100 löslich. Die Perlen wurden mit einem magnetischen Separator von der ungebundenen Fraktion getrennt. Nach dem Waschen wurden die gebundenen Proteine mit SDS-Probenpuffer eluiert und als gebundener Bruch verwendet. Rot: VN, grün: TLCN, andere Farben: gebundene Proteine. Diese Zahl wurde gegenüber einer früheren Studie18geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Bestätigung der phagozytischen Becherfraktion. (A) Silberfärbung von Proteinen in den ungebundenen und gebundenen Fraktionen der Mikroperlen. Die gleiche Menge (50 ng) an Proteinen in den ungebundenen und gebundenen Fraktionen, die von Wildtyp (WT) und TLCN-mangelhaften (TLCN KO) Hippocampus-Neuronen gereinigt wurden, wurden durch SDS-PAGE getrennt und mit Silberfärbung visualisiert. (B) Western Blot Analyse der ungebundenen und gebundenen Brüche. Die gleiche Menge (50 ng) Proteine wurden durch SDS-PAGE getrennt und einer Western-Blot-Analyse mit Anti-TLCN, Anti-VN, Anti-Actin, Anti-Ezrin, Anti-Moesin, Anti-G-Q, Anti-PLC-1, Anti-MAP-2, Anti-Spectrin, Anti-PSD-95, Anti-A-Actinin und Anti-Tubulin-Antikörper. Beachten Sie, dass TLCN, VN, Actin, Ezrin, PLC1, MAP-2 und Spectrin in der dendritischen filopodiareichen Fraktion beobachtet werden. Diese Zahl wurde gegenüber einer früheren Studie18geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Wir entwickelten eine Reinigungsmethode für die dendritische filopodiareiche Fraktion unter Verwendung einer Affinität zwischen dem Zelladhäsionsmolekül TLCN und dem extrazellulären Matrixprotein vitronectin. Im Vergleich zur PSD-Fraktion könnte es möglich sein, die synaptischen Proteine, die auf die unreife Synapse wirken, aus der dendritischen filopodiareichen Fraktion zu identifizieren. So unterscheiden sich die Bestandteile der dendritischen filopodiareichen Fraktion um 74% von denen der PSD-Fraktion. Anders als die PSD-Fraktion verwendeten wir kultivierte Hippocampus-Neuronen, um aktiv phagozytische Tassen zu bilden, und die Zellen müssen am Leben sein. Um den phagozytischen Becher zu bilden, verwendeten wir die Wechselwirkung zwischen TLCN und vitronectin. Die TLCN-Expression ist im Telencephalon begrenzt. Daher können wir keine kultivierten Neuronen verwenden, die vom Kleinhirn abgeleitet sind. Wenn wir jedoch die Perlen mit verschiedenen Proteinen beschichten, könnte diese aktivitätsabhängige Reinigungsmethode auf Kleinhirnneuronen angewendet werden. Wenn beispielsweise die N-terminale Domäne von Glutamatrezeptor-Delta2-beschichteten Mikroperlen auf Kleinhirngranulatzellen aufgebracht wird, wurden aus den Bindungsproteinen präsynaptisches Neurexin und Cbln1 identifiziert. Daher könnte diese aktivitätsabhängige Methode verwendet werden, wenn die Beschichtungsproteine gewechselt werden. Da der Zugang von vitronectin-beschichteten Mikroperlen auf die Hirnscheibe und das Hirngewebe beschränkt ist, werden phagozytische Becher nicht effizient gebildet. Zukünftige Aufgaben umfassen daher die Entwicklung der Reinigungsmethode der dendritischen filopodiareichen Fraktion aus Hirnscheibe und Gewebe.
In diesem Protokoll, Low-Density-Kultur Zustand wird für Hippocampus-Neuronen verwendet, und das Wachstum von Gliazellen werden durch die Zugabe von Ara-C10,20,21gehemmt. Hippocampus-Neuronen werden in MEM von uns hergestellt kultiviert, aber nicht in neurobasalen Medium, das weit verbreitet für die Kultur der Hippocampus-Neuronen verwendet wird. Hippocampus-Neuronen sterben oft von 14 DIV, wenn sie auf neurobasalen Medium kultiviert werden, was darauf hindeutet, dass das neurobasale Medium nicht für unsere niedrige Dichte Kulturzustand geeignet ist. Darüber hinaus ist ein wichtiger Aspekt der Kultur mit geringer Dichte die Beschichtung der Schale mit Poly-L-Lysin-Hydrobromid, das nicht durch Poly-L-Lysin ersetzt werden kann.
Um eine ausreichende Menge an Proteinen aus der dendritischen filopodiareichen Fraktion zu erhalten, sind die Anzahl der Hippocampus-Neuronen und magnetischen Mikroperlen wichtige Faktoren. Zur immunfärbung derdritischer Filopodia wurden Hippocampus-Neuronen auf einer 35-mm-Schale mit 5,6 x x 104 Zellen/Schale plattiert, während die Neuronen mit 7,0 x 104 Zellen/Schale zur Reinigung der dendritischen filopodiareichen Fraktion plattiert wurden. Bei 14 DIV überlappten sich fast keine Hippocampus-Neuronen bei 5,6 x 104 Zellen/Schale zur Immunfärbung, während viele hippocampale Neuronen teilweise mit den anderen Neuronen bei 7,0 x 104 Zellen/Schale zur Reinigung der dendritischen Filopodia-reichen bruch. Jedoch, dendritische Filopodia waren reichlich vorhanden bei beiden Dichten von Hippocampus-Neuronen. Hochdichte Kulturen von Hippocampus-Neuronen reifen oft schneller als niedrigdichte kultivierte Hippocampus-Neuronen; Daher ist die Anpassung der Dichte von Hippocampus-Neuronen an die Kultur mit niedriger Dichte unerlässlich, um die dendritische filopodiareiche Fraktion zu erhalten. Mikroperlen wurden bei 1 x 106 Mikroperlen/Schale zur Immunfärbung und bei 3 x 106 Mikroperlen/Schale zur Reinigung der dendritischen filopodiareichen Fraktion zugegeben. Zur Reinigung der Fraktion wurden, sobald eine ausreichende Menge an Perlen hinzugefügt wurde, die ungebundenen Perlen aus Hippocampus-Neuronen ausgewaschen.
In diesem Protokoll wurden Mikroperlen automatisch mit VN beschichtet, das im Kulturmedium vorhanden ist. Mikroperlen können jedoch mit rekombinantem VN beschichtet und hippocampalneuronen zugesetzt werden. Da VN ein sehr klebriges Protein ist, bilden VN-beschichtete Mikroperlen leicht Aggregate. So werden VN-beschichtete Mikroperlen beschallt und pipetiert, um sich kurz vor der Zugabe von Hippocampus-Neuronen voneinander zu distanzieren.
Wir haben zuvor gezeigt, dass VN-beschichtete Mikroperlen Phosphor-ERM, PI(4,5)P2und F-Actin zusammen mit TLCN-Akkumulation15induzieren. Als die dendritische filopodiareiche Fraktion durch Western Blotting analysiert wurde, wurde Phospho-ERM nicht von polyklonalen Anti-Phospho-ERM-Antikörpern nachgewiesen und leicht von Anti-Ezrin- und Antimoesin-Monoklon-Antikörpern nachgewiesen. Es scheint, dass die Empfindlichkeit der monoklonalen Antikörper höher war als der polyklonale Antikörper gegen Phospho-ERM. Darüber hinaus wurden ERM-Proteine in fast alle Regionen der Hippocampus-Neuronen lokalisiert, aber Phospho-ERM-Proteine wurden nur bis zur Spitze der dendritischen Filopodia und des phagozytischen Bechers lokalisiert. Es wird davon ausgegangen, dass die Menge an Phospho-ERM-Bindung an TLCN im Vergleich zur Menge des nicht phosphorylierten ERM begrenzt ist. Somit scheint der Nachweis von Phospho-ERM in der dendritischen filopodiareichen Fraktion schwierig zu sein.
Um die Mikroperlen von der Zellmembran zu lösen, verwendeten wir ein schwaches Reinigungsmittel, 0,01% Triton X-100. TLCN ist mit Demobin-Filament durch Phospho-ERM in den dendritischen Filopodia- und phagozytischen Becherstrukturen verbunden. Um Proteine, die indirekt mit TLCN verbunden sind, durch das Actin-Filament zu reinigen, haben wir in diesem Protokoll ein schwaches Reinigungsmittel verwendet. Die Konzentration von Triton X-100 konnte jedoch je nach Zweck des Experiments auf eine höhere Konzentration umgestellt werden.
Esselens et al. hat gezeigt, dass die phagozytische Aufnahme von Mikroperlen induziertt TLCN, PIP2, und F-Actin Akkumulation in kultivierten Hippocampus-Neuronen17. Nach unserer Analyse mittels konfokaler Mikroskopie nach 24 h Inkubation mit Mikroperlen wurden die Mikroperlen nicht vollständig in das Zytoplasma aufgenommen. TLCN und PIP2, die auf die Zellmembran lokalisiert sind, wurden um Perlen lokalisiert, vor allem auf der Unterseite der Mikroperlen. Darüber hinaus wurden 319 Proteine, die aus der dendritischen filopodiareichen Fraktion identifiziert wurden, mit Hilfe der KEGG-Signalweganalyse analysiert. Phagozytose- und Autophagie-Wege wurden nicht nachgewiesen, aber Zytoskelett-Organisation, Exozytose, Actin-Filament-basierter Prozess und Mikrotubuli-basierter Prozess wurden im Bruchteil18signifikant angereichert.
Der molekulare Mechanismus der dendritischen Filopodiabildung bleibt weitgehend unbekannt. Die Analyse der phagozytischen Becherstruktur könnte helfen, die molekularen Bestandteile und dynamischen Funktionen der dendritischen Filopodia zu verstehen. Es wäre interessant, die dendritische filopodiareiche Fraktion zu analysieren, die aus Mausmodellen neuroentwicklungs- und neuropsychiatrischer Störungen hergestellt wird.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken Shigeo Okabe und Hitomi Matsuno für die Low-Density-Kultur der Hippocampus-Neuronen, Masayoshi Mishina für TLCN-mäuse, Sachiko Mitsui und Momoko Shiozaki für technische Hilfe und Mitglieder des Yoshihara-Labors für hilfreiche Diskussionen . Diese Arbeit wurde von JSPS KAKENHI Grant Nos unterstützt. JP20700307, JP22700354 und JP24500392 und MEXT KAKENHI Grant Nos. JP23123525 auf YF und JP20022046, JP18H04683 und JP18H05146 zu YY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 1.7 mLl Low Binding MCT | Sorenson BioScience | 39640T | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | 2530149 | |
| 35 mm plastic cell culture dishes | Corning | 430165 | |
| Anti-actin | Sigma-Aldrich | A-5060 | |
| Anti-alpha-Actinin | Sigma-Aldrich | A-5044 | |
| Anti-alpha-tubulin | Sigma-Aldrich | T-9026 | |
| Anti-Ezrin | Sigma-Aldrich | clone3C12, SAB4200806 | |
| Anti-Galphaq | Santacruz | sc-393 | |
| Anti-MAP2 | Chemicon | clone AP20, MAB3418 | |
| Anti-Moesin | Sigma-Aldrich | clone 38/87, M7060 | |
| Anti-PLCbeta1 | Santacuz | sc-5291 | |
| Anti-PSD95 | MA2 | ABR | |
| Anti-Spectrin beta | Chemicon | MAB1622 | |
| B27 | Gibco | 0080085SA | |
| BCA protein assay kit | Thermo | 23227 | |
| Bromophenol blue | Merck | 1.08122.0005 | |
| Calcium chrolide, hydrous | Wako | 038-19735 | |
| Cell scraper | Falcon | 353085 | |
| Cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Choline chloride | Sigma-Aldrich | C7527 | |
| Complete EDTA free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Cytosine beta-D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich | C-6645 | |
| DNase-I | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma-Aldrich | P5155 | |
| DynaMag-2 Magnet | Thermo | 12321D | |
| ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE | RPN2232 | |
| e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gradient gel | ATTO | E-T520L | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
| HBSS | Gibco | 14175095 | |
| HRP-conjugated anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | |
| i-Inositol | Sigma-Aldrich | I7508 | |
| LAS-1000 mini | Fuji Film | LAS-1000 mini | For detection of luminescence from WB membrane |
| Magnetic polystyrene microbeads | Sperotech | PM-20-10 | |
| MEM amino acid solution | Gibco | 11130-051 | 30 mM L-Arginine hydrochloride, 5 mM L-Cystine, 10 mM L-Histidine hydrochloride-H2O, 20 mM L-Isoleucine, 20 mM L-Leucine, 19.8 mM L-Lysine hydrochloride, 5.1 mM L-Methionine, 10 mM L-Phenylalanine, 20 mM L-Threonine, 2.5 mM L-Tryptophan, 10 mM L-Tyrosine, and 20 mM L-Valine |
| Mini-slab size electrophoresis system | ATTO | AE-6530 | |
| Niacinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Penicilin / Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail | Roche | 4906845001 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Nacali | 28360-14 | |
| Pyridoxal HCl | Sigma-Aldrich | P6155 | |
| Riboflavin | Sigma-Aldrich | R9504 | |
| Silver Stain 2 Kit wako | Wako | 291-5031 | |
| Thiamine HCl | Sigma-Aldrich | T1270 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-rad | 1703940JA | |
| Ultra pure water | MilliQ | For production of ultra pure water |
References
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