Summary
In questo protocollo, introduciamo un metodo per purificare la frazione dendritica ricca di filopodia dalla struttura di protrusione simile a una coppa fagocitica sui neuroni ippocampali coltivati sfruttando l'affinità specifica e forte tra un filopopodiale dendritico molecola di adesione, TLCN, e una molecola di matrice extracellulare, vitronectina.
Abstract
I filodidi dendrici sono sporche sottili e lunghe basate sul filamento di actin, e si estendono e si ritraggono come se cercassero un assone bersaglio. Quando la filopodia dendritica stabilisce il contatto con un assone bersaglio, iniziano a maturare in spine, portando alla formazione di una sinapsi. La telencefine (TLCN) è abbondantemente localizzata nella filopodia dendritica ed è gradualmente esclusa dalle spine. La sovraespressione del TLCN nei neuroni ippocampali coltivati induce la formazione di filopodia dendritica. Abbiamo dimostrato che la telencefine si lega fortemente a una molecola di matrice extracellulare, la vitronectina. Le microsfere rivestite di cellavanguardia in vitronectine hanno indotto la formazione di coppe fagocitiche sui dendriti neuronali. Nella tazza fagocitica, si accumulano proteine che legano il TLCN, come Ezrin/Radixin/Moesin (phospho-ERM), e F-actin, il che suggerisce che i componenti della coppa fagocitica sono simili a quelli della filodia dendritica. Così, abbiamo sviluppato un metodo per purificare la coppa fagocitica invece di filopodi a dendritica. Le perle di polistirene magnetico sono state rivestite con vitronectina, che è abbondantemente presente nel mezzo di coltura dei neuroni ippocampali e che induce la formazione di coppe fagocitiche sui dendriti neuronali. Dopo 24 h di incubazione, le tazze fagocitiche erano leggermente solubili con detergente e raccolte utilizzando un separatore magnete. Dopo aver lavato le perline, le proteine leganti sono state eluite e analizzate dalla colorazione d'argento e dalla gonfiore occidentale. Nella frazione vincolante, TLCN e actin erano abbondantemente presenti. Inoltre, molte proteine identificate dalla frazione sono state localizzate alla filopodica dendritica; così, abbiamo chiamato la frazione di legame come la frazione dendritica ricca di filopodia. Questo articolo descrive i dettagli relativi al metodo di purificazione per la frazione dendritica ricca di filopodia.
Introduction
Si pensa che la filopodi dendritica sia precursore delle spine. I filamenti di Actin nella filopodi adendriticane regolano l'estensione e la retrazione 1,2,3. Dopo aver contattato un assone, la filopodia dendritica selezionata inizia la loro maturazione in spine, e si forma una sinapsi4,5. I componenti delle spine sono stati determinati dall'analisi completa delle frazioni di densità postsinaptica6,7, mentre i componenti della filopodia dendritica rimangono in gran parte sconosciuti. È stato dimostrato che telencephalin (TLCN), ERM, SynGAP, Ras, PI3 kinase, Akt, mTOR, polo-like kinase 2, CaMKII, syndecan-2, paralemin-1, ARF6, e EphB regolano la formazione di filopodi dendritici5,8,9 ,10,11, mentre un metodo non è stato sviluppato per l'analisi completa delle molecole presenti nella filopodia dendritica.
TLCN (ICAM-5) è specificamente espresso dai neuroni spinosi nel segmento cerebrale più rostrale, il telencephalon12. TLCN ha 9 domini simili a Ig nella sua regione extracellulare, una regione transmembrana e una coda citoplasmica13. TLCN si lega alla vitronectina (VN) e all'integrina LFA-1 nella sua regione extracellulare, alla presenilina nella sua regione transmembrana, e alla fosfora-ERM e alla z-actinina nella sua regione citoplasmica5,8,14,15 ,16. TLCN si lega al citoscheletro dell'actina attraverso il fosforo-ERM su punta di filopodia dendritica e di z-actininina nelle spine e negli alberi dendritici8,16.
Abbiamo dimostrato che la sovraespressione del TLCN ha migliorato la formazione di filopodi a dendritici e ha indotto la reversione delle spine alla filopodia10. La forma attiva costituiscista di ezrin legata alla regione citoplasmica TLCN e la formazione di filopodia dendritica migliorata8. Così, TLCN regola la formazione di filopodi dendritici attraverso proteine che legano l'atto. Esselens et al. ha dimostrato che le microsfere hanno indotto l'accumulo di TLCN sui neuroni coltivati17. Abbiamo dimostrato che le strutture della coppa fagocitica si sono formate sui dendriti neuronali intorno alle microsfere rivestite di VN in modo dipendente dalla TLCN15. Costituenti di filopodi dendritici sono simili a quelli della coppa fagocitica. È difficile raccogliere la filopodi dendritica, ma è relativamente più facile raccogliere la coppa fagocitica utilizzando microsfere magnetiche. Così, abbiamo sviluppato un metodo per purificare la coppa fagocitica invece di filopodia dendritica18. Qui, descriviamo il metodo di purificazione per la frazione dendritica ricca di filopodia.
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Protocol
Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali di RIKEN Wako.
1. Cultura dei neuroni ippocampali
- Preparazione del mezzo culturale
- Preparazione del mix di vitamine 200x. Sciogliere 100 mg di sale di emicalcio acido Pantotenico, 100 mg di cloruro di colina, 100 mg di acido folico, 180 mg di i-inositolo, 100 mg di niacinamide, 100 mg di HCl piruridossiale e 100 mg di tiamina HCl in 500 mL di acqua ultrapura. La soluzione non è completamente dissolta. Mescolare con cura, aliquota in tubi da 50 mL e conservare a -20 gradi centigradi.
- Preparazione della soluzione Riboflavin. Sciogliere 100 mg di Riboflavin in 500 mL di acqua ultrapura utilizzando un mescolatore magnetico. La soluzione non è completamente dissolta. Mescolare con cura, aliquota in tubi da 50 mL e conservare a -20 gradi centigradi.
- Preparazione di 1 M CaCl2. Sciogliere 7,35 g di CaCl2x 2H2O in 50 mL di acqua ultrapura utilizzando un agitatore magnetico.
- Preparazione del mezzo essenziale minimo (MEM). Sciogliere 400 mg di KCl, 6800 mg di NaCl, 2.200 mg di NaHCO3, 158 mg di NaH2PO4a 2H2O, 7000 mg di D-glucosio, e 200 mg di MgSO4-7H2O in 950 mL di acqua ultrapura utilizzando uno stirrer magnetico.
- Titralata 1,8 mL di 1 M CaCl2 al MEM in modo gocciolamento utilizzando un pipet da 1 mL con un'agitazione costante su un agitatore magnetico. Regolare il pH del MEM su pH 7.25 con 1 mol/L HCl.
- Aggiungere al MEM 5 mL di miscela di vitamina 200x e 200 l di riboflavina. Regolare il volume della soluzione a 1.000 mL con acqua ultrapura. Filtrare la soluzione utilizzando un sistema di filtro da 0,22 m e conservarla a 4 gradi centigradi.
- Preparazione di 10x soluzioni stock DNase-I. Sciogliere 100 mg di DNase-I in 12,5 mL di soluzione di sale equilibrato di Hanks ', filtrare attraverso un filtro aliquota 0,22 m, in tubi da 1,5 mL, e conservare i tubi a -20 .
- Preparazione della soluzione di stock di citosina a z-D-arabinofuranoside (Ara-C). Sciogliere 25 mg di Ara-C in 8,93 mL di acqua ultrapura (concentrazione finale di 10 mM), filtrare attraverso un filtro da 0,22 m, in tubi da 1,5 mL e conservarlo a -20 gradi centigradi
- Preparazione del mezzo di placcatura. Mescolare 1 mL di soluzione aminoacide MEM, 750 -L di 1 M HEPES, 1 mL di B27, 125 L di 200 mM di glutammina, 250 mL di penicillina/streptomicina, 2,5 mL di siero bovino fetale (FBS) e 44,375 mL di MEM in un tubo da 50 mL.
- Preparazione del mezzo di arresto. Mescolare 1 mL di soluzione aminoacido MEM, 750 -L di 1 M HEPES, 5 mL di FBS (finale 10%) e 43,25 mL di MEM in un tubo da 50 mL.
- Preparazione di piatti poli-L-Lysine
- Piatto di coltura di cellule plastiche da 35 mm con 0,2 mg/mL di idrobromofo poli-L-lisina per 1 giorno a 25 gradi centigradi.
NOT: Poly-L-lysina non deve essere utilizzato al posto dell'idrobromofopoli poli-L-lisina. - Lavare i piatti con 2 mL di acqua ultrapura 3 volte. Incubare i piatti con 1,5 mL di stop medio a 25 gradi centigradi fino all'uso.
- Piatto di coltura di cellule plastiche da 35 mm con 0,2 mg/mL di idrobromofo poli-L-lisina per 1 giorno a 25 gradi centigradi.
- Dissezione dei neuroni ippocampali dall'embrione di topo
- Fonte tissutale di neuroni ippocampali. Dissecitare l'ippocampo da topi C57BL6/J carenti di tipo selvaggio e TLCN nei giorni embrionali 16-17 secondo il metodo di Lu et al.19.
- Incubato sezionato ippocampi in 0.25% trypsin e 1x DNaseI in HBSS contenente 15 mHe, pH 7.2 per 15 min a 37 s con agitazione ogni 3 min. Rimuovere la soluzione. Incubare gli ippocampi in 10 mL di STOP medio per inattivare la trypsin a 4 gradi centigradi per 5 minuti.
- Spostare gli ippocampi in 10 mL di fresco DI STOP medio e incubare a 4 gradi C per 5 min. Spostare l'ippocampo in 10 mL di fresco di medio STOP fresco e incubare a 4 gradi centigradi per altri 5 min. tubo mL. Dissociare gli ippocampi in neuroni isolati pipettando 20 volte usando un pipet da 1 mL.
NOT: La punta del tubo da 1 mL tocca leggermente il fondo del tubo da 15 mL durante la dissociazione degli ippocampi. - Aggiungere 9 mL di mezzo di placcatura e filtrare attraverso un colino da 70 m in un tubo da 50 mL. Contare il numero di celle utilizzando un emocitometro e regolare a 3,5 x 104 celle / mL nel mezzo di placcatura.
- Mezzo ASpirato STOP da piatti poli-L-lisini. Placcare le cellule su piatti poli-L-Lisini rivestiti a 7 x 104 celle/piatto (2 mL/piatto).
- Dopo 60-64 h di incubazione al di sotto del 5% di CO2 a 37 gradi centigradi, aggiungere 2 -L di soluzione di ara-C ai neuroni e scuotere il piatto lentamente. Conservare i piatti della coltura in una scatola umidizzata senza cambiare il mezzo di coltura sotto il 5% di CO2 a 37 gradi centigradi.
2. Purificazione della Frazione dendritica ricca di filopodia
- Dopo 13 giorni in vitro (DIV), aggiungere microsfere magnetiche in polistirolo (3 x 106 particelle/piatto) a 20 piatti contenenti i neuroni coltivati. Dopo 1 giorno, lavare i neuroni in 1 mL di PBS con agitazione 3 volte per rimuovere le microsfere medie e non associate. Dopo aver rimosso PBS, decisi i neuroni con 500 s/piatto di tampone di lisi (PBS contenente 0,01% Triton X-100, cocktail inibitore della proteasi senza EDTA e cocktail inibitore della fosfosi).
- Raccogliere il lisato con un raschietto cellulare e spostare il lisato a microtubi a basso legame proteico (10 tubi). Impostare i tubi su un separatore magnete e attendere 1 min. Raccogliere il supernatante e usarlo come la frazione non associata per la colorazione d'argento e l'analisi macchia occidentale.
- Trasferire le perline in un nuovo microtubo a basso legame proteico, impostato su un separatore magnetico e rimuovere completamente il supernatante. Aggiungere 500 l di lisi tampone e lavare le perline utilizzando un mixer vortice per 15 s. Impostare il tubo su un separatore magnete, attendere 1 min, rimuovere il supernatante, e aggiungere 500 L di tampone di lisi. Ripetere il lavaggio delle perline 10 volte e rimuovere il supernatante.
- Elute proteine legate alle perline (la frazione vincolata) con l'aggiunta di 50 - L di 1x buffer campione SDS (62,5 mM Tris HCl, pH 6,8, 2,5% SDS, e 10% glicerolo) e far bollire il tubo a 98 gradi centigradi per 5 min. Centrifugare il tubo a 860 x g per 10 s e il tubo impostare il tubo su un separatore magnetico per 1 min. Raccogliere il supernatante e usarlo come frazione legata.
NOT: Il protocollo può essere messo in pausa qui. - Misurare le concentrazioni proteiche delle frazioni non legate e legate dal saggio della proteina BCA. Visualizza le soluzioni proteiche con il blu bromofenolo e regola la concentrazione a 5 ng/L per SDS-PAGE.
3. Colorazione d'argento e analisi blot occidentale
- Separare le frazioni associate e non associate (50 ng) da SDS-PAGE utilizzando un gel sfumato 5-20%. Macchia d'argento il gel.
- Blot occidentale con anti-TLCN-C (1/3,000), vitronectina anti-bovina (1/5,000), anti-actina (1/1,000) e anti-tubulina anti-thapoling (1/5,000) come anticorpi primari e HRP-congioso anti-coniglio IgG (1/5.000) come anticorpo secondario. Visualizza gli antigeni usando il reagente di rilevamento del rilevamento del bloting occidentale chemiluminescente e un imager chemiluminescenza.
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Representative Results
Nei neuroni ippocampali coltivati, TLCN è stato abbondantemente localizzato alla filopodia dendritica, albero, e soma e colocalizzato con F-actin (Figura 1A, B). Quando le microsfere di polistirolo sono state aggiunte ai neuroni ippocampali coltivati, le perline sono state automaticamente rivestite con vitronectina (VN) derivata dal siero bovino fetale (FBS) nel mezzo di coltura; erano principalmente legati ai dendriti, e indotto la formazione di tazze fagocitiche (Figura 1B-E). Le tazze fagocitiche erano basate su filamenti di actina a forma di foglio intorno alle microsfere sui dendriti. TLCN, fospho-ERM e PI(4,5)P2, che sono marcatori per la filopodi a dendritica, sono altamente accumulati intorno a perline (Figura 1D)8,15. Le coppe fagocitiche si sono formate solo su neuroni ippocampali wild-type, ma non su neuroni ippocampali carenti di TLCN (Figura 2A-D). Così, la formazione della coppa fagocitica era cruciale dalla presenza di TLCN nei dendriti.
I costituenti della filopodia dendritica apparivano simili a quelli delle coppe fagocitiche. Successivamente, abbiamo purificato tazze fagocitiche invece di filopodi dendritiche. Il protocollo per la purificazione delle tazze fagocitiche è schematicamente illustrato nella figura 3. Le microsfere magnetiche sono state aggiunte ai neuroni ippocampali coltivati wild-type, che induce la formazione di strutture di coppa fagocitica. Le strutture della coppa fagocitatica sono state lisciviate con un detergente debole. Le microsfere sono state raccolte dopo la lisi utilizzando un separatore magnete. Dopo il lavaggio delle perline, le loro proteine leganti sono state bollite ed eluite in un buffer di campione SDS.
La quantità di proteine nella frazione legata e non legata è stata misurata utilizzando il kit di saggio delle proteine BCA. La stessa quantità di proteine nelle frazioni non legate e legate è stata separata da SDS-PAGE e macchiata da colorazione argento (Figura 4A). I modelli di banda proteica erano quasi gli stessi per le frazioni non legate e legate, ma le intensità a 50 e 70 kDa nella frazione legata erano inferiori a quelle della frazione non legata. Tuttavia, l'intensità della banda non era ovviamente diversa tra le frazioni non legate e legate preparate dai neuroni ippocampali della coltura TLCN. Per confermare la purificazione delle strutture delle coppe fagocitiche, abbiamo eseguito il blotting occidentale usando la vitronectina anti-TLCN-C, la vitronectina anti-bovina, l'anti-actin e l'anti-tubulina (Figura 4B). TLCN e VN sono stati rilevati principalmente nella frazione legata. Actin, ezrin, G'q, PLC-1, MAP-2 e spectrin sono stati rilevati in entrambe le frazioni legate e non legate. Moesin, PSD-95, z-actinina, e z-tubulina sono stati rilevati nella frazione non legata.
Figura 1: Localizzazione di TLCN e F-actin in filopodi deendritiche e tazze fagocitiche. (A) Colorazione immunofluorescenza dei dendriti di un neurone ippocampale colto che esprime un'ondata di vena con anticorpo anti-GFP (blu in un'immagine fusa), anticorpo anti-TLCN (rosso in un'immagine fusa) e phalloidin (verde in un'immagine fusa). TLCN e F-actin sono abbondantemente osservati nella filopodia dendritica. (B, C) Formazione di strutture di coppa fagocitica su dendriti neuronali. Le microsfere fluorescenti (blu nelle immagini fuse di B, C) aggiunte ai neuroni ippocampali coltivati aderiscono fortemente ai dendriti e inducono l'accumulo di TLCN (rosso nelle immagini fuse di B, C) e F-actin (verde nelle immagini fuse di B, C). (D) Una vista laterale di una coppa fagocitica dendritica ricostruita da immagini confocali rivela TLCN (rosso nelle immagini fuse di D) che circonda il tallone fluorescente (blu nelle immagini fuse di D). (E) Una tazza fallagcitica dendritica indotta da una microsfera magnetica attaccata a un dendrite neuronale e immunostaina con anticorpi anti-VN (blu nelle immagini fuse di E), anticorpi anti-TLCN (rossi nelle immagini fuse di E) e phalloidin (immagini giunte in bianco nelle immagini E). Barre di scala : 1 m in (D); 2 m in (A), (C) e (E); e 20 m in (B). Questa cifra è stata modificata da uno studio precedente18. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: formazione dipendente dal TLCN di una struttura a forma di coppa fagocitica. (A-D) Immagini a tripla fluorescenza di tipo selvaggio (WT; A, C) e TLCN-carente (KO; C, D) neuroni trattati con perline fluorescenti rivestite in VN (rosse nelle immagini fuse di A, B, C, D) ed etichettati con anticorpi anti-TLCN (verde nelle immagini fuse di A, B, C, D) e anticorpo antifosato-ERM (blu nelle immagini fuse di A, B) o Alexa488-phalloidin (blu fuso in immagini di C, D). Barre della scala: 5 m. Questa cifra è stata modificata da uno studio precedente15. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Un diagramma schematico che illustra la procedura di purificazione della frazione dendritica ricca di filopodia. Le microsfere magnetiche sono state aggiunte ai neuroni ippocampali coltivati per indurre la formazione di coppe fagocitiche dendritiche. Dopo 1 giorno di incubazione, i neuroni sono stati solubili con tampone di lisi contenente 0.01% Triton X-100. Le perline erano separate dalla frazione non legata utilizzando un separatore magnetico. Dopo il lavaggio, le proteine associate sono state eluite con buffer campione SDS e utilizzate come frazione legata. Rosso: VN, verde: TLCN, altri colori: proteine legate. Questa cifra è stata modificata da uno studio precedente18. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Conferma della frazione di coppa fagocitica. (A) Colorazione argento delle proteine nelle frazioni non legate e legate delle microsfere. La stessa quantità (50 ng) di proteine nelle frazioni non legate e legate purificate dai neuroni ippocampali di tipo selvaggio (WT) e TLCN (TLCN KO) sono stati separati da SDS-PAGE e visualizzati con colorazione d'argento. (B) Analisi commerciale delle frazioni non legate e legate. La stessa quantità (50 ng) di proteine è stata separata da SDS-PAGE e sottoposta ad analisi delle macchie occidentali utilizzando anti-TLCN, anti-VN, anti-actin, anti-ezrin, anti-moesin, anti-G-Q, anti-PLC-1, anti-MAP-2, anti-spectrina, anti-PSD-95, anti-z-actin, e anticorpi anti-tubulina. Si noti che TLCN, VN, actin, ezrin, PLC-1, MAP-2 e spectrin sono osservati nella frazione dendritica ricca di filopodia. Questa cifra è stata modificata da uno studio precedente18. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Abbiamo sviluppato un metodo di purificazione per la frazione dendritica ricca di filopodia utilizzando affinità tra la molecola di adesione cellulare TLCN e la proteina matrice extracellulare vitronectina. Rispetto alla frazione PSD, potrebbe essere possibile identificare le proteine sinaptiche che agiscono sulla sinapsi immatura dalla frazione dendritica ricca di filopodia. Così, i costituenti della frazione dendritica ricca di filopodia sono diversi da quelli della frazione PSD del 74%. A differenza della frazione PSD, abbiamo usato neuroni ippocampali coltivati per formare attivamente tazze fagocitiche, e le cellule devono essere vive. Per formare la coppa fagocitica, abbiamo usato l'interazione tra TLCN e vitronectin. L'espressione TLCN è limitata nel telencephalon. Pertanto, non possiamo usare neuroni coltivati derivati dal cerebellare. Tuttavia, se ricopriamo le perline con proteine diverse, questo metodo di purificazione dipendente dall'attività potrebbe essere applicato ai neuroni cerebellari. Ad esempio, quando il dominio N-terminale dei microsfere rivestite delta2 rivestite del recettore del glutammato vengono applicate alle cellule di granulo cerebellare, la neurexina presilitica e la cbln1 sono state identificate dalle proteine leganti. Pertanto, questo metodo dipendente dall'attività potrebbe essere utilizzato, se le proteine di rivestimento vengono modificate. Poiché l'accesso di microsfere rivestite di vitronectin è limitato alla fetta cerebrale e al tessuto cerebrale, le tazze fagocitiche non sono formate in modo efficiente. Così, compiti futuri includono lo sviluppo del metodo di purificazione della frazione dendritica filopodia-ricca da fetta cerebrale e tessuto.
In questo protocollo, condizione di coltura a bassa densità viene utilizzato per i neuroni ippocampali, e la crescita delle cellule gliali sono inibite dall'aggiunta di Ara-C10,20,21. I neuroni ippocampali sono coltivati in MEM preparati da noi stessi, ma non nel mezzo neurobasale, che è ampiamente utilizzato per la coltura dei neuroni ippocampali. I neuroni ippocampali spesso muoiono di 14 DIV quando sono coltivati su mezzi neurobasali, il che indica che il mezzo neurobasale non è adatto alla nostra condizione di coltura a bassa densità. Inoltre, un aspetto importante della coltura a bassa densità è il rivestimento del piatto con idrobromofo poli-L-lisina, che non può essere sostituito con poli-L-lisina.
Per ottenere una quantità sufficiente di proteine dalla frazione dendritica ricca di filopodia, il numero di neuroni ippocampali e microsfere magnetiche sono fattori importanti. Per la filopodia dendritica immunostaintica, i neuroni ippocampali sono stati placcati su un piatto di 35 mm a 5,6 x 104 cellule/piatto, mentre i neuroni sono stati placcati a 7,0 x 104 celle /piatto per la purificazione della frazione dendritica ricca di filopodia. A 14 DIV, quasi nessun neuroni ippocampali si sovrapponeva a 5,6 x 104 celle/piatto per l'immunostaining, mentre molti dei neuroni ippocampali si sovrapponevano in parte agli altri neuroni a 7,0 x 104 celle/piatto per la purificazione della filopopodia filofila frazione f. Tuttavia, la filopodica dendritica erano abbondantemente presenti a entrambe le densità dei neuroni ippocampali. Le colture ad alta densità di neuroni ippocampali spesso maturano più velocemente dei neuroni ippocampali coltivati a bassa densità; così, regolare la densità dei neuroni ippocampali alla coltura a bassa densità è indispensabile per ottenere la frazione dendritica ricca di filopodia. Le microsfere sono state aggiunte a 1 x 106 microsfere/piatto per immunostaining e a 3 x 106 microsfere/piatto per la purificazione della frazione dendritica ricca di filopodia. Per la purificazione della frazione, una volta aggiunta una quantità sufficiente di perline, le perline non legate sono state sbiadite dai neuroni ippocampali.
In questo protocollo, le microsfere sono state rivestite automaticamente con VN, che è presente nel mezzo di coltura. Tuttavia, le microsfere possono essere rivestite con VN ricombinante e aggiunte ai neuroni ippocampali. Poiché VN è una proteina molto appiccicosa, le microsfere rivestite in VN formano facilmente aggregati. Così, microsfere rivestite di VN sono sonicate e pipetted per dissociare l'uno dall'altro appena prima di oltre ai neuroni ippocampali.
In precedenza abbiamo dimostrato che le microsfere rivestite in VN inducono fosforo-ERM, PI(4,5)P2e F-actin insieme all'accumulo di TLCN15. Quando la frazione dendritica ricca di filopodia è stata analizzata dal gonfiore occidentale, il fosforo-ERM non è stato rilevato dagli anticorpi policlonali anti-fosforo-ERM ed è stato leggermente rilevato dagli anticorpi monoclonali anti-ezrin e anti-moesin. Sembra che la sensibilità degli anticorpi monoclonali fosse superiore all'anticorpo policlonale antifosofo-ERM. Inoltre, le proteine ERM sono state localizzate in quasi tutte le regioni dei neuroni ippocampali, ma le proteine fosfo-ERM sono state localizzate solo alla punta della filopodia dendritica e alla coppa fagocitica. Si ritiene che la quantità di legame fosforo-ERM al TLCN sia limitata rispetto alla quantità di ERM non forosforato. Pertanto, l'individuazione del fosforo-ERM nella frazione dendritica ricca di filopodia sembra essere difficile.
Per staccare le microsfere dalla membrana cellulare, abbiamo usato un detergente debole, 0,01% Triton X-100. Il TLCN è collegato al filamento di actin attraverso il fosforo-ERM nelle strutture di filopodia dendritica e coppa fagocitica. Per purificare le proteine indirettamente legate al TLCN attraverso il filamento di actina, abbiamo usato un detergente debole in questo protocollo. Tuttavia, la concentrazione di Triton X-100 potrebbe essere modificata in una concentrazione più alta a seconda dello scopo dell'esperimento.
Esselens et al. ha dimostrato che l'assorbimento fagocitico delle microsfere ha indotto TLCN, PIP2e F-actin accumulo nei neuroni ippocampali coltivati17. Secondo la nostra analisi tramite microscopia confocale dopo 24 h di incubazione con microsfere, le microsfere non sono state completamente assorbite nel citoplasma. TLCN e PIP2, localizzati nella membrana cellulare, sono stati localizzati intorno alle perline, in particolare sul fondo delle microsfere. Inoltre, sono state analizzate 319 proteine identificate dalla frazione ricca di filopodia dendritica utilizzando l'analisi del percorso KEGG. Non sono stati rilevati percorsi di fagocitosi e autofagia, ma l'organizzazione del citoscheletro, l'esocitosi, il processo basato sull'actina-filamento e il processo basato su microtubuli sono stati notevolmente arricchiti nella frazione18.
Il meccanismo molecolare della formazione della filopodia dendritica rimane in gran parte sconosciuto. L'analisi della struttura della coppa fagocitica potrebbe aiutare a comprendere i costituenti molecolari e le funzioni dinamiche della filopodia dendritica. Sarebbe interessante analizzare la frazione dendritica ricca di filopodia preparata da modelli murini di disturbi neurosviluppo e neuropsichiatrici.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Shigeo Okabe e Hitomi Matsuno per la cultura a bassa densità dei neuroni ippocampali, Masayoshi Mishina per topi carenti di TLCN, Sachiko Mitsui e Momoko Shiozaki per l'assistenza tecnica, e membri del laboratorio Yoshihara per discussioni utili . Questo lavoro è stato supportato da JSPS KAKENHI Grant Nos. JP20700307, JP22700354 e JP24500392 e MEXT KAKENHI Grant Nos. da JP23123525 a YF e JP20022046, JP18H04683 e da JP18H05146 a YY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 1.7 mLl Low Binding MCT | Sorenson BioScience | 39640T | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | 2530149 | |
| 35 mm plastic cell culture dishes | Corning | 430165 | |
| Anti-actin | Sigma-Aldrich | A-5060 | |
| Anti-alpha-Actinin | Sigma-Aldrich | A-5044 | |
| Anti-alpha-tubulin | Sigma-Aldrich | T-9026 | |
| Anti-Ezrin | Sigma-Aldrich | clone3C12, SAB4200806 | |
| Anti-Galphaq | Santacruz | sc-393 | |
| Anti-MAP2 | Chemicon | clone AP20, MAB3418 | |
| Anti-Moesin | Sigma-Aldrich | clone 38/87, M7060 | |
| Anti-PLCbeta1 | Santacuz | sc-5291 | |
| Anti-PSD95 | MA2 | ABR | |
| Anti-Spectrin beta | Chemicon | MAB1622 | |
| B27 | Gibco | 0080085SA | |
| BCA protein assay kit | Thermo | 23227 | |
| Bromophenol blue | Merck | 1.08122.0005 | |
| Calcium chrolide, hydrous | Wako | 038-19735 | |
| Cell scraper | Falcon | 353085 | |
| Cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Choline chloride | Sigma-Aldrich | C7527 | |
| Complete EDTA free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Cytosine beta-D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich | C-6645 | |
| DNase-I | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma-Aldrich | P5155 | |
| DynaMag-2 Magnet | Thermo | 12321D | |
| ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE | RPN2232 | |
| e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gradient gel | ATTO | E-T520L | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
| HBSS | Gibco | 14175095 | |
| HRP-conjugated anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | |
| i-Inositol | Sigma-Aldrich | I7508 | |
| LAS-1000 mini | Fuji Film | LAS-1000 mini | For detection of luminescence from WB membrane |
| Magnetic polystyrene microbeads | Sperotech | PM-20-10 | |
| MEM amino acid solution | Gibco | 11130-051 | 30 mM L-Arginine hydrochloride, 5 mM L-Cystine, 10 mM L-Histidine hydrochloride-H2O, 20 mM L-Isoleucine, 20 mM L-Leucine, 19.8 mM L-Lysine hydrochloride, 5.1 mM L-Methionine, 10 mM L-Phenylalanine, 20 mM L-Threonine, 2.5 mM L-Tryptophan, 10 mM L-Tyrosine, and 20 mM L-Valine |
| Mini-slab size electrophoresis system | ATTO | AE-6530 | |
| Niacinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Penicilin / Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail | Roche | 4906845001 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Nacali | 28360-14 | |
| Pyridoxal HCl | Sigma-Aldrich | P6155 | |
| Riboflavin | Sigma-Aldrich | R9504 | |
| Silver Stain 2 Kit wako | Wako | 291-5031 | |
| Thiamine HCl | Sigma-Aldrich | T1270 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-rad | 1703940JA | |
| Ultra pure water | MilliQ | For production of ultra pure water |
References
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