Summary
このプロトコルでは、樹状性フィロポジア間の特異的かつ強い親和性を利用して、培養海馬ニューロン上の食中毒カップ様突起構造から樹状フィロポジアが豊富な画分を精製する方法を紹介する。接着分子、TLCN、および細胞外マトリックス分子、ビトロネクチン。
Abstract
樹状フィロポディアは、アクチンフィラメントに基づいて薄く長い突起であり、それらは、ターゲット軸を検索するかのように拡張し、後退します。樹状フィロポディアが標的軸線との接触を確立すると、それらは脊椎に成熟し始め、シナプスの形成につながる。テレンセファリン(TLCN)は樹状フィロポディアに豊富に局在し、徐々に脊椎から除外される。培養海馬ニューロンにおけるTLCNの過剰発現は、樹状性フィロポディア形成を誘導する。我々は、テレスファリンが細胞外マトリックス分子、ビトロネクチンに強く結合することを示した。ビトロネクチンコーティングマイクロビーズは、神経デンドライト上の食器細胞性カップ形成を誘発した。食細胞カップでは、TLCN、リン酸化エズリン/ラジキシン/モエシン(ホスホ-ERM)、F-アクチンなどのTLCN結合タンパク質が蓄積され、食中毒カップの成分が樹状フィロポディアのものと類似していることを示唆している。そこで、樹状フィロポディアの代わりに食細胞性カップを精製する方法を開発した。磁気ポリスチレンビーズは、海馬ニューロンの培養培地に豊富に存在し、神経デンドライト上の食細胞性カップ形成を誘導するビトロネクチンでコーティングされた。インキュベーションの24時間後、ファゴサイトカップを洗剤で軽度に可溶化し、磁石セパレータを用いて回収した。ビーズを洗浄した後、結合タンパク質をタンパク質をタンパク質をタンパク質をタンパク質でタンパク質にして、銀染色およびウェスタンブロッティングにより分析した。結合画分では、TLCNおよびアクチンが豊富に存在していた。さらに、画分から同定された多くのタンパク質は樹状フィロポディアに局在した。したがって、結合分数を樹状フィロポディアリッチ画として命名した。この記事では、樹状フィロポディアリッチ画の精製方法に関する詳細について説明します。
Introduction
樹状フィロポディアは脊椎の前駆体であると考えられている。樹状フィロポディアのアクチンフィラメントは、その延長と引き込みを調節する1,2,3.軸と接触した後、選択された樹状フィロポディアは脊椎に成熟を開始し、シナプスが形成され、4、5.脊椎の成分は、樹状密度画率6、7の包括的な分析から決定されたが、樹状フィロポディアの成分はほとんど知られていない。テレスファリン(TLCN)、ERM、SynGAP、Ras、PI3キナーゼ、Akt、mTOR、ポロ様キナーゼ2、CaMKII、シンデカン-2、パラレミン-1、ARF6、およびEphBBがデンドリックフィロポダイヤ形成5、8、9を調節することが示されている。 ,10,11, 樹状フィロポディアに存在する分子の包括的な分析のための方法が開発されていない間.
TLCN(ICAM-5)は、最もrostral脳セグメントにおける脊椎ニューロンによって特異的に発現され、テレスファロン12である。TLCNは、その細胞外領域に9つのIg様ドメイン、膜領域、および細胞質尾13を有する。TLCNは、その細胞外領域におけるビトロネクチン(VN)およびLFA-1インテグリンに結合し、その膜領域におけるプレセニリンに、そして細胞質領域5、8、14、15におけるホスホ-ERMおよびα-アクチニンに結合する。 、16.TLCNは、脊椎および樹状シャフト8、16の樹状フィロポディアおよびα-アクチニンの先端にリン-ERMを介してアクチン細胞骨格に結合する。
我々は、TLCNの過剰発現が樹状フィロポディア形成を増強し、フィロポディア10への脊椎の復帰を誘導することを示した。TLCN細胞質領域に結合したエズリンの構成活性形態と高められた樹状フィロポディア形成8.したがって、TLCNは、アクチン結合タンパク質を介して樹状フィロポディア形成を調節する。Esselensらは、マイクロビーズが培養ニューロン17にTLCN蓄積を誘導することを実証した。我々は、TNコーティングされたマイクロビーズの周りの神経デンドライト上に、TLCN依存的な方法15で食細胞性カップ構造が形成されることを示した。樹状フィロポディアの成分は、食中毒カップのものと類似しています。樹状フィロポディアを採取することは困難ですが、磁気マイクロビーズを使用して食中毒カップを収集することは比較的容易です。そこで、樹状フィロポディア18の代わりに食細胞性カップを精製する方法を開発した。ここでは、樹状フィロポディアが豊富な画分の精製方法について説明する。
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Protocol
ここに記載されているすべての方法は、理化学研究所和光の施設動物管理・使用委員会によって承認されています。
1. 海馬ニューロンの培養
- 培養培地の調製
- 200倍のビタミンミックスの調製。Dパントテイン酸ヘミカルシウム塩の100mg、塩化コリン100mg、葉酸100mg、イノシトール180mg、ナイアシンアミド100mg、ピリドキサルHCl100mg、500mLのチアミンHClを100mgの磁性を使用して溶解する。溶液が完全に溶解するわけではありません。慎重に混合し、50 mLチューブでアリコートし、-20 °Cで保存します。
- リボフラビン溶液の調製。磁気攪拌機を用いて500mLの超純水にリボフラビン100mgを溶解する。溶液が完全に溶解するわけではありません。慎重に混合し、50 mLチューブでアリコートし、-20 °Cで保存します。
- 1 M CaCl2の準備 .磁気攪拌機を用いて50mLの超純水にCaCl2・2H2 Oの7.35gを溶解する。
- 最小必須培地(MEM)の調製。KClの400mg、NaClの6800mg、NaHCO3の2,200mg、NaH2 PO4~2H2Oの158mg、D-グルコースの7000mg、および950mLの超純水のMgSO4-7H2Oを950mLの超純水で溶解する。
- 磁気撹拌機に一定の攪拌を伴う1mLピペを用いて、1M CaCl2の1.8mLをMEMに滴下方法で滴下する。MEMのpHを1モル/L HClでpH 7.25に調整します。
- MEMに200倍のビタミンミックスの5 mLとリボフラビン溶液の200 μLを追加します。溶液の体積を超純水で1,000mLに調整します。0.22 μmフィルターシステムを使用して溶液をろ過し、4°Cに保存します。
- 10倍DNase-Iストックソリューションの準備。ハンクスのバランス塩溶液(HBSS)の12.5 mLでDNase-Iの100mgを溶解し、0.22 μmフィルターを通して濾過し、1.5 mLチューブでアリコートし、-20°Cでチューブを保存します。
- シトシンβ-D-アラビノフラノシド(Ara-C)ストック溶液の調製。8.93 mLの超純水(最終濃度10mM)でAra-Cの25mgを溶解し、0.22 μmフィルターを通して濾過し、1.5mLチューブにアリコートを入れ、-20°Cで保存
- めっき媒体の調製。MEMアミノ酸溶液の1mL、1M HEPESの750 μL、B27の1mL、200mMグルタミンの125μL、ペニシリン/ストレプトマイシンの250μL、2.5mLの胎児ウシ血清(FBS)、および44.375 mLのMELチューブを混合する。
- ストップ培地の調製。MEMアミノ酸溶液1mL、1M HEPESの750 μL、FBSの5mL(最終10%)、および50mLチューブにMEMの43.25 mLを混合します。
- ポリL-リジンコーティングされた料理の調製
- ポリL-リジンヒドロブロマイドの0.2 mg/mLで35mmプラスチック細胞培養皿を25°Cで1日塗ります。
注:ポリ-L-リジンは、ポリ-L-リジンヒドロブロミドの代わりに使用しないでください。 - 2mLの超純水で3回洗います。使用するまで25°Cでストップ媒体の1.5 mLで皿をインキュベートします。
- ポリL-リジンヒドロブロマイドの0.2 mg/mLで35mmプラスチック細胞培養皿を25°Cで1日塗ります。
- マウス胚からの海馬ニューロンの解剖
- 海馬ニューロンの組織源。Lu et al.19の方法に従って、胚性16-17日目に野生型およびTLCN欠損C57BL6/Jマウスから海馬を解剖する。
- 15 mM HEPESを含むHBSSで0.25%トリプシンと1x DNaseIで解剖した海馬を3分毎に攪拌して37°Cで15分間pH 7.2を加分し、溶液を取り除きます。10mLのSTOP培地で海馬をインキュベートし、4°Cでトリプシンを5分間不活性化させる。
- 海馬を新鮮なSTOP培地の10mLに移動し、4°Cでインキュベートし、新鮮なSTOP培地の10 mLに移動し、さらに5分間4°Cでインキュベートする。mLチューブ。1 mLピペを使用して20回ピペッティングすることにより、海馬を単離ニューロンに解離する。
注:1 mLピペットの先端は、海馬の解離中に15 mLチューブの底部にわずかに触れます。 - めっき媒体の9 mLを追加し、50 mLチューブに70 μmセルストレーナーを通してフィルタリングします。ヘモサイトメーターを使用して細胞数を数え、めっき培地で3.5 x 104セル/mLに調整します。
- ポリL-リジンコーティングされた料理からSTOP培地を吸引。ポリL-リジンコーティングされた皿に7 x 104セル/皿(2 mL/皿)でセルをプレートします。
- 37°Cで5%CO2以下のインキュベーションを60〜64時間後、ニューロンにAra-Cストック溶液(最終10μM)の2μLを加え、ゆっくりと皿を振ります。培養物は、培養物を5%CO2以下の37°Cで変えずに加湿箱に入れたままにしておきます。
2. 樹状性フィロポディアリッチ画分の精製
- インビトロ(DIV)で13日後、培養ニューロンを含む20皿に磁気ポリスチレンマイクロビーズ(3 x 106粒子/皿)を添加する。1日後、培地および非結合マイクロビーズを除去するために攪拌3回でPBSの1 mLでニューロンを洗浄する。PBSを除去した後、500 μL/皿のライシスバッファー(0.01%トリトンX-100、EDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテル、ホスファターゼ阻害剤カクテルを含むPBS)でニューロンをlyseします。
- 細胞スクレーパーでライサートを収集し、低タンパク質結合マイクロチューブ(10チューブ)にリザートを移動します。磁石セパレータにチューブをセットし、1分間待って上清を収集し、銀染色とウェスタンブロット分析のための非結合分画として使用します。
- ビーズを新しい低タンパク質結合マイクロチューブに移し、磁気セパレータにセットし、上清を完全に除去する。500 μLのリシスバッファーを追加し、15 s. 磁石セパレータにチューブを設定し、1分間待って、上清を取り除き、500 μLのリシスバッファーを追加します。ビーズの洗浄を10回繰り返し、上清を取り除きます。
- ビーズに結合した溶質タンパク質(結合分画)を1x SDSサンプルバッファー(62.5 mMトリスHCl、pH 6.8、2.5%SDS、および10%グリセロール)の50 μLを添加し、チューブを98°Cで5分間沸騰させ、チューブを860 x gで10°sに設定し、チューブを860 x gで沸騰させます。1分間の磁気セパレータ上に上清を収集し、結合分数として使用します。
注:プロトコルはここで一時停止できます。 - BCAタンパク質アッセイによる非結合分画および結合画分のタンパク質濃度を測定します。ブロモフェノールブルーでタンパク質溶液を可視化し、SDS-PAGEの濃度を5ng/μLに調整します。
3. 銀染色とウェスタンブロット分析
- 5~20%のグラデーションゲルを使用して、SDS-PAGEでバインド分数と非連結分数(50ng)を分離します。ゲルを銀染色します。
- 抗TLCN-C(1/3,000)、抗ウシビトロネクチン(1/5,000)、抗アクチン(1/1,000)、抗αチューブリン(1/1,000)を一次抗体として使用し、HRP結合ヤギ抗ウサギIgG(1/500)を用いたウェスタンブロット。化学発光ウエスタンブロッティング検出試薬と化学発光イメージャーを用いて抗原を可視化する。
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Representative Results
培養海馬ニューロンにおいて、TLCNは樹状フィロポディア、シャフト、およびソマに豊富に局在し、F-アクチンと共局所化した(図1A、B)。培養海馬ニューロンにポリスチレンマイクロビーズを添加すると、ビーズは培養培地中の胎児ウシ血清(FBS)由来のビトロネクチン(VN)で自動的に被覆された。彼らは主にデンドライトに結合し、彼らは咽末カップの形成を誘導した(図1B-E)。ファゴサイトカップは、デンドライト上のマイクロビーズの周りのシート状のアクチンフィラメントに基づいていました。TLCN、ホスホ-ERM、およびPI(4,5)P2は、樹状フィロポディアのマーカーであり、ビーズの周りに高度に蓄積されている(図1D)8、15。食細胞性カップは野生型海馬ニューロンでのみ形成されたが、TLCN欠損海馬ニューロンでは形成されなかった(図2A-D)。したがって、食細胞性カップ形成は、デンドライト中のTLCNの存在に極めて依存していた。
樹状フィロポディアの成分は、咽頭カップのものと同様に現れた。次に、樹状フィロポディアの代わりに咽頭カップを精製した。咽頭カップの精製のためのプロトコルは、図3に概略的に示されています。野生型培養海馬ニューロンに磁気マイクロビーズを添加し、食細胞性カップ構造の形成を誘導した。食細胞性カップ構造体は、弱い洗剤で溶解した。マイクロビーズを磁石セパレータを用いてライシス後に採取した。ビーズを洗浄した後、その結合タンパク質を沸騰させ、SDSサンプルバッファーで果流した。
結合および非結合画分中のタンパク質の量をBCAタンパク質アッセイキットを用いて測定した。非結合分画および結合画分中の同じ量のタンパク質をSDS-PAGEで分離し、銀染色により染色した(図4A)。タンパク質バンドパターンは非結合分画と結合画分でほぼ同じでしたが、結合率の50kDaの強度は非結合画分の強度よりも低かった。しかし、バンド強度は、TLCN欠乏培養海馬ニューロンから調製された非結合分画と結合分画の間で明らかに異なっていなかった。食細胞性カップ構造の精製を確認するために、抗TLCN-C、抗ウシビトロネクチン、抗アクチン、抗αチューブリン(図4B)を用いてウェスタンブロッティングを行った。TLCNおよびVNは主に結合画分で検出された。アクチン、エズリン、Gαq、PLCβ1、MAP-2、およびスペクトルリンは、結合率と非結合画分の両方で検出された。モーシン、PSD-95、α-アクチニン、およびαチューブリンは、非結合画分で検出された。
図1:樹状フィロポディアおよび咽頭カップにおけるTLCNおよびF-アクチンの局在化(A)抗GFP抗体(結合画像中の青色)、抗TLCN抗体(マージ画像中の赤色)、およびファロイジン(マージされた画像における緑色)を用いてgapVenusを発現する培養海馬ニューロンのデンドライトの免疫蛍光染色。TLCNおよびF-アクチンは樹状フィロポディアで豊富に観察される。(B, C)神経デンドライト上の食細胞性カップ構造の形成培養海馬ニューロンに添加された蛍光マイクロビーズ(B、Cのマージ画像では青色)がデンドライトに強く付着し、TLCN(B、Cのマージ画像では赤色)とF-アクチン(B、Cのマージ画像で緑色)の蓄積を誘導する。(D) 共焦点画像から再構築された樹状性食症カップの横図は、蛍光ビーズを取り囲むTLCN(Dのマージ画像の赤色)を明らかにする(Dのマージされた画像では青)。(E) 神経デンドライトに付着し、抗VN抗体(Eのマージ画像では青色)、抗TLCN抗体(Eのマージ画像では赤色)、およびファロイジン(マージされた画像の緑色)で免疫系のデンデントライトに付着し、免疫染色された樹状性食細胞性カップE) スケール バー = 1 μm インチ (D)。2 μm インチ (A)、(C)、および (E);(B)で20 μmです。この数値は、以前の研究18から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:食細胞性カップ様構造のTLCN依存的形成。(A-D)野生型の三重蛍光画像(WT;A, C) および TLCN 欠乏 (KO;C,D)VNコーティングされた蛍光ビーズ(A、B、C、Dのマージ画像で赤色)を処理し、抗TLCN抗体(A、B、C、Dのマージ画像で緑色)および抗ホスホ-ERM抗体(A、B、Bのマージ画像で青色)またはAlexa488-ファロイジン(青色)で標識C、D)の画像)スケールバー = 5 μm.この数値は、以前の研究15から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:樹状フィロポディア富分の精製手順を示す概略図。磁気マイクロビーズを培養海馬ニューロンに添加し、樹状食細胞性カップの形成を誘導した。インキュベーションの1日後、ニューロンを0.01%トリトンX-100を含む溶解バッファーで可溶化した。ビーズを磁気セパレータを用いて非結合画分から分離した。洗浄後、結合タンパク質をSDSサンプルバッファーでタンパク質でタンパク質化し、結合分画として使用した。赤:VN、緑:TLCN、その他の色:結合タンパク質。この数値は、以前の研究18から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:食細胞性カップ画分の確認(A) マイクロビーズの結合のない分画中のタンパク質の銀染色。野生型(WT)およびTLCN欠損(TLCN KO)海馬ニューロンから精製された結合非結合分画中のタンパク質の同じ量(50ng)をSDS-PAGEで分離し、銀染色で可視化した。(B) 非連結分数とバインドされた分数のウェスタン ブロット分析。同じ量のタンパク質(50ng)をSDS-PAGEで分離し、抗TLCN、抗VN、抗アクチン、抗エズリン、抗モエシン、抗Gαq、抗PLCβ1、抗MAP-2、抗スペクトルリン、抗PSD-95、抗α-95、抗α-95を用いたウェスタンブロット分析を行った。抗α-チューブリン抗体。なお、TLCN、VN、アクチン、エズリン、PLCβ1、MAP-2、およびスペクトルリンは樹状フィロポディアが豊富な画分で観察される。この数値は、以前の研究18から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
細胞接着分子TLCNと細胞外マトリックスタンパク質ビトロネクチンとの親和性を用いた樹状フィロポディアリッチ画分の精製方法を開発した。PSD画分と比較して、樹状フィロポディアが豊富な画分から未熟なシナプスに作用するシナプスタンパク質を同定することができる。したがって、樹状フィロポディア富率の構成成分は、74%によってPSD画分のものと異なる。PSD分画とは異なり、培養海馬ニューロンを用いて食細胞カップを積極的に形成し、細胞は生きている必要があります。食細胞性カップを形成するために、TLCNとビトロネクチンの相互作用を用いた。TLCN式はテレスファロンでは限られている。したがって、小脳由来の培養ニューロンは使用できません。しかし、ビーズを異なるタンパク質でコーティングすれば、この活性依存性精製法を小脳ニューロンに適用することができます。例えば、グルタミン酸受容体delta2コーティングマイクロビーズのN末端ドメインが小脳顆粒細胞に適用されると、結合タンパク質からシナプス前ニューレキシンおよびcbln1が同定された。したがって、コーティングタンパク質が変化した場合、この活性依存性法を用いることができる。ビトロネクチンコーティングされたマイクロビーズのアクセスは脳のスライスおよび脳組織に限られているので、食細胞性カップは効率的に形成されない。したがって、将来のタスクは、脳のスライスおよび組織からの樹状フィロポディア豊富な画分の精製方法の開発を含む。
このプロトコルでは、海馬ニューロンに低密度培養状態が用いられ、グリア細胞の増殖はAra-C 10、20、21の添加によって阻害される。海馬ニューロンは、自分たちで調製したMEMで培養されていますが、海馬ニューロンの培養に広く使用されている神経基底培地では培養されません。海馬ニューロンは、神経基底培地で培養すると14DIVで死亡することが多く、これは神経基底培地が低密度培養条件に適していないことを示している。さらに、低密度培養の重要な側面は、ポリL-リジンと置き換えることができないポリ-L-リジンヒドロブロマイドで皿をコーティングすることです。
樹状フィロポディアが豊富な画分から十分な量のタンパク質を得るためには、海馬ニューロンと磁気マイクロビーズの数が重要な要因です。免疫染色樹状フィロポディアについては、海馬ニューロンを5.6 x×104細胞/皿で35mm皿にめっきし、ニューロンは樹状フィロポディアの分画を精製するために7.0 x 104細胞/皿でめっきした。14 DIVでは、免疫染色のために5.6 x 104細胞/皿で海馬ニューロンがほとんど重なり合っていませんが、海馬ニューロンの多くは樹状フィロポディアの精製のために7.0 x 104細胞/皿で他のニューロンと部分的に重なっていました。分数。しかし、樹状性フィロポディアは海馬ニューロンの両方の密度に豊富に存在していた。海馬ニューロンの高密度培養は、多くの場合、低密度培養海馬ニューロンよりも速く成熟します。したがって、海馬ニューロンの密度を低密度培養に調整することは、樹状性フィロポディアが豊富な画分を得るために不可欠である。マイクロビーズを免疫染色用の1 x 106マイクロビーズ/皿に加え、樹状フィロポディアを豊富に精製するための3 x 106マイクロビーズ/皿に添加した。画分の精製のために、十分な量のビーズを添加すると、結合されていないビーズを海馬ニューロンから洗い流した。
このプロトコルでは、マイクロビーズをVNで自動的に被覆し、培養培地に存在する。しかし、マイクロビーズは組換えVNでコーティングし、海馬ニューロンに添加することができる。VNは非常に粘着性のタンパク質であるため、VNコーティングされたマイクロビーズは凝集体を形成しやすい。したがって、VNコーティングされたマイクロビーズは、海馬ニューロンに加える直前に互いに解離するために超音波処理され、ピペットされます。
我々は、VNコーティングされたマイクロビーズがTLCN蓄積15と共に蛍光体-ERM、PI(4,5)P2、およびF-アクチンを誘導することを以前に示した。樹状フィロポディア豊富な画分をウェスタンブロッティングにより分析した場合、ホスホ-ERMは抗ホスホ-ERMポリクローナル抗体では検出されず、抗エズリンおよび抗モエシンモノクローナル抗体によってわずかに検出された。モノクローナル抗体の感度は抗ホスホ-ERMポリクローナル抗体よりも高かったようです。さらに、ERMタンパク質は海馬ニューロンのほぼすべての領域に局在していたが、リン-ERMタンパク質は樹状フィロポディアと食中毒カップの先端にのみ局在していた。TLCNに対するリン-ERM結合の量は、非リン酸化ERMの量と比較して制限されると考えられる。したがって、樹状フィロポディアが豊富な画分におけるホスホ-ERMの検出は困難であると思われる。
細胞膜からマイクロビーズを取り外すには、弱い洗剤、0.01%トリトンX-100を使用しました。TLCNは、樹状フィロポディアおよび食細胞性カップ構造におけるホスホ-ERMを介してアクチンフィラメントにリンクされている。アクチンフィラメントを介してTLCNに間接的に連結されたタンパク質を精製するために、このプロトコルでは弱い洗剤を使用しました。しかしながら、トリトンX-100の濃度は、実験の目的に応じてより高い濃度に変更することができる。
Esselensらは、培養海馬ニューロン17におけるマイクロビーズの食細胞摂取がTLCN、PIP2、およびF-アクチン蓄積を誘発することを示している。マイクロビーズによるインキュベーションの24時間後の共焦点顕微鏡による我々の分析によると、マイクロビーズは完全に細胞質に取り込まれなかった。細胞膜に局在するTLCNおよびPIP2は、特にマイクロビーズの底部にビーズの周りに局在した。さらに、樹状フィロポディア豊富な画分から同定された319個のタンパク質をKEGG経路解析を用いて分析した。食細胞症およびオートファジー経路は検出されなかったが、細胞骨格組織、エキソサイトーシス、アクチンフィラメントベースのプロセス、および微小管ベースのプロセスは、分数18で有意に濃縮された。
樹状フィロポディア形成の分子機構は、ほとんど知られていない。食細胞性カップ構造の解析は、樹状性フィロポディアの分子成分および動的機能を理解するのに役立つ可能性がある。神経発達および神経精神疾患のマウスモデルから調製された樹状フィロポディアが豊富な分画を分析することは興味深いだろう。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
海馬ニューロンの低密度培養に対する岡部茂雄氏と松野仁美さん、TLCN欠損マウスの三科正義さん、技術支援を受けた三井幸子さん、塩崎桃子さん、吉原研究室のメンバーに感謝の意を表します。.この作品は、JSPSカケンヒグラント・ノーズが支援しました。JP20700307、JP22700354、JP24500392、文部研日グラントNos.JP23123525からYFおよびJP20022046、JP18H04683、およびJP18H05146からYYへ。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 1.7 mLl Low Binding MCT | Sorenson BioScience | 39640T | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | 2530149 | |
| 35 mm plastic cell culture dishes | Corning | 430165 | |
| Anti-actin | Sigma-Aldrich | A-5060 | |
| Anti-alpha-Actinin | Sigma-Aldrich | A-5044 | |
| Anti-alpha-tubulin | Sigma-Aldrich | T-9026 | |
| Anti-Ezrin | Sigma-Aldrich | clone3C12, SAB4200806 | |
| Anti-Galphaq | Santacruz | sc-393 | |
| Anti-MAP2 | Chemicon | clone AP20, MAB3418 | |
| Anti-Moesin | Sigma-Aldrich | clone 38/87, M7060 | |
| Anti-PLCbeta1 | Santacuz | sc-5291 | |
| Anti-PSD95 | MA2 | ABR | |
| Anti-Spectrin beta | Chemicon | MAB1622 | |
| B27 | Gibco | 0080085SA | |
| BCA protein assay kit | Thermo | 23227 | |
| Bromophenol blue | Merck | 1.08122.0005 | |
| Calcium chrolide, hydrous | Wako | 038-19735 | |
| Cell scraper | Falcon | 353085 | |
| Cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Choline chloride | Sigma-Aldrich | C7527 | |
| Complete EDTA free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Cytosine beta-D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich | C-6645 | |
| DNase-I | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma-Aldrich | P5155 | |
| DynaMag-2 Magnet | Thermo | 12321D | |
| ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE | RPN2232 | |
| e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gradient gel | ATTO | E-T520L | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
| HBSS | Gibco | 14175095 | |
| HRP-conjugated anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | |
| i-Inositol | Sigma-Aldrich | I7508 | |
| LAS-1000 mini | Fuji Film | LAS-1000 mini | For detection of luminescence from WB membrane |
| Magnetic polystyrene microbeads | Sperotech | PM-20-10 | |
| MEM amino acid solution | Gibco | 11130-051 | 30 mM L-Arginine hydrochloride, 5 mM L-Cystine, 10 mM L-Histidine hydrochloride-H2O, 20 mM L-Isoleucine, 20 mM L-Leucine, 19.8 mM L-Lysine hydrochloride, 5.1 mM L-Methionine, 10 mM L-Phenylalanine, 20 mM L-Threonine, 2.5 mM L-Tryptophan, 10 mM L-Tyrosine, and 20 mM L-Valine |
| Mini-slab size electrophoresis system | ATTO | AE-6530 | |
| Niacinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Penicilin / Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail | Roche | 4906845001 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Nacali | 28360-14 | |
| Pyridoxal HCl | Sigma-Aldrich | P6155 | |
| Riboflavin | Sigma-Aldrich | R9504 | |
| Silver Stain 2 Kit wako | Wako | 291-5031 | |
| Thiamine HCl | Sigma-Aldrich | T1270 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-rad | 1703940JA | |
| Ultra pure water | MilliQ | For production of ultra pure water |
References
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