Summary
I denne protokol introducerer vi en metode til rensning af dendritiske filopodia-rige fraktion fra den fagocytiske Cup-lignende fremspringende struktur på dyrkede hippocampus neuroner ved at drage fordel af den specifikke og stærke affinitet mellem en dendritisk filopodial adhæsions molekyle, TLCN og et ekstracellulær matrix molekyle, vitronectin.
Abstract
Dendritiske filopodia er tynde og lange fremspring baseret på actin filament, og de udvider og trækker som om at søge efter et mål Axon. Når dendritiske filopodia etablerer kontakt med et mål Axon, begynder de at modnes i spines, hvilket fører til dannelsen af en synapse. Telencephalin (TLCN) er rigeligt lokaliseret i dendritiske filopodia og er gradvist udelukket fra spines. Overekspression af TLCN i dyrkede hippocampus neuroner inducerer dendritiske filopodia dannelse. Vi viste, at telencepin stærkt binder sig til en ekstracellulær matrix molekyle, vitronectin. Vitronectin-coatede mikroperler induceret Fagocytisk kop dannelse på neuronal dendritter. I fagocytic Cup akkumuleres tlcn-bindende proteiner såsom phosphoryleret Ezrin/Radixin/Moesin (phospho-ERM) og F-actin, hvilket tyder på, at komponenterne i det fagocytiske bæger ligner dem af dendritiske filopodia. Således udviklede vi en metode til rensning af den fagocytiske kop i stedet for dendritiske filopodia. Magnetiske polystyren perler blev belagt med vitronectin, som er rigeligt til stede i kulturen medium hippocampus neuroner og som inducerer Fagocytisk kop dannelse på neuronal dendritter. Efter 24 timers inkubation var de fagocytiske kopper mildt opløste med vaskemiddel og indsamlet ved hjælp af en magnet separator. Efter vask af perlerne blev de bindende proteiner elueret og analyseret ved sølvfarvning og vestlig blotting. I bindings brøken var TLCN og actin rigeligt til stede. Desuden blev mange proteiner identificeret fra fraktionen lokaliseret til dendritiske filopodia; således, vi navngiver bindende fraktion som dendritiske filopodia-rige fraktion. I denne artikel beskrives detaljer om rensningsmetoden for den dendritiske filopodia-rige fraktion.
Introduction
Dendritiske filopodia menes at være forløbere for spines. Actin filamenter i dendritiske filopodia regulerer deres forlængelse og tilbagetrækning1,2,3. Efter kontakt med en Axon begynder udvalgte dendritiske filopodia deres modning i spines, og en synapse dannes4,5. Komponenterne i Spiner er blevet fastlagt ud fra omfattende analyse af postsynaptiske massefylde fraktioner6,7, mens komponenterne i dendritiske filopodia er stort set ukendte. Det har vist sig, at telencepin (tlcn), ERM, syngap, RAS, PI3 kinase, akt, MTOR, Polo-like kinase 2, camkii, syndecan-2, paralemin-1, ARF6 og ephb regulerer dendritiske filopodia dannelse5,8,9 ,10,11, mens en metode ikke er blevet udviklet til den omfattende analyse af molekyler, der findes i dendritiske filopodia.
TLCN (ICAM-5) udtrykkes specifikt af spiny neuroner i det mest rostrale hjerne segment, telencephalon12. Tlcn har 9 IG-lignende domæner i sin ekstracellulære region, en transmembran region, og en cytoplasmisk hale13. Tlcn binder sig til vitronectin (vn) og LFA-1 anti i dets ekstracellulære region, til presenilin i dets transmembran-region, og til phospho-ERM og α-actinin i dets cytoplasmiske region5,8,14,15 ,16. Tlcn binder sig til det cytoskelet actin gennem fosho-ERM ved spidserne af dendritiske filopodia og α-actinin i spines og dendritiske aksler8,16.
Vi viste, at overekspression af TLCN forbedret dendritiske filopodia dannelse og induceret omversion af spines til filopodia10. Den konstitutive aktive form af PMS bundet til tlcn cytoplasmiske region og forbedret dendritiske filopodia dannelse8. Således regulerer TLCN dendritiske filopodia dannelse gennem actin bindende proteiner. Esselens et al. påviste, at mikroperler inducerede TLCN-akkumulering på dyrkede neuroner17. Vi viste, at fagocytiske Cup strukturer blev dannet på neuronal dendritter omkring VN-belagte mikroperler i en TLCN-afhængige måde15. Bestanddele af dendritiske filopodia svarer til de fagocytiske bæger. Det er svært at indsamle dendritiske filopodia, men det er relativt lettere at indsamle den fagocytiske kop ved hjælp af magnetiske mikroperler. Således udviklede vi en metode til at rense den fagocytiske kop i stedet for dendritiske filopodia18. Her beskriver vi rensningsmetoden for den dendritiske filopodia-rige fraktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder, der er beskrevet her, er blevet godkendt af den institutionelle dyrepleje-og anvendelses Komité for RIKEN Wako.
1. kultur af hippocampus neuroner
- Forberedelse af kulturmedium
- Fremstilling af 200x vitamin mix. Opløse 100 mg af D-pantothensyre hemicalcium salt, 100 mg cholinchlorid, 100 mg folinsyre, 180 mg af i-inositol, 100 mg af niacinamid, 100 mg af PYRIDOXAL HCl, og 100 mg thiamin HCL i 500 ml af ultrarent vand ved hjælp af en magnetisk omrører. Opløsningen er ikke helt opløst. Bland forsigtigt, alikvot i 50 ml rør og opbevar ved-20 °c.
- Fremstilling af riboflavin opløsning. 100 mg riboflavin opløses i 500 ml ultrarent vand ved hjælp af en magnetisk omrører. Opløsningen er ikke helt opløst. Bland forsigtigt, alikvot i 50 ml rør og opbevar ved-20 °c.
- Klargøring af 1 M CaCl2. 7,35 g CaCl2· 2H2O opløses i 50 ml ultrarent vand ved hjælp af en magnetisk omrører.
- Forberedelse af mindste essentielle medium (MEM). Opløses 400 mg KCl, 6800 mg NaCl, 2.200 mg NaHCO3, 158 mg af Nah2po4· 2H2o, 7000 mg D-glucose, og 200 mg mgso4-7h2o i 950 ml ultrarent vand ved hjælp af en magnetisk omrører.
- 1,8 mL 1 M CaCl2 TITRERET til MEM i en dråbe for dråbe ved hjælp af et 1 ml pipet med konstant agitation på en magnetisk omrører. Juster pH-værdien for MEM til pH 7,25 med 1 mol/L HCl.
- Tilsæt 5 mL 200x vitamin blanding og 200 μL riboflavin opløsning til MEM. Opløsningen justeres til 1.000 ml med ultrarent vand. Opløsningen filtreres ved hjælp af et 0,22 μm filter system og opbevares ved 4 °C.
- Klargøring af 10x DNase-I-stamopløsninger. 100 mg DNase-i opløses i 12,5 ml Hanks ' afbalancerede salt opløsning (hbss), filtreres gennem et 0,22 μm filter, alikvot i 1,5 ml-rør, og rørene opbevares ved-20 °c.
- Præparat af cytosin β-D-arabinofuranoside (ara-C) stamopløsning. 25 mg ara-C opløses i 8,93 mL ultrarent vand (den endelige koncentration på 10 mM), filtreres gennem et 0,22 μm filter, alikvot i 1,5 mL rør og opbevares ved-20 °C
- Fremstilling af plating medium. 1 mL af MEM-aminosyre opløsningen blandes, 750 μL 1 M HEPES, 1 mL B27, 125 μL 200 mM glutamin, 250 μL penicillin/streptomycin, 2,5 mL føtal bovint serum og 44,375 ml af MEM i et 50 mL rør.
- Forberedelse af stop medium. 1 mL af MEM-aminosyre opløsningen blandes, 750 μL 1 M HEPES, 5 mL FBS (sidste 10%) og 43,25 mL af MEM i et 50 mL rør.
- Fremstilling af poly-L-lysin-belagte retter
- Coat 35 mm plastik cellekultur retter med 0,2 mg/mL af poly-L-lysin hydrobromid i 1 dag ved 25 °C.
Bemærk: Poly-L-lysin bør ikke anvendes i stedet for poly-L-lysin hydrobromid. - Vask opvasken med 2 ml ultrarent vand 3 gange. Retterne inkubates med 1,5 mL stop medium ved 25 °C indtil brug.
- Coat 35 mm plastik cellekultur retter med 0,2 mg/mL af poly-L-lysin hydrobromid i 1 dag ved 25 °C.
- Dissektion af hippocampale neuroner fra mus embryo
- Vævs kilde af hippocampus neuroner. Dissekere hippocampus fra vildtype og TLCN-mangelfuld C57BL6/J mus på embryonale dage 16-17 i henhold til metoden i Lu et al.19.
- Incubate dissekeret hippocampi i 0,25% trypsin og 1x DNaseI i HBSS indeholdende 15 mM HEPES, pH 7,2 for 15 min ved 37 °C med agitation hver 3 min. Fjern opløsningen. Hippocampi skal inkubere i 10 mL STOP medium for at inaktivere trypsin ved 4 °C i 5 min.
- Hippocampi flyttes til 10 mL frisk STOP medium, og der inkubates ved 4 °C i 5 min. Flyt hippocampi til 10 mL frisk STOP medium og Inkuber ved 4 °C i yderligere 5 min. Flyt hippocampi til 900 μL STOP medium og 100 μL 10x DNaseI i en 15 mL rør. Dissocier hippocampi i isolerede neuroner ved pipettering 20 gange ved hjælp af et 1 mL pipet.
Bemærk: Spidsen af 1 mL pipet rører lidt ved bunden af 15 mL røret under dissociation af hippocampi. - Tilsæt 9 mL plating medium, og Filtrer gennem en 70 μm cellefilter i et 50 mL rør. Tæl antallet af celler ved hjælp af et hemocytometer og Juster til 3,5 x 104 celler/ml i plating medium.
- Aspirate STOP medium fra poly-L-lysin-belagte retter. Plade cellerne på poly-L-lysin-belagte retter på 7 x 104 celler/fad (2 ml/fad).
- Efter 60-64 h inkubation under 5% CO2 ved 37 °c tilsættes 2 μl ara-C stamopløsning (sidste 10 μM) til neuronerne og rystes skålen langsomt. Hold kultur retterne i en befuret æske uden at ændre kulturmediet under 5% CO2 ved 37 °c.
2. rensning af dendritiske Filopodia-rige fraktion
- Efter 13 dage in vitro (DIV) tilsættes magnetiske polystyren mikroperler (3 x 106 partikler/fad) til 20 retter, der indeholder de dyrkede neuroner. Efter 1 dag vaskes neuronerne i 1 mL PBS med agitation 3 gange for at fjerne mediet og ubundne mikroperler. Efter fjernelse PBS, lyse neuroner med 500 μL/skål af lysis buffer (PBS indeholder 0,01% Triton X-100, EDTA-fri proteasehæmmer cocktail, og fosfatasehæmmer cocktail).
- Saml lysatet med en celle skraber og Flyt lysatet til lave proteinbindende mikrorør (10 rør). Sæt rørene på en magnet separator og vent 1 min. Saml supernatanten, og brug den som den ubundne fraktion til sølvfarvning og Western blot-analyse.
- Overfør perlerne til et nyt lavprotein bindende mikrorør, der er indstillet på en magnetisk separator, og Fjern supernatanten helt. Tilsæt 500 μL lysis-buffer, og vask perlerne med en vortex mixer i 15 s. sæt røret på en magnet separator, vent 1 min, Fjern supernatanten, og tilsæt 500 μL lysis-buffer. Gentag vask af perlerne 10 gange og Fjern supernatanten.
- Elute proteiner bundet til perlerne (den bundne fraktion) ved tilsætning af 50 μL 1x SDS prøve buffer (62,5 mM Tris HCl, pH 6,8, 2,5% SDS, og 10% glycerol) og kog røret ved 98 °C i 5 min. centrifuger røret ved 860 x g i 10 s og Indstil røret på en magnetisk separator i 1 min. Saml supernatanten, og brug den som den bundne fraktion.
Bemærk: Protokollen kan sættes på pause her. - Måle protein koncentrationerne af de ubundne og bundne fraktioner ved BCA protein assay. Visualiser proteinopløsninger med bromphenolblåt blåt, og Juster koncentrationen til 5 ng/μl for SDS-Page.
3. sølvfarvning og Western blot analyse
- Adskil de bundne og ubundne fraktioner (50 ng) med SDS-side ved hjælp af en 5-20% gradient gel. Sølv-plette gelen.
- Western blot ved hjælp af anti-TLCN-C (1/3000), anti-kvæg vitronectin (1/5000), anti-actin (1/1000), og anti-α-Tubulin (1/1000) som primære antistoffer og HRP-konjugeret ged anti-kanin IgG (1/5000) som sekundært antistof. Visualiser antigener ved hjælp af kemiluminescens Western blotting detektion reagens og en chemiluminescens Imager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I dyrkede hippocampus neuroner, TLCN var rigeligt lokaliseret til dendritiske filopodia, aksel, og Soma og colokeret med F-actin (figur 1a, B). Når polystyren mikroperler blev tilsat til dyrkede hippocampus neuroner, blev perlerne automatisk belagt med vitronectin (VN) afledt af føtal bovint serum (FBS) i dyrkningsmediet; de var hovedsageligt bundet til dendritter, og de inducerede dannelsen af fagocytiske kopper (figur 1b-E). Fagocytiske kopper var baseret på plade formede actin filamenter omkring mikroperler på dendritter. Tlcn, fosho-ERM og PI (4,5) P2, som er markører for dendritiske filopodia, er stærkt akkumuleret omkring perler (figur 1d)8,15. Fagocytiske kopper blev kun dannet på vilde-type hippocampus neuroner, men ikke på TLCN-mangelfuld hippocampus neuroner (figur 2a-D). Således var den fagocytiske kop dannelse afgørende afhængig af tilstedeværelsen af TLCN i dendritter.
Bestanddele af dendritiske filopodia optrådte ligner dem af fagocytiske kopper. Næste, vi renset fagocytiske kopper i stedet for dendritiske filopodia. Protokollen til rensning af fagocytiske kopper er skematisk vist i figur 3. Magnetiske mikroperler blev tilføjet til vilde-type dyrkede hippocampus neuroner, som inducerer dannelsen af fagocytiske Cup strukturer. De fagocytiske kopkonstruktioner blev lyseres med et svagt rengøringsmiddel. Mikroperlerne blev indsamlet efter lysis ved hjælp af en magnet separator. Efter vask af perlerne blev deres bindende proteiner kogt og elueret i en SDS-prøve buffer.
Mængden af proteiner i den bundne og ubundne fraktion blev målt ved hjælp af BCA protein assay kit. Den samme mængde proteiner i de ubundne og bundne fraktioner blev adskilt af SDS-PAGE og plettet af sølvfarvning (figur 4a). Protein bånds mønstrene var næsten de samme for de ubundne og bundne fraktioner, men intensiteten ved 50 og 70 kDa i den bundne fraktion var lavere end i den ubundne fraktion. Men bandet intensitet var ikke klart anderledes mellem de ubundne og bundne fraktioner fremstillet af TLCN-mangelfuld kultur hippocampus neuroner. For at bekræfte rensningen af fagocytiske kopkonstruktioner udførte vi Western blotting ved hjælp af anti-TLCN-C, anti-bovine vitronectin, anti-actin og anti-α-Tubulin (figur 4b). TLCN og VN blev hovedsagelig påvist i den bundne fraktion. Actin, Ezrin, Gαq, PLCβ1, MAP-2 og spectrin blev fundet i både bundne og ubundne fraktioner. Der blev påvist moesin, PSD-95, α-actinin og α-Tubulin i den ubundne fraktion.
Figur 1: lokalisering af TLCN og F-actin i dendritiske filopodia og fagocytiske kopper. A) immunofluorescens farvning af dendritter af et kulturperler hippocampus-Neuron, der udtrykker gapvenus med anti-gfp-antistoffer (blåt i et fusioneret billede), anti-tlcn-antistoffer (rødt i et flettet billede) og phalloidin (grøn i et flettet billede). TLCN og F-actin er overvejende observeret i dendritiske filopodia. (B, C) Dannelse af fagocytiske Cup strukturer på neuronal dendritter. Fluorescerende mikroperler (blå i fusionerede billeder af B, C) tilføjet til dyrkede hippocampus neuroner kraftigt overholde dendritter og inducere akkumulering af TLCN (rød i fusionerede billeder af B, C) og F-actin (grøn i fusionerede billeder af B, C). (D) en lateral visning af en dendritisk Fagocytisk kop rekonstrueret fra konfokale billeder afslører tlcn (rød i fusionerede billeder af d) omkring fluorescerende perle (blå i fusionerede billeder af d). E) et dendritisk Fagocytisk bæger fremkaldt af en magnetisk mikroperle fastgjort på en neuronal dendrit og immun plettet med anti-vn-antistoffer (blåt i fusionerede billeder af e), anti-tlcn-antistoffer (rød i fusionerede billeder af e) og phalloidin (grøn i fusionerede billeder af E). skala stænger = 1 μm i (D); 2 μm i litra A), C) og E) og 20 μm i (B). Dette tal er blevet ændret fra et tidligere studie18. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: TLCN-afhængig dannelse af Fagocytisk Cup-lignende struktur. (A-D) Tredobbelt fluorescensbilleder af vildtype (WT; A, C) og TLCN-mangelfulde (KO; C, D) neuroner behandlet med VN-coatede fluorescerende perler (rød i fusionerede billeder af A, B, C, D) og mærket med anti-TLCN antistoffer (grøn i fusionerede billeder af A, B, C, D) og anti-phospho-ERM antistof (blå i fusionerede billeder af A, B) eller Alexa488-phalloidin (blå billeder af C, D). Skala stænger = 5 μm. Dette tal er blevet ændret fra et tidligere studie15. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: et skematisk diagram, der illustrerer rensningsproceduren for den dendritiske filopodia-rige fraktion. Magnetiske mikroperler blev tilføjet på dyrkede hippocampus neuroner til at inducere dannelsen af dendritiske fagocytiske kopper. Efter 1 dag med inkubation blev neuronerne opløst med lyse buffer indeholdende 0,01% Triton X-100. Perlerne blev adskilt fra den ubundne fraktion ved hjælp af en magnetisk separator. Efter vask eluppes de bundne proteiner med SDS-prøve buffer og anvendes som den bundne fraktion. Rød: VN, grøn: TLCN, andre farver: bundne proteiner. Dette tal er blevet ændret fra et tidligere studie18. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: bekræftelse af Fagocytisk kopfraktion. A) sølvfarvet farvning af proteiner i de ubundne og bundne fraktioner af mikroperlerne. Det samme beløb (50 ng) af proteiner i de ubundne og bundne fraktioner renset fra vildtype (WT) og TLCN-mangelfulde (TLCN KO) hippocampus-neuroner blev adskilt af SDS-PAGE og visualiseret med sølvfarvning. B) Western blot-analyse af de ubundne og bundne fraktioner. Det samme beløb (50 ng) af proteiner blev adskilt af SDS-PAGE og udsat for Western blot-analyse ved hjælp af anti-TLCN, anti-VN, anti-actin, anti-Ezrin, anti-moesin, anti-Gαq, anti-PLCβ1, anti-MAP-2, anti-spectrin, anti-PSD-95, anti-α-actinin, og anti-α-Tubulin-antistoffer. Bemærk, at TLCN, VN, actin, Ezrin, PLCβ1, MAP-2 og spectrin observeres i den dendritiske filopodia-rige fraktion. Dette tal er blevet ændret fra et tidligere studie18. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi udviklede en rensningsmetode for dendritiske filopodia-rige fraktion ved hjælp af affinitet mellem celle adhæsions molekyle TLCN og det ekstracellulære matrix protein vitronectin. Sammenlignet med PSD-fraktion kunne det være muligt at identificere de synaptiske proteiner, der optræder på den umodne synapse fra den dendritiske filopodia-rige fraktion. Bestanddelene i den dendritiske filopodia-rige fraktion adskiller sig således fra dem i PSD-fraktionen med 74%. Forskellig fra PSD fraktion, vi brugte dyrkede hippocampus neuroner til aktivt at danne fagocytiske kopper, og cellerne skal være i live. For at danne den fagocytiske kop, vi brugte samspillet mellem TLCN og vitronectin. TLCN-ekspression er begrænset i telencephalon. Således kan vi ikke bruge kultiverede neuroner afledt af cerebellare. Men hvis vi pels perlerne med forskellige proteiner, denne aktivitet-afhængige rensning metode kunne anvendes til cerebellar neuroner. For eksempel, når N-terminal domæne af glutamat receptor delta2-coated mikroperler anvendes til cerebellar granulet celler, præsynaptisk neurexin og cbln1 blev identificeret fra bindende proteiner. Derfor kan denne aktivitets afhængige metode anvendes, hvis belægnings proteinerne ændres. Da adgangen til vitronectin-coatede mikroperler er begrænset til hjerne skive og hjernevæv, dannes fagocytiske kopper ikke effektivt. Således fremtidens opgaver omfatter udvikling af rensningsmetoden for dendritiske filopodia-rige fraktion fra hjerne skive og væv.
I denne protokol, er lav-density kultur tilstand anvendes til hippocampus neuroner, og væksten af gliaceller celler hæmmes ved tilsætning af ara-C10,20,21. Hippocampus neuroner dyrkes i MEM udarbejdet af os selv, men ikke i neurobasal medium, som er meget udbredt til kulturen i hippocampus neuroner. Hippocampus neuroner ofte dø af 14 DIV når dyrkes på neurobasal medium, hvilket indikerer, at neurobasal medium er ikke egnet til vores lav-density kultur tilstand. Desuden er et vigtigt aspekt af lav-tæthed kultur belægning skålen med poly-L-lysin hydrobromid, som ikke kan erstattes med poly-L-lysin.
For at opnå tilstrækkelig mængde proteiner fra den dendritiske filopodia-rige fraktion er antallet af hippocampale neuroner og magnetiske mikroperler vigtige faktorer. For immunofarvning dendritiske filopodia, hippocampus neuroner blev belagt på en 35 mm skål på 5,6 x × 104 celler/fad, mens neuronerne blev belagt på 7,0 x 104 celler/fad til rensning af dendritiske filopodia-rige fraktion. Ved 14 DIV overlappede næsten ingen hippocampus neuroner ved 5,6 x 104 celler/parabol til immun farvning, mens mange af hippocampale neuroner delvist overlappede med de andre neuroner ved 7,0 x 104 celler/skål til rensning af dendritiske filopodia-rige Brøkdel. Dendritiske filopodia var dog rigeligt til stede ved begge tætheder af hippocampus neuroner. High-density kulturer af hippocampus neuroner ofte modne hurtigere end lav densitet kulturperler hippocampus neuroner; således at justere tætheden af hippocampus neuroner til lav densitet kultur er uundværlig for at opnå dendritiske filopodia-rige fraktion. Mikroperler blev tilsat ved 1 x 106 mikroperler/parabol til immun farvning og ved 3 x 106 mikroperler/skål til rensning af dendritiske filopodia-rige fraktion. Til rensning af fraktionen, når en tilstrækkelig mængde af perler blev tilføjet, blev de ubundne perler skyllet ud fra hippocampus neuroner.
I denne protokol blev mikroperler automatisk belagt med VN, som er til stede i dyrkningsmediet. Men, mikroperler kan være belagt med rekombinant VN og tilsættes til hippocampus neuroner. Fordi VN er en meget klæbrig protein, VN-coated mikroperler let danne aggregater. Således, VN-belagte mikroperler sonikeres og pipetteres at dissociere fra hinanden lige før tilsætning til hippocampus neuroner.
Vi har tidligere vist, at VN-coatede mikroperler inducerer phosphor-ERM, PI (4,5) P2, og F-actin sammen med tlcn akkumulering15. Når den dendritiske filopodia-rige fraktion blev analyseret af Western blotting, fosho-ERM blev ikke påvist ved anti-phospho-ERM polyklonal antistof og blev let opdaget af anti-Ezrin og anti-moesin monoklonale antistoffer. Det fremgår, at følsomheden af de monoklonale antistoffer var højere end anti-phospho-ERM polyklonal antistof. Desuden blev ERM-proteiner lokaliseret til næsten alle regioner i hippocampus-neuronerne, men phospho-ERM-proteiner blev kun lokaliseret til spidsen af dendritiske filopodia og den fagocytiske kop. Det vurderes, at mængden af phospho-ERM-binding til TLCN er begrænset i forhold til mængden af ikke-phosphoryleret ERM. Påvisning af phospho-ERM i den dendritiske filopodia-rige fraktion synes således at være vanskelig.
For at løsne mikroperlerne fra cellemembranen brugte vi et svagt rengøringsmiddel, 0,01% Triton X-100. TLCN er knyttet til actin filament gennem phospho-ERM i dendritiske filopodia og fagocytiske Cup strukturer. For at rense proteiner, der er indirekte forbundet med TLCN gennem actin-glødetråden, brugte vi et svagt rengøringsmiddel i denne protokol. Koncentrationen af Triton X-100 kan dog ændres til en højere koncentration afhængigt af formålet med forsøget.
Esselens et al. har vist, at den fagocytiske optagelse af mikroperler inducerede TLCN, PIP2, og F-actin ophobning i dyrkede hippocampus neuroner17. Ifølge vores analyse via confokal mikroskopi efter 24 h inkubation med mikroperler, var mikroperlerne ikke helt taget op i cytoplasmaet. TLCN og PIP2, som er lokaliseret til cellemembranen, blev lokaliseret omkring perler, især på bunden af mikroperlerne. Desuden blev 319 proteiner identificeret fra den dendritiske filopodia-rige fraktion analyseret ved hjælp af KEGG pathway analyse. Fagocytose og autophagy veje blev ikke påvist, men cytoskelet organisation, exocytose, actin-filament-baserede proces, og microtubule-baserede proces blev væsentligt beriget i brøken18.
Den molekylære mekanisme af dendritiske filopodia dannelse er stadig stort set ukendt. Analyse af den fagocytiske kop struktur kunne hjælpe med at forstå de molekylære bestanddele og dynamiske funktioner af dendritiske filopodia. Det ville være interessant at analysere dendritiske filopodia-rige fraktion fremstillet af musemodeller af neuroudviklingsmæssige og neuropsykiatriske lidelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Shigeo Okabe og Hitomi Matsuno for den lave-density kultur af hippocampus neuroner, Masayoshi Mishina for tlcn-mangelfulde mus, Sachiko Mitsui og Momoko shiozaki for teknisk assistance, og medlemmer af yoshihara laboratorium for nyttige diskussioner . Dette arbejde blev støttet af JSPS KAKENHI Grant NOS. JP20700307, JP22700354 og JP24500392 og MEXT KAKENHI Grant NOS. JP23123525 til YF og JP20022046, JP18H04683 og JP18H05146 til åå.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 1.7 mLl Low Binding MCT | Sorenson BioScience | 39640T | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | 2530149 | |
| 35 mm plastic cell culture dishes | Corning | 430165 | |
| Anti-actin | Sigma-Aldrich | A-5060 | |
| Anti-alpha-Actinin | Sigma-Aldrich | A-5044 | |
| Anti-alpha-tubulin | Sigma-Aldrich | T-9026 | |
| Anti-Ezrin | Sigma-Aldrich | clone3C12, SAB4200806 | |
| Anti-Galphaq | Santacruz | sc-393 | |
| Anti-MAP2 | Chemicon | clone AP20, MAB3418 | |
| Anti-Moesin | Sigma-Aldrich | clone 38/87, M7060 | |
| Anti-PLCbeta1 | Santacuz | sc-5291 | |
| Anti-PSD95 | MA2 | ABR | |
| Anti-Spectrin beta | Chemicon | MAB1622 | |
| B27 | Gibco | 0080085SA | |
| BCA protein assay kit | Thermo | 23227 | |
| Bromophenol blue | Merck | 1.08122.0005 | |
| Calcium chrolide, hydrous | Wako | 038-19735 | |
| Cell scraper | Falcon | 353085 | |
| Cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Choline chloride | Sigma-Aldrich | C7527 | |
| Complete EDTA free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Cytosine beta-D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich | C-6645 | |
| DNase-I | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma-Aldrich | P5155 | |
| DynaMag-2 Magnet | Thermo | 12321D | |
| ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE | RPN2232 | |
| e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gradient gel | ATTO | E-T520L | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
| HBSS | Gibco | 14175095 | |
| HRP-conjugated anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | |
| i-Inositol | Sigma-Aldrich | I7508 | |
| LAS-1000 mini | Fuji Film | LAS-1000 mini | For detection of luminescence from WB membrane |
| Magnetic polystyrene microbeads | Sperotech | PM-20-10 | |
| MEM amino acid solution | Gibco | 11130-051 | 30 mM L-Arginine hydrochloride, 5 mM L-Cystine, 10 mM L-Histidine hydrochloride-H2O, 20 mM L-Isoleucine, 20 mM L-Leucine, 19.8 mM L-Lysine hydrochloride, 5.1 mM L-Methionine, 10 mM L-Phenylalanine, 20 mM L-Threonine, 2.5 mM L-Tryptophan, 10 mM L-Tyrosine, and 20 mM L-Valine |
| Mini-slab size electrophoresis system | ATTO | AE-6530 | |
| Niacinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Penicilin / Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail | Roche | 4906845001 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Nacali | 28360-14 | |
| Pyridoxal HCl | Sigma-Aldrich | P6155 | |
| Riboflavin | Sigma-Aldrich | R9504 | |
| Silver Stain 2 Kit wako | Wako | 291-5031 | |
| Thiamine HCl | Sigma-Aldrich | T1270 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-rad | 1703940JA | |
| Ultra pure water | MilliQ | For production of ultra pure water |
References
- Fiala, J. C., Feinberg, M., Popov, V., Harris, K. M. Synaptogenesis via dendritic filopodia in developing hippocampal area CA1. Journal of Neuroscience. 18 (21), 8900-8911 (1998).
- Portera-Cailliau, C., Pan, D. T., Yuste, R. Activity-regulated dynamic behavior of early dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia. Journal of Neuroscience. 23 (18), 7129-7142 (2003).
- Ziv, N. E., Smith, S. J. Evidence for a role of dendritic filopodia in synaptogenesis and spine formation. Neuron. 17 (1), 91-102 (1996).
- Lohmann, C., Bonhoeffer, T. A role for local calcium signaling in rapid synaptic partner selection by dendritic filopodia. Neuron. 59 (2), 253-260 (2008).
- Yoshihara, Y., De Roo, M., Muller, D. Dendritic spine formation and stabilization. Current Opinion in Neurobiology. 19 (2), 146-153 (2009).
- Bayes, A., et al. Comparative study of human and mouse postsynaptic proteomes finds high compositional conservation and abundance differences for key synaptic proteins. PLoS One. 7 (10), e46683 (2012).
- Bayes, A., et al. Characterization of the proteome, diseases and evolution of the human postsynaptic density. Nature Neuroscience. 14 (1), 19-21 (2011).
- Furutani, Y., et al. Interaction between telencephalin and ERM family proteins mediates dendritic filopodia formation. Journal of Neuroscience. 27 (33), 8866-8876 (2007).
- Mao, Y. T., et al. Filopodia Conduct Target Selection in Cortical Neurons Using Differences in Signal Kinetics of a Single Kinase. Neuron. 98 (4), 767-782 (2018).
- Matsuno, H., et al. Telencephalin slows spine maturation. Journal of Neuroscience. 26 (6), 1776-1786 (2006).
- Raemaekers, T., et al. ARF6-mediated endosomal transport of Telencephalin affects dendritic filopodia-to-spine maturation. The EMBO Journal. 31 (15), 3252-3269 (2012).
- Mori, K., Fujita, S. C., Watanabe, Y., Obata, K., Hayaishi, O. Telencephalon-specific antigen identified by monoclonal antibody. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (11), 3921-3925 (1987).
- Yoshihara, Y., Mori, K. Telencephalin: a neuronal area code molecule? Neuroscience Research. 21 (2), 119-124 (1994).
- Annaert, W. G., et al. Interaction with telencephalin and the amyloid precursor protein predicts a ring structure for presenilins. Neuron. 32 (4), 579-589 (2001).
- Furutani, Y., et al. Vitronectin induces phosphorylation of ezrin/radixin/moesin actin-binding proteins through binding to its novel neuronal receptor telencephalin. Journal of Biological Chemistry. 287 (46), 39041-39049 (2012).
- Nyman-Huttunen, H., Tian, L., Ning, L., Gahmberg, C. G. alpha-Actinin-dependent cytoskeletal anchorage is important for ICAM-5-mediated neuritic outgrowth. Journal of Cell Biology. 119 (Pt 15), 3057-3066 (2006).
- Esselens, C., et al. Presenilin 1 mediates the turnover of telencephalin in hippocampal neurons via an autophagic degradative pathway. Journal of Cell Biology. 166 (7), 1041-1054 (2004).
- Furutani, Y., Yoshihara, Y. Proteomic Analysis of Dendritic Filopodia-Rich Fraction Isolated by Telencephalin and Vitronectin Interaction. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 10, 27 (2018).
- Lu, Z., Piechowicz, M., Qiu, S. A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture. Journal of Visualized Experiments. (109), (2016).
- Okabe, S., Miwa, A., Okado, H. Alternative splicing of the C-terminal domain regulates cell surface expression of the NMDA receptor NR1 subunit. The Journal of Neuroscience. 19 (18), 7781-7792 (1999).
- Okabe, S., Vicario-Abejon, C., Segal, M., McKay, R. D. Survival and synaptogenesis of hippocampal neurons without NMDA receptor function in culture. European Journal of Neuroscience. 10 (6), 2192-2198 (1998).
