Summary
在此协议中,我们介绍了一种利用树突状纤维蛋白之间特定且强烈的亲和力,从培养的海马神经元上的方皮杯状突起结构中纯化树突状纤维素的富足部分的方法。粘附分子,TLCN,和细胞外基质分子,体外内丁。
Abstract
丹德林丝洛波迪亚是薄和长突起基于作用素灯丝,他们延伸和缩回,仿佛寻找目标斧突。当树突状纤维化与目标斧突建立接触时,它们开始成熟成脊柱,导致突触的形成。端脑素 (TLCN) 在树突状纤维化中大量局部化,并逐渐被排除在脊柱之外。在培养的海马神经元中TLCN的过度表达诱导树突状的纤维化形成。我们表明,端脑蛋白与细胞外基质分子,体外核酸强结合。Vitronectin涂层微珠诱导神经元树突形成方位细胞杯。在方细胞杯中,TLCN、TLCN结合蛋白,如磷酸化Ezrin/Radixin/Moesin(磷-ERM)和F-actin被积累,这表明方位细胞杯的成分与树突状西多迪亚的成分相似。因此,我们开发了一种净化方丹花杯的方法,而不是树突状的纤维化。磁聚苯乙烯珠被涂覆体内蛋白,在海马神经元的培养基中大量存在,诱导神经元树突形成方位体。孵育24小时后,用洗涤剂温和溶解咽喉杯,并用磁铁分离器收集。洗涤珠子后,通过银染色和西方印迹对结合蛋白进行洗脱和分析。在结合部分中,TLCN和actin大量存在。此外,从该分数中识别的许多蛋白质被局部化为树突状纤维化;因此,我们命名结合分数作为树突状的菲洛波迪亚丰富的分数。本文介绍了树突状纤维素富分馏的纯化方法。
Introduction
丹德炎纤维素被认为是脊柱的前体。在树突状纤维中的Actin细丝调节其延伸和缩回1,2,3。与斧子接触后,选定的树突状纤维开始成熟到脊柱,并形成突触形成4,5。脊柱的成分是由对鼻后密度分数6、7的综合分析确定的,而树突状纤维素的成分在很大程度上仍不为人所知。已经表明,端脑素(TLCN),ERM,SynGAP,Ras,PI3激酶,阿克特,mTOR,马球状激酶2,CaMKII,Syndecan-2,帕拉lemin-1,ARF6和EphB调节树突状纤维素形成5,8,9 ,10,11,虽然尚未开发一种方法,用于综合分析存在于树突状的纤维素中的分子。
TLCN(ICAM-5)是由最神经部分的尖刺神经元,即端脑12中专门表达的。TLCN在其细胞外区域有9个类似Ig的域,一个跨膜区域,一个细胞质尾13。TLCN与其细胞外区域的体外核酸素(VN)和LFA-1一元结结合,在其跨膜区域与前塞尼林结合,在其细胞质区5、8、14、15中与磷-ERM和β-actinin结合 ,16.TLCN通过磷-ERM结合到脊柱和树突状轴8、16的树突状纤维素和β-actinin的尖端。
研究表明,TLCN的过度表达增强了树突状纤维化的形成,并诱导脊柱回归到纤维化10。与TLCN细胞质区结合的ezrin的构成活性形式,增强树突状纤维化形成8。因此,TLCN通过行动素结合蛋白调节树突状纤维化形成。埃塞伦斯等人证明,微珠诱导TLCN在培养神经元上积累17。研究表明,在VN涂层微珠周围的神经元树突上形成方状的杯子结构以TLCN依赖性的方式形成15。树突状纤维素的成分与咽喉杯的成分相似。收集树突状纤维素是很困难的,但使用磁性微珠收集方位细胞杯相对容易。因此,我们开发了一种净化方丹石杯的方法,而不是树突状的纤维化18。在这里,我们描述了树突状富足部分的纯化方法。
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Protocol
这里描述的所有方法都已获得RIKEN Wako机构动物护理和使用委员会的批准。
1. 希马坎帕神经元文化
- 培养媒介的准备
- 制备200x维生素混合物。使用磁性搅拌器在500 mL的超纯水中溶解100毫克D-泛酸血酸、100毫克氯丁酸、100毫克叶酸、180毫克i-ininitol、100mg烟酰胺、100毫克皮里多什HCl和100毫克二胺HCl。溶液未完全溶解。小心地混合,在50 mL管中等分,储存在-20°C。
- 制备核黄素溶液。使用磁搅拌器将100毫克核黄素溶解在500mL的超纯水中。溶液未完全溶解。小心地混合,在50 mL管中等分,储存在-20°C。
- 准备 1 M CaCl2.使用磁力搅拌器将 7.35 g 的 CaCl2±2H2O 溶解在 50 mL 的超纯水中。
- 编制最低基本介质 (MEM)。使用磁力搅拌器在 950 mL 的超纯水中溶解 400 mg KCl、6800 mg NaHCO3、158 mg NaH 2 PO4+2H2O、7000 mg D-葡萄糖和 200 mgSO4-7H2O。
- 使用 1 mL 移液器,在磁力搅拌器上持续搅拌,以滴滴方式将 1.8 mL 的 1 M CaCl2滴到 MEM。使用 1 摩尔/L HCl 将 MEM 的 pH 调整为 pH 7.25。
- 在MEM中加入5 mL的200x维生素混合物和200μL的核黄素溶液。使用超纯水将溶液的体积调节到 1,000 mL。使用 0.22 μm 过滤系统过滤溶液并将其存储在 4°C。
- 准备 10x DNase-I 库存解决方案。将100毫克DNase-I溶解在汉克斯平衡盐溶液(HBSS)的12.5 mL中,通过0.22 μm过滤器过滤,在1.5 mL管中等分,并将管储存在-20°C。
- 制备细胞氨酸β-D-阿拉伯诺拉诺赛德(Ara-C)库存溶液。在8.93 mL的超纯水中溶解25毫克的Ara-C(最终浓度为10 mM),通过0.22 μm过滤器过滤,在1.5 mL管中等分,储存在-20°C
- 制备电镀介质。在 50 mL 管中混合 1 mL 的 MEM 氨基酸溶液、750 μL 的 1 M HEPES、1 mL B27、125 μL 200 mM 谷氨酰胺、250 μL 青霉素/链霉素、2.5 mL 的胎儿牛血清 (FBS) 和 44.375 mM L。
- 准备停止介质。在 50 mL 管中混合 1 mL 的 MEM 氨基酸溶液、750 μL 的 1 M HEPES、5 mL FBS(最终 10%)和 43.25 mL MEM。
- 多L-莱辛涂层餐具的制备
- 在25°C下涂上0.2毫克/mL的聚L-莱辛氢溴化物35毫米塑料细胞培养皿1天。
注:不应使用聚L-莱辛代替聚L-莱辛氢溴。 - 用2 mL的超纯水洗碗3次。在25°C下用1.5 mL的停止介质孵育菜肴,直到使用。
- 在25°C下涂上0.2毫克/mL的聚L-莱辛氢溴化物35毫米塑料细胞培养皿1天。
- 从小鼠胚胎中解剖海马神经元
- 海马神经元的组织来源。根据Lu等人19号的方法,在胚胎日16-17日从野生型和TLCN缺乏的C57BL6/J小鼠中分离海马。
- 在含有15 mM HEPES的HBSS中孵育解剖海马,在HBSS中分0.25%胰马素和1x DNaseI,pH 7.2在37°C时15分钟,每3分钟搅拌一次。在10 mL的停止培养基孵育海马,在4°C下灭活胰蛋白酶5分钟。
- 将海马移入10mL的新鲜停止介质中,在4°C下孵育5分钟。将海马移入10mL的新鲜停止介质中,在4°C下孵育5分钟。将海马移入900μL的停止介质和100μL的10xDNaseImL 管。使用1mL移液移液20次,将海马分离成分离的神经元。
注:在海马分离过程中,1 mL 移液器的尖端稍微接触 15 mL 管的底部。 - 加入9 mL的电镀介质,并通过70μm的细胞滤网过滤到50 mL管中。使用血细胞计计算细胞数量,并在电镀培养基中调整到 3.5 x 104细胞/mL。
- 从多-L-莱辛涂层餐具中吸气停止介质。将细胞盘在聚L-Lysin-涂层的盘子上,在7 x 104细胞/碟(2 mL/碟)上。
- 在37°C下在5%CO2下孵育60-64小时后,向神经元加入2μL的Ara-C库存溶液(最终10μM),然后慢慢摇动盘子。将培养皿放在加湿盒中,在 37°C 下不改变 5% CO2以下的培养基。
2. 纯化富含歧丹的菲洛波迪亚分数
- 体外13天后(DIV),将磁性聚苯乙烯微珠(3 x 106颗粒/盘)加入含有培养神经元的20个菜肴中。1天后,用搅拌3次洗涤1mL的PBS神经元,以去除中度和未结合的微珠。去除PBS后,用500μL/碟的解液缓冲液(PBS含有0.01%Triton X-100、EDTA无蛋白酶抑制剂鸡尾酒和磷酸酶抑制剂鸡尾酒)对神经元进行解毒。
- 用细胞刮刀收集莱沙,并将莱酸移动到低蛋白结合微管(10管)。将管子放在磁铁分离器上,等待1分钟。收集上清液,并将其用作银染色和西印迹分析的未绑定分数。
- 将珠子转移到新的低蛋白结合微管中,设置在磁性分离器上,并完全去除上清液。加入500 μL的莱沙缓冲液,使用涡旋混合器清洗珠子15秒。将管子放在磁铁分离器上,等待1分钟,取出上清液,并加入500μL的液变缓冲液。重复洗涤珠子10次,并去除上清液。
- 通过添加 50 μL 的 1x SDS 样品缓冲液(62.5 mM Tris HCl、pH 6.8、2.5% SDS 和 10% 甘油)与珠子(结合分数)结合的电离蛋白,并在 98°C 下将管沸腾 5 分钟。将管在 860 x g下离心 10 秒,并设置管在磁性分离器上1分钟。收集上清液并将其用作约束分数。
注:可以在此处暂停该协议。 - 通过 BCA 蛋白质测定测量未结合和结合分数的蛋白质浓度。可视化具有溴酚蓝色的蛋白质溶液,并将浓度调整为 5 纳克/μL,用于 SDS-PAGE。
3. 银染色和西斑分析
- 使用 5-20% 梯度凝胶将 SDS-PAGE 分离成界和未绑定分数 (50 ng)。银染色凝胶。
- 西部斑点使用抗TLCN-C(1/3,000)、抗牛体素(1/5,000)、抗活性素(1/1,000)和抗β-图布林(1/1,000)作为原发抗体和HRP偶联山羊抗兔IgG(1/5,000)作为二级抗体。使用化学发光西方印迹检测试剂和化学发光成像仪可视化抗原。
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Representative Results
在培养的海马神经元中,TLCN被大量地本地化为树突状的纤维化、轴和索马,并与F-actin共同本地化(图1A,B)。当聚苯乙烯微珠被添加到培养的海马神经元中时,珠子被自动涂覆从培养基中的胎儿牛血清(FBS)中提取的体外内蛋白(VN);它们主要与树突结合,它们诱导了方位细胞杯的形成(图1B-E)。噬菌体杯基于树突上微珠周围的薄片状蛋白细丝。TLCN、磷-ERM和PI(4,5)P2是树突状纤维化的标记物,在珠子周围高度累积(图1D)8、15。噬菌体杯只形成野生型海马神经元,而不是TLCN缺乏海马神经元(图2A-D)。因此,方位细胞杯的形成关键取决于树突中TLCN的存在。
树突状纤维素的成分与咽喉的成分相似。接下来,我们纯化了噬菌体杯,而不是树突状的菲洛波迪亚。用于净化咽喉的杯子的协议如图3所示。在野生培养的海马神经元中加入磁性微珠,诱导方形成方体杯结构。噬菌体杯结构用弱洗涤剂解液。微珠是在利用磁体分离器进行分酶后收集的。洗涤珠子后,在SDS样品缓冲液中煮沸并洗脱其结合蛋白。
使用BCA蛋白测定试剂盒测量结合和未结合分数中的蛋白质量。未结合和结合分数中相同数量的蛋白质被SDS-PAGE分离,并被银染色染色(图4A)。未绑定和绑定分数的蛋白质带模式几乎相同,但绑定分数中 50 和 70 kDa 的强度低于未绑定分数中的强度。然而,从TLCN缺乏培养海马神经元制备的无约束和结合分数之间的带强度没有明显差异。为了确认方圆杯结构的纯化,我们使用抗TLCN-C、抗牛体素、抗活性素和抗β-图布林(图4B)进行西印。TLCN和VN主要在结合分数中检测到。在绑定和未绑定分数中检测到Actin、ezrin、G_q、PLC+1、MAP-2和光谱。在未结合的分数中检测到莫辛、PSD-95、β-肌蛋白和β-图布林。
图1:在树突状纤维素和方位细胞杯中定位TLCN和F-actin。(A) 培养的海马神经元的树突的免疫荧光染色,用抗GFP抗体表达间隙维纳斯(合并图像中的蓝色)、抗TLCN抗体(合并图像中的红色)和phalloidin(合并图像中的绿色)。TLCN和F-actin在树突状纤维素中大量观察到。(B, C)在神经元树突上形成方位细胞杯结构。荧光微珠(在B、C合并图像中的蓝色)添加到培养的海马神经元中,强烈附着在树突上,并诱导TLCN的积累(在B、C合并图像中的红色)和F-actin(B、C合并图像中的绿色)。(D) 从共聚焦图像重建的树突状方位石状咽喉杯的横向视图显示荧光珠周围的 TLCN(D 合并图像中的红色)(D 合并图像中的蓝色)。(E) 由附着在神经元树突上的磁性微珠诱导的树突状噬菌体杯,免疫中沾染了抗VN抗体(E合并图像中的蓝色)、抗TLCN抗体(E合并图像中的红色)和phalloidin(合并图像中的绿色)E. 刻度条 = 1 μm (D);2 μm in(A)、(C)和(E);和 20 μm (B)。这个数字是从先前的研究18中修改的。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:方阵杯状结构的TLCN依赖性形成。(A-D)野生型三重荧光图像(WT;A、C)和TLCN缺乏(KO;C、D)用VN涂层荧光珠(A、B、C、D合并图像中的红色)处理并贴上抗TLCN抗体(A、B、C、D合并图像中的绿色)和抗磷-ERM抗体(A、B合并图像中的蓝色)或Alexa488-phalloidin(合并中的蓝色)处理的神经元C、D)的图像)。刻度条 = 5 μm。这个数字是从先前的研究15中修改的。请点击此处查看此图的较大版本。
图3:图解图,说明富含树突的纤维素的纯化过程。磁性微珠被添加到培养的海马神经元中,以诱导树突状的噬菌体杯的形成。孵育1天后,用含有0.01%Triton X-100的溶解液缓冲液溶解神经元。使用磁性分离器将珠子与未绑定分数分离。洗涤后,结合蛋白用SDS样品缓冲液洗脱,并用作结合分数。红色:VN,绿色:TLCN,其他颜色:结合蛋白。这个数字是从先前的研究18中修改的。请点击此处查看此图的较大版本。
图4:方位杯分数的确认。(A) 微珠未结合和结合部分的蛋白质的银染色。从野生型 (WT) 和 TLCN 缺陷 (TLCN KO) 的海马神经元中纯化的无结合和结合部分中的蛋白质量相同(50 ng),由SDS-PAGE分离,并用银染色进行可视化。(B) 未绑定和绑定分数的西方污点分析。相同量(50 ng)的蛋白质被SDS-PAGE分离,并使用抗TLCN、抗VN、抗肌酸、抗电子素、抗霉素、抗G_q、抗PLC_1、抗MAP-2、抗光谱、抗PSD-95、抗β-actin和抗β-图布林抗体。请注意,在富含树突的纤维素馏分中观察到TLCN、VN、actin、ezrin、PLC+1、MAP-2和光谱。这个数字是从先前的研究18中修改的。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
利用细胞粘附分子TLCN与细胞外基质蛋白体外核酸之间的亲和力,开发了一种树突状纤维素富度分体的纯化方法。与PSD分数相比,有可能从富含树突子的丝虫片段中识别作用于未成熟突触的突触蛋白。因此,富含树突的纤维素的成分与PSD分数的成分相差74%。与PSD分数不同,我们使用培养的海马神经元主动形成噬菌体杯,细胞需要存活。为了形成方位细胞杯,我们使用了TLCN和体外核子细胞之间的相互作用。TLCN表达在端脑中是有限的。因此,我们不能使用从小脑派生的培养神经元。然而,如果我们用不同的蛋白质涂覆珠子,这种活性依赖性纯化方法可以应用于小脑神经元。例如,当谷氨酸受体Delta2涂层微珠的N端域应用于小脑颗粒细胞时,从结合蛋白中识别前突触内酰氨基辛和cbln1。因此,如果涂层蛋白发生变化,可以使用这种活动相关方法。由于体外内膜涂层微珠的进入仅限于脑切片和脑组织,因此噬菌体杯的形成效率不高。因此,今后的任务包括开发从脑切片和组织中富含树突状纤维素的成分的纯化方法。
在此协议中,低密度培养条件用于海马神经元,胶质细胞的生长通过添加Ara-C10,20,21来抑制。海马神经元由我们自己制备的MEM培养,但不是在神经基介质中培养的,后者广泛用于海马神经元的培养。在神经基培养基培养中培养时,希马神经元通常死亡14 DIV,这表明神经巴介质不适合我们的低密度培养条件。此外,低密度培养的一个重要方面是给盘子涂上多L-莱辛氢溴,不能用多L-莱辛取代。
为了从富含树突的纤维素中获得足够的蛋白质,海马神经元和磁性微珠的数量是重要的因素。对于免疫染色树突状纤维素,海马神经元在35毫米盘上被镀在5.6 x× 104细胞/盘上,而神经元在7.0 x 104细胞/盘上被镀,以纯化富含树突的纤维素状部分。在14 DIV,几乎没有海马神经元重叠在5.6 x 104细胞/碟免疫染色,而许多海马神经元部分重叠与其他神经元在7.0 x 104细胞/盘纯化树突状的细皮多产分数。然而,树突状的纤维化在海马神经元的两个密度中都大量存在。海马神经元的高密度培养物通常比低密度培养的海马神经元成熟得更快;因此,调整海马神经元的密度到低密度培养是获得树突状的菲洛波迪亚丰富的部分所不可缺少的。在1 x 106微珠/碟上加入微珠用于免疫染色,在3 x 106微珠/盘上加入微珠,用于纯化富含树突的纤维素部分。为了纯化该分数,一旦加入足够的珠子,未绑定的珠子就会从海马神经元中洗掉。
在此协议中,微珠被自动涂覆在培养基中存在的VN。然而,微珠可以涂上重组的VN,并添加到海马神经元。由于VN是一种非常粘的蛋白质,VN涂层的微珠很容易形成聚合体。因此,VN涂层微珠在海马神经元之前被声波和移液,彼此分离。
目 前我们的研究表明,VN涂层微珠诱导磷-ERM、PI(4,5)P2和F-actin与TLCN积累15。当西方印迹分析树突状纤维素富度分时,磷磷-ERM未被抗磷-ERM多克隆抗体检测,而通过抗ezrin和抗莫辛单克隆抗体略微检测。单克隆抗体的灵敏度高于抗磷-ERM多克隆抗体。此外,ERM蛋白被本地化到海马神经元的几乎所有区域,但磷-ERM蛋白仅局部化到树突状纤维素和方状杯的尖端。认为与TLCN结合的磷-ERM与非磷酸化ERM的量相比是有限的。因此,在富含树突的纤维素部分中检测磷-ERM似乎很困难。
为了从细胞膜中分离微珠,我们使用弱洗涤剂,0.01%Triton X-100。TLCN通过树突状纤维素和方状杯结构中的磷-ERM与作用灯丝相连。为了通过作用蛋白灯丝来纯化与TLCN间接连接的蛋白质,我们在此协议中使用了弱洗涤剂。然而,Triton X-100的浓度可以改变为更高的浓度,这取决于实验的目的。
埃塞伦斯等人已经表明,微珠的方位吸附诱导TLCN、PIP2和F-actin在培养的海马神经元中积累17。根据我们通过共聚焦显微镜分析,在用微珠孵育24小时后,微珠没有完全进入细胞质。TLCN和PIP2,这是局部的细胞膜,被本地化围绕珠子,特别是在微珠的底部。此外,使用KEGG通路分析,对从富含树突的纤维素部分中鉴定的319种蛋白质进行了分析。未检测到噬菌体和自噬通路,但细胞骨架组织、外泄、基于肌酸丝的过程和基于微管的过程在18部分中显著富集。
树突状纤维素形成的分子机制在很大程度上仍不为人所知。对方节杯结构的分析有助于了解树突状纤维化的分子成分和动态功能。分析从神经发育和神经精神病的小鼠模型制备的树突状纤维丰富部分会很有趣。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢小冈和松野幸男为海马神经元的低密度培养,Masayoshi Mishina为TLCN缺乏小鼠,三井三子和MomokoShiozaki的技术援助,以及Yoshihara实验室的成员进行有益的讨论.这项工作得到了JSPS KAKENHI格兰特Nos的支持。JP20700307、JP22700354 和 JP24500392 和 MEXT KAKENHI 授予号。JP23123525 到 YF 和 JP20022046、JP18H04683 和 JP18H05146 到 YY。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 1.7 mLl Low Binding MCT | Sorenson BioScience | 39640T | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | 2530149 | |
| 35 mm plastic cell culture dishes | Corning | 430165 | |
| Anti-actin | Sigma-Aldrich | A-5060 | |
| Anti-alpha-Actinin | Sigma-Aldrich | A-5044 | |
| Anti-alpha-tubulin | Sigma-Aldrich | T-9026 | |
| Anti-Ezrin | Sigma-Aldrich | clone3C12, SAB4200806 | |
| Anti-Galphaq | Santacruz | sc-393 | |
| Anti-MAP2 | Chemicon | clone AP20, MAB3418 | |
| Anti-Moesin | Sigma-Aldrich | clone 38/87, M7060 | |
| Anti-PLCbeta1 | Santacuz | sc-5291 | |
| Anti-PSD95 | MA2 | ABR | |
| Anti-Spectrin beta | Chemicon | MAB1622 | |
| B27 | Gibco | 0080085SA | |
| BCA protein assay kit | Thermo | 23227 | |
| Bromophenol blue | Merck | 1.08122.0005 | |
| Calcium chrolide, hydrous | Wako | 038-19735 | |
| Cell scraper | Falcon | 353085 | |
| Cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Choline chloride | Sigma-Aldrich | C7527 | |
| Complete EDTA free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Cytosine beta-D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich | C-6645 | |
| DNase-I | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma-Aldrich | P5155 | |
| DynaMag-2 Magnet | Thermo | 12321D | |
| ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE | RPN2232 | |
| e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gradient gel | ATTO | E-T520L | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
| HBSS | Gibco | 14175095 | |
| HRP-conjugated anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | |
| i-Inositol | Sigma-Aldrich | I7508 | |
| LAS-1000 mini | Fuji Film | LAS-1000 mini | For detection of luminescence from WB membrane |
| Magnetic polystyrene microbeads | Sperotech | PM-20-10 | |
| MEM amino acid solution | Gibco | 11130-051 | 30 mM L-Arginine hydrochloride, 5 mM L-Cystine, 10 mM L-Histidine hydrochloride-H2O, 20 mM L-Isoleucine, 20 mM L-Leucine, 19.8 mM L-Lysine hydrochloride, 5.1 mM L-Methionine, 10 mM L-Phenylalanine, 20 mM L-Threonine, 2.5 mM L-Tryptophan, 10 mM L-Tyrosine, and 20 mM L-Valine |
| Mini-slab size electrophoresis system | ATTO | AE-6530 | |
| Niacinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Penicilin / Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail | Roche | 4906845001 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Nacali | 28360-14 | |
| Pyridoxal HCl | Sigma-Aldrich | P6155 | |
| Riboflavin | Sigma-Aldrich | R9504 | |
| Silver Stain 2 Kit wako | Wako | 291-5031 | |
| Thiamine HCl | Sigma-Aldrich | T1270 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-rad | 1703940JA | |
| Ultra pure water | MilliQ | For production of ultra pure water |
References
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