Summary
In dit protocol introduceren we een methode voor het zuiveren van de dendritische filopodia-rijke Fractie van de phagocytische beker-achtige uitsteeksel structuur op gekweekte hippocampal neuronen door gebruik te maken van de specifieke en sterke affiniteit tussen een dendritische filopodial adhesie molecuul, TLCN, en een extracellulaire matrix molecuul, vitronectine.
Abstract
Dendritische filopodia zijn dunne en lange uitsteeksels op basis van de actine filament, en ze verlengen en intrekken alsof ze zoeken naar een doel-axon. Wanneer de dendritische filopodia contact leggen met een doel-axon, beginnen ze te rijpen in stekels, wat leidt tot de vorming van een synaps. Telencephalin (TLCN) is overvloedig gelokaliseerd in dendritische filopodia en wordt geleidelijk uitgesloten van stekels. Overexpressie van TLCN in gekweekte hippocampal neuronen induceert dendritische filopodia vorming. We toonden aan dat telencephalin sterk bindt aan een extracellulair matrix molecuul, vitronectine. Vitronectin-gecoate microbeads geïnduceerde fagocytische beker vorming op neuronale dendrieten. In de fagocytische beker worden TLCN, TLCN-bindende eiwitten zoals gefosforyleerd Ezrin/Radixin/Moesin (phospho-ERM) en F-actin verzameld, wat suggereert dat componenten van de phagocytische beker vergelijkbaar zijn met die van dendritische filopodia. Zo ontwikkelden we een methode voor het zuiveren van de fagocytische beker in plaats van dendritische filopodia. Magnetische polystyreen kralen werden bekleed met vitronectine, die overvloedig aanwezig is in het cultuurmedium van hippocampal neuronen en die fagocytische beker vorming op neuronale dendrieten induceert. Na 24 uur incubatie werden de fagocytische bekers mild gesolubiliseerd met wasmiddel en verzameld met behulp van een Magneet separator. Na het wassen van de kralen werden de bindende eiwitten geeluteerd en geanalyseerd door zilver kleuring en Western blotting. In de bindende fractie waren TLCN en actine overvloedig aanwezig. Bovendien werden veel eiwitten die uit de Fractie werden geïdentificeerd, gelokaliseerd in de dendritische filopodia; zo noemden we de bindende fractie als de dendritische filopodia-rijke Fractie. Dit artikel beschrijft de details met betrekking tot de zuiveringsmethode voor de dendritische filopodia-Rich Fractie.
Introduction
Dendritische filopodia wordt beschouwd als voorlopers van stekels. Actin filamenten in de dendritische filopodia reguleren hun verlenging en terugtrekking1,2,3. Na contact met een axon beginnen geselecteerde dendritische filopodia hun rijping in stekels en wordt een synaps gevormd op4,5. Componenten van stekels zijn vastgesteld aan de hand van een uitgebreide analyse van postsynaptische dichtheids fracties6,7, terwijl de componenten van dendritische filopodia grotendeels onbekend blijven. Het is aangetoond dat telencephalin (tlcn), ERM, syngap, ras, PI3 kinase, Akt, mtor, Polo-achtige kinase 2, camkii, syndecan-2, paralemin-1, ARF6, en ephb reguleren dendritische filopodia vorming5,8,9 ,10,11, terwijl een methode niet is ontwikkeld voor de uitgebreide analyse van moleculen die in de dendritische filopodia aanwezig zijn.
Tlcn (ICAM-5) wordt specifiek uitgedrukt door stekelige neuronen in het meest rostrale migratoire hersen segment, de telencephalon12. TLCN heeft 9 Ig-achtige domeinen in de extracellulaire regio, een transmembraan regio, en een cytoplasmische staart13. Tlcn bindt aan vitronectine (VN) en LFA-1 integrine in zijn extracellulaire regio, aan presenilin in zijn transmembraan regio, en aan fosho-ERM en α-actinine in de cytoplasmische regio5,8,14,15 ,16. Tlcn bindt aan de actine cytoskelet via fosho-ERM op de uiteinden van dendritische filopodia en α-actinine in stekels en dendritische assen8,16.
We toonden aan dat overexpressie van tlcn verbeterde dendritische filopodia-formatie en de reversie van stekels veroorzaakte tot filopodia10. De constitutieve actieve vorm van Ezrin gebonden aan de TLCN cytoplasmatische regio en verbeterde dendritische filopodia formatie8. Zo reguleert TLCN de vorming van dendritische filopodia door middel van actin-bindende eiwitten. Esselens et al. heeft aangetoond dat microbeads de accumulatie van TLCN op gekweekte neuronen17induceerde. We toonden aan dat de fagocytische beker structuren werden gevormd op neuronale dendrites rond VN-gecoate microbeads in een TLCN-afhankelijke manier15. Bestanddelen van dendritische filopodia lijken op die van de phagocytische beker. Het is moeilijk om dendritische filopodia te verzamelen, maar het is relatief gemakkelijker om de phagocytische beker te verzamelen met behulp van magnetische microbeads. Zo ontwikkelden we een methode om de fagocytische beker te zuiveren in plaats van dendritische filopodia18. Hier beschrijven we de zuiveringsmethode voor de dendritische filopodia-rijke Fractie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité van RIKEN WAKO.
1. cultuur van Hippocampal neuronen
- Bereiding van kweekmedium
- Bereiding van 200x vitamine mengsel. Los 100 mg van D-Pantotheenzuur hemicalcium zout, 100 mg choline chloride, 100 mg foliumzuur, 180 mg i-inositol, 100 mg niacinamide, 100 mg pyridoxal HCl, en 100 mg thiamine HCl in 500 mL ultrapuur water met behulp van een magnetische roerder. De oplossing is niet volledig opgelost. Voorzichtig mengen, ALIQUOT in 50 mL tubes en bewaren bij-20 °C.
- Bereiding van riboflavine oplossing. Los 100 mg riboflavine op in 500 mL ultrapuur water met behulp van een magnetische roerder. De oplossing is niet volledig opgelost. Voorzichtig mengen, ALIQUOT in 50 mL tubes en bewaren bij-20 °C.
- Bereiding van 1 M CaCl2. Los 7,35 g CaCl2· 2H2O op in 50 ml ultrapuur water met behulp van een magneetroerder.
- Voorbereiding van het minimale essentiële medium (MEM). Los 400 mg KCl op, 6800 mg NaCl, 2.200 mg NaHCO3, 158 mg Nah2po4· 2H2O, 7000 mg D-glucose, en 200 mg MgSO4-7h2O in 950 ml ultrapuur water met behulp van een magnetische roerder.
- Ticaat 1,8 mL van 1 M CaCl2 op de mem in een druppel-voor-druppel manier met een pipet van 1 ml met een constante opwinding op een magneetroerder. Stel de pH van de MEM in op pH 7,25 met 1 mol/L HCl.
- Voeg 5 mL 200x vitamine mengsel en 200 μL riboflavine oplossing toe aan de MEM. Stel het volume van de oplossing in op 1.000 mL met ultrapuur water. Filter de oplossing met een 0,22 μm filtersysteem en bewaar deze op 4 °C.
- Voorbereiding van 10x DNase-I stockoplossingen. Los 100 mg DNase-I op in 12,5 mL van de uitgebalanceerde zoutoplossing van Hanks (HBSS), filtreer door een 0,22 μm filter, ALIQUOT in 1,5 mL buisjes en bewaar de buisjes bij-20 °C.
- Bereiding van Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) stockoplossing. Los 25 mg Ara-C op in 8,93 mL ultrapuur water (eindconcentratie van 10 mM), filtreer door een 0,22 μm filter, ALIQUOT in 1,5 mL buizen en bewaar bij-20 °C
- Bereiding van het beplating medium. Meng 1 mL-aminozuur oplossing van MEM, 750 μL van 1 M HEPES, 1 mL B27, 125 μL 200 mM glutamine, 250 μL van penicillaire/streptomycine, 2,5 mL foetaal runderserum (FBS) en 44,375 mL MEM in een 50 mL Tube.
- Voorbereiding van stop medium. Meng 1 mL-aminozuur oplossing van MEM, 750 μL van 1 M HEPES, 5 mL FBS (Final 10%) en 43,25 mL MEM in een buis van 50 mL.
- Bereiding van gerechten met poly-L-lysine coating
- Jas 35 mm kunststof celkweek gerechten met 0,2 mg/mL poly-L-lysine hydrobromide voor 1 dag bij 25 °C.
Opmerking: Poly-L-lysine mag niet worden gebruikt in plaats van poly-L-lysine-hydrobromide. - Was 3 keer de afwas met 2 mL ultrapuur water. Incuberen de afwas met 1,5 mL stop medium bij 25 °C tot het gebruik.
- Jas 35 mm kunststof celkweek gerechten met 0,2 mg/mL poly-L-lysine hydrobromide voor 1 dag bij 25 °C.
- Dissectie van hippocampal neuronen van muis embryo
- Weefsel bron van hippocampal neuronen. Dissect de hippocampus van wild-type en TLCN-deficiënte C57BL6/J muizen op de embryonale dagen 16-17 volgens de methode van Lu et al.19.
- Inincuberen van de ontleed hippocampi in 0,25% trypsine en 1x DNaseI in HBSS met 15 mM HEPES, pH 7,2 gedurende 15 min bij 37 °C met roeren om de 3 min. Verwijder de oplossing. Inbroed de hippocampi in 10 mL STOP medium om trypsine gedurende 5 minuten te deactiveren bij 4 °C.
- Breng de hippocampi in 10 mL vers STOP medium en inbroed bij 4 °C gedurende 5 min. Verplaats de hippocampi in 10 mL vers STOP medium en inbroed bij 4 °C nog eens 5 min. Beweeg de hippocampi in een STOP medium van 900 μL en 100 μL DNaseI in een 15 mL buis. Dissociate de hippocampi in geïsoleerde neuronen door pipetteren 20 keer met behulp van een 1 mL pipet.
Opmerking: De punt van de 1 mL pipet licht raakt de onderkant van de 15 mL buis tijdens dissociatie van de hippocampi. - Voeg 9 mL beplating medium toe en filtreer door een celzeef van 70 μm in een buis van 50 mL. Tel het aantal cellen met behulp van een hemocytometer en aanpassen aan 3,5 x 104 cellen/ml in plating medium.
- Aspirate STOP medium van poly-L-lysine-gecoate gerechten. Plaat de cellen op poly-L-lysine-gecoate gerechten op 7 x 104 cellen/schotel (2 ml/schotel).
- Na 60-64 h incubatie onder 5% CO2 bij 37 °c, voeg 2 μL Ara-C Stock Solution (Final 10 μM) toe aan de neuronen en schud het gerecht langzaam. Houd de cultuur gerechten in een bevoficeerde doos zonder het kweekmedium te veranderen onder 5% CO2 bij 37 °c.
2. zuivering van dendritische Filopodia-rijke Fractie
- Voeg na 13 dagen in vitro (DIV) magnetische polystyreen microbeads (3 x 106 deeltjes/schotel) toe aan 20 gerechten die de gekweekte neuronen bevatten. Was na 1 dag de neuronen in 1 mL PBS met roeren 3 keer om de medium en ongebonden microbeads te verwijderen. Na het verwijderen van PBS, Lyse de neuronen met 500 μL/schotel van lysisbuffer (PBS met 0,01% Triton X-100, EDTA-vrije proteaseremmer cocktail en cocktail van de fosfatase remmer).
- Verzamel het lysaat met een celscraper en verplaats het lysaat naar lage eiwit bindende microbuisjes (10 tubes). Zet de buizen op een Magneet separator en wacht 1 minuut. Verzamel het supernatant en gebruik het als de ongebonden fractie voor zilver kleuring en Western Blot-analyse.
- Breng de parels over naar een nieuwe, eiwit bindende micro buis die op een magnetische separator is gezet en verwijder het supernatant volledig. Voeg 500 μL lysisbuffer toe en was de parels met een Vortex-mixer voor 15 sec. Zet de buis op een Magneet separator, wacht 1 minuut, verwijder het supernatant en voeg 500 μL lysisbuffer toe. Herhaal het wassen van de kralen 10 keer en verwijder het supernatant.
- Elute eiwitten gebonden aan de parels (de gebonden Fractie) door de toevoeging van 50 μL van 1x SDS monster buffer (62,5 mM tris HCl, pH 6,8, 2,5% SDS, en 10% glycerol) en kook de buis bij 98 °C gedurende 5 min. Centrifugeer de buis op 860 x g voor 10 s en stel de buis op een magnetische separator voor 1 min. Verzamel het supernatant en gebruik het als de gebonden breuk.
Opmerking: Het protocol kan hier worden onderbroken. - Meet de eiwit concentraties van de ongebonden en gebonden fracties door de BCA-eiwit test. Visualiseer eiwit oplossingen met broomfenolblauw en stel de concentratie in op 5 ng/μL voor SDS-page.
3. zilver kleuring en westerse Blot-analyse
- Scheid de gebonden en ongebonden fracties (50 ng) per SDS-PAGE met een 5-20% gradiënt gel. Zilver vlek de gel.
- Western Blot met anti-TLCN-C (1/3000), anti-bovine vitronectine (1/5000), anti-actin (1/1000), en anti-α-tubuline (1/1000) als primaire antilichamen en HRP-geconjugeerde geit anti-konijn IgG (1/5000) als secundair antilichaam. Visualiseer de antigenen met chemiluminescerende Western blotting Detection-reagens en een chemiluminescentie Imager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In gekweekte hippocampal neuronen, TLCN was overvloedig gelokaliseerd aan de dendritische filopodia, schacht, en Soma en cogelokaliseerd met F-actin (Figuur 1a, B). Wanneer polystyreen microbeads werden toegevoegd aan gekweekte hippocampal neuronen, werden de parels automatisch bekleed met vitronectine (VN) afgeleid van foetaal runderserum (FBS) in het kweekmedium; ze waren voornamelijk gebonden aan dendrites, en ze veroorzaakte de vorming van fagocytische bekers (Figuur 1b-E). Phagocytische bekers waren gebaseerd op blad vormige, actine filamenten rond microbeads op dendrieten. Tlcn, phospho-ERM, en Pi (4, 5) P2, die markers voor dendritische filopodia zijn, worden sterk geaccumuleerd rond kralen (figuur 1d)8,15. Phagocytische bekers werden alleen gevormd op wild-type hippocampal neuronen, maar niet op TLCN-deficiënte hippocampal neuronen (Figuur 2a-D). Zo was de vorming van de phagocytische beker cruciaal afhankelijk van de aanwezigheid van TLCN in dendrieten.
Bestanddelen van de dendritische filopodia leken op die van fagocytische bekers. Vervolgens gezuiverde we fagocytische bekers in plaats van dendritische filopodia. Het protocol voor de zuivering van fagocytische bekers wordt schematisch weergegeven in Figuur 3. Magnetische microbeads werden toegevoegd aan wild-type gekweekte hippocampal neuronen, die de vorming van fagocytische Cup structuren induceert. De phagocytische beker structuren waren gelyseerd met een zwak reinigingsmiddel. De microbeads werden na de lysis verzameld met behulp van een Magneet separator. Na het wassen van de kralen werden hun bindende eiwitten gekookt en in een SDS-sample buffer geellueerd.
De hoeveelheid eiwitten in de gebonden en ongebonden Fractie werd gemeten met behulp van de BCA proteïne assay kit. Dezelfde hoeveelheid eiwitten in de ongebonden en gebonden fracties werd gescheiden door SDS-PAGE en gekleurd door zilver kleuring (figuur 4a). De eiwit band patronen waren bijna hetzelfde voor de ongebonden en gebonden fracties, maar de intensiteiten op 50 en 70 kDa in de gebonden fractie waren lager dan die in de ongebonden Fractie. Echter, de intensiteit van de band was niet duidelijk verschillend tussen de ongebonden en gebonden fracties bereid uit TLCN-deficiënte cultuur hippocampal neuronen. Om de zuivering van de fagocytische beker structuren te bevestigen, voerden we Western blotting uit met anti-TLCN-C, anti-rundervitronectine, anti-actin en anti-α-tubuline (figuur 4b). TLCN en VN werden voornamelijk aangetroffen in de gebonden Fractie. Actin, Ezrin, Gαq, PLCβ1, MAP-2 en spectrine werden aangetroffen in zowel de gebonden als de ongebonden fracties. Moesin, PSD-95, α-actinin en α-tubulin werden aangetroffen in de ongebonden Fractie.
Figuur 1: lokalisatie van TLCN en F-actin in dendritische filopodia en fagocytische bekers. A) immunofluorescentie kleuring van dendrieten van een gekweekte hippocampal neuron die gapvenus uitdrukt met anti-GFP antilichaam (blauw in een samengevoegde afbeelding), anti-tlcn antilichaam (rood in een samengevoegde afbeelding), en phalloidin (groen in een samengevoegde afbeelding). TLCN en F-actin worden overvloedig waargenomen in dendritische filopodia. (B, C) Vorming van fagocytische beker structuren op neuronale dendrieten. Fluorescerende microbeads (blauw in samengevoegde afbeeldingen van B, C) toegevoegd aan gekweekte hippocampal neuronen hechten sterk aan dendrites en induceren de accumulatie van TLCN (rood in samengevoegde afbeeldingen van B, C) en F-actin (groen in samengevoegde afbeeldingen van B, C). D) een zijaanzicht van een dendritische phagocytische beker gereconstrueerd uit confocale beelden onthult tlcn (rood in samengevoegde afbeeldingen van d) rond de fluorescerende kraal (blauw in samengevoegde afbeeldingen van d). E) een dendritische fagocytische beker, geïnduceerd door een magnetische micro kraal die op een neuronale dendriet is bevestigd en die immunogekleurd is met anti-VN antilichaam (blauw in samengevoegde beelden van e), antitlcn-antilichamen (rood in samengevoegde afbeeldingen van e), en phalloidine (groen in samengevoegde afbeeldingen van E). schaal staven = 1 μm in (D); 2 μm onder A), C) en E); en 20 μm in (B). Dit cijfer is gewijzigd van een eerdere studie18. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: TLCN-afhankelijke vorming van een fagocytische beker achtige structuur. (a-D) Driedubbele fluorescentie beelden van wild-type (WT; A, C) en TLCN-deficiënte (KO; C, D) neuronen behandeld met VN-gecoate fluorescerende kralen (rood in samengevoegde afbeeldingen van A, B, C, D) en gelabeld met anti-TLCN-antilichamen (groen in samengevoegde beelden van A, B, C, D) en anti-fosho-ERM antilichaam (blauw in samengevoegde afbeeldingen van A, B) of Alexa488-phalloidin (blauw afbeeldingen van C, D). Schaal staven = 5 μm. Dit cijfer is gewijzigd van een eerdere studie15. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: een schematisch diagram dat de zuiverings procedure van de dendritische filopodia-rijke fractie illustreert. Magnetische microbeads werden toegevoegd op gekweekte hippocampal neuronen voor het opwekken van de vorming van dendritische fagocytische cups. Na 1 dag incubatie werden de neuronen gesolubiliseerd met lysisbuffer met 0,01% Triton X-100. De parels werden gescheiden van de ongebonden fractie met behulp van een magnetische separator. Na het wassen werden de gebonden eiwitten geellueerd met SDS sample buffer en gebruikt als de gebonden Fractie. Rood: VN, groen: TLCN, andere kleuren: gebonden eiwitten. Dit cijfer is gewijzigd van een eerdere studie18. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: bevestiging van fagocytische beker breuk. A) zilver kleuring van eiwitten in de ongebonden en gebonden fracties van de microbeads. Hetzelfde bedrag (50 ng) eiwitten in de ongebonden en gebonden fracties gezuiverd van wild-type (WT) en TLCN-deficiënte (TLCN KO) hippocampal neuronen werden gescheiden door SDS-PAGE en gevisualiseerd met zilver kleuring. B) analyse van westerse Blot van de niet-afhankelijke en gebonden fracties. Hetzelfde bedrag (50 ng) eiwitten werden gescheiden door SDS-PAGE en onderworpen aan Western Blot analyse met behulp van anti-TLCN, anti-VN, anti-actin, anti-Ezrin, anti-Moesin, anti-Gαq, anti-PLCβ1, anti-MAP-2, anti-spectrine, anti-PSD-95, anti-α-actinine, en anti-α-tubulin-antilichamen. Merk op dat TLCN, VN, actin, Ezrin, PLCβ1, MAP-2 en spectrine worden waargenomen in de dendritische filopodia-rijke Fractie. Dit cijfer is gewijzigd van een eerdere studie18. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We ontwikkelden een zuiveringsmethode voor de dendritische filopodia-rijke fractie met behulp van affiniteit tussen de celadhesie molecule TLCN en het extracellulaire matrix eiwit vitronectine. Vergeleken met de PSD-Fractie, kan het mogelijk zijn om de synaptische eiwitten te identificeren die op de onrijpe Synapse van de dendritische filopodia-rijke fractie optreden. De bestanddelen van de dendritische filopodia-Rich fractie verschillen dus van die van de PSD-fractie met 74%. Anders dan PSD-Fractie, gebruikten we gekweekte hippocampal neuronen om actief phagocytische bekers te vormen, en de cellen moeten levend zijn. Om de phagocytische beker te vormen, gebruikten we de interactie tussen TLCN en vitronectin. TLCN expressie is beperkt in de telencephalon. Dus, we kunnen geen gekweekte neuronen afgeleid van de cerebellaire gebruiken. Echter, als we de kralen met verschillende eiwitten jas, deze activiteit afhankelijke zuivering methode kan worden toegepast op cerebellaire neuronen. Bijvoorbeeld, wanneer de N-terminale domein van glutamaat-receptor delta2-gecoate microbeads worden toegepast op cerebellaire submodule cellen, presynaptische neurexin en cbln1 werden geïdentificeerd uit de bindende eiwitten. Daarom kan deze activiteitsafhankelijke methode worden gebruikt als de coating eiwitten worden gewijzigd. Aangezien de toegang van vitronectin gecoate microbeads beperkt is tot het hersen segment en hersenweefsel, worden fagocytische bekers niet efficiënt gevormd. Toekomstige taken omvatten dus het ontwikkelen van de zuiveringsmethode van de dendritische filopodia-rijke fractie uit hersen slice en weefsel.
In dit protocol, lage dichtheid cultuur voorwaarde wordt gebruikt voor hippocampal neuronen, en de groei van gliacellen cellen worden geremd door de toevoeging van Ara-C10,20,21. Hippocampal neuronen zijn gekweekt in MEM bereid door onszelf, maar niet in neurobasal medium, die op grote schaal wordt gebruikt voor de cultuur van Hippocampal neuronen. Hippocampal neuronen sterven vaak door 14 DIV wanneer gekweekt op neurobasal medium, wat aangeeft dat het neurobasal medium is niet geschikt voor onze lage dichtheid cultuur staat. Bovendien, een belangrijk aspect van lage dichtheid cultuur is coating van het gerecht met poly-L-lysine-hydrobromide, die niet kan worden vervangen door poly-L-lysine.
Om voldoende eiwitten uit de dendritische filopodia-rijke fractie te verkrijgen, zijn de aantallen hippocampal neuronen en magnetische microbeads belangrijke factoren. Voor immunokleuring dendritische filopodia, hippocampal neuronen werden verguld op een 35 mm schotel bij 5,6 x × 104 cellen/schotel, terwijl de neuronen werden verguld op 7,0 x 104 cellen/schotel voor zuivering van de dendritische filopodia-rijke Fractie. Op 14 DIV, bijna geen hippocampal neuronen overlapt op 5,6 x 104 cellen/schotel voor immunokleuring, terwijl veel van hippocampal neuronen deels overlapt met de andere neuronen 7,0 x 104 cellen/schotel voor zuivering van de dendritische filopodia-Rich Fractie. Echter, dendritische filopodia waren overvloedig aanwezig op beide dichtheden van hippocampal neuronen. High-density culturen van hippocampal neuronen vaak rijpen sneller dan lage dichtheid gekweekte hippocampal neuronen; zo, aanpassing van de dichtheid van de hippocampal neuronen aan lage dichtheid cultuur is onmisbaar voor het verkrijgen van de dendritische filopodia-rijke Fractie. Microbeads werden toegevoegd bij 1 x 106 microbeads/schaal voor immunokleuring en bij 3 x 106 microbeads/schotel voor zuivering van de dendritische filopodia-rijke Fractie. Voor de zuivering van de breuk, zodra een voldoende hoeveelheid kralen werd toegevoegd, de ongebonden kralen werden weggespoeld uit hippocampal neuronen.
In dit protocol werden microbeads automatisch bekleed met VN, die aanwezig is in het kweekmedium. Echter, microbeads kunnen worden gecoat met recombinant VN en toegevoegd aan hippocampal neuronen. Omdat VN een zeer kleverig eiwit is, vormen VN-gecoate microbeads gemakkelijk aggregaten. Zo worden VN-gecoate microbeads gesoniceerd en pipetteren om van elkaar te ontkoppelen vlak voor toevoeging aan hippocampal neuronen.
We toonden eerder aan dat VN-gecoate microbeads fosfor-ERM, PI (4, 5) P2en F-actin samen met tlcn-accumulatie15induceert. Wanneer de dendritische filopodia-Rich Fractie werd geanalyseerd door Western blotting, fosho-ERM werd niet gedetecteerd door anti-fosho-ERM Polyklonale antilichamen en werd licht gedetecteerd door anti-Ezrin en anti-Moesin monoklonale antilichamen. Het lijkt erop dat de gevoeligheid van de monoklonale antilichamen hoger was dan het anti-fosho-ERM Polyklonale antilichamen. Bovendien, ERM-eiwitten waren gelokaliseerd om bijna alle regio's van de hippocampal neuronen, maar phospho-ERM eiwitten waren alleen gelokaliseerd op de punt van de dendritische filopodia en de fagocytische Cup. Er wordt van uitgegaan dat de hoeveelheid fosho-ERM-binding aan TLCN beperkt is in vergelijking met de hoeveelheid nonfosforylated ERM. Dus, detectie van fosho-ERM in de dendritische filopodia-Rich fractie lijkt moeilijk.
Om de microbeads van het celmembraan los te maken, gebruikten we een zwak reinigingsmiddel, 0,01% Triton X-100. Tlcn is gekoppeld aan actine filament via phospho-ERM in de dendritische filopodia en fagocytische Cup structuren. Om eiwitten te zuiveren die indirect zijn gekoppeld aan TLCN via de actine-gloeidraad, gebruikten we een zwak reinigingsmiddel in dit protocol. Echter, de concentratie van Triton X-100 kan worden veranderd in een hogere concentratie, afhankelijk van het doel van het experiment.
Esselens et al. heeft aangetoond dat de fagocytische opname van microbeads geïnduceerde TLCN, PIP2en F-actin accumulatie in gekweekte hippocampal neuronen17. Volgens onze analyse via confocale microscopie na 24 h van incubatie met microbeads, werden de microbeads niet volledig opgenomen in het cytoplasma. TLCN en PIP2, die zijn gelokaliseerd in het celmembraan, waren gelokaliseerd rond kralen, vooral op de bodem van de microbeads. Daarnaast werden 319 eiwitten die werden geïdentificeerd uit de dendritische filopodia-Rich fractie geanalyseerd met behulp van de KEGG pathway analyse. Fagocytose en autophagy trajecten werden niet gedetecteerd, maar cytoskelet organisatie, exocytose, actin-filament-gebaseerd proces, en microtubulusgebaseerd proces werden aanzienlijk verrijkt in de Fractie18.
Het moleculaire mechanisme van de formatie van dendritische filopodia blijft grotendeels onbekend. Analyse van de phagocytische beker structuur kan helpen de moleculaire bestanddelen en dynamische functies van dendritische filopodia te begrijpen. Het zou interessant zijn om te analyseren van de dendritische filopodia-rijke fractie bereid uit muizen modellen van neurodevelopmental en neuropsychiatrische aandoeningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We bedanken Shigeo Okabe en Hitomi Matsuno voor de lage-densiteit cultuur van hippocampal neuronen, Masayoshi Mishina voor TLCN-deficiënte muizen, Sachiko Mitsui en Momoko Shiozaki voor technische assistentie, en leden van het Yoshihara laboratorium voor nuttige discussies . Dit werk werd gesteund door JSPS KAKENHI Grant NOS. JP20700307, JP22700354 en JP24500392 en MEXT KAKENHI Grant NOS. JP23123525 naar YF en JP20022046, JP18H04683, en JP18H05146 naar YY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 1.7 mLl Low Binding MCT | Sorenson BioScience | 39640T | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | 2530149 | |
| 35 mm plastic cell culture dishes | Corning | 430165 | |
| Anti-actin | Sigma-Aldrich | A-5060 | |
| Anti-alpha-Actinin | Sigma-Aldrich | A-5044 | |
| Anti-alpha-tubulin | Sigma-Aldrich | T-9026 | |
| Anti-Ezrin | Sigma-Aldrich | clone3C12, SAB4200806 | |
| Anti-Galphaq | Santacruz | sc-393 | |
| Anti-MAP2 | Chemicon | clone AP20, MAB3418 | |
| Anti-Moesin | Sigma-Aldrich | clone 38/87, M7060 | |
| Anti-PLCbeta1 | Santacuz | sc-5291 | |
| Anti-PSD95 | MA2 | ABR | |
| Anti-Spectrin beta | Chemicon | MAB1622 | |
| B27 | Gibco | 0080085SA | |
| BCA protein assay kit | Thermo | 23227 | |
| Bromophenol blue | Merck | 1.08122.0005 | |
| Calcium chrolide, hydrous | Wako | 038-19735 | |
| Cell scraper | Falcon | 353085 | |
| Cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Choline chloride | Sigma-Aldrich | C7527 | |
| Complete EDTA free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Cytosine beta-D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich | C-6645 | |
| DNase-I | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma-Aldrich | P5155 | |
| DynaMag-2 Magnet | Thermo | 12321D | |
| ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE | RPN2232 | |
| e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gradient gel | ATTO | E-T520L | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
| HBSS | Gibco | 14175095 | |
| HRP-conjugated anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | |
| i-Inositol | Sigma-Aldrich | I7508 | |
| LAS-1000 mini | Fuji Film | LAS-1000 mini | For detection of luminescence from WB membrane |
| Magnetic polystyrene microbeads | Sperotech | PM-20-10 | |
| MEM amino acid solution | Gibco | 11130-051 | 30 mM L-Arginine hydrochloride, 5 mM L-Cystine, 10 mM L-Histidine hydrochloride-H2O, 20 mM L-Isoleucine, 20 mM L-Leucine, 19.8 mM L-Lysine hydrochloride, 5.1 mM L-Methionine, 10 mM L-Phenylalanine, 20 mM L-Threonine, 2.5 mM L-Tryptophan, 10 mM L-Tyrosine, and 20 mM L-Valine |
| Mini-slab size electrophoresis system | ATTO | AE-6530 | |
| Niacinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Penicilin / Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail | Roche | 4906845001 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Nacali | 28360-14 | |
| Pyridoxal HCl | Sigma-Aldrich | P6155 | |
| Riboflavin | Sigma-Aldrich | R9504 | |
| Silver Stain 2 Kit wako | Wako | 291-5031 | |
| Thiamine HCl | Sigma-Aldrich | T1270 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-rad | 1703940JA | |
| Ultra pure water | MilliQ | For production of ultra pure water |
References
- Fiala, J. C., Feinberg, M., Popov, V., Harris, K. M. Synaptogenesis via dendritic filopodia in developing hippocampal area CA1. Journal of Neuroscience. 18 (21), 8900-8911 (1998).
- Portera-Cailliau, C., Pan, D. T., Yuste, R. Activity-regulated dynamic behavior of early dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia. Journal of Neuroscience. 23 (18), 7129-7142 (2003).
- Ziv, N. E., Smith, S. J. Evidence for a role of dendritic filopodia in synaptogenesis and spine formation. Neuron. 17 (1), 91-102 (1996).
- Lohmann, C., Bonhoeffer, T. A role for local calcium signaling in rapid synaptic partner selection by dendritic filopodia. Neuron. 59 (2), 253-260 (2008).
- Yoshihara, Y., De Roo, M., Muller, D. Dendritic spine formation and stabilization. Current Opinion in Neurobiology. 19 (2), 146-153 (2009).
- Bayes, A., et al. Comparative study of human and mouse postsynaptic proteomes finds high compositional conservation and abundance differences for key synaptic proteins. PLoS One. 7 (10), e46683 (2012).
- Bayes, A., et al. Characterization of the proteome, diseases and evolution of the human postsynaptic density. Nature Neuroscience. 14 (1), 19-21 (2011).
- Furutani, Y., et al. Interaction between telencephalin and ERM family proteins mediates dendritic filopodia formation. Journal of Neuroscience. 27 (33), 8866-8876 (2007).
- Mao, Y. T., et al. Filopodia Conduct Target Selection in Cortical Neurons Using Differences in Signal Kinetics of a Single Kinase. Neuron. 98 (4), 767-782 (2018).
- Matsuno, H., et al. Telencephalin slows spine maturation. Journal of Neuroscience. 26 (6), 1776-1786 (2006).
- Raemaekers, T., et al. ARF6-mediated endosomal transport of Telencephalin affects dendritic filopodia-to-spine maturation. The EMBO Journal. 31 (15), 3252-3269 (2012).
- Mori, K., Fujita, S. C., Watanabe, Y., Obata, K., Hayaishi, O. Telencephalon-specific antigen identified by monoclonal antibody. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (11), 3921-3925 (1987).
- Yoshihara, Y., Mori, K. Telencephalin: a neuronal area code molecule? Neuroscience Research. 21 (2), 119-124 (1994).
- Annaert, W. G., et al. Interaction with telencephalin and the amyloid precursor protein predicts a ring structure for presenilins. Neuron. 32 (4), 579-589 (2001).
- Furutani, Y., et al. Vitronectin induces phosphorylation of ezrin/radixin/moesin actin-binding proteins through binding to its novel neuronal receptor telencephalin. Journal of Biological Chemistry. 287 (46), 39041-39049 (2012).
- Nyman-Huttunen, H., Tian, L., Ning, L., Gahmberg, C. G. alpha-Actinin-dependent cytoskeletal anchorage is important for ICAM-5-mediated neuritic outgrowth. Journal of Cell Biology. 119 (Pt 15), 3057-3066 (2006).
- Esselens, C., et al. Presenilin 1 mediates the turnover of telencephalin in hippocampal neurons via an autophagic degradative pathway. Journal of Cell Biology. 166 (7), 1041-1054 (2004).
- Furutani, Y., Yoshihara, Y. Proteomic Analysis of Dendritic Filopodia-Rich Fraction Isolated by Telencephalin and Vitronectin Interaction. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 10, 27 (2018).
- Lu, Z., Piechowicz, M., Qiu, S. A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture. Journal of Visualized Experiments. (109), (2016).
- Okabe, S., Miwa, A., Okado, H. Alternative splicing of the C-terminal domain regulates cell surface expression of the NMDA receptor NR1 subunit. The Journal of Neuroscience. 19 (18), 7781-7792 (1999).
- Okabe, S., Vicario-Abejon, C., Segal, M., McKay, R. D. Survival and synaptogenesis of hippocampal neurons without NMDA receptor function in culture. European Journal of Neuroscience. 10 (6), 2192-2198 (1998).
