Summary
בפרוטוקול זה, אנו מציגים שיטה לטיהור החלק הדנדריטי-עשיר של השבר הדנדריטים של הגביע phagocytic כמו מבנה בליטה על הנוירונים היפוקמאל תרבותי על ידי ניצול הזיקה הספציפית והחזקה בין מחוגה הדנדריטי מולקולת הדבקה, TLCN ומולקולת מטריקס בעלי מטריצה, vitronectin.
Abstract
פילפאות דנדריטי הן בליטות דקות וארוכות המבוססות על הפילטין, והן מרחיבות ומסגת כאילו מחפשים מטרה אקסון. כאשר filפאות הדנדריטים ליצור קשר עם axon היעד, הם מתחילים התבגרות לתוך הקוצים, המוביל היווצרות סינפסה. Telencephalin (TLCN) הוא מקומי בשפע בפילפיאה דנדריטי והוא נשלל בהדרגה מהקוצים. הבעות יתר של TLCN בנוירונים מתורבתים היפוקמאל מעוררת היווצרות הדנדריטים. הצגנו שtelencephalin מאגד בחוזקה למולקולה של מטריקס, ויטרופקטין. ויטרופקטין מצופה בחרוזי מיקרו-חרוזים. שנגרמה כתוצאה מהדנדריטים העצביים בגביע phagocytic, TLCN, טלCN-מחייב חלבונים כגון זרחנת אזרין/Radixin/מוסין (פוספהו-אה), ו-F-actin נצבר, אשר מציע כי מרכיבים של הגביע phagocytic דומים לאלה של פילפיאה הדנדריטי. לכן, פיתחנו שיטה לטיהור הגביע phagocytic במקום filפאות הדנדריטים. חרוזי קלקר מגנטיים היו מצופים vitronectin, אשר בשפע בתווך התרבות של נוירונים היפוקמאל ואשר משרה היווצרות גביע phagocytic על הדנדריטים העצביים. לאחר 24 שעות של דגירה, כוסות phagocytic היו מסיסות במקצת עם חומרי ניקוי ונאסף באמצעות מפריד מגנט. לאחר שטיפת החרוזים, החלבונים המחייבים היו מנותחים ונותחו על ידי כתמים מכסף וכתמים מערביים. בשבר הכריכה, tlcn ו-אקטין היו נוכחים בשפע. בנוסף, חלבונים רבים שזוהו מן השבר היו מותאמים לפילפיאה הדנדריטי; לכן, קראנו את השבר המחייב כמו השבר הדנדריפיאה-עשיר. מאמר זה מתאר פרטים בנוגע לשיטת הטיהור של השבר הדנדריטי-עשיר.
Introduction
פילפיאה דנדריטי נחשבים להיות סמנים מוקדמים של שפני השדרה. שקעים לוויסות השלוחה והנסיגה שלהם1,2,3. לאחר יצירת קשר עם axon, הדנדריטים הדנדריטי הנבחר להתחיל ההבשלה שלהם לתוך השדרה, ו סינפסה נוצרת4,5. מרכיבים של שפני השדרה נקבעו מניתוח מקיף של שברים בצפיפות הפוסט-סינפטיות6,7, בעוד שרכיבים של פילופיאה דנדריטי נשארים לא ידועים. הוכח כי telencephalin (tlcn), אה, סינקופה, ראס, PI3 קינאז, akt, mtor, פולו-כמו קינאז 2, camkii, syndecan-2, paralemin-1, ARF6, ולהסדיר את המבנה הדנדריטי הדנדריטים5,8,9 ,10,11, בעוד שיטה לא פותחה עבור ניתוח מקיף של מולקולות נוכח בפילפיאה הדנדריטי.
TLCN (ICAM-5) מתבטאת במיוחד על ידי נוירונים קוצני בחלק המוח הrostral ביותר, הטלנצאלון12. TLCN 9 תחומים כמו Ig באזור החילוץ שלה, אזור טרנסקרום, ו cytoplasmic זנב13. Tlcn נקשר ל vitronectin (VN) ו-lfa-1 אינטגרציה באזור המוטרתאי שלה, לפרזלין באזור הטרנסג שלה, ולפואהו-אה ולα-אקטין באזור cytoplasmic5,8,14,15 ,16. Tlcn נקשר לשלד ציטוטין באמצעות פוספהו-אה בקצות הפילפיאה הדנדרידיה ובα-אקמין ב שבקוצים ופירים דנדריטים8,16.
הראנו כי ביטוי יתר של TLCN היווצרות הדנדריטים הדנדריטי משופרת והמושרה גרסה מחודשת של השדרה לפילפיאה10. הצורה האקטיבית והפעילה של אזרין כרוך באזור cytoplasmic של TLCN ובמערך הדנדריטים הדנדריטי המשופר8. לפיכך, TLCN מווסת את היווצרות הדנדריטים הדנדריטי דרך actin-מחייב חלבונים. Esselens ואח ' הפגינו כי מיקרוחרוזים המושרה הצטברות TLCN על נוירונים מתורבתים17. הצגנו כי מבנים של גביע phagocytic הוקמה על הדנדריטים העצביים סביב מיקרוחרוזי VN מצופה באמצעות TLCN באופן תלוי15. מרכיבים של פילפיאה דנדריטי דומים לאלה של הגביע phagocytic. קשה לאסוף filפאות הדנדריטים, אבל זה קל יחסית לאסוף את הגביע phagocytic באמצעות מיקרוחרוזי מגנטי. לכן, פיתחנו שיטה כדי לטהר את הגביע phagocytic במקום filפיאה הדנדריטים18. כאן, אנו מתארים את שיטת הטיהור עבור השבר הדנדריפיאה עשיר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים והשימוש של RIKEN Wako.
1. תרבות ההיפוקאמאל הנוירונים
- הכנת מדיום לתרבות
- הכנת מיקס ויטמין 200x. לפזר 100 מ"ג של D-פנטטטום חומצה hemicalcium מלח, 100 mg של כולין כלוריד, 100 mg של חומצה פולית, 180 mg של i-inositol, 100 mg של niacinamide, 100 mg של pyridoxal HCl, ו-100 mg של תיאמין HCl בתוך 500 mL של מים אלקטרופורזה באמצעות מיקרו מגנטי. הפתרון אינו מומס לחלוטין. לערבב בקפידה, סדרת מחלקים ב 50 מ ל צינורות וחנות ב-20 ° c.
- הכנת תמיסת הריבופלאווין. מתמוסס 100 מ"ג של ריבופלאווין ב 500 מ ל של מים אלקטרופורזה באמצעות מערבב מגנטי. הפתרון אינו מומס לחלוטין. לערבב בקפידה, סדרת מחלקים ב 50 מ ל צינורות וחנות ב-20 ° c.
- הכנה של 1 מ ל2. מתמוסס 7.35 g של cacl2· 2h2O ב 50 מ ל של מים אלקטרופורזה באמצעות מערבב מגנטי.
- הכנת מדיום חיוני מינימלי (הגברת). לפזר 400 מ"ג של KCl, 6800 mg של הנאל, 2,200 mg של נחקו3, 158 mg של נה2פו4· 2h2o, 7000 mg של D-גלוקוז, ו-200 mg של mgso4-7h2O ב 950 mL של מים באולטרטהורים באמצעות מערבב מגנטי.
- Titrate 1.8 mL של 1 M CaCl2 ל-הגברת באופן שחרור על ידי שחרור באמצעות 1 mL pipet עם עצבנות מתמדת על מערבב מגנטי. להתאים את ה-pH של הגברת ל-pH 7.25 עם 1 מול/L HCl.
- הוסף 5 מ ל של מיקס ויטמין 200x ו-200 μL של פתרון הריבופלאווין ל-הזיכרון. כוונן את נפח הפתרון ל-1,000 mL עם מים באולטרטהורים. סנן את הפתרון באמצעות מערכת מסנני 0.22 יקרומטר ואחסן אותה ב-4 ° c.
- הכנת פתרונות מניות 10x DNase-I. התמוססות 100 מ"ג של dnase-I ב 12.5 mL של הנקס ' מאוזנת תמיסת מלח (hbss), לסנן דרך מסנן 0.22 יקרומטר, סדרת מחלקים בצינורות 1.5 mL, ולאחסן את הצינורות ב-20 ° c.
- הכנת ציטוסינוס β-D-arabinofuranoside (Ara-C) פתרון מניות. התמוססות 25 מ ג של Ara-C ב 8.93 מ ל של מים אלקטרופורזה (הריכוז הסופי של 10 מ"מ), לסנן דרך מסנן 0.22 יקרומטר, סדרת מחלקים ב 1.5 mL וחנות ב-20 ° c
- הכנת מדיום לציפוי. מערבבים 1 מ ל של הפתרון חומצה אמינית, 750 μL של 1 M HEPES, 1 מ ל של B27, 125 μL של 200 mM גלוטמין, 250 μL של פניצילין/סטרפטומיצין, 2.5 mL של סרום של שור העוברי (FBS), ו 44.375 mL של הגברת בתוך 50 mL שפופרת.
- הכנת מדיום Stop. מערבבים 1 מ ל הפתרון חומצה אמינית, 750 μL של 1 מ' HEPES, 5 מ ל של FBS (הסופי 10%), ו 43.25 mL של הגברת בצינור ה50 mL.
- הכנת מנות פולי-ל-ליזין מצופות
- מעיל 35 מ"מ מנות מפלסטיק בשילוב של מאכלים עם 0.2 mg/mL של פולי-ל-ליזין הידרוברומיד ליום אחד ב -25 ° c.
הערה: אין להשתמש בפולי-L-ליזין במקום ב-פולי-ליזין הידרורומיד. - רוחצים את הכלים עם 2 מ ל של מים באולטרסאונד 3 פעמים. מודיית את הכלים עם 1.5 mL של מדיום Stop ב -25 ° צ' עד השימוש.
- מעיל 35 מ"מ מנות מפלסטיק בשילוב של מאכלים עם 0.2 mg/mL של פולי-ל-ליזין הידרוברומיד ליום אחד ב -25 ° c.
- חיתוך נוירונים היפוקמאל מתוך העובר העכבר
- מקור הרקמה של נוירונים. בהיפוקמאל לנתח את ההיפוקמפוס מן פראי סוג ו TLCN-C57BL6/J עכברים בימים עובריים 16-17 על פי שיטת Lu et al.19.
- דגירה של היפוקמאני ב 0.25% טריפסין ו 1x DNaseI ב HBSS המכיל 15 מ"מ HEPES, pH 7.2 עבור 15 דקות ב 37 ° צ' עם עצבנות כל 3 דקות. הסר את הפתרון. מודחלת ההיפוקמאני ב 10 מ ל של מדיום STOP כדי להשבית טריפסין ב 4 ° צ' עבור 5 דקות.
- להעביר את ההיפוקמאני לתוך 10 מ ל של מדיום להפסיק טריים ו-דגירה ב 4 ° c עבור 5 דקות. להעביר את ההיפוקמאני לתוך 10 ml של מדיום להפסיק טרי ו-דגירה ב 4 ° c עבור עוד 5 דקות. להעביר את ההיפוקמאני לתוך 900 μl של מדיום stop ו 100 μl של 10 . שפופרת ממ הנתק את ההיפוקמאני לתוך נוירונים מבודדים על ידי ליטוף 20 פעמים באמצעות 1 mL pipetting.
הערה: הקצה של 1 מ ל pipet במקצת נוגע בתחתית של 15 מ"ל צינור במהלך הדיסוציאציה של היפוקמאני. - הוסף 9 מ ל של ציפוי בינונית, ולסנן דרך מסננת תא 70 יקרומטר לתוך צינור 50 mL. לספור את מספר התאים באמצעות הטציטוטומטר ולהתאים 3.5 x 104 תאים/mL ב ציפוי בינוני.
- שאיפה לעצור מנות מצופות פולי L-ליזין. לוחית התאים על מנות פולי-L-ליזין מצופות 7 x 104 תאים/צלחת (2 מ ל/מנה).
- לאחר 60-64 h של דגירה תחת 5% CO2 ב 37 ° c, להוסיף 2 μl של פתרון מלאי Ara-C (הסופי 10 μm) אל הנוירונים, ולנער את התבשיל לאט. השאר את מנות התרבות בקופסא לחות מבלי לשנות את מדיום התרבות תחת 5% CO2 ב 37 ° c.
2. טיהור הדנדריטים הדנדריפיאה-שבר עשיר
- לאחר 13 ימים בתוך מבחנה (DIV), להוסיף מיקרוחרוזי פוליסטירן מגנטיים (3 x 106 חלקיקים/צלחת) כדי 20 מנות המכילות נוירונים תרבותי. לאחר יום אחד, לשטוף את הנוירונים ב 1 מ ל של PBS עם עצבנות 3 פעמים כדי להסיר את המיקרוחרוזים בינונית ולא מאוגד. לאחר הסרת PBS, lyse הנוירונים עם 500 μL/צלחת של מאגר לפירוק (PBS המכיל 0.01% טריטון X-100, EDTA-חינם מעכב פרוטאז קוקטייל, ו פוספספטאז קוקטייל מעכבי).
- לאסוף את הליפוסט עם מגרד התא ולהעביר את ליפוסט לחלבון נמוך מחייב מיקרוצינורות (10 שפופרות). הגדר את הצינורות על מפריד מגנט ולחכות 1 דקות. לאסוף את supernatant ולהשתמש בו כשבר לא מאוגד עבור כתמי כסף וניתוח כתמים מערבי.
- העבר את החרוזים למיקרו-צינורית נמוך-חלבון חדש, שנקבע על מפריד מגנטי, והסר לחלוטין את הסופרנטאנט. הוסף 500 μL של מאגר הליזה ושטוף את החרוזים באמצעות מערבל מערבולת עבור 15 s. הגדר את הצינור על מפריד מגנט, לחכות 1 דקות, להסיר את supernatant, ולהוסיף 500 μL של מאגר הליזה. חזרו על נטילת החרוזים 10 פעמים והסירו את הסופרנטאנט.
- חלבונים elute הקשורים החרוזים (השבר המאוגד) על ידי תוספת של 50 μL של 1x SDS מאגר לדוגמה (62.5 mM טריס HCl, pH 6.8, 2.5% SDS, ו 10% גליצרול) ו להרתיח את הצינור ב-98 c במשך 5 דקות ולהגדיר את הצינור על מפריד מגנטי במשך 1 דקות. אסוף את הסופרנטנט והשתמש בו כשבר מאוגד.
הערה: הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן. - מדידת ריכוזי חלבון של שברים לא מאוגדים ומאוגדים על ידי שיטת החלבון BCA. המחש פתרונות חלבונים עם כחול ברומרופנול והתאם את הריכוז ל-5 ng/μL עבור SDS-PAGE.
3. כתמי כסף וניתוח כתמים מערביים
- הפרד בין השברים המאוגדים והלא מאוגדים (50 ng) ב-SDS-PAGE באמצעות ג'ל מעבר צבע של 5-20%. . כתמי כסף את הג'ל
- כתם מערבי באמצעות anti-TLCN-C (1/3000), אנטי השור ויטרונטין (1/5000), נגד actin (1/1000), ו anti-α-טובולין (1/1000) כמו נוגדנים הראשי ו HRP מצוח עז הפנים נגד ארנב IgG (1/5000) כמו הנוגדן המשני. המחש את האנטיגנים באמצעות כימוע מערבי לזיהוי מגיב ומיגראומיאנריבורגר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ב מתורבת נוירונים היפוקמאל, TLCN היה מקומי בשפע לפילפיאה הדנדריטי, פיר, ואת הסומה ואת מקומי עם F-actin (איור 1A, B). כאשר מיקרוחרוזי פוליסטירן התווספו לנוירונים מתורבתים, החרוזים היו מצופים באופן אוטומטי עם vitronectin (VN) נגזר סרום שור עוברי (FBS) במדיום התרבות; הם היו קשורים בעיקר לדנדריטים, והם המושרה את היווצרות כוסות phagocytic (איור 1B-E). כוסות פאיגוטיות התבססו על מחרוזות בצורת סדין סביב מיקרוחרוזים על דנדריטים. Tlcn, פוספהו-אה, ו-PI (4, 5) P2, אשר סמנים עבור filפיאה הדנדריטי, הם צברו מאוד סביב חרוזים (איור 1d)8,15. כוסות phagocytic הוקמה רק על הנוירונים סוג פראי היפוקמאל, אבל לא על הנוירונים היפוקמאל לקויה (איור 2A-D). כך, היווצרות גביע phagocytic היה תלוי באופן מכריע בנוכחות TLCN בדנדריטים.
המרכיבים של הפילפיאה הדנדריטי הופיעו בדומה לאלה של כוסות phagocytic. בשלב הבא, הצלחנו לטהר את כוסות הפייגוציטוטיק במקום פילפיאה דנדריטי. הפרוטוקול לטיהור של כוסות phagocytic מוצג באיור 3. מיקרוחרוזים מגנטיים נוספו מסוג פראי היפוקמאל נוירונים תרבותי, אשר משרה את היווצרות של מבנים גביע phagocytic. מבני הגביע הפייגוציטיים. היו מכוסות בחומר ניקוי חלש המיקרוחרוזים נאספו לאחר הליזה באמצעות מפריד מגנט. לאחר שטיפת החרוזים, החלבונים המחייבים שלהם היו מבושלים ומורתחים במאגר לדוגמה של SDS.
כמות החלבונים בשבר המאוגד והלא מאוגד נמדדה באמצעות ערכת שיטת החלבון BCA. אותה כמות של חלבונים בשברים לא מאוגדים ומאוגד הופרד על ידי SDS-PAGE ומוכתם על ידי מכתים כסף (איור 4A). דפוסי הגומייה היו כמעט זהים עבור שברים לא מאוגדים וכבולים, אבל את עוצמות ב 50 ו 70 kDa בשבר המאוגד היו נמוכים יותר מאשר בשבר לא מאוגד. עם זאת, עוצמת הלהקה לא היתה שונה בבירור בין השברים הלא מאוגדים ומאוגדים הכין מפני נוירונים בלתי מוגבל של תרבות היפוקמאל. כדי לאשר את הטיהור של מבנים גביע phagocytic, אנו ביצעו בלוק המערבי באמצעות anti-TLCN-C, אנטי שור vitronectin, אנטי actin, ו anti-α-טובולין (איור 4B). TLCN ו-VN זוהו בעיקר בשבר המאוגד. Actin, עזרין, Gαq, PLCβ1, מפה -2, ו הספקטרובועיים זוהו הן בשברים מאוגד ולא מאוגד. מואסין, PSD-95, α-אקסין, ו α-טובולין זוהו בשבר לא מאוגד.
איור 1: לוקליזציה של TLCN ו-F-actin ב פילדפיאה דנדריטי וכוסות phagocytic. (א) אימונוofor, כתמים של דנדריטים של מעצב היפוקמאל מתורבת המבטא ונוס עם נוגדן אנטי-gfp (כחול בתמונה ממוזגת), נוגדן ANTI-tlcn (אדום בתמונה ממוזגת), ו phalloidin (ירוק בתמונה ממוזג). TLCN ו-F-actin נצפו בשפע בפילפיאה דנדריטי. (ב, ג) היווצרות מבנים של גביע phagocytic על הדנדריטים העצביים. מיקרוחרוזי פלורסנט (כחול בתמונות ממוזגות של B, C) התווסף לנוירונים היפוקמאל תרבותי בחוזקה לדבוק הדנדריטים ולגרום להצטברות של TLCN (אדום בתמונות ממוזגות של B, C) ו-F-actin (ירוק בתמונות ממוזגות של B, C). (ד) השקפה לרוחב של ספל phagocytic דנדריטי שוחזר מתמונות קונפוקלית וקד חושף tlcn (אדום בתמונות ממוזגות של d) סביב חרוז פלורסנט (כחול בתמונות ממוזגות של d). (ה) גביע דנדריטים מגנטי הנגרם על ידי מיקרוחרוז מגנטית המצורפת לדנדריטים עצביים ומוכתם בנוגדן אנטי-VN (כחול בתמונות ממוזגות של e), נוגדן אנטי-tlcn (אדום בתמונות ממוזגות של e), ו phalloidin (ירוק בתמונות ממוזגות של E) שינוי קנה מידה = 1 יקרומטר ב (ד); 2 יקרומטר ב (א), (ג) ו-(ה); ו -20 יקרומטר ב (ב). דמות זו השתנתה ממחקר קודם18. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: היווצרות תלויי-TLCN של מבנה דומה לגביע phagocytic. (A-D) משולש תמונות פלואורסצנטית של פראי (WT; A, C) ו-TLCN (KO; ג, ד) נוירונים שטופלו בחרוזי פלורסנט מצופים VN (אדום בתמונות ממוזגות של A, B, C, D) ומתויג בנוגדן נגד-TLCN (ירוק בתמונות ממוזגות של A, B, C, D) ונוגדן anti-פוספהו-אה (כחול בתמונות ממוזגות של A, B) או Alexa488-phalloidin ( תמונות של C, D). קנה מידה של סרגלים = 5 μm. דמות זו השתנתה ממחקר קודם15. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: דיאגרמה סכמטית המדגימה את תהליך הטיהור של השבר הדנדריפיאה-עשיר. מיקרוחרוזים מגנטיים נוספו על נוירונים היפוקמאל תרבותי כדי לגרום להיווצרות כוסות phagocytic הדנדריטים. לאחר יום 1 של דגירה, הנוירונים היו מסיסות עם מאגר הליזה המכיל 0.01% טריטון X-100. החרוזים הופרדו מבריר לא מאוגד באמצעות מפריד מגנטי. לאחר השטיפה, החלבונים המאוגדים הופרדו ממאגר המדגם של SDS והשתמשו בהם כשבר מאוגד. אדום: VN, ירוק: TLCN, צבעים אחרים: חלבונים מאוגדים. דמות זו השתנתה ממחקר קודם18. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: אישור של שבר הספל phagocytic. (א) כתמים מכסף של חלבונים בחלקים הלא מאוגדים והמאוגדים של המיקרוחרוזים. אותה כמות (50 ng) של חלבונים בשברים לא מאוגדים ומאוגדים מטוהרים מסוג פראי (WT) ו TLCN-לקוי (TLCN KO) נוירונים היפוקמאלםהיו מופרדים על ידי SDS-PAGE ו לדמיין עם כתמים כסף. (ב) ניתוח כתמי אבן מערבי של השברים הלא מאוגדים והמאוגדים. אותו סכום (50 ng) של חלבונים הופרדו על ידי SDS-עמוד ונתון ניתוח כתמי אבן מערבית באמצעות anti-TLCN, anti-VN, אנטי-actin, אנטי-ezrin, אנטי מוסין, אנטי Gαq, anti-PLCβ1, אנטי מפה-2, anti-ספקטרוin, anti-PSD-95, אנטי-α-אקטין, ו נוגדנים נגד-α-טובולין. שים לב ש-TLCN, VN, actin, אזרין, PLCβ1, מפה -2 והספקטרומטר מצופים בשבר הדנדריטי-עשיר. דמות זו השתנתה ממחקר קודם18. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פיתחנו שיטת טיהור עבור השבר הדנדריטים הדנדריפיאה-עשיר באמצעות זיקה בין מולקולת תא הדבקה TLCN לבין מטריקס חלבון מטריצה vitronectin. בהשוואה לשבר PSD, זה יכול להיות אפשרי כדי לזהות את החלבונים סינפטיות פועל על הסינפסה בלתי בוגר מן השבר הדנדריטי-עשיר. לפיכך, המרכיבים של השבר הדנדריטי-עשיר, שונים מאלה של השבר PSD על ידי 74%. שונה משבר PSD, השתמשנו בנוירונים היפוקמאל מתורבתים באופן פעיל בצורה פעילה כוסות phagocytic, ואת התאים צריכים להיות בחיים. כדי ליצור את גביע phagocytic, השתמשנו האינטראקציה בין TLCN ו vitronectin. ביטוי TLCN מוגבל בטלנצאלון. לפיכך, איננו יכולים להשתמש בנוירונים מתורבתים שמקורם במוח. עם זאת, אם אנו מעילים את החרוזים עם חלבונים שונים, זו שיטת טיהור תלוי הפעילות יכול להיות מיושם על נוירונים בלבלר. לדוגמה, כאשר התחום N-terminal של קולטן גלוטמט delta2 מצופה מיקרוחרוזי מיקרו מוחלים על התאים המוח, מראש neurexin ו cbln1 זוהו מן החלבונים קשירה. לפיכך, ניתן להשתמש בשיטה תלוית פעילות זו, אם משתנות החלבונים בציפוי. מאז הגישה של מיקרוחרוזים מצופה vitronectin מוגבל לנתח המוח רקמת המוח, כוסות phagocytic לא נוצרות ביעילות. לפיכך, משימות עתידיות כוללות פיתוח שיטת הטיהור של החלק הדנדריטי-עשיר של נתח מוח ורקמות.
בפרוטוקול זה, מצב התרבות בצפיפות נמוכה משמש עבור נוירונים היפוקמאל, ואת הצמיחה של תאי גליה מעוכבים על ידי תוספת של Ara-C10,20,21. נוירונים היפוקמליים הם מתורבתים ב-הגברת מוכן על ידי עצמנו, אבל לא במדיום neurobasal סיס, אשר משמש רבות לתרבות של נוירונים היפוקמאל. נוירונים היפוקמליים לעתים קרובות למות על ידי 14 DIV כאשר מתורבת על מדיום נוירובסיס, אשר מציין כי המדיום נוירובסיס אינו מתאים למצב התרבות בצפיפות נמוכה שלנו. בנוסף, היבט חשוב של התרבות בצפיפות נמוכה הוא ציפוי הצלחת עם פולי ליזין הידרוברומיד, אשר לא ניתן להחליף עם פולי-L-ליזין.
כדי להשיג כמות מספקת של חלבונים משבר הדנדריטים הדנדריפיאה-עשיר, המספרים של נוירונים היפוקמאל ומיקרוחרוזים מגנטיים הם גורמים חשובים. עבור מכתים הדנדריטים הדנדריטי, נוירונים היפוקמאל היו מצופים בצלחת 35 מ"מ ב 5.6 x × 104 תאים/צלחת, בעוד הנוירונים היו מצופים ב-7.0 x 104 תאים/צלחת לטיהור של השבר הדנדריטי-עשיר. ב 14 DIV, כמעט אין היפוקמאל נוירונים חופפים ב 5.6 x 104 תאים/צלחת עבור כתמים חיסוני, בעוד רבים של נוירונים היפוקמאל בחלקו חופפים עם נוירונים אחרים ב 7.0 x 104 תאים/צלחת לטיהור של הדנדריטים הדנדריפיאה עשיר שבר. עם זאת, filפאות הדנדריטים היו נוכחים בשפע בשני צפיפויות של נוירונים היפוקמאל. בצפיפות גבוהה תרבויות של נוירונים היפוקמאל לעתים קרובות בוגרת יותר מאשר בצפיפות נמוכה נוירונים היפוקמאל תרבותי; לכן, כוונון הצפיפות של נוירונים היפוקמאל תרבות בצפיפות נמוכה היא הכרחית כדי להשיג את השבר הדנדריטי-עשיר. חרוזי מיקרו-חרוזים נוספו ב-1 x 106 מיקרוחרוזים/צלחת לצביעת חיסוני ו-3 x 106 מיקרוחרוזים/צלחת לטיהור של השבר הדנדריטי-עשיר. לטיהור השבר, לאחר כמות מספקת של חרוזים נוספה, חרוזים לא מאוגדים נשטפו החוצה נוירונים היפוקמאל.
בפרוטוקול זה, מיקרוחרוזים היו מצופים אוטומטית ב-VN, הקיים במדיום התרבותי. עם זאת, מיקרוחרוזים יכול להיות מצופה עם רקומביננטי VN והוסיף נוירונים היפוקמאל. בגלל VN הוא חלבון דביק מאוד, מיקרוחרוזים VN מצופה בקלות ליצור אגרגטים. כך, מיקרוחרוזים VN-מצופה מsonicated ומצנבים לנתק אחד את השני בדיוק לפני בנוסף לנוירונים.
בעבר הראינו שחרוזי מיקרו-מצופי VN מחייבים את פוספור-אה, PI (4, 5) פי2, ו-F-actin יחד עם הצטברות tlcn15. כאשר השבר הדנדריפיאה-עשיר בחלק המערבי נותחו על ידי הכתמים המערביים, פוספהו-אה לא זוהה על ידי נוגדן אנטי-פוספהו-שבטיים והוא זוהה מעט על ידי אנטי-אזרין ואנטי-מוסין נוגדנים חד-שבטיים. מסתבר שרגישות הנוגדנים החד-שבטיים הייתה גבוהה יותר מהנוגדן לאנטי-פוספאהו-שבטיים. בנוסף, חלבונים מקומיים היו מותאמים כמעט לכל האזורים של נוירונים היפוקמאל, אבל החלבונים פוספהו-אה היו רק מותאמים לקצה של filפיאה הדנדריטי ואת הגביע phagocytic. הוא נחשב כי כמות הקשירה של פוספהו-אה ל-TLCN מוגבלת בהשוואה לכמות ה-it הלא זרחנת. כך, זיהוי של פוספהו-אה בחלק הדנדריטי-עשיר, נראה קשה.
כדי לנתק את המיקרוחרוזים מקרום התא, השתמשנו בחומר ניקוי חלש, 0.01% טריטון X-100. TLCN מקושרת לפילמנט באמצעות פוספהו-אה בתוך מבנה הגביע הדנדריטי ומבני הספל phagocytic. כדי לטהר את החלבונים המקושרים בעקיפין ל-TLCN דרך החוט הטטין, השתמשנו בתכשיר כביסה חלש בפרוטוקול זה. עם זאת, הריכוז של טריטון X-100 יכול להשתנות לריכוז גבוה יותר בהתאם למטרת הניסוי.
Esselens ואח ' הראה כי קליטת phagocytic של מיקרוחרוזים המושרה TLCN, פיפ2, ו-F-actin הצטברות של נוירונים היפוקמאל מתורבתים17. על פי הניתוח שלנו באמצעות מיקרוסקופ מוקד לאחר 24 שעות של דגירה עם מיקרוחרוזים, המיקרוחרוזים לא לגמרי נלקח לתוך הציטופלסמה. TLCN ו-PIP2, אשר מותאמים לקרום התא, היו מותאמים סביב חרוזים, במיוחד על החלק התחתון של מיקרוחרוזי. בנוסף, 319 חלבונים המזוהים מתוך השבר הדנדריטי-עשיר, נותחו באמצעות ניתוח מסלול KEGG. מסלולים של פאגוציטוזה והמסלולים האוטומטיים לא זוהו, אך הארגון מבוסס על השלד, האקסוציציטוזה, התהליך המבוסס על פילטין, ותהליך המיקרו-כדורית מועשר באופן משמעותי בשבר18.
המנגנון המולקולרי של היווצרות הפילופיאה הדנדריטי נשאר ברובו לא ידוע. ניתוח של מבנה הגביע phagocytic יכול לעזור להבין את המרכיבים המולקולריים ופונקציות דינמיות של filפאות הדנדריטי. זה יהיה מעניין לנתח את השבר הדנדריטי-עשיר שהוכן מדגמי העכבר של הפרעות נוירולוגיות התפתחותית נוירופסיכיאטרית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
אנו מודים Shigeo Okabe ו היטומי Matsuno עבור התרבות בצפיפות נמוכה של נוירונים היפוקמאל, מסאיושי מישנה עבור העכברים TLCN-לקויה, Sachiko מיצ ו מומוקו Shioזאקי לסיוע טכני, וחברי המעבדה יושיהארה לדיונים מועילים . עבודה זו נתמכת על ידי JSPS KAKENHI גרנט Nos. JP20700307, JP22700354, ו JP24500392 ו-MEXT KAKENHI גרנט Nos. JP23123525 ל-YF ו-JP20022046, JP18H04683 וJP18H05146 ל-YY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 1.7 mLl Low Binding MCT | Sorenson BioScience | 39640T | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | 2530149 | |
| 35 mm plastic cell culture dishes | Corning | 430165 | |
| Anti-actin | Sigma-Aldrich | A-5060 | |
| Anti-alpha-Actinin | Sigma-Aldrich | A-5044 | |
| Anti-alpha-tubulin | Sigma-Aldrich | T-9026 | |
| Anti-Ezrin | Sigma-Aldrich | clone3C12, SAB4200806 | |
| Anti-Galphaq | Santacruz | sc-393 | |
| Anti-MAP2 | Chemicon | clone AP20, MAB3418 | |
| Anti-Moesin | Sigma-Aldrich | clone 38/87, M7060 | |
| Anti-PLCbeta1 | Santacuz | sc-5291 | |
| Anti-PSD95 | MA2 | ABR | |
| Anti-Spectrin beta | Chemicon | MAB1622 | |
| B27 | Gibco | 0080085SA | |
| BCA protein assay kit | Thermo | 23227 | |
| Bromophenol blue | Merck | 1.08122.0005 | |
| Calcium chrolide, hydrous | Wako | 038-19735 | |
| Cell scraper | Falcon | 353085 | |
| Cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Choline chloride | Sigma-Aldrich | C7527 | |
| Complete EDTA free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Cytosine beta-D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich | C-6645 | |
| DNase-I | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma-Aldrich | P5155 | |
| DynaMag-2 Magnet | Thermo | 12321D | |
| ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE | RPN2232 | |
| e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gradient gel | ATTO | E-T520L | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
| HBSS | Gibco | 14175095 | |
| HRP-conjugated anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | |
| i-Inositol | Sigma-Aldrich | I7508 | |
| LAS-1000 mini | Fuji Film | LAS-1000 mini | For detection of luminescence from WB membrane |
| Magnetic polystyrene microbeads | Sperotech | PM-20-10 | |
| MEM amino acid solution | Gibco | 11130-051 | 30 mM L-Arginine hydrochloride, 5 mM L-Cystine, 10 mM L-Histidine hydrochloride-H2O, 20 mM L-Isoleucine, 20 mM L-Leucine, 19.8 mM L-Lysine hydrochloride, 5.1 mM L-Methionine, 10 mM L-Phenylalanine, 20 mM L-Threonine, 2.5 mM L-Tryptophan, 10 mM L-Tyrosine, and 20 mM L-Valine |
| Mini-slab size electrophoresis system | ATTO | AE-6530 | |
| Niacinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Penicilin / Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail | Roche | 4906845001 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Nacali | 28360-14 | |
| Pyridoxal HCl | Sigma-Aldrich | P6155 | |
| Riboflavin | Sigma-Aldrich | R9504 | |
| Silver Stain 2 Kit wako | Wako | 291-5031 | |
| Thiamine HCl | Sigma-Aldrich | T1270 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-rad | 1703940JA | |
| Ultra pure water | MilliQ | For production of ultra pure water |
References
- Fiala, J. C., Feinberg, M., Popov, V., Harris, K. M. Synaptogenesis via dendritic filopodia in developing hippocampal area CA1. Journal of Neuroscience. 18 (21), 8900-8911 (1998).
- Portera-Cailliau, C., Pan, D. T., Yuste, R. Activity-regulated dynamic behavior of early dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia. Journal of Neuroscience. 23 (18), 7129-7142 (2003).
- Ziv, N. E., Smith, S. J. Evidence for a role of dendritic filopodia in synaptogenesis and spine formation. Neuron. 17 (1), 91-102 (1996).
- Lohmann, C., Bonhoeffer, T. A role for local calcium signaling in rapid synaptic partner selection by dendritic filopodia. Neuron. 59 (2), 253-260 (2008).
- Yoshihara, Y., De Roo, M., Muller, D. Dendritic spine formation and stabilization. Current Opinion in Neurobiology. 19 (2), 146-153 (2009).
- Bayes, A., et al. Comparative study of human and mouse postsynaptic proteomes finds high compositional conservation and abundance differences for key synaptic proteins. PLoS One. 7 (10), e46683 (2012).
- Bayes, A., et al. Characterization of the proteome, diseases and evolution of the human postsynaptic density. Nature Neuroscience. 14 (1), 19-21 (2011).
- Furutani, Y., et al. Interaction between telencephalin and ERM family proteins mediates dendritic filopodia formation. Journal of Neuroscience. 27 (33), 8866-8876 (2007).
- Mao, Y. T., et al. Filopodia Conduct Target Selection in Cortical Neurons Using Differences in Signal Kinetics of a Single Kinase. Neuron. 98 (4), 767-782 (2018).
- Matsuno, H., et al. Telencephalin slows spine maturation. Journal of Neuroscience. 26 (6), 1776-1786 (2006).
- Raemaekers, T., et al. ARF6-mediated endosomal transport of Telencephalin affects dendritic filopodia-to-spine maturation. The EMBO Journal. 31 (15), 3252-3269 (2012).
- Mori, K., Fujita, S. C., Watanabe, Y., Obata, K., Hayaishi, O. Telencephalon-specific antigen identified by monoclonal antibody. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (11), 3921-3925 (1987).
- Yoshihara, Y., Mori, K. Telencephalin: a neuronal area code molecule? Neuroscience Research. 21 (2), 119-124 (1994).
- Annaert, W. G., et al. Interaction with telencephalin and the amyloid precursor protein predicts a ring structure for presenilins. Neuron. 32 (4), 579-589 (2001).
- Furutani, Y., et al. Vitronectin induces phosphorylation of ezrin/radixin/moesin actin-binding proteins through binding to its novel neuronal receptor telencephalin. Journal of Biological Chemistry. 287 (46), 39041-39049 (2012).
- Nyman-Huttunen, H., Tian, L., Ning, L., Gahmberg, C. G. alpha-Actinin-dependent cytoskeletal anchorage is important for ICAM-5-mediated neuritic outgrowth. Journal of Cell Biology. 119 (Pt 15), 3057-3066 (2006).
- Esselens, C., et al. Presenilin 1 mediates the turnover of telencephalin in hippocampal neurons via an autophagic degradative pathway. Journal of Cell Biology. 166 (7), 1041-1054 (2004).
- Furutani, Y., Yoshihara, Y. Proteomic Analysis of Dendritic Filopodia-Rich Fraction Isolated by Telencephalin and Vitronectin Interaction. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 10, 27 (2018).
- Lu, Z., Piechowicz, M., Qiu, S. A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture. Journal of Visualized Experiments. (109), (2016).
- Okabe, S., Miwa, A., Okado, H. Alternative splicing of the C-terminal domain regulates cell surface expression of the NMDA receptor NR1 subunit. The Journal of Neuroscience. 19 (18), 7781-7792 (1999).
- Okabe, S., Vicario-Abejon, C., Segal, M., McKay, R. D. Survival and synaptogenesis of hippocampal neurons without NMDA receptor function in culture. European Journal of Neuroscience. 10 (6), 2192-2198 (1998).
