Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Rensing av dendrittiske Filopodia-rik brøk

doi: 10.3791/59292 Published: May 2, 2019

Summary

I denne protokollen introduserer vi en metode for rensing av dendrittiske filopodia fraksjon fra phagocytic Cup-lignende protrusion struktur på kultivert hippocampus neurons ved å utnytte den spesifikke og sterke affinitet mellom en dendrittiske filopodial vedheft molekyl, TLCN, og en ekstracellulære matrise molekyl, vitronectin.

Abstract

Dendrittiske filopodia er tynne og lange utstikkende basert på utgangen filament, og de strekker og trekker seg som om du søker etter et mål axon. Når dendrittiske filopodia etablere kontakt med en mål axon, begynner de å modnes i pigger, noe som fører til dannelsen av en synapse. Telencephalin (TLCN) er rikelig lokalisert i dendrittiske filopodia og blir gradvis ekskludert fra pigger. Overuttrykte av TLCN i kultivert hippocampus neurons induserer dendrittiske filopodia formasjon. Vi viste at telencephalin sterkt binder seg til en ekstracellulære matrise molekyl, vitronectin. Vitronectin-belagt mikroperler indusert phagocytic kopp formasjon på neuronal dendrites. I phagocytic Cup, TLCN, TLCN-bindende proteiner som fosforylert Ezrin/Radixin/Moesin (fosfat-ERM), og F-utgangen er akkumulert, noe som tyder på at komponentene i phagocytic koppen er lik de av dendrittiske filopodia. Derfor utviklet vi en metode for rensing av phagocytic koppen i stedet for dendrittiske filopodia. Magnetiske polystyren perler var belagt med vitronectin, som er rikelig til stede i kulturen medium for hippocampus neurons og som induserer phagocytic kopp formasjon på neuronal dendrites. Etter 24 h av inkubasjons, phagocytic koppene var mildt solubilized med vaskemiddel og samlet inn ved hjelp av en magnet separator. Etter vask av perlene, ble de bindende proteinene eluert og analysert av sølv flekker og vestlig blotting. I bindingen brøk, TLCN og utgangen var rikelig til stede. I tillegg ble mange proteiner identifisert fra fraksjonen lokalisert til dendrittiske filopodia; dermed kalte vi bindingen brøk som dendrittiske filopodia-rik brøk. Denne artikkelen beskriver detaljer om rensing metoden for dendrittiske filopodia-rik brøk.

Introduction

Dendrittiske filopodia antas å være forløpere for pigger. Utgangen filamenter i dendrittiske filopodia regulere sin forlengelse og uttrekk1,2,3. Etter å ha kontaktet en axon, valgte dendrittiske filopodia begynne sin modning i pigger, og en synapse er dannet4,5. Komponenter av pigger har blitt bestemt fra omfattende analyse av postsynaptic tetthet fraksjoner6,7, mens komponenter av dendrittiske filopodia fortsatt i stor grad ukjent. Det har blitt vist at telencephalin (TLCN), erm, SynGAP, RAS, PI3 kinase, akt, mTOR, Polo-like kinase 2, CaMKII, syndecan-2, paralemin-1, ARF6, og EphB regulere dendrittiske filopodia formasjon5,8,9 ,10,11, mens en metode ikke er utviklet for den omfattende analyse av molekyler til stede i dendrittiske filopodia.

TLCN (ICAM-5) er spesielt uttrykt ved spiny neurons i de mest rostral hjernen segmentet, Telencephalon12. TLCN har 9 IG-lignende domener i sin ekstracellulære region, en transmembrane region, og en cytoplasmatiske hale13. TLCN binder seg til vitronectin (vn) og LFA-1 integrin i sin ekstracellulære region, til presenilin i sin transmembrane region, og til fosfat-erm og α-actinin i sin cytoplasmatiske region5,8,14,15 ,16. TLCN binder seg til utgangen cytoskeleton gjennom fosfat-erm på tuppen av dendrittiske filopodia og α-actinin i pigger og dendrittiske aksler8,16.

Vi viste at overuttrykte av TLCN forbedret dendrittiske filopodia formasjon og indusert reversion av pigger til filopodia10. Den konstituerende aktive formen av Ezrin bundet til TLCN cytoplasmatiske regionen og forbedret dendrittiske filopodia formasjon8. Således regulerer TLCN dendrittiske filopodia formasjon gjennom utgangen-bindende proteiner. Esselens et al. demonstrerte at mikroperler indusert TLCN akkumulering på kultivert neurons17. Vi viste at phagocytic Cup strukturer ble dannet på neuronal dendrites rundt VN-belagt mikroperler i en TLCN-avhengig måte15. Bestanddeler av dendrittiske filopodia er lik de av phagocytic koppen. Det er vanskelig å samle dendrittiske filopodia, men det er relativt lettere å samle phagocytic koppen ved hjelp av magnetisk mikroperler. Dermed har vi utviklet en metode for å rense phagocytic koppen i stedet for dendrittiske filopodia18. Her beskriver vi rensing metoden for dendrittiske filopodia-rik brøk.

Protocol

Alle metoder beskrevet her over ha blitt anerkjent av det institusjonell dyr bekymre og bruk komité av RIKEN Wako.

1. kultur hippocampus neurons

  1. Utarbeidelse av kultur medium
    1. Utarbeidelse av 200x vitamin mix. Oppløse 100 mg av D-Pantotensyre acid hemicalcium salt, 100 mg av kolin klorid, 100 mg folsyre, 180 mg av i-Inositol, 100 mg av Niacinamide, 100 mg pyridoxal HCl, og 100 mg av Tiamin HCl i 500 mL av ultrarent vann ved hjelp av en magnetisk rører. Løsningen er ikke helt oppløst. Bland alikvot i 50 mL rør og oppbevar ved-20 ° c.
    2. Utarbeidelse av riboflavin løsning. Løs opp 100 mg av riboflavin i 500 mL ultrarent vann ved hjelp av en magnetisk rører. Løsningen er ikke helt oppløst. Bland alikvot i 50 mL rør og oppbevar ved-20 ° c.
    3. Utarbeidelse av 1 M CaCl2. Løs opp 7,35 g CaCl2· 2h2O i 50 ml ultrarent vann ved hjelp av en magnetisk rører.
    4. Utarbeidelse av minimum essensielle medium (MEM). Oppløse 400 mg KCl, 6800 mg NaCl, 2 200 mg NaHCO3, 158 mg NaH2PO4· 2H2O, 7000 mg D-glukose, og 200 mg MgSO4-7H2O i 950 ml ultrarent vann ved hjelp av en magnetisk rører.
    5. Titrere 1,8 mL 1 M CaCl2 til mem i a drop-by-drop måte ved hjelp av en 1 ml Pipet med en konstant agitasjon på en magnetisk stirrer. Juster pH i MEM til pH 7,25 med 1 mol/L HCl.
    6. Tilsett 5 mL 200x vitamin mix og 200 μL av riboflavin-løsning til MEM. Juster volumet på løsningen til 1 000 mL med ultrarent vann. Filtrer løsningen med et 0,22 μm filter system og oppbevar det ved 4 ° c.
    7. Utarbeidelse av 10x DNase-I lager løsninger. Løs opp 100 mg DNase-i 12,5 mL av Hanks ' balanserte salt løsning (HBSS), Filtrer gjennom et 0,22 μm filter, alikvot i 1,5 mL rør, og oppbevar rørene ved-20 ° c.
    8. Utarbeidelse av cytosin β-D-arabinofuranoside (ARA-C) lagerløsning. Løs opp 25 mg Ara-C i 8,93 mL ultrarent vann (siste konsentrasjon på 10 mM), Filtrer gjennom et 0,22 μm-filter, alikvot i 1,5 mL rør og oppbevares ved-20 ° c
    9. Utarbeidelse av plating medium. Bland 1 mL MEM aminosyre-oppløsning, 750 μL av 1 M HEPES, 1 mL B27, 125 μL av 200 mM glutamin, 250 μL av penicillin/Streptomycin, 2,5 mL av Foster storfe serum (FBS) og 44,375 mL av MEM i et 50 mL rør.
    10. Utarbeidelse av stop medium. Bland 1 mL MEM aminosyre-oppløsning, 750 μL av 1 M HEPES, 5 mL FBS (siste 10%) og 43,25 mL MEM i et 50 mL rør.
  2. Utarbeidelse av Poly-L-lysin-belagte retter
    1. Coat 35 mm plast cellekultur retter med 0,2 mg/mL av Poly-L-lysin Hydrobromide for 1 dag ved 25 ° c.
      Merk: Poly-L-lysin bør ikke brukes i stedet for Poly-L-lysin Hydrobromide.
    2. Vask rettene med 2 mL ultrarent vann 3 ganger. Ruge rettene med 1,5 mL av stop medium ved 25 ° c til bruk.
  3. Disseksjon av hippocampus neurons fra mus embryo
    1. Tissue kilde av hippocampus neurons. Analysere hippocampus fra vill-type og TLCN-mangelfull C57BL6/J mus på embryonale dager 16-17 i henhold til metoden for Lu et al.19.
    2. Ruge dissekert hippocampi i 0,25% Trypsin og 1x DNaseI i HBSS inneholdende 15 mM HEPES, pH 7,2 i 15 min ved 37 ° c med agitasjon hver 3 min. Fjern løsningen. Ruge hippocampi i 10 mL av STOP medium for å deaktivere Trypsin ved 4 ° c i 5 min.
    3. Flytt hippocampi inn i 10 mL friskt STOP-medium og ruge ved 4 ° c i 5 min. Flytt hippocampi til 10 mL friskt STOP-medium og ruge ved 4 ° c i ytterligere 5 min. Flytt hippocampi til 900 μL av STOP medium og 100 μL av 10x DNaseI i en 15 mL rør. Distansere hippocampi i isolerte neurons av pipettering 20 ganger ved hjelp av en 1 mL Pipet.
      Merk: Tuppen av 1 mL Pipet litt berører bunnen av 15 mL rør under dissosiasjon av hippocampi.
    4. Tilsett 9 mL plating medium, og Filtrer gjennom en 70 μm celle sil til et 50 mL rør. Tell antall celler ved hjelp av en hemocytometer og Juster til 3,5 x 104 celler/ml i plating medium.
    5. Aspirer STOP medium fra Poly-L-lysin-belagte retter. Plate cellene på Poly-L-lysin-belagte retter på 7 x 104 celler/parabol (2 ml/parabol).
    6. Etter 60-64 h av inkubasjons under 5% CO2 ved 37 ° c, tilsett 2 μL Ara-C lagerløsning (siste 10 μM) til neurons, og riste parabolen langsomt. Hold kulturen retter i en fuktet boks uten å endre kulturen medium under 5% CO2 ved 37 ° c.

2. rensing av dendrittiske Filopodia-rik brøk

  1. Etter 13 dager in vitro (DIV), tilsett magnetiske polystyren mikroperler (3 x 106 partikler/parabol) til 20 retter som inneholder kulturperler neurons. Etter 1 dag, vask neurons i 1 mL PBS med agitasjon 3 ganger for å fjerne medium og ubundet mikroperler. Etter fjerning av PBS, lyse neurons med 500 μL/Dish av lyseringsbuffer (PBS inneholder 0,01% Triton X-100, EDTA-fri protease inhibitor cocktail, og fosfatase inhibitor cocktail).
  2. Samle lysat med en celle skrape og flytte lysat til lav protein-binding mikrorør (10 rør). Sett rørene på en magnet separator og vent i 1 min. samle supernatanten og bruke den som ubundet brøkdel for sølv farging og Western Blot analyse.
  3. Overfør perlene til en ny lav-protein-binding microtube, satt på en magnetisk separator, og helt fjerne supernatanten. Tilsett 500 μL av lyseringsbuffer og vask perlene med en Vortex-mikser i 15 s. sett slangen på en magnet separator, vent i 1 min, Fjern supernatanten og tilsett 500 μL av lyseringsbuffer. Gjenta vask av perlene 10 ganger og fjern supernatanten.
  4. Eluere proteiner som er bundet til perlene (den bundne fraksjonen) ved tilsetning av 50 μL av 1x SDS prøve buffer (62,5 mM Tris HCl, pH 6,8, 2,5% SDS, og 10% glyserol) og kok røret ved 98 ° c i 5 min. sentrifuger røret ved 860 x g for 10 s og sett slangen på et magnetisk skilletegn i 1 min. samle supernatanten og bruk den som den bundne fraksjonen.
    Merk: Protokollen kan stanses midlertidig her.
  5. Mål protein konsentrasjoner av ubundet og bundet fraksjoner av BCA protein analysen. Visualiser protein løsninger med bromophenol blå og Juster konsentrasjonen til 5 ng/μL for SDS-PAGE.

3. Silver farging og Western Blot analyse

  1. Skill de bundne og ubundne fraksjonene (50 ng) ved SDS-PAGE ved hjelp av en 5-20% gradert gel. Silver-stain gelen.
  2. Western Blot ved hjelp av anti-TLCN-C (1/3000), anti-storfe vitronectin (1/5000), anti-utgangen (1/1000), og anti-α-tubulin (1/1000) som primære antistoffer og HRP-bøyd geit anti-kanin IgG (1/5000) som sekundær antistoff. Visualiser antigener ved hjelp av chemiluminiscerende Western blotting Detection reagens og et kjemiluminescens Imager.

Representative Results

I kulturperler hippocampus neurons, var TLCN rikelig lokalisert til dendrittiske filopodia, aksel, og Soma og colocalized med F-utgangen (figur 1a, B). Når polystyren mikroperler ble lagt til kultivert hippocampus neurons, ble perlene automatisk belagt med vitronectin (VN) avledet fra fosterets storfe serum (FBS) i kulturen medium; de var hovedsakelig bundet til dendrites, og de induserte dannelsen av phagocytic kopper (figur 1B-E). Phagocytic kopper var basert på ark-formet utgangen filamenter rundt mikroperler på dendrites. TLCN, fosfat-erm og PI (4, 5) P2, som er markører for dendrittiske filopodia, er svært akkumulert rundt perler (figur 1d)8,15. Phagocytic kopper ble bare dannet på vill-type hippocampus neurons, men ikke på TLCN-mangelfull hippocampus neurons (figur 2a-D). Således ble den phagocytic kalk formasjonen avgjørende avhengig av tilstedeværelsen av TLCN i dendrites.

Bestanddeler av dendrittiske filopodia dukket opp som ligner på de av phagocytic kopper. Deretter renset vi phagocytic kopper i stedet for dendrittiske filopodia. Protokollen for rensing av phagocytic kopper er skjematisk vist i Figur 3. Magnetisk mikroperler ble lagt til vill-type kultivert hippocampus neurons, som induserer dannelsen av phagocytic kopp strukturer. De phagocytic kopp strukturene ble lysert med et svakt vaskemiddel. Mikroperler ble samlet etter lyse Rings boksen med en magnet separator. Etter vask av perlene ble deres bindende proteiner kokt og eluert i en SDS prøve buffer.

Mengden av proteiner i bundet og ubundet brøkdel ble målt ved hjelp av BCA protein analysen Kit. Samme mengde proteiner i de ubundne og bundne fraksjoner ble adskilt av SDS-PAGE og farget av sølv flekker (figur 4a). Protein bånd mønstrene var nesten de samme for de ubundne og bundne fraksjoner, men intensiteten på 50 og 70 kDa i den bundne fraksjonen var lavere enn i den ubundne fraksjonen. Men bandet intensiteten var ikke åpenbart forskjellig mellom de ubundne og bundne fraksjoner fremstilt fra TLCN-mangelfull kultur hippocampus neurons. For å bekrefte rensing av phagocytic Cup strukturer, utførte vi vestlige blotting ved hjelp av anti-TLCN-C, anti-storfe vitronectin, anti-utgangen, og anti-α-tubulin (figur 4b). TLCN og VN ble hovedsakelig oppdaget i den bundne fraksjonen. Utgangen, Ezrin, Gαq, PLCβ1, MAP-2 og spectrin ble påvist i både bundne og ubundne fraksjoner. Moesin, PSD-95, α-actinin og α-tubulin ble påvist i den ubundne fraksjonen.

Figure 1
Figur 1: lokalisering av TLCN og F-utgangen i dendrittiske filopodia og phagocytic kopper. (A) Immunofluorescence farging av dendrites av en kultivert hippocampus Nevron uttrykker gapVenus med anti-GFP antistoff (blå i et flettet bilde), anti-TLCN antistoff (rødt i et flettet bilde), og phalloidin (grønn i et flettet bilde). TLCN og F-utgangen er rikelig observert i dendrittiske filopodia. (B, C) Dannelse av phagocytic Cup strukturer på neuronal dendrites. Fluorescerende mikroperler (blå i sammenslåtte bilder av B, C) lagt til kulturperler hippocampus neurons sterkt følge på dendrites og indusere akkumulering av TLCN (rød i sammenslåtte bilder av B, C) og F-utgangen (grønn i sammenslåtte bilder av B, C). (D) en lateral visning av en dendrittiske phagocytic kopp rekonstruert fra konfokalmikroskopi bilder avslører TLCN (rød i sammenslåtte bilder av d) rundt fluorescerende perle (blå i sammenslåtte bilder av d). (E) en dendrittiske phagocytic kopp indusert av en magnetisk microbead festet på en neuronal dendrit og immunostained med anti-vn antistoff (blå i sammenslåtte bilder av e), anti-TLCN antistoff (rød i sammenslåtte bilder av e), og phalloidin (grønn i sammenslåtte bilder av E). Skaler stolper = 1 μm inn (D); 2 μm i (A), (C), og (E); og 20 μm inn (B). Dette tallet er endret fra en tidligere studie18. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: TLCN-avhengig dannelse av phagocytic Cup-lignende struktur. (A-D) Trippel fluorescens bilder av vill-type (WT; A, C) og TLCN-mangelfull (KO; C, D) neurons behandlet med VN-belagt fluorescerende perler (rød i sammenslåtte bilder av A, B, C, D) og merket med anti-TLCN antistoff (grønn i sammenslåtte bilder av A, B, C, D) og anti-fosfat-ERM antistoff (blå i sammenslåtte bilder av A, B) eller Alexa488-phalloidin (blå i fusjonerte bilder av C, D). Vektstenger = 5 μm. Dette tallet er endret fra en tidligere studie15. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: et skjematisk diagram som illustrerer rensing prosedyren av dendrittiske filopodia-rik brøk. Magnetisk mikroperler ble lagt inn i kulturperler hippocampus neurons å indusere dannelsen av dendrittiske phagocytic kopper. Etter 1 dag med inkubasjons ble neurons solubilized med lyseringsbuffer inneholdende 0,01% Triton X-100. Perlene ble separert fra den ubundne fraksjonen ved hjelp av et magnetisk skille. Etter vask ble de bundne proteinene eluert med SDS prøve buffer og brukt som den bundne fraksjonen. Rød: VN, grønn: TLCN, andre farger: bundet proteiner. Dette tallet er endret fra en tidligere studie18. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: bekreftelse på phagocytic kopp brøk. (A) sølv farging av proteiner i de ubundne og bundne fraksjoner av mikroperler. Det samme beløpet (50 ng) av proteiner i de ubundne og bundne fraksjoner renset fra vill-type (WT) og TLCN-mangelfull (TLCN KO) hippocampus neurons ble separert av SDS-side og visualisere med sølv flekker. (B) Western Blot analyse av de ubundne og bundne fraksjoner. Det samme beløpet (50 ng) av proteiner ble separert av SDS-side og utsatt for Western Blot analyse ved hjelp av anti-TLCN, anti-VN, anti-utgangen, anti-Ezrin, anti-moesin, anti-Gαq, anti-PLCβ1, anti-MAP-2, anti-spectrin, anti-PSD-95, anti-α-actinin, og anti-α-tubulin antistoffer. Legg merke til at TLCN, VN, utgangen, Ezrin, PLCβ1, MAP-2 og spectrin er observert i den dendrittiske filopodia Brøkdelen. Dette tallet er endret fra en tidligere studie18. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Vi utviklet en rensing metode for dendrittiske filopodia-rike brøkdel ved hjelp av affinitet mellom celle vedheft molekylet TLCN og ekstracellulære Matrix protein vitronectin. Sammenlignet med PSD brøkdel, kan det være mulig å identifisere Synaptic proteiner opptrer på umodne synapse fra dendrittiske filopodia-rik brøk. Dermed er bestanddelene av dendrittiske filopodia-rik brøk er forskjellig fra de av PSD brøkdel av 74%. Forskjellig fra PSD brøkdel, brukte vi kultivert hippocampus neurons å aktivt danne phagocytic kopper, og cellene må være i live. For å danne phagocytic koppen, brukte vi samspillet mellom TLCN og vitronectin. TLCN-uttrykket er begrenset i Telencephalon. Dermed kan vi ikke bruke kultivert neurons avledet fra lillehjernen. Men hvis vi pels perlene med forskjellige proteiner, denne aktiviteten avhengig rensing metoden kan brukes til lillehjernen neurons. For eksempel når N-Terminal domene av glutamat reseptor delta2-belagt mikroperler brukes på lillehjernen granule celler, presynaptiske nerve neurexin og cbln1 ble identifisert fra bindingen proteiner. Derfor kan denne aktiviteten-avhengige metoden brukes, hvis belegget proteiner er endret. Siden tilgangen av vitronectin-belagt mikroperler er begrenset til hjernen skive og hjernevev, phagocytic kopper ikke dannes effektivt. Således, fremtid verv inkludere utvikler det rensing metoden av dendrittiske filopodia-rik brøk fra hjerne skive og tissue.

I denne protokollen, lav tetthet kultur tilstand brukes til hippocampus neurons, og veksten av gliacellene celler er hemmet av tilsetning av Ara-C10,20,21. Hippocampus neurons er kultivert i MEM utarbeidet av oss selv, men ikke i neurobasal medium, som er mye brukt for kulturen av hippocampus neurons. Hippocampus neurons dør ofte av 14 DIV når kultivert på neurobasal medium, som indikerer at neurobasal medium ikke er egnet for vår lav tetthet kultur tilstand. I tillegg er en viktig del av lav tetthet kultur belegg parabolen med Poly-L-lysin Hydrobromide, som ikke kan erstattes med Poly-L-lysin.

For å oppnå tilstrekkelig mengde proteiner fra dendrittiske filopodia, er antall hippocampus neurons og magnetiske mikroperler viktige faktorer. For immunostaining dendrittiske filopodia, hippocampus neurons ble belagt på en 35 mm parabol på 5,6 x × 104 celler/parabol, mens neurons ble belagt på 7,0 x 104 celler/parabol for rensing av dendrittiske filopodia-rik brøk. Ved 14 DIV, nesten ingen hippocampus neurons overlappes til 5,6 x 104 celler/parabol for immunostaining, mens mange av hippocampus neurons delvis overlappes med de andre neurons ved 7,0 x 104 celler/parabol for rensing av dendrittiske filopodia-rik Brøkdel. Imidlertid var dendrittiske filopodia rikelig tilstede på begge tettheten av hippocampus neurons. Høy tetthet kulturer av hippocampus neurons ofte modne raskere enn lav tetthet kultivert hippocampus neurons; dermed justere tettheten av hippocampus neurons til lav tetthet kultur er uunnværlig for å få dendrittiske filopodia-rik brøk. Mikroperler ble lagt til på 1 x 106 mikroperler/parabol for immunostaining og på 3 x 106 mikroperler/parabol for rensing av dendrittiske filopodia-rik brøk. For rensing av fraksjonen, en gang en tilstrekkelig mengde perler ble tilsatt, ble de ubundne perlene vasket ut fra hippocampus neurons.

I denne protokollen ble mikroperler automatisk belagt med VN, som er til stede i kultur mediet. Imidlertid kan mikroperler være belagt med rekombinant VN og lagt til hippocampus neurons. Fordi VN er en veldig klebrig protein, VN-belagt mikroperler lett form aggregater. Således, VN-belagt mikroperler er sonikert og Pipet tert å distansere fra hverandre like før addisjon å hippocampus neurons.

Vi har tidligere vist at VN-belagt mikroperler induserer fosfor-ERM, PI (4, 5) P2, og F-utgangen sammen med TLCN akkumulering15. Når dendrittiske filopodia-rik brøk ble analysert av vestlige blotting, fosfat-ERM ble ikke oppdaget av anti-fosfat-ERM polyklonale antistoff og ble litt oppdaget av anti-Ezrin og anti-moesin monoklonale antistoffer. Det ser ut til at følsomheten til de monoklonale Antistoffene var høyere enn anti-fosfat-ERM polyklonale antistoff. I tillegg ble ERM-proteiner lokalisert til nesten alle regioner av hippocampus neurons, men fosfat-ERM proteiner var bare lokalisert til spissen av dendrittiske filopodia og phagocytic koppen. Det anses at mengden av fosfat-ERM binding til TLCN er begrenset i forhold til mengden av nonphosphorylated ERM. Således, oppdagelsen av fosfat-ERM inne det dendrittiske filopodia-rik brøk fremgår å bli vanskelig.

For å løsne mikroperler fra cellemembranen brukte vi et svakt vaskemiddel, 0,01% Triton X-100. TLCN er knyttet til utgangen filament gjennom fosfat-ERM i dendrittiske filopodia og phagocytic Cup strukturer. For å rense proteiner indirekte knyttet til TLCN gjennom utgangen filament, brukte vi et svakt vaskemiddel i denne protokollen. Konsentrasjonen av Triton X-100 kan imidlertid endres til en høyere konsentrasjon avhengig av formålet med eksperimentet.

Esselens et al. har vist at phagocytic opptaket av mikroperler indusert TLCN, PIP2, og F-utgangen akkumulering i kultivert hippocampus neurons17. Ifølge vår analyse via konfokalmikroskopi mikroskopi etter 24 h av inkubasjons med mikroperler, var mikroperler ikke helt tatt opp i cytoplasma. TLCN og PIP2, som er lokalisert til cellemembranen, var lokalisert rundt perler, spesielt på bunnen av mikroperler. I tillegg ble 319 proteiner identifisert fra den dendrittiske filopodia-rike fraksjonen analysert ved hjelp av KEGG vei analyse. Fagocytose og autofagi trasé ble ikke oppdaget, men cytoskeleton organisasjonen, exocytosis, utgangen-filament-basert prosess, og mikrotubulinettverket-baserte prosessen ble betydelig beriket i brøkdelen18.

Den molekylære mekanismen av dendrittiske filopodia formasjon er fortsatt i stor grad ukjent. Analyse av phagocytic Cup strukturen kan bidra til å forstå molekyl bestanddeler og dynamiske funksjoner av dendrittiske filopodia. Det ville være interessant å analysere dendrittiske filopodia-rike brøkdel fremstilt av musemodeller av neurodevelopmental og nevropsykiatriske lidelser.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Shigeo Okabe og Hitomi Matsuno for lav tetthet kultur hippocampus neurons, Masayoshi Mishina for TLCN-mangelfull mus, Sachiko Mitsui og Momoko Shiozaki for teknisk assistanse, og medlemmer av Yoshihara laboratoriet for nyttige diskusjoner . Dette arbeidet ble støttet av JSP KAKENHI Grant NOS. JP20700307, JP22700354 og JP24500392 og MEXT KAKENHI Grant NOS. JP23123525 til YF og JP20022046, JP18H04683 og JP18H05146 til åå.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 M HEPES Gibco 15630-080
1.7 mLl Low Binding MCT Sorenson BioScience 39640T
200 mM L-Glutamine Gibco 2530149
35 mm plastic cell culture dishes Corning 430165
Anti-actin Sigma-Aldrich A-5060
Anti-alpha-Actinin Sigma-Aldrich A-5044
Anti-alpha-tubulin Sigma-Aldrich T-9026
Anti-Ezrin Sigma-Aldrich clone3C12, SAB4200806
Anti-Galphaq Santacruz sc-393
Anti-MAP2 Chemicon clone AP20, MAB3418
Anti-Moesin Sigma-Aldrich clone 38/87, M7060
Anti-PLCbeta1 Santacuz sc-5291
Anti-PSD95 MA2 ABR
Anti-Spectrin beta Chemicon MAB1622
B27 Gibco 0080085SA
BCA protein assay kit Thermo 23227
Bromophenol blue Merck 1.08122.0005
Calcium chrolide, hydrous Wako 038-19735
Cell scraper Falcon 353085
Cell strainer Falcon 352350
Choline chloride Sigma-Aldrich C7527
Complete EDTA free protease inhibitor cocktail Roche 11873580001
Cytosine beta-D-arabinofuranoside Sigma-Aldrich C-6645
DNase-I Sigma-Aldrich DN-25
D-Pantothenic acid hemicalcium salt Sigma-Aldrich P5155
DynaMag-2 Magnet Thermo 12321D
ECL Prime Western Blotting Detection Reagent GE RPN2232
e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gradient gel ATTO E-T520L
Folic acid Sigma-Aldrich F8758
HBSS Gibco 14175095
HRP-conjugated anti-rabbit IgG Jackson ImmunoResearch 111-035-144
i-Inositol Sigma-Aldrich I7508
LAS-1000 mini Fuji Film LAS-1000 mini For detection of luminescence from WB membrane
Magnetic polystyrene microbeads Sperotech PM-20-10
MEM amino acid solution Gibco 11130-051 30 mM L-Arginine hydrochloride, 5 mM L-Cystine, 10 mM L-Histidine hydrochloride-H2O, 20 mM L-Isoleucine, 20 mM L-Leucine, 19.8 mM L-Lysine hydrochloride, 5.1 mM L-Methionine, 10 mM L-Phenylalanine, 20 mM L-Threonine, 2.5 mM L-Tryptophan, 10 mM L-Tyrosine, and 20 mM L-Valine
Mini-slab size electrophoresis system ATTO AE-6530
Niacinamide Sigma-Aldrich N0636
Penicilin / Streptomycin Gibco 15070063
PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail Roche 4906845001
Poly-L-lysine hydrobromide Nacali 28360-14
Pyridoxal HCl Sigma-Aldrich P6155
Riboflavin Sigma-Aldrich R9504
Silver Stain 2 Kit wako Wako 291-5031
Thiamine HCl Sigma-Aldrich T1270
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell Bio-rad 1703940JA
Ultra pure water MilliQ For production of ultra pure water

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fiala, J. C., Feinberg, M., Popov, V., Harris, K. M. Synaptogenesis via dendritic filopodia in developing hippocampal area CA1. Journal of Neuroscience. 18, (21), 8900-8911 (1998).
  2. Portera-Cailliau, C., Pan, D. T., Yuste, R. Activity-regulated dynamic behavior of early dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia. Journal of Neuroscience. 23, (18), 7129-7142 (2003).
  3. Ziv, N. E., Smith, S. J. Evidence for a role of dendritic filopodia in synaptogenesis and spine formation. Neuron. 17, (1), 91-102 (1996).
  4. Lohmann, C., Bonhoeffer, T. A role for local calcium signaling in rapid synaptic partner selection by dendritic filopodia. Neuron. 59, (2), 253-260 (2008).
  5. Yoshihara, Y., De Roo, M., Muller, D. Dendritic spine formation and stabilization. Current Opinion in Neurobiology. 19, (2), 146-153 (2009).
  6. Bayes, A., et al. Comparative study of human and mouse postsynaptic proteomes finds high compositional conservation and abundance differences for key synaptic proteins. PLoS One. 7, (10), e46683 (2012).
  7. Bayes, A., et al. Characterization of the proteome, diseases and evolution of the human postsynaptic density. Nature Neuroscience. 14, (1), 19-21 (2011).
  8. Furutani, Y., et al. Interaction between telencephalin and ERM family proteins mediates dendritic filopodia formation. Journal of Neuroscience. 27, (33), 8866-8876 (2007).
  9. Mao, Y. T., et al. Filopodia Conduct Target Selection in Cortical Neurons Using Differences in Signal Kinetics of a Single Kinase. Neuron. 98, (4), 767-782 (2018).
  10. Matsuno, H., et al. Telencephalin slows spine maturation. Journal of Neuroscience. 26, (6), 1776-1786 (2006).
  11. Raemaekers, T., et al. ARF6-mediated endosomal transport of Telencephalin affects dendritic filopodia-to-spine maturation. The EMBO Journal. 31, (15), 3252-3269 (2012).
  12. Mori, K., Fujita, S. C., Watanabe, Y., Obata, K., Hayaishi, O. Telencephalon-specific antigen identified by monoclonal antibody. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, (11), 3921-3925 (1987).
  13. Yoshihara, Y., Mori, K. Telencephalin: a neuronal area code molecule? Neuroscience Research. 21, (2), 119-124 (1994).
  14. Annaert, W. G., et al. Interaction with telencephalin and the amyloid precursor protein predicts a ring structure for presenilins. Neuron. 32, (4), 579-589 (2001).
  15. Furutani, Y., et al. Vitronectin induces phosphorylation of ezrin/radixin/moesin actin-binding proteins through binding to its novel neuronal receptor telencephalin. Journal of Biological Chemistry. 287, (46), 39041-39049 (2012).
  16. Nyman-Huttunen, H., Tian, L., Ning, L., Gahmberg, C. G. alpha-Actinin-dependent cytoskeletal anchorage is important for ICAM-5-mediated neuritic outgrowth. Journal of Cell Biology. 119, (Pt 15), 3057-3066 (2006).
  17. Esselens, C., et al. Presenilin 1 mediates the turnover of telencephalin in hippocampal neurons via an autophagic degradative pathway. Journal of Cell Biology. 166, (7), 1041-1054 (2004).
  18. Furutani, Y., Yoshihara, Y. Proteomic Analysis of Dendritic Filopodia-Rich Fraction Isolated by Telencephalin and Vitronectin Interaction. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 10, 27 (2018).
  19. Lu, Z., Piechowicz, M., Qiu, S. A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture. Journal of Visualized Experiments. (109), (2016).
  20. Okabe, S., Miwa, A., Okado, H. Alternative splicing of the C-terminal domain regulates cell surface expression of the NMDA receptor NR1 subunit. The Journal of Neuroscience. 19, (18), 7781-7792 (1999).
  21. Okabe, S., Vicario-Abejon, C., Segal, M., McKay, R. D. Survival and synaptogenesis of hippocampal neurons without NMDA receptor function in culture. European Journal of Neuroscience. 10, (6), 2192-2198 (1998).
Rensing av dendrittiske Filopodia-rik brøk
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Furutani, Y., Yoshihara, Y. Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction. J. Vis. Exp. (147), e59292, doi:10.3791/59292 (2019).More

Furutani, Y., Yoshihara, Y. Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction. J. Vis. Exp. (147), e59292, doi:10.3791/59292 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter