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Neuroscience

Purificação da fração rica de Filopodia dendrítica

doi: 10.3791/59292 Published: May 2, 2019

Summary

Neste protocolo, nós introduzimos um método para purificante a fração filopodia-rica dendríticas do fagocitária copo-como a estrutura do protrusão em neurônios hippocampal cultivados aproveitando-se da afinidade específica e forte entre um filopodial dendríticas molécula de adesão, TLCN, e uma molécula de matriz extracelular, vitronectina.

Abstract

Os filopódios dendríticos são protrusões finas e longas com base no filamento de actina, e eles se estendem e se retraem como se estivessem buscando um AXON alvo. Quando o filopódia dendrítico estabelecer contato com um AXON alvo, eles começam a amadurecer em espinhos, levando à formação de uma sinapse. A telencífica (tlcn) está abundantemente localizada em filopódia dendrítico e é gradualmente excluída de espinhas. O overexpression de tlcn em neurônios hippocampal cultivados induz a formação dendríticas do filopódia. Nós mostramos que o Telencephalin liga fortemente a uma molécula extracelular da matriz, Vitronectin. Microesferas Vitronectin-revestidos induziu a formação fagocitária do copo em dendrites neuronal. No copo fagocitítico, TLCN, proteínas de ligação TLCN tais como Ezrin fosforilado/Radixina/Moesina (fosho-ERM), e F-Actina são acumuladas, o que sugere que os componentes do copo fagocítico são semelhantes aos de filopodia dendrítico. Assim, desenvolvemos um método para purificação do copo fagocítico em vez de filopópodes dendrítico. Os grânulos magnéticos do poliestireno foram revestidos com o Vitronectin, que é abundantemente atual no meio de cultura de neurônios hippocampal e que induz a formação fagocitária do copo em dendrites neuronal. Após 24 h de incubação, os copos fagocíticos foram levemente solubilizados com detergente e coletados por meio de um separador magnético. Após a lavagem dos grânulos, as proteínas de ligação foram eluidas e analisadas por coloração de prata e western blotting. Na fração de ligação, TLCN e actina estavam abundantemente presentes. Além, muitas proteínas identificadas da fração foram localizadas ao filopodia dendríticas; assim, denominamos a fração de ligação como a fração rica em filopóticos dendrítico. Este artigo descreve detalhes a respeito do método da purificação para a fração filopodia-rica dendríticas.

Introduction

O filopódia dendrítico é pensado para ser precursores dos espinhas. Os filamentos de actina no filopódia dendrítico regulam sua extensão e retração1,2,3. Depois de entrar em contato com um axão, o filopódia dendrítico selecionado começa sua maturação em espinhos, e uma sinapse é formada em4,5. Componentes de espinhos foram determinados a partir da análise abrangente das frações de densidade pós-sináptica6,7, enquanto os componentes de filopódia dendrítico permanecem em grande parte desconhecidos. Demonstrou-se que a telencérola (tlcn), erm, syngap, Ras, ARF6 quinase, Akt, mTOR, Polo-como a quinase 2, camkii, syndecan-2, paralemin-1, e ephb regulam a formação dendrítica defilopódia5,8,9 ,10,11, enquanto um método não foi desenvolvido para a análise abrangente de moléculas presentes no filopódio dendrítico.

Tlcn (ICAM-5) é expressado especificamente por neurônios spiny no segmento o mais rostral do cérebro, o telencéfalo12. Tlcn tem 9 domínios do IG-like em sua região extracelular, uma região do transmembrana, e uma cauda cytoplasmic13. A tlcn liga-se à vitronectina (vn) e à integrina LFA-1 em sua região extracelular, à presenilina em sua região transmembranar e ao fosho-ERM e α-actinina em sua região citoplasmática5,8,14,15 ,16. Tlcn liga-se ao citoesqueleto de actina através de fosho-ERM nas pontas de filopódia dendrítico e α-actinina em espinhos e eixos dendríticos8,16.

Nós mostramos que o superexpressão de tlcn aumentou a formação dendríticas do filopódia e induziu a reversão dos espinhos ao filopódia10. A forma ativa constitutiva de Ezrin ligada à região citoplasmática do TLCN e a formação de filopótico dendrítica reforçada8. Assim, a TLCN regula a formação de filopódios dendríticos através de proteínas de ligação actina. Esselens et al. demonstraram que microgrânulos induziu acúmulo de TLCN em neurônios cultivados17. Nós mostramos que as estruturas fagocitária do copo foram dadas forma em dendritos neuronal em torno dos microesferas vn-revestidos em uma maneira tlcn-dependente15. Constituintes de filopódios dendríticos são semelhantes aos do copo fagocitítico. É difícil coletar filopódios dendríticos, mas é relativamente mais fácil coletar o copo fagocitítico usando microgrânulos magnéticos. Assim, desenvolvemos um método para purificar o copo fagocitítico em vez de filopódia dendrítico18. Aqui, nós descrevemos o método da purificação para a fração filopodia-rica dendríticas.

Protocol

Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidado e uso de animais da RIKEN Wako.

1. cultura dos neurônios hipocampais

  1. Preparação do meio de cultura
    1. Preparação da mistura da vitamina 200x. Dissolver 100 mg de D-ácido pantotênico hemicalcium sal, 100 mg de cloreto de colina, 100 mg de ácido fólico, 180 mg de i-inositol, 100 mg de niacinamida, 100 mg de HCl piridoxal, e 100 mg de tiamina HCl em 500 mL de água ultrapura usando um agitador magnético. A solução não está completamente dissolvida. Misture cuidadosamente, alíquota em 50 tubos de ml e armazene a-20 ° c.
    2. Preparação da solução de riboflavina. Dissolver 100 mg de riboflavina em 500 mL de água ultrapura utilizando um agitador magnético. A solução não está completamente dissolvida. Misture cuidadosamente, alíquota em 50 tubos de ml e armazene a-20 ° c.
    3. Preparação de 1 M CaCl2. Dissolver 7,35 g de CaCl2· 2h2o em 50 ml de água ultrapura utilizando um agitador magnético.
    4. Preparação do meio mínimo essencial (MEM). Dissolver 400 mg de KCl, 6800 mg de NaCl, 2.200 mg de NaHCO3, 158 mg de NaH2po4· 2h2O, 7000 mg de D-glucose e 200 mg de MgSO4-7h2o em 950 ml de água ultrapura utilizando um agitador magnético.
    5. Titrate 1,8 mL de 1 M de CaCl2 ao mem em uma maneira gota-a-gota usando um 1 ml de Pipet com uma agitação constante em um agitador magnético. Ajuste o pH do MEM para pH 7,25 com 1 mol/L HCl.
    6. Adicionar 5 mL de mistura de vitamina 200x e 200 μL de solução de riboflavina ao MEM. Ajuste o volume da solução para 1.000 mL com água ultrapura. Filtre a solução utilizando um sistema de filtro de 0,22 μm e guarde-o a 4 ° c.
    7. Preparação de soluções de estoque de 10x DNase-I. Dissolva 100 mg de DNase-I em 12,5 mL de solução de sal balanceada de Hanks (HBSS), filtre por um filtro de 0,22 μm, alíquota em tubos de 1,5 mL e armazene os tubos a-20 ° c.
    8. Preparação da solução em estoque de citosina β-D-arabinofuranoside (ARA-C). Dissolver 25 mg de Ara-C em 8,93 mL de água ultrapura (concentração final de 10 mM), filtrar através de um filtro de 0,22 μm, alíquota em tubos de 1,5 mL e armazenar a-20 ° c
    9. Preparação do meio de chapeamento. Misture 1 mL de solução de aminoácidos MEM, 750 μL de 1 M de HEPES, 1 mL de B27, 125 μL de glutamina de 200 mM, 250 μL de penicilina/estreptomicina, 2,5 mL de soro bovino fetal (FBS) e 44,375 mL de MEM num tubo de 50 mL.
    10. Preparação do meio de batente. Misture 1 mL de solução de aminoácido MEM, 750 μL de 1 M de HEPES, 5 mL de FBS (final 10%) e 43,25 mL de MEM num tubo de 50 mL.
  2. Preparação de pratos revestidos de poli-L-lisina
    1. Cubra 35 mm pratos de cultura de células plásticas com 0,2 mg/mL de brometo de poli-L-lisina por 1 dia a 25 ° c.
      Nota: A poli-L-lisina não deve ser usada em vez do brometo de poli-L-lisina.
    2. Lave os pratos com 2 mL de água ultrapura 3 vezes. Incubar os pratos com 1,5 mL de meio de batente a 25 ° c até o uso.
  3. Dissecção de neurônios hipocampais do embrião do rato
    1. Fonte de tecido de neurônios hipocampais. Dissecar o hipocampo de camundongos C57BL6/J de tipo selvagem e com deficiência de TLCN nos dias embrionários 16-17 de acordo com o método de Lu et al.19.
    2. Incubar hipocampo dissecado em 0,25% de tripsina e 1x DNaseI em HBSS contendo 15 mM de HEPES, pH 7,2 por 15 min a 37 ° c com agitação a cada 3 min. Retire a solução. Incubar os hipocampi em 10 mL de meio STOP para inativar a tripsina a 4 ° c por 5 min.
    3. Mova os hipocampos em 10 mL de meio de STOP fresco e incubar a 4 ° c durante 5 min. Mova os hipocampi em 10 mL de meio de STOP fresco e incubar a 4 ° c por mais 5 min. Mova os hipocampi em 900 μL de meio STOP e 100 μL de 10x DNaseI em 15 tubo de mL. Dissociar os hipocampi em neurônios isolados por pipetagem 20 vezes usando um 1 mL Pipet.
      Nota: A ponta do Pipet de 1 mL toca levemente a parte inferior do tubo de 15 mL durante a dissociação dos hipocampi.
    4. Adicione 9 mL do meio do chapeamento, e filtre através de um filtro da pilha de 70 μm em um tubo de 50 mL. Conte o número de células usando um hemociômetro e ajuste para 3,5 x 104 células/ml em meio de chapeamento.
    5. Aspirar o meio de STOP de pratos revestidos de poli-L-lisina. Placa as células em poli-L-lisina-revestido pratos em 7 x 104 células/prato (2 ml/prato).
    6. Após 60-64 h de incubação 5% CO2 a 37 ° c, adicionar 2 μL de solução de ações ara-C (final 10 μm) para os neurônios, e agitar o prato lentamente. Mantenha os pratos da cultura em uma caixa humidificada sem mudar o meio de cultura 5% CO2 em 37 ° c.

2. purificação da fração Filopodia-rica dendrítica

  1. Após 13 dias in vitro (DIV), adicione microesferas de poliestireno magnético (3 x 106 partículas/prato) a 20 pratos contendo os neurônios cultivados. Após 1 dia, lave os neurônios em 1 mL de PBS com agitação 3 vezes para remover os microgrânulos médios e não acoplados. Após a remoção de PBS, lyse os neurônios com 500 μL/prato de tampão de lise (PBS contendo 0, 1% Triton X-100, coquetel inibidor de protease livre de EDTA e coquetel inibidor da fosfatase).
  2. Colete o lisado com um raspador de células e mova o lisado para microtubos de ligação de proteínas baixas (10 tubos). Ajuste os tubos em um separador magnético e aguarde 1 min. colete o sobrenadante e use-o como a fração não acoplada para coloração de prata e análise Western Blot.
  3. Transfira as contas para um novo microtubo de ligação de baixa proteína, situado em um separador magnético, e remova completamente o sobrenadante. Adicionar 500 μL de tampão de Lise e lavar os grânulos utilizando um misturador Vortex durante 15 s. Ajuste o tubo em um separador magnético, Aguarde 1 min, retire o sobrenadante e adicione 500 μL de tampão de Lise. Repita a lavagem das contas 10 vezes e retire o sobrenadante.
  4. Proteínas elute ligadas aos grânulos (a fração acoplada) pela adição de 50 μL de tampão de amostra de 1x SDS (62,5 mM Tris HCl, pH 6,8, 2,5% SDS e 10% glicerol) e ferver o tubo a 98 ° c por 5 min. centrifugar o tubo a 860 x g por 10 s e definir o tubo em um separador magnético por 1 min. colete o sobrenadante e use-o como a fração acoplada.
    Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.
  5. Meça as concentrações proteicas das frações não acopladas e ligadas pelo ensaio da proteína BCA. Visualize soluções proteicas com azul de bromofenol e ajuste a concentração para 5 ng/μL para SDS-PAGE.

3. mancha de prata e Western blot análise

  1. Separe as frações acopladas e não ligadas (50 ng) por SDS-PAGE usando um gel de gradiente de 5-20%. Prata-mancha o gel.
  2. Western blot usando anti-TLCN-C (1/3000), antibovino vitronectina (1/5000), anti-actina (1/1000), e anti-α-tubulin (1/1000) como anticorpos primários e HRP-conjugado de cabra IgG anti-coelho (1/5000) como o anticorpo secundário. Visualize os antígenos usando o reagente de detecção de blotting ocidental quimioluminescente e um Imager de quimiluminescência.

Representative Results

Nos neurônios hipocampais cultivados, a TLCN foi localizada abundantemente ao filopótico dendrítica, ao eixo e ao soma e colocalizada com F-Actina (Figura 1a, B). Quando os microgrânulos de poliestireno foram adicionados aos neurônios do hipocampal cultivado, os grânulos foram revestidos automaticamente com o vitronectina (vn) derivado do soro bovino fetal (FBS) no meio de cultura; Eles foram principalmente vinculados a dendritos, e induziram a formação de copos fagocíticos (Figura 1b-e). Os copos phagocytic foram baseados em filamentos folha-dados forma do actínio em torno dos microesferas em dendrites. Tlcn, fosho-ERM e PI (4, 5) P2, que são marcadores para filopodia dendrítico, são altamente acumulados em torno de grânulos (Figura 1D)8,15. Os copos phagocytic foram dados forma somente em selvagem-tipo neurônios hippocampal, mas não em neurônios hippocampal TLCN-deficientes (Figura 2a-D). Assim, a formação do copo fagocitária era crucialmente dependente da presença de tlcn em dendrites.

Os constituintes do filopódia dendríticas pareceram similares àqueles de copos fagocitária. Em seguida, nós purificamos copos fagocíticos em vez de filopodia dendrítico. O protocolo para a purificação de copos fagocíticos é mostrado esquematicamente na Figura 3. Os microesferas magnéticos foram adicionados ao selvagem-tipo os neurônios hippocampal cultivados, que induz a formação de estruturas fagocitária do copo. As estruturas do copo fagocitária foram lysed com um detergente fraco. Os microgrânulos foram coletados após a Lise por meio de um separador magnético. Após a lavagem das contas, suas proteínas de ligação foram fervidas e eluidas em um tampão de amostra SDS.

A quantidade de proteínas na fração acoplada e não acoplada foi mensurada por meio do kit de ensaio de proteína BCA. A mesma quantidade de proteínas nas frações não acopladas e ligadas foi separada por SDS-PAGE e manchada por coloração de prata (figura 4a). Os testes padrões da faixa da proteína eram quase os mesmos para as frações não acoplado e encadernadas, mas as intensidades em 50 e 70 kDa na fração acoplada eram mais baixas do que aquelas na fração não acoplada. Entretanto, a intensidade da faixa não era obviamente diferente entre as frações não acoplado e encadernadas preparadas dos neurônios hippocampal da cultura tlcn-deficientes. Para confirmar a purificação das estruturas do copo fagocítico, realizou-se western blotting utilizando anti-TLCN-C, vitronectina antibovina, antiactina e anti-α-tubulina (Figura 4B). TLCN e VN foram detectados principalmente na fração acoplada. Actin, Ezrin, Gαq, PLCβ1, MAP-2, e spectrin foram detectados nas frações acopladas e não acopladas. Moesin, PSD-95, α-actinina e α-tubulina foram detectados na fração não acoplada.

Figure 1
Figura 1: localização de tlcn e F-Actina em filopódia dendrítico e copos fagocíticos. (A) coloração da imunofluorescência de dendritos de um neurônio hippocampal cultivado que expressa gapvenus com anticorpo do anti-GFP (azul em uma imagem fundida), anticorpo de anti-tlcn (vermelho em uma imagem fundida), e faloidina (verde em uma imagem fundida). TLCN e F-Actina são abundantemente observados em filopódios dendríticos. (B, C) Formação de estruturas do copo fagocitária em dendrites neuronal. Os microgrânulos fluorescentes (azuis em imagens fundidas de b, c) adicionados aos neurônios hippocampal cultivados aderem fortemente em dendritos e induzem a acumulação de tlcn (vermelho em imagens fundidas de b, de c) e de F-Actin (verde em imagens fundidas de b, c). (D) uma vista lateral de um copo fagocitária dendríticas reconstruído das imagens confocal revela tlcn (vermelho em imagens fundidas de d) que cercam o grânulo fluorescente (azul em imagens fundidas de d). (E) um copo fagocitária dendríticas induzido por um microbead magnético Unido em um dendrito neuronal e immunomanchado com anticorpo de anti-VN (azul em imagens fundidas de e), anticorpo de anti-tlcn (vermelho em imagens fundidas de e), e faloidina (verde em imagens fundidas de E). barras de escala = 1 μm em (D); 2 μm em (A), (C) e (e); e 20 μm em (B). Este número foi modificado a partir de um estudo anterior18. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: formação dependente de TLCN de estrutura fagocitítica tipo xícara. (A-D) Imagens triplas da fluorescência do selvagem-tipo (WT; A, C) e com deficiência de TLCN (KO; C, D) neurônios tratados com grânulos fluorescentes revestidos por VN (vermelho em imagens mescladas de A, B, C, D) e rotulados com anticorpo anti-TLCN (verde em imagens mescladas de A, B, C, D) e anticorpo anti-fosho-ERM (azul em imagens mescladas de A, B) ou Alexa488-Phalloidin (azul imagens de C, D). Barras de escala = 5 μm. Este número foi modificado a partir de um estudo anterior15. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: diagrama esquemático ilustrando o procedimento de purificação da fração dendrítica filopodia-rica. Os microesferas magnéticos foram adicionados em neurônios hippocampal cultivados para induzir a formação de copos fagocitária dendríticas. Após 1 dia de incubação, os neurônios foram solubilizados com tampão de Lise contendo 0, 1% de Triton X-100. Os grânulos foram separados da fração não acoplada usando um separador magnético. Após a lavagem, as proteínas ligadas foram eluidas com tampão de amostra SDS e utilizadas como fração acoplada. Vermelho: VN, verde: TLCN, outras cores: proteínas encadernadas. Este número foi modificado a partir de um estudo anterior18. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: confirmação da fração fagocitítica do copo. (A) coloração de prata das proteínas nas frações não acopladas e encadernadas dos microgrânulos. A mesma quantidade (50 ng) de proteínas nas frações não acopladas e ligadas purificadas de neurônios hipocampais de tipo selvagem (WT) e TLCN-deficiente (TLCN KO) foram separadas por SDS-PAGE e visualizadas com coloração prateada. (B) análise de Western blot das frações não acopladas e ligadas. A mesma quantidade (50 ng) de proteínas foi separada por SDS-PAGE e submetida à análise ocidental do borrão usando o anti-TLCN, anti-VN, anti-Actin, anti-Ezrin, anti-moesin, anti-Gαq, anti-PLCβ1, anti-mapa-2, anti-spectrin, anti-PSD-95, anti-α-Actinin, e anticorpos anti-α-tubulina. Note-se que TLCN, VN, Actin, Ezrin, PLCβ1, MAP-2 e spectrin são observados na fração rica em filopodia dendrítica. Este número foi modificado a partir de um estudo anterior18. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Nós desenvolvemos um método da purificação para a fração filopodia-rica dendríticas usando a afinidade entre a molécula tlcn da adesão da pilha e a vitronectina extracelular da proteína da matriz. Comparado à fração PSD, pode ser possível identificar as proteínas sinápticas atuando na sinapse imatura da fração dendrítica rica em filopodia. Assim, os constituintes da fração dendrítica filopodia-rica são diferentes dos da fração PSD em 74%. Diferente da fração PSD, usamos neurônios hipocampais cultivados para formar ativamente copos fagocíticos, e as células precisam estar vivas. Para formar o cálice fagocitático, utilizou-se a interação entre TLCN e vitronectina. A expressão TLCN é limitada no telencótido. Assim, não podemos usar os neurônios cultivados derivados do cerebelar. Entretanto, se nós revemos os grânulos com proteínas diferentes, este método atividade-dependente da purificação poderia ser aplicado aos neurônios cerebelares. Por exemplo, quando o domínio N-terminal de microgrânulos Delta2-coated do receptor do glutamato é aplicado às pilhas Cerebelares do grânulo, o neurexin e o cbln1 pré-sináptica foram identificados das proteínas de ligação. Portanto, esse método dependente de atividade poderia ser usado, se as proteínas de revestimento forem alteradas. Desde que o acesso de microesferas Vitronectin-revestidos é limitado à fatia do cérebro e ao tecido de cérebro, os copos fagocitária não são dados forma eficientemente. Assim, as tarefas futuras incluem o desenvolvimento do método de purificação da fração dendrítica filopodia-rica de fatia cerebral e tecido.

Neste protocolo, a condição de cultura de baixa densidade é utilizada para neurônios hipocampais, e o crescimento de células gliais é inibido pela adição de Ara-C10,20,21. Os neurônios hipocampais são cultivados em MEM preparados por nós mesmos, mas não no meio neurobasal, que é amplamente utilizado para a cultura de neurônios hipocampais. Os neurônios hipocampais morrem frequentemente por 14 DIV quando cultivados em meio neurobasal, o que indica que o meio neurobasal não é adequado para nossa condição de cultura de baixa densidade. Além disso, um aspecto importante da cultura de baixa densidade é o revestimento do prato com o brometo de poli-L-lisina, que não pode ser substituído por poli-L-lisina.

Para obter quantidade suficiente de proteínas da fração dendrítica filopodia-rica, os números de neurônios hipocampais e microgrânulos magnéticos são fatores importantes. Para a imunocoloração filopodia dendrítico, os neurônios hipocampais foram revestidos em um prato de 35 mm em 5,6 x × 104 células/prato, enquanto os neurônios foram chapeados em 7,0 x 104 células/prato para purificação da fração dendrítica filopodia rica. Em 14 DIV, quase nenhum neurônio hipocampal sobreposta em 5,6 x 104 células/prato para imunocoloração, enquanto muitos dos neurônios hipocampais parcialmente sobrepostas com os outros neurônios em 7,0 x 104 células/prato para purificação do dendrítico filopodia-rico Fração. Entretanto, o filopódia dendríticas estava abundantemente atual em ambas as densidades de neurônios hippocampal. Culturas de alta densidade de neurônios hipocampais muitas vezes amadurecem mais rápido do que os neurônios hipocampais cultivados de baixa densidade; assim, o ajuste da densidade dos neurônios hipocampais à cultura de baixa densidade é indispensável para a obtenção da fração dendrítica filopodia-rica. Microbeads foram adicionados em 1 x 106 microbeads/prato para imunocoloração e em 3 x 106 microbeads/prato para purificação da fração dendrítica filopodia-rico. Para a purificação da fração, uma vez que uma quantidade suficiente de grânulos foi adicionada, os grânulos não acoplado foram lavados para fora dos neurônios hippocampal.

Neste protocolo, os microgrânulos foram revestidos automaticamente com VN, que está presente no meio de cultura. No entanto, os microgrânulos podem ser revestidos com VN recombinante e adicionados aos neurônios hipocampais. Porque vn é uma proteína muito pegajosa, os microesferas vn-revestidos formam facilmente agregados. Assim, os microgrânulos vn-revestidos são sonicated e pipetado para dissociar de se apenas antes da adição aos neurônios hippocampal.

Nós mostramos previamente que os microesferas vn-revestidos induz Phosphor-ERM, PI (4, 5) P2, e F-Actin junto com a acumulação15de tlcn. Quando a fração filopodia-rica dendrítica foi analisada pela mancha ocidental, o phospho-ERM não foi detectado pelo anticorpo Polyclonal do anti-phospho-ERM e foi detectado ligeiramente por anti-Ezrin e por anticorpos monoclonais do anti-moesin. Parece que a sensibilidade dos anticorpos monoclonais era mais elevada do que o anticorpo Polyclonal do anti-phospho-ERM. Além, as proteínas do ERM foram localizadas a quase todas as regiões dos neurônios hippocampal, mas as proteínas de Phospho-ERM foram localizadas somente à ponta do filopódia dendríticas e do copo fagocitária. Considera-se que a quantidade de ligação de fosho-ERM a TLCN é limitada comparada à quantidade de ERM nonphosphorylated. Assim, a detecção de fosho-ERM na fração dendrítica filopodia-rica parece ser difícil.

Para separar os microgrânulos da membrana celular, utilizamos um detergente fraco, 0, 1% Triton X-100. Tlcn é lig ao filamento do actina através de Phospho-ERM nas estruturas dendríticas do copo do filopódia e do fagocitária. Para purificar as proteínas ligadas indiretamente ao TLCN através do filamento de actina, utilizamos um detergente fraco neste protocolo. No entanto, a concentração de Triton X-100 pode ser alterada para uma concentração mais elevada, dependendo da finalidade do experimento.

Esselens et al. demonstraram que a captação fagocítica de microgrânulos induziu a acumulação de TLCN, PIP2e F-Actina em neurônios hipocampais cultivados17. De acordo com nossa análise através da microscopia confocal após 24 h da incubação com microesferas, os microesferas não foram tomados completamente acima no citoplasma. TLCN e PIP2, que estão localizados na membrana celular, foram localizados em torno de grânulos, especialmente na parte inferior dos microgrânulos. Além disso, foram analisadas 319 proteínas identificadas a partir da fração dendrítica filopodia-rica, utilizando-se a análise da via KEGG. As vias de fagocitose e autofagia não foram detectadas, mas a organização do citoesqueleto, a exocitose, o processo à base de actina-filamento e o processo de microtúse foram significativamente enriquecidos na fração18.

O mecanismo molecular da formação dendrítica do filopódia permanece pela maior parte desconhecido. A análise da estrutura do copo fagocítico poderia ajudar a compreender os constituintes moleculares e as funções dinâmicas do filopodia dendrítico. Seria interessante analisar a fração dendrítica filopodia-rica preparada a partir de modelos de camundongo de neurodesenvolvimento e distúrbios neuropsiquiátricos.

Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Agradecemos Shigeo Okabe e Hitomi Matsuno pela cultura de baixa densidade de neurônios hipocampais, Masayoshi Mishina para camundongos deficientes em TLCN, Sachiko Mitsui e Momoko Shiozaki para assistência técnica, e membros do laboratório Yoshihara para discussões úteis . Este trabalho foi apoiado por JSPS KAKENHI Grant nos. JP20700307, JP22700354, e JP24500392 e MEXT KAKENHI Grant nos. JP23123525 para YF e JP20022046, JP18H04683 e JP18H05146 para YY.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 M HEPES Gibco 15630-080
1.7 mLl Low Binding MCT Sorenson BioScience 39640T
200 mM L-Glutamine Gibco 2530149
35 mm plastic cell culture dishes Corning 430165
Anti-actin Sigma-Aldrich A-5060
Anti-alpha-Actinin Sigma-Aldrich A-5044
Anti-alpha-tubulin Sigma-Aldrich T-9026
Anti-Ezrin Sigma-Aldrich clone3C12, SAB4200806
Anti-Galphaq Santacruz sc-393
Anti-MAP2 Chemicon clone AP20, MAB3418
Anti-Moesin Sigma-Aldrich clone 38/87, M7060
Anti-PLCbeta1 Santacuz sc-5291
Anti-PSD95 MA2 ABR
Anti-Spectrin beta Chemicon MAB1622
B27 Gibco 0080085SA
BCA protein assay kit Thermo 23227
Bromophenol blue Merck 1.08122.0005
Calcium chrolide, hydrous Wako 038-19735
Cell scraper Falcon 353085
Cell strainer Falcon 352350
Choline chloride Sigma-Aldrich C7527
Complete EDTA free protease inhibitor cocktail Roche 11873580001
Cytosine beta-D-arabinofuranoside Sigma-Aldrich C-6645
DNase-I Sigma-Aldrich DN-25
D-Pantothenic acid hemicalcium salt Sigma-Aldrich P5155
DynaMag-2 Magnet Thermo 12321D
ECL Prime Western Blotting Detection Reagent GE RPN2232
e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gradient gel ATTO E-T520L
Folic acid Sigma-Aldrich F8758
HBSS Gibco 14175095
HRP-conjugated anti-rabbit IgG Jackson ImmunoResearch 111-035-144
i-Inositol Sigma-Aldrich I7508
LAS-1000 mini Fuji Film LAS-1000 mini For detection of luminescence from WB membrane
Magnetic polystyrene microbeads Sperotech PM-20-10
MEM amino acid solution Gibco 11130-051 30 mM L-Arginine hydrochloride, 5 mM L-Cystine, 10 mM L-Histidine hydrochloride-H2O, 20 mM L-Isoleucine, 20 mM L-Leucine, 19.8 mM L-Lysine hydrochloride, 5.1 mM L-Methionine, 10 mM L-Phenylalanine, 20 mM L-Threonine, 2.5 mM L-Tryptophan, 10 mM L-Tyrosine, and 20 mM L-Valine
Mini-slab size electrophoresis system ATTO AE-6530
Niacinamide Sigma-Aldrich N0636
Penicilin / Streptomycin Gibco 15070063
PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail Roche 4906845001
Poly-L-lysine hydrobromide Nacali 28360-14
Pyridoxal HCl Sigma-Aldrich P6155
Riboflavin Sigma-Aldrich R9504
Silver Stain 2 Kit wako Wako 291-5031
Thiamine HCl Sigma-Aldrich T1270
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell Bio-rad 1703940JA
Ultra pure water MilliQ For production of ultra pure water

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References

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Purificação da fração rica de Filopodia dendrítica
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Furutani, Y., Yoshihara, Y. Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction. J. Vis. Exp. (147), e59292, doi:10.3791/59292 (2019).More

Furutani, Y., Yoshihara, Y. Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction. J. Vis. Exp. (147), e59292, doi:10.3791/59292 (2019).

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