Summary
マウス乳腺から開発されたオルガノイドを照射し、上皮形質および免疫細胞との相互作用を評価することを特徴とした。照射されたオルガノイドは、照射正常組織における腫瘍細胞動員につながる可能性のある細胞間相互作用をよりよく評価するために使用することができる。
Abstract
消化された組織に由来するオルガノイドは、多細胞三次元 (3D) 構成要素であり、細胞単層よりもインビボ条件においてより良い不在を有する。これらは、生体内の複雑さを完全にモデル化できませんが、元の臓器のいくつかの機能を保持します。がんモデルでは、オルガノイドは、腫瘍細胞の浸潤を研究するために一般的に使用されます。このプロトコルは正常な、照射されたマウス乳腺組織からのオルガノイドを発達させることを特徴とし、正常組織における放射線応答を評価することを目的とする。これらのオルガノイドは、放射線照射されたオルガノイドとの腫瘍細胞相互作用を評価するために将来のインビトロ癌研究に適用することができる。乳腺を切除し、20 Gy に照射し、コラゲナーゼ VIII 溶液で消化した。上皮のオルガノイドは遠心分化によって分離され、3D オルガノイドは96の低付着性マイクロプレートで開発しました。オルガノイドは、特徴的な上皮マーカーサイトケラチン14を発現した。オルガノイドとのマクロファージ相互作用は、共培養実験で観察された。このモデルは、腫瘍間質相互作用、免疫細胞の浸潤、および照射された微小環境内のマクロファージ偏波を研究するのに有用である可能性がある。
Introduction
3つの否定的な乳癌 (TNBC) の患者のおよそ 60% は処置1の形態として乳房温存療法 (BCT) を選ぶ。この治療モダリティでは、乳房組織の一部を含む腫瘍を除去し、周囲の正常組織を電離放射線に曝露して、任意の残留腫瘍細胞を死滅させる。治療は、乳癌集団の多くで再発を減少させます;しかし、TNBC 経験を持つ治療された患者の約 13.5% が2を再発局所領域的。したがって、放射線がどのように循環腫瘍細胞 (CTCs) を募集するかを研究することは、局所再発3,4における重要な洞察につながります。
従来の研究は、正常組織の放射線が様々な細胞型5の動員を増加させることを示している。TNBC の前臨床モデルにおいて、正常組織の照射はマクロファージを増加させ、続いて正常組織5に腫瘍細胞を動員する。免疫状態は、照射部位への腫瘍細胞の動員に影響を与え、腫瘍細胞の遊走は免疫不全の被験者で観察された。乳腺に由来するオルガノイドを用いてこれらの相互作用を概説することで、細胞遊走と細胞間相互作用を顕微鏡検査と生細胞イメージングでリアルタイムに観察し、変化による放射線損傷の役割を決定することができます。腫瘍細胞の挙動。
マウス乳腺オルガノイドは、乳腺の発達における主要なステップを解明するのに役立った。乳腺オルガノイドは50μ m6,7,8,9,10よりも大きい単離された乳腺上皮の多細胞性、三次元構造体である。原発性上皮オルガノイドを用いて、サル et al. は、乳腺7における分枝について必要な因子を評価した。シャミル et al. は上皮間葉転移を伴わない伝播が起こり得ることを発見し、転移性カスケード8に対する洞察を提供する。乳腺組織からのオルガノイドの生成および特徴づけの方法は、6、11、12、13で十分に確立されている。しかし、我々の知る限りでは、乳腺から照射されたオルガノイドが増殖するための方法は報告していない。照射されたオルガノイドの増殖および特性評価のためのプロトコルは、放射線誘導免疫および腫瘍細胞の概説において重要なステップである。
本論文では、スフェロイドの形成をサポートする親水性高分子を被覆した低接着マイクロプレートにおいて、照射された乳腺上皮オルガノイドを増殖・特性評価する方法を報告する。これらのオルガノイドは、免疫細胞浸潤動態を調べるためにマクロファージと共培養した。この作業は、脂肪細胞との共培養オルガノイドを乳房特性に不在し、腫瘍細胞の動員を可視化する乳癌細胞、および CD8 + T 細胞が腫瘍・免疫細胞相互作用を研究するように拡張することができる。以前に確立されたプロトコルは、照射オルガノイドを評価するために使用することができる。以前のモデルでは、乳腺オルガノイドと免疫細胞の共培養は、転移と播種のメカニズムに光を当てています。DeNardo et al. は、腫瘍関連マクロファージの CD4 + T 細胞調節が乳腺腺癌14の転移性表現型を増強したことを見出した。共培養モデルは、生物学的発達のメカニズムを解明するためにも用いられてきた。Plaks et al. は、乳腺器官形成15のダウンレギュレータとしての CD4 + T 細胞の役割を明らかにした。しかし、私たちのグループは、正常な組織の照射がどのように免疫細胞の挙動に影響するかを可視化する手順を最初に確立します。正常な組織の照射が腫瘍細胞の動員5を増強することが示されているので、このプロトコルは、腫瘍細胞の挙動が正常な組織および細胞の照射によってどのように変化するかを分析するためにさらに開発することができ、より大きな理解につながる癌の再発
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Protocol
動物実験は、ヴァンダービルト大学組織動物ケア・ユース委員会によって承認された制度的ガイドラインとプロトコルに従って実施した。
1. マウスおよび細胞の獲得の準備 (グエン・ゴック et al.11から適応)
- 犠牲無胸腺 Nu/Nu マウス (8-10 週齢) を使用して、co2 窒息の後に頚部脱臼が続きます。70% エタノールを使用して皮膚をきれいにします。
- 切除は、滅菌済みのはさみおよび鉗子を使用して、マウスから腹部および鼠径乳腺を採取します。切除前にリンパ節を除去する。滅菌1x リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) ですすいでください (図 1a)。
- 輸送用のダルベッコ改変イーグル培地/栄養混合物 F12 (DMEM/F12) 10 mL の 15 mL チューブに入れてください。サンプルは4° c で一晩保存するか、すぐに処理することができます。氷の上に保管してください。
- セシウム源を用いて 20 Gy で試料を照射する (図 1b)。
- 45分照射後、乳腺を 35 mm の無菌細胞プレートに入れ、メスでミンチする (図1c、D)。約40のストロークでミンチすると、組織が弛緩し、部分が約 1mm2より大きくならない小片が得られる。
- 50 mL 遠心管でコラゲナーゼ溶液に移します。コラゲナーゼ溶液は、2mg/mL コラゲナーゼ (材料表参照)、2mg/ml トリプシン、5% v/v 胎仔ウシ血清 (FBS)、5μ g/ml インスリン、および50μ g/ml ゲンタマイシンで、DMEM/F12 培地で構成される。マウスあたり 10 mL のコラゲナーゼ溶液を使用する。
- 37° c の水浴中に配置し、ボルテックスの場合は10分ごとに30-60 分間、コラゲナーゼ溶液が白濁したときに消化が完了する (図 1e, F)。
- 室温 (RT) で10分間 450 x gで消化液をスピンダウンします。3つの層が観察されます。上清は、脂肪から構成され、中間層は水溶液であり、底部はペレットである。このペレットは、上皮細胞、個々の基質細胞、および赤血球の混合物であるため、赤色で表示されます (図 1g)。
- 予備コーティングは、すべてのピペット、ピペットチップ、および接触前にウシ血清アルブミン (BSA) 溶液で遠心管を使用します。BSA 溶液は、ダルベッコ改変のリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) 中の 2.5 w/v% BSA で構成されています。前コーティングのために、単にピペットの先端および管の内部に BSA の解決を加えて取除きなさい。BSA 溶液は、各実験の前に滅菌濾過されるべきであるが、再利用することができる。
- 追加の回復のために、上清を新鮮な BSA に 15 mL のチューブをコーティングして移します。上下に激しく脂肪層を分散させます。RT で10分間 450 x gで遠心分離します。上清を吸引し、細胞ペレットを吸引しないように少量の培地をチューブに残します。
- 元のペレットでチューブから水性層を吸引します。
- 元のペレットでチューブに 10 mL の DMEM/F12 を加え、2番目のチューブに移します。2つのペレットを結合し、再懸濁するために精力的にピペット。
- RT で10分間 450 x gで遠心分離します。上澄みを吸引し、4 ML の DMEM/F12 をチューブに加えます。
- 40μ l のデオキシリボヌクレアーゼ (DNase) を懸濁液に加え、RT で2-5 分間軽く手で振ります。 DNase 溶液は、DMEM/F12 で 4 U/mL の DNase で構成されています。
- 6 mL の DMEM/F12 およびピペットを完全に加えてください。RT で10分間 450 x gでチューブを遠心します。
- 0.5 mL マークに上清を吸引します。10 mL の DMEM/F12 およびピペットで再懸濁を完全に洗浄する。
- 450 x gにパルスし、その速度に達した後に4秒を停止します。
- ステップ 1.16-1.17 をさらに3回繰り返して、遠心分化によってオルガノイドを精製します。ペレットは、上皮オルガノイドのみからなるオフホワイト色になります (図 1h)。
注: オルガノイドはまた生殖不能の網40μ m フィルターを使用してろ過することができる。ステップ1.16 の後、フィルターを通してオルガノイドを含有する培地を遠心管に通し、次いで5〜10ml の DMEM/F12 培地ですすいでください。新しい 50 mL の遠心管の上のフィルターをひっくり返しなさい。10 mL の DMEM/F12 メディアを通して、逆方向に行って任意の保持液を洗い流す。保持液はオルガノイドで構成されており、濾液は主に基質細胞から成り、必要に応じて廃棄または保持することができる。
2. 密度とめっきオルガノイドの決定
- 再懸濁ペレットを 10 mL の DMEM/F12 で行います。均質な溶液を作成するために徹底的にピペット。
- 50μ l を 30 mm のペトリ皿に移し、20倍の位相コントラスト顕微鏡で見る。集計カウンタを使用してオルガノイドの数をカウントします。
注: ここでピペットの先端が一貫して457μ m の最低の直径と、播種されるオルガノイドの直径の5-10 倍で使用されています。2つの mL またはより大きいの容積 (例えばステップ1.16 および 2.1) の移動のために、1500μ m の先端の直径超過の血清学的ピペットを使用しなさい。 - 次の式を使用して、オルガノイド密度を計算します。
所望の密度は、さらなる希釈を容易にするために1000オルガノイド/mL である。密度が低すぎる場合は、450 x gで5分間の遠心分離を行います。1000オルガノイド/mL に到達するために必要なメディアを追加し、均質な混合物を作成するために徹底的にピペット。- タンパク質マトリックス中でオルガノイドを成長させるために、種子オルガノイドをコラーゲンタイプ1で1オルガノイド/L の濃度で 87% に希釈するか、または Engelbreth ・ホルム群マウス肉腫から抽出した基底膜中で濃縮する。サンプルで作業しながら、氷の上で維持します。
- オルガノイドを凍結するには、目的の容積を別の遠心管に移します。5分間、450 x gでスピンダウンして、同じ容量の 90% FBS/10% DMSO を加えます。オルガノイドを再懸濁、次に cryotubes にアリコートします。-80 ° c に移し、その後1週間以内に液体窒素に移行します。
- 解凍するには、37° c の水浴で1分間加温し、450 x gで5分間遠心分離し、次いで凍結培地を吸引する。滅菌 DPBS ですすいでから、再度遠心分離してください。DPBS を吸引し、オルガノイドメディアを追加します。
- 低付着プレートの各ウェルにピペット50μ l (50 オルガノイド) を挿入します (図 1i)。
- 150μ l のオルガノイドを加えて、総作業量を200μ l とする。オルガノイド培地は、1% のペニシリン・ストレプトマイシンと 1% のインスリン-トランスフェリン−セレン (ITS) を DMEM/F12 培地で構成する。
- 2日ごとにメディアを慎重に置き換えます。
注: 低付着プレートは、治療された組織培養ではありません。したがって、細胞を容易に剥離することができる。プレートを傾け、各ウェルの端にピペットチップを挿入して、ゆっくりとメディアを吸引します。井戸の底にメディアの少量を残します。不要なせん断力をオルガノイドに適用しないように、新しいメディアをゆっくりと追加します。
3. マクロファージとの共培養
- 10% の FBS および 1% のペニシリン・ストレプトマイシンを添加した DMEM 培地中の GFP または dTomato ラベルの生264.7 マクロファージを維持する。シード 1 x 104, 5 x 104, または 1 x 105細胞/ml オルガノイドメディアに.
- 生細胞相コントラストと蛍光イメージングを使用して、時間の経過とともにマクロファージ浸潤を監視します。
4. オルガノイドの免疫蛍光染色
注: オルガノイドは低い付着の井戸で染まることができるまたは部屋のスライドに移すことができる。転送するには、オルガノイドがプレートから取り外されるまで、ゆっくりと上下にピペットで移動します。部屋のスライドに移し、4-8 h の間インキュベートして、オルガノイドがプレート表面に付着できるようにします。
- 慎重に吸引することにより、ウェルからオルガノイド培地を除去します。RT で15分間 10% 中性緩衝ホルマリンでサンプルを固定します。
- 1x PBS で3倍5分洗浄します。必要に応じて、固定サンプルを4° c で1週間保存し、さらに染色を行うことができます。
- 透過処理の 0.1% 4-(1, 1, 3, 3-Tetramethylbutyl) フェニル-5 分のポリエチレングリコール。
注: F-アクチンを染色するには、ファロイジンで 1: 1000 および 1.67 nM bisbenzimide の核色素を 1% の PBS/BSA で 1% の RT でインキュベートします。次に、ステップ4.8 に進みます。 - 0.5 PBS で Bermeabilize。サンプルは4opy イメージおよび immunofluorescent イメージで貯えることができる。CTC に寄与する機構 rlock で 5% 正常ヤギ血清で 0.1% PBS/ポリエチレングリコールソルビタン monolaurate (PBST) を RT で1時間洗浄する。 PBS で3倍5分洗ってください。
- 抗サイトケラチン14希釈した 1: 1000、E-カドヘリンを希釈した1:200、またはタイトな接合タンパク質1を RT で1時間 PBST で 1% の NGS で希釈した1:100 でインキュベートします。 PBST で5分間洗浄します。
- ヤギ抗ウサギ2次希釈1:200 で 1% の NGS/PBST で1時間 RT でインキュベートします。光の暴露を避けるために箔でカバーしています。
- PBS で3倍5分洗浄します。核染料 (物質表参照) を使って核を染色する。
- PBS で3倍5分洗浄します。チェンバースライドを使用する場合は、カバースリップで取り付けてください。4° c で2週間まで箔で包まれた店舗。
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Representative Results
照射した上皮乳腺オルガノイドをマウス乳腺から正常に取得し、処理し、低付着性プレート上で培養した (図 1)。オルガノイド収率は、異なる増殖環境で播種することによって試験された (図2a − G)。組織培養に直接播種された細胞は 10 cm の細胞版を処理し、線維芽細胞の増殖を引き起こした。線維芽細胞は、オルガノイドと同じ焦点のまたはその近くの位相コントラスト顕微鏡下で同定され、そして彼らはすぐに数日以内にめっきオルガノイドから成長した。オルガノイドが基底膜とコラーゲンタンパク質マトリックスに播種されたとき、線維芽細胞の伸長も観察されました (図 2e, F)。
照射されたオルガノイド成長の最適化において様々な条件を試験した (図 2h)。コラゲナーゼのhistolyticum由来の I および VIII は、オルガノイド消化ステップ12、16、17において酵素として使用した。オルガノイド収率は、コラゲナーゼ VIII での消化後に有意に高かった。これは、酵素の生成に使用される精製プロセスによるものかもしれません: コラゲナーゼタイプ I は部分的に精製され、膜タンパク質およびレセプターに不必要な損傷を引き起こし、オルガノイド形成、細胞溶解、または過剰消化につながる16,17,18. 照射および制御オルガノイド間の収率に有意な差は認められなかった。
照射されたオルガノイドは、低い接着プレート (図3a − C) または基底膜内 (図3d − G) で培養することができたが、最も急速な成長は低い接着プレートで生じた (図 3h)。オルガノイド疾患乳腺特性。白色の矢印は、乳腺21における乳汁の産生および輸送にとって重要な、ダクトおよび葉19, 20,21 (図 3c) に形態学的に類似する構造を示す。ただし、この観測値を確認するには、さらに特性評価が必要です。成長の傾向は、非照射オルガノイドが照射されたオルガノイドよりも速く成長したことを示した (図 3h), 最も可能性の高い DNA 損傷修復のメカニズムに起因する細胞増殖停止に起因する;しかし、傾向は統計的に有意ではなかった22.低接着オルガノイドの時折の束が観察され、オルガノイドは解離の2週間前まで培養することができた。
オルガノイドは、サイトケラチン 14 (K14)、e-カドヘリン (e − cad)、およびタイトジャンクションタンパク質 1 (ZO − 1)23,24,25 (図 4)。照射されたオルガノイドは上皮マーカーを発現した。K14 は、myoepithelium23のマーカーであり、照射されたオルガノイドの表面に強く発現した (図 4a)。さらに、E − cad および ZO −1は、オルガノイドの細胞接合部内で発現した (図4b、C)。これらのタンパク質は、適切な細胞接着24に不可欠である。照射後、オルガノイドはその上皮特性を保持し続けた。
オルガノイドの蛍光染色は、蛍光顕微鏡 (図 5a-D) を用いて低接着プレート内で可視化することができました。しかし、共焦点顕微鏡 (図5e − F) を介して最も明確なビジュアライゼーションが得られた。補正された全蛍光強度は、バックグラウンドを減算し、オルガノイド領域によって正常化することによって計算した (図 5g)。96-ウェル低付着プレートでオルガノイドを成長させることも、共培養実験を簡略化しました。乳腺に典型的な濃度で播種されると、マクロファージは対照と共に局在化し、オルガノイドを照射した (図 6)24、26。
図 1.メソッドのワークフロー。(A) 乳腺をマウスから切除した。腹部および鼠径部の乳腺が使用された。(B) 乳腺を、DMEM/F12 培地を含む 50 mL 遠心管に照射した。(C) 乳腺を無菌6ウェルプレートに移し、細片化するまで外科用メスで切断した (D)。(E) 乳腺あたり 5 ml の滅菌 DMEM/F12 培地を含む 50 ml 遠心管に移し、コラゲナーゼ VIII 溶液 (F) で消化した。(G) 15 mL チューブに移した後、基質細胞、単一細胞、および赤血球を除去するために、遠心分化が利用され、赤色のペレット (白色の矢印−頭) で観察され、唯一の白上皮オルガノイドが得られるまで (H).(I) 50 オルガノイドを96で200μ l の培地に播種し、相コントラスト顕微鏡を用いて撮像して、50μ m を表す。ここをクリックして、この図の大規模なバージョンを表示してください。
図 2.3D タンパク質マトリクスおよび組織培養処理プラスチックへのオルガノイドめっきオルガノイドは、コラーゲン (A) および基底膜 (B) に播種し、84時間の成長後に画像化した。線維芽細胞の伸長は、マトリクスめっきオルガノイド (C, D) において生じた。濾過を通して選別されたオルガノイドの位相コントラスト画像を、播種後192時間で得た。濾液 (E) と保持液 (F) との間に大きな差は見られず、その両方がコンフルエントな線維芽細胞増殖をもたらす。EおよびFの細胞を組織培養処理プラスチック上に播種した。RT で5分間 trypsinizing した後、線維芽細胞を吸引によって除去した。しかし、残りの上皮細胞は、三次元オルガノイド (G) の代わりに単層培養を形成した。A-Gのスケールバーは100μ m を表します。 (H) 異なるコラゲナーゼタイプ (I (CI) および VIII (CVIII)) および細胞処理方法 (濾過および遠心分化 (セント Diff)) を試験し、乳腺あたりのオルガノイド収率を定量化 (n = CI のための2つの腺、フィルター、CVIII のための2つの腺、フィルタ、CI、セント Diff のための4つの腺、および CVIII、セント Diff のための12の腺)。統計的有意性は、2尾の対になっていない t 検定、* * * p < 0.0001 を用いて決定された。誤差バーは標準誤差を表します。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.代表オルガノイド成長。照射されたオルガノイドの位相コントラスト画像は、播種後 20 (A)、44 (B)、および 106 (C) 時間を得た低い接着プレートで成長した。白い矢印は、ダクトおよびローブに類似した形態を有する構造を示す。オルガノイドに照射された基底膜の位相コントラスト画像は 42 (D)、66 (E)、60 (F)、および、播種後 114 (G) 時間を得た。スケールバーは50μ m を表します。領域測定は、異なる生育条件下で得られた: 消化および選別後直ちにオルガノイド (照射 (●)、対照 (▪))、地下膜に播種したオルガノイド (放射線照射 (○)、対照 (□)) (n = 3各腺)。面積計算は、ImageJ ソフトウェアを使用して行われました。誤差バーは標準誤差を表します。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4.照射オルガノイドにおける上皮マーカー発現扁平上皮および非扁平上皮の基底層に対するマーカーであるサイトケラチン 14 (K14、緑) を、照射されたオルガノイド (a) 上で発現させた。E −カドヘリン (E − Cad) は、接着に必須のタンパク質であり、照射されたオルガノイド (B) における細胞間の接合部内で発現していた。タイトジャンクションタンパク質 1 (ZO − 1) も、照射されたオルガノイド (C) の細胞接合内に発現した。画像は、共焦点顕微鏡を介してチャンバースライドで得られた。核 (青色) を可視化するために核酸染色を用いた。すべてのオルガノイドを固定し、成長の1週間後に画像化した。スケールバーは50μ m です。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5.オルガノイドにおける F-アクチン発現Microfilament 上皮細胞における F-アクチン (赤色) は、照射された (B、D、F) オルガノイドよりも非照射オルガノイド (a、C、E) において低強度で発現した。核 (青色) を可視化するために核酸染色を用いた。イメージは低い付着 96-井戸版 (A、 B) および16井戸部屋のスライド (C、 D) で取られた。画像も共焦点顕微鏡 (E, F) を用いて撮影した。すべてのオルガノイドを固定し、成長の1週間後に画像化した。スケールバーは50μ m です。ファロイジンの低い接着プレート画像からの蛍光データを ImageJ (n = 3 腺) で定量化した。誤差バーは標準誤差を示します。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 6.マクロファージ-オルガノイドの共培養による細胞間相互作用の評価マクロファージ (赤色) に浸潤した制御 (a) および照射された (B) オルガノイド。スケールバーは50μ m を表します。画像分野におけるマクロファージの平均面積 (C) は、24時間の対照培養 (黄) および照射された (オレンジ) オルガノイド (各試料については n = 3 腺) で報告した。マクロファージを1万細胞/ml の濃度で播種し、5万細胞/ml、10万細胞/ml と、生細胞蛍光イメージングを介して30分ごとにそれらの浸潤を捕捉した。すべての共培養実験は、最初のオルガノイド播種から7日後に開始した。統計的有意性は、2尾の対になっていない t 検定、* p < 0.05、* * * p < 0.0001 を使用して決定されました。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルでは、照射された乳腺オルガノイドの再生可能な成長と特性評価のための方法を開発しました (図 1)。20 Gy の照射用量を、腫瘍細胞リクルート5の前インビボモデルを鏡映するために適用した。オルガノイド形成の前にインビボの乳腺の照射は、免疫細胞の対応する浸潤を伴わずに放射線損傷の影響を単離することを可能にした。インビトロ照射正常組織モデルの開発により、放射線誘発 CTC 動員11,12に寄与し得る細胞相互作用のリアルタイム表示が可能になる。
1.5 ~ 1.18 のステップに密接に従うことは、オルガノイドの収量を最大化するために重要でした。私たちは、消化液に濃縮コラゲナーゼの、融解したアリコートを加えた。濃縮されたコラゲナーゼアリコートの非常に粘性の高い性質のために、量にいくつかの変化があり、したがって酵素活性である可能性があるので、過剰消化を避けるためにオルガノイド消化を厳密に監視する必要があります。これは、消化のための偶数表面積を可能にするように、50 mL チューブでオルガノイドを消化することも重要です。他の研究は、オルガノイドを浄化するための濾過を使用しています19,23;しかし、我々は、遠心分離を用いてはるかに高い収率精製を得た (図 2h)。BSA ソリューションによるプレコーティングピペット、ピペットチップ、遠心分離チューブは、歩留まりを最大化するために不可欠です。ソリューションアプリケーションを無視した場合、オルガノイドはコーティングされていないプラスチックに顕著に付着します。
オルガノイドを吸引しないように細心の注意が必要です。これは、浄化、変化するメディア、蛍光マーカーの染色で発生するリスクです。成長のための低い付着の版を使用してオルガノイドの容易な移動を可能にし、更なる染色のための10月に区分されるべきオルガノイドのための必要性を除去する、基底膜埋め込まれたオルガノイド11のために必要なプロシージャ。優れた成長の恩恵に加えて、低い接着プレートにオルガノイド照射された播種は、より少ない手順を必要とし、基底膜またはコラーゲンでオルガノイドを培養するよりも技術的に困難であった。しかしながら、マーカーのために染色する場合、偶発的な吸引が起こらないようにするために顕微鏡下でオルガノイドを見るのが役立つかもしれません。
さらに、オルガノイドを撮像する際に考慮しなければならない多くの検討事項があります。オルガノイドに埋め込まれた基底膜内に、時折線維芽細胞成長が観察されることがある (図 2c、D)。3D 培養オルガノイドにおける線維芽細胞の伸長は、接着細胞27においてアップレギュレートされた線維芽成長因子産生につながる組織培養処理表面との接触をオルガノイドことによって引き起こされ得る。興味深いことに、これらの線維芽細胞の形態は、両方の細胞タイプがひょろひょろ、細長い形状28を示すように、プレ脂肪細胞と著しく類似している。さらなる調査では、インスリンへの曝露、デキサメタゾン、および 3-メチルイソブチルキサンチン-1-メチルキサンチン (IBMX) は、及び系統を有する細胞を産出し、脂肪細胞28 に関連するより球状の細胞形状に向けたシフトを促進し、29. 我々は、自由に成長している低密着性 (図 3a-C) と基底膜埋め込み (図 3d-G) オルガノイドの位相コントラスト顕微鏡法を用いて鮮明な画像を得ました。しかし、低付着プレートでの個々のオルガノイド成長の追跡は、細胞と井戸表面との間の最小限の焦点癒着のために困難であり、オルガノイド運動および時折の吸引をもたらす。
表面マーカーのために染色されると、共焦点顕微鏡は、広視野顕微鏡 (図5a-D) よりもより明確なマーカー局在 (図 5e、F) をレンダリングした。蛍光定量化から、ファロイジン発現の傾向は、照射されたオルガノイドがコントロールに対して F-アクチンを増加して発現することを示唆する (図 5g)。同様の投薬量30で照射された皮膚微小血管内皮細胞におけるアクチン細胞骨格の再編成が認められる。
拡張画像化配列の場合、免疫細胞と共培養の時間経過と同様に (図 6)、湿度および co2 制御を有する生細胞イメージングチャンバーが31個必要である。30分ごとに撮影された生細胞画像は、マクロファージが24時間後にオルガノイドと共に局在化することを明らかにした (図 6a、B)、照射したオルガノイドに向かって優先的に移行する (図 6c)。照射した正常組織へのマクロファージ浸潤はインビボで観察されており、ケモカインおよびサイトカインの勾配に帰因し、そして典型的には CTC リクルート5に先行する。将来の研究は、偏光マクロファージダイナミクスとしてオルガノイドとの古典的および代替活性化されたマクロファージ相互作用を評価し、放射線32,33への応答を決定する上で重要な役割を果たす可能性がある。追加の分析は、これらの変数がオルガノイド免疫細胞相互作用に大きな影響を及ぼす可能性があるので、完全な培地での血清飢餓とオルガノイド培養の成長効果の結果を評価します。このシステムは、さらに、CD8 + T 細胞、間質細胞、脂肪細胞、および乳癌細胞を含む他の細胞型との共培養のために適合させることができる。生細胞イメージングのような技術を用いたリアルタイム観察は、照射された正常組織への CTC 動員に寄与する可能性のある機構の解明を促進し、再発性患者に重大な影響を及ぼす可能性があるTNBC.
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Disclosures
作者は何も開示することはありません。
Acknowledgments
私たちは、GFP と dTomato 標識の生264.7 マクロファージを提供するために、Dr. ローラ l. Bronsart に感謝します。本研究は、NIH 助成 #R00CA201304 による財政的支援であった。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | |
| Anti-cytokeratin 14 | abcam | ab181595 | Lot: GR3200524-3 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A1933-25G | |
| Collagen Type I | Corning | 354236 | |
| Collagenase from Clostridium Histolyticum, Type VIII | Sigma | C2139 | |
| Collagenase I | Gibco | 17018029 | |
| DMEM/F12 | Thermofisher | 11320-033 | |
| DNAse | Roche | 10104159001 | |
| DPBS | Fisher | 14190250 | |
| E-Cadherin | Cell Signaling | 24E10 | Lot: 13 |
| FBS | Sigma | F0926 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750 | |
| Goat anti-rabbit secondary | abcam | ab150077 | green Lot: GR3203000-1 |
| Goat anti-rabbit secondary | abcam | ab150080 | red Lot: GR3192711-1 |
| Hoechst 33342 | Fisher | 62249 | Lot: TG2611041 |
| Insulin (10 mg/mL) | Sigma | I9278 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium, 100x | Gibco | 51500-056 | |
| Matrigel Basement Membrane (basement membrane extracted from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma) | Corning | 356237 | |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Nuclon Sphera 96 well plates | Thermo | 174927 | |
| PBS | VWR | 10128-856 | |
| Pen/strep | Fisher | 15140122 | |
| Phalloidin | abcam | ab176757 | Lot: GR3214582-16 |
| Tight Junction Protein 1 | Novus | NBP1-85047 | Lot: C115428 |
| Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol) | Sigma | X100-100ML | |
| Trypsin | Gibco | 27250-018 | |
| Tween-20 (Polyethylene glycol sorbitan monolaurate) | Sigma | P1379-100ML |
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