Summary
ここでは、洗剤とクマシーブルーへの暴露を最小限に抑えるミトコンドリア supercomplexes を抽出、解決、識別するためのプロトコルを紹介します。このプロトコルは、分解能と酵素活性の維持との間の最適なバランスを提供しながら、不安定なタンパク質間相互作用を失うリスクを最小限に抑えます。
Abstract
酸化リン酸化機械の複合体は、supercomplexes (SCs) という名前の超分子タンパク質配列を形成し、これはミトコンドリアに構造的および機能的利点を付与すると考えられている。SCs は、酵母から哺乳類まで多くの種で同定されており、遺伝子および後天性ヒト疾患における組織の破壊を報告する研究の数が増加しています。その結果、SCs の分析に関心を持つ研究室が増えており、方法論的には困難な場合があります。この記事では、ブルーとクリアのネイティブページメソッドの利点を組み合わせて、時間効果の高い方法で SCs を解決および分析するための、最適化されたプロトコルを紹介します。このハイブリッド CN/BN-PAGE 法では、最適な量の中性洗剤 digitonin を用いて抽出されたミトコンドリア SCs は、電気泳動の開始時にアニオン性染料クマシーブルー (CB) に一時的に曝露し、他の洗剤に曝露することはない。CB へのこの短い暴露は、従来の BN-PAGE 法と同様に効果的に SCs を分離して解決することを可能にし、高 CB レベルのゲル内活性アッセイおよび SCs 内の不安定なタンパク質相互作用の負の影響を回避します。このプロトコルによって、それは SCs の高度の分析のための第2電気泳動、免疫検出および/またはプロテオミクスを含む分析的な技術とゲルの活動の測定の精密な、急速を結合することは可能である。
Introduction
ミトコンドリアは、酸化リン酸化によってエネルギーを生成します, ここで、呼吸器錯体 I-II-III-IV は、基板を酸化し、酸素に電子を転送, ATP 合成酵素によって ADP のリン酸化を可能にするグラデーションを生成する (CV).この数年間、広範囲にわたる研究により、呼吸鎖複合体はミトコンドリア内膜に直線的に組み込まれるのではなく、supercomplexes (SCs) 配置1,2にも組織化されていることが示されています。哺乳動物のミトコンドリアにおいて、SCs は様々な stoichiometries に存在します: CI/CIII2/CIV1-4 (これは respirasome と名付けられ、NADH が可能であります: O2 oxidoreduction in vitro)2、CI/CIII2、および CIII2/CIV1-23,4.さらに、呼吸器複合体は、遊離形態と SCs 配列との間に異なる比率で分布する。したがって、85% – CI の 100%、CIII の 55% – 65%、および 15% – 25% の CIV が SCs4に含まれていると推定されます。これらの超分子構造は、ROS の産生を減少させると考えられています, 個々の複合体のアセンブリを安定化または支援, 呼吸連鎖活性を調節します, そして、タンパク質中のタンパク質の凝集を防ぐことが豊富な内部ミトコンドリア膜5 、6、7、8。エネルギー需要の変動に改造能力と疾患の病因におけるそれらの重要性は、いくつかの研究室で調査されている3,7,9,10,11,12,13,14. 研究は、SCs アセンブリにおける病理学的変化が様々な障害に存在することを示しているが、これらに限定されないが、カルジオリピン合成15の遺伝的欠損、心不全16、虚血再灌流17、糖尿病12、及びエージング18。
ネイティブ電気泳動および免疫検出法は、OXPHOS 複合体の第四紀の配置2、19、20、21を解決するために、SCs 研究で広く使用されています。ネイティブ電気泳動は、さらに特定のゲル活性アッセイまたは 2d-SDS ページと組み合わせることで、さまざまな SCs アセンブリ1,19の精密分子測定を可能にします。SCs を研究する能力は、使用される洗剤の種類と濃度、イオン強度と pH、および電気泳動移行条件 (バッファー組成、CB の存在、ゲル) を含む抽出条件に非常に依存しています。サイズ、アクリルアミドの割合2.
プロトコルと SCs 帯域の分解能は論文によって大きく異なり、研究の比較は困難であり、22に挑戦する方法の適応である。したがって、本論文では、非イオン性洗剤 digitonin を用いて異なるソースから分離されたミトコンドリアから SCs を抽出し、高分子量の SCs バンドを解決するための、堅牢で最適なプロトコルを提案する。最適化された洗剤濃度、抽出バッファーの組成、およびクマシーブルーのないサンプル調製は、タンパク質複合体の破壊を最小限に抑えます。このプロトコル (概要については図 1を参照) は、大規模なゲルで最適な SCs アセンブリの解像度に対して CN ページと BN ページを組み合わせたもので、反応性バンドのより良い視覚化を可能にするインゲル活性アッセイと互換性があります。詳細な分析のための免疫検出法 SCs 配置および構成。
Protocol
1. SC 抽出
- EDTA を水に溶解させることによって 100 mL の抽出バッファー (表 2を参照) を準備します。完全に溶解するまで KOH で pH を上げ、HCl で pH を7.5 に調整します。溶液に残りの成分を追加し、水で最終的なボリュームに完了し、氷の上に保ちます。チューブでは、抽出バッファーに digitonin を溶解させ、10% の原液を作り、完全に溶解するまで徹底的に渦をかけ、氷上で維持します。
注: 抽出バッファは、事前に調製し、最大2ヶ月の4° c に保つことができます。波状バンドがゲルの下部に現れ始めた場合、抽出バッファーが古すぎることを意味します。10% digitonin 溶液を調製するときは、マウスの肝臓のミトコンドリアを使用している場合、サンプルあたりのストックボリュームカウント500μ l を準備します。Digitonin 溶解度は、起源および製品ロットによって異なります (資料の表を参照してください)。 - 動物組織から単離されたミトコンドリア (マウス心臓、筋肉、肝臓、ラット心臓) または細胞 (ヒト線維芽線) を用いて標準プロトコール23、24、25を使用して、SCs の抽出を行うことができる。ミトコンドリアが得られたら、メーカーの推奨に従って bicinchoninic 酸測定キットを使用してタンパク質含量を定量化します。必要に応じて、このステップでプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を用いた単離されたミトコンドリアを補う。
注: SCs は、新鮮または解凍されたミトコンドリアのいずれかで抽出することができます。すべてのサンプルから SCs を同時に抽出し、同じ条件下で同じ溶液バッチで処理されることを保証することをお勧めします。 - 得られたミトコンドリアタンパク質濃度に基づいて、最終的な digitonin/タンパク質比を所望し、表 1に従って必要とされるストック digitonin 溶液および抽出バッファーの体積を計算する。SC 抽出のために、ミトコンドリアタンパク質の10μ g ごとに digitonin を含む1μ l の抽出バッファー (表 2) を加えます。Digitonin/タンパク質比は、2から 8 g/g に変化することができます。Digitonin 滴定は、使用するサンプルの新しいタイプごとに常に実行する必要があります (例については図 2を参照)。
- ペレットのミトコンドリアは、1.5 mL チューブで、16000 x gで4° c で10分間遠心分離した。
- その上清を廃棄し、digitonin を含む氷冷抽出バッファーの計算量でミトコンドリアペレットを再懸濁させる。ミニチューブ回転子にチューブを配置し、中回転速度で4° c で30分間インキュベートします。サンプルが適切に混合されていることを確認します。
- 20400 x gのサンプルを4° c で45分間遠心分離し、insolubilized の断片を除去します。
- 氷の新しい管に上澄みを移し、タンパク質を定量化します。この画分は、呼吸 supercomplexes 抽出物を表す。同じ日に電気泳動が行われない場合は、-80 ° c でサンプルを保管してください。
注: 1) 必要であれば、最初の凍結/解凍サイクルの前に、これがアリコートサンプルのより高い分子配列を破壊するので、抽出の凍結/解凍サイクルを避けてください。2) 標準的な BN-ページ実験を実行するには、この手順で SCs 抽出に CB を追加する必要があります。CB は、使用される洗剤の量に対して 1g/8g 比で添加されるべきである。
2. 勾配のゲルの鋳造および電気泳動
- 勾配ゲル、アリコート、および-20 ° c での保管には、3倍勾配バッファーとアクリルアミドストックを用意してください (表 3を参照)。
- アノードおよびカソードバッファーを準備し、4° c で保管してください (表 5を参照)。
- 鋳造室を開け、外側のガラスプレート (20cm x 22 cm) をチャンバーに置きます。アライメント・カードを使用してスペーサー (1.5 mm) を1セット配置し、チャンバの側面と角にしっかりと固定されていることを確認します。内側のガラス板 (20 cm x 20cm) をスペーサーの上に置き (ゲルサンドイッチを形成)、プラスチックの分離シートをガラス板の上に置きます。
- 必要な数のゲルがキャストするまでステップ2.3 を繰り返します。このプロトコルでは、4つのゲルがキャストされます。私達が使用する鋳造の部屋システム (材料のテーブルを見なさい) は一度に10のゲルの最高の鋳造を可能にする。最初に必要に応じて、できるだけ多くのアクリルブロックを追加することにより、チャンバー内の残りのスペースを取り、その後、必要に応じてガラス板。
注: モンタージュはしっかりと密閉されている必要があります。室内にゲルサンドイッチの間にはスペースを入れるべきではありません。 - ガスケットをガスケットのノッチにしっかりと固定する前に、溝にパラフィルムのストリップを置きます。密閉プレートをチャンバーに置き、6本のネジをすべて締めます。鋳造室に立つ。
- 「光」混合チャンバ内の磁気攪拌機で攪拌プレート上に元勾配を配置します。鋳造室のチューブを勾配前者に接続し、蠕動ポンプのカセットにチューブを固定し、勾配前者の活栓が閉じていることを確認します。
- 4ゲルを鋳造するために、三角フラスコに 4% および 60 mL の 12% ゲル溶液 (表 4を参照) の 60 ml を調製し、混合するために徹底的に旋回する。60 mL の 4% ゲル溶液を「光」混合チャンバに注ぎ、勾配前者の「重」貯留チャンバ内に 12% の 60 mL を注ぐ。攪拌板の撹拌速度を 350 rpm で設定します。活栓を開き、35 rpm でポンプをオンにします。
- 光の割合が重い分画よりも低い場合は、ポンプを一時停止し、「光」と「重い」貯水池の間にバルブステムを開き、フラクションボリュームを平衡化にして、ポンプを再起動します。
注: 泡がシステムに入らないし、ガラス板の間に閉じ込められることが重要です。この問題が発生した場合は、モンタージュ、ウォッシュ、やり直しを元に戻します。 - 勾配ゲルが完全に注がれると、ポンプを停止し、ゲルの乾燥を防ぐために水 (約 1ml) を各ゲルサンドイッチに重ねます。2時間重合ましょう。
- 三角に 25 mL の積み重ねのゲルを準備し、徹底的に混ぜるために旋回しなさい。水を除去し、各ゲルサンドイッチに15ウェル櫛を挿入します。積み重ねのゲルを注ぎ、2 h のための重合をしなさい。
注: ゲルは1週間、4° c で鋳造して保持することができます。 - サンドイッチクランプにゲルを挿入し、櫛を削除します。短いガラス板を下に向けて、冷却コアにゲルサンドイッチを挿入します。反対側で繰り返し、電気泳動タンクにコアを置きます。
- 電気泳動タンクの内部チャンバに 300 mL の青色カソード緩衝液を注ぎます。電気泳動タンクの外室に陽極緩衝液を 2 L 注ぎます。
注: 電極をカソードバッファーに沈めて、約 300 mL を必要とします。 - 1ウェルあたりのタンパク質の75μ g と175μ g の間で負荷をかけます。1.5 h のために 150 V でゲルを実行してください (またはサンプルが全て勾配ゲルに入るまで) 冷蔵室 (4 ° c) で。
注 1: 1) ゲル内活性バンドの良好な分解能には、ウェルあたり最低75μ g が必要です。タンパク質の175μ g 以上をロードすると、酵素活性が過剰になるためにクリアバンドが失われます。2) サンプルの反復は、ゲル内活性の並列決定および OXPHOS 複合体のイムノブロット分析を可能にするために、別々のウェルに装填する必要があります。CI、CII、CIV、および CV に対する IGA の並列決定には、最低300μ g が必要です。 CI、CII、CII、CIV、および CV の並列イムノブロット分析には、最低375μ g が必要です。 - Pipet または真空で青色の陰極緩衝液を除去し、300 mL のクマシーブルーフリーのカソードバッファーに交換し、冷蔵室 (4 ° c) で一晩 (16 〜20時間) の 200 V でゲルを実行します。ゲル内活性測定またはイムノブロッティングアッセイの手順3または4に進みます。
3. 複合体 I、II、IV および CV のゲル内活性
- 電気泳動の終了前に、表 6に従ってゲル内活性バッファーを準備し、RT で暗所に保管してください。 20 mL のゲル内活性バッファーは、3つのサンプルレーンに十分です。
注: この CV in ゲル活性アッセイは、ATPsynthase (すなわち、ATP 加水分解) の逆活性に基づいており、カルシウムを副因子として使用し、ゲル中で沈殿します。カルシウムは他のプロトコルで使用される鉛よりも害が少ない。さらに、このプロトコルの使用は、ゲル23の事前活性化/コンディショニングを必要としない。 - 電気泳動を止め、ゲルを取り出します。必要に応じてレーンをカットし、ジェルレーンをビニール袋 (3 面カット、本のように開いたビニール袋) に移します。ヒートシーラーで3側面のシール2。
注: 実験グループ間で SC バンドの組成を比較するには、同じサンプルを同じゲル上の反復で実行することをお勧めします。レーンを切り、異なるゲル内活性バッファー (CI、II、IV、V) で各反復をインキュベートします。アッセイの特異性を確認するために、追加の反復を、特定の呼吸鎖阻害剤の存在下でゲル活性において実行するために調製することができる。 - 3つの実験試料 (すなわち3ウェル) について、20 mL のゲル内活性緩衝液を加え、気泡を除去し、ビニール袋の 4番目の側面を密封する。
注: 実行された場合、陰性対照実験に阻害剤を加える: CI: ロテノン1μ m;CII: Malonate ナトリウム 10 mM;CIII: Antimycin-8 μ m;CIV: KCN 0.6 mM;CV: Oligomycin 0.5 μ m。 - 暗闇の中でゲルレーンを37° c でインキュベートし、15分ごとにチェックします。インキュベーション時間は、タンパク質および複合体の量によって異なります。CI は CIV または CV よりも速く反応します。最適な染色は通常、CI の場合は2時間後、CIV の場合は4時間、CII と CV の場合は 6 h に発生します。
- 水の中でゲルレーンをすすぎ、反応を停止させると、CV の CI、CII、CIV、または黒の背景の白い背景に画像を表示します。
注: ゲルは、数ヶ月間、RT または4° c でビニール袋に保管することができます。
4. イムノブロッティングアッセイ
- 表 7に従って転送バッファを準備し、rt で保持する。 TBST を準備し、rt で維持します。
- ゲル全体または選択したレーンを容器に入れ、SDS (転送バッファで 0.25% のファイナル) を添加して転送バッファを追加します。ロッカーにコンテナを置き、1時間インキュベートします。
- PVDF メンブレン (ゲルのサイズに対応するサイズ) をカットし、撹拌下で 20 mL のメタノールを2分間攪拌し、20 mL の転写バッファーに置き換え、撹拌下に2分間入れます。
- 転写サンドイッチを下から上に準備し、ジェルとアクティブな PVDF メンブレンの間に気泡がないことを確認します: カセット/ブラックスポンジ/ブロッティング紙/メンブレン/ジェル/ブロッティング紙/黒スポンジ/ブラックサイドカセットのクリアサイド。カセットを閉じてロックします。
- 転送タンクに移動サンドイッチを置き、電極の赤色側に面するサンドイッチのクリアサイドで、ゲルを immerge するために転写バッファを注ぎます。冷却システムをトランスファータンクに接続し、4° c に設定します。電源に接続し、40 mA で設定し、24時間実行します。
- 膜を取り出し、TBST の 5% BSA で1時間ブロックし、4° c で一晩 TBST で 5% BSA で調製した一次抗体溶液にインキュベートします。
注: 使用する抗体については表 8を参照してください。 - TBST 3 倍の膜をそれぞれ10分間洗浄する。
- TBST の 5% BSA で調製した二次抗体溶液中の膜を、室温で2時間インキュベートします。
- TBST 3 倍の膜をそれぞれ10分間洗浄する。
- 膜およびイメージに化学発光の解決を加えなさい。
5. 分析
- ゲル内活性アッセイ画像または immunoblots を使用して、SCs を分析することができます。バンドの合成を分析し、反復を調整し、与えられたバンドごとにどの複合体が正に反応したかを検証します。
- さまざまな超分子アセンブリで、複合体の分布を解析するには、ImageJ で画像を開き、ゲル分析ツールを使用します (例については図 5を参照してください)。
- 矩形ツールで車線を選択し、車線をプロットします。
- 線を描画して、目的の各バンドの曲線の下の領域を閉じ、[杖] ツールを使用して各領域をクリックすると、曲線の値の下の領域を含むテーブルが生成されます。
- 複合体の分布を計算するには、各バンドの値をモノマーの相対的な基準に基づいてレポートします。
Representative Results
図 2は、SCs の抽出に必要な digitonin の適正量を特定することを目的とした digitonin 滴定実験の結果を示す。この量は、組織/細胞の種類とサンプルが凍結したかどうかによって異なります。この実験のために、CIV のゲル活性は、新鮮なマウス肝臓のミトコンドリアから分離された SCs を可視化するために実施した。2/1 〜 10/1 g のタンパク質の digitonin/g の比を試験した。このサンプルのための digitonin の最適の量は CIV の単量体のよい決断、および高分子量の SCs を提供するので 4 g/g である。より低い比率では、バンドは電気泳動の間、汚れにはっきりと解決されませんが、digitonin のより高い比率の使用は高分子量 SC の破壊につながります。
図 3および 図 4は、4 g digitonin/g タンパク質で抽出されたマウス肝ミトコンドリアの調製について実施した完全実験の結果を示す。タンパク質は、ハイブリッド BN/CN-ページ、標準の BN-ページ、または CN ページを使用して分離しました。3つのゲルはすべて同時に鋳造され、レーンは同じサンプルの反復でロードされました。電気泳動の後、個々のレーンは、ゲル活性測定 (CI、CII、CIV および CV図 3) およびイムノブロッティングアッセイ (CI、CII、CIII、CIV、cv図 4) で切断および処理されました。
CB の付加は、瞬間的にカソードバッファー (すなわちハイブリッド CN/BN-PAGE) で、または電気泳動全体にわたってサンプルおよびカソードバッファー (すなわち BN − PAGE) で、SC バンドの移動性および分解能をかなり改善し、個々の呼吸器複合体CN ページと比較した (図 3)。バンドは、CIV のためのゲル内活性後のハイブリッド技術または BN-ページと容易に区別可能であるが、CN ページによって解決される同じサンプルでは、SCs および単量体 CIV 反応性バンドは識別できない。
図 3と図 4は、OXPHOS モノマーおよび超分子アセンブリの解像度とバンドパターンが、ハイブリッド CN/BN-PAGE と bn-page の間で定性的に比較可能であることを示しています。ただし、顕著な違いが存在します。まず、OXPHOS 複合体の電気泳動移動性は、CB の量が減少したため、タンパク質をハイブリッド CN/BN-ページ条件対標準の BN-ページを使用して分離すると、わずかに減少します。この移動シフトは、CIV モノマーの方が大きく、その後に CV モノマー、および CI (図 3および図 4) が続きます。第2に、ハイブリッド CN/BN-ページでは、BN-ページ (図 3、左車線) と比較して、青色の背景が低くなっています。その結果、BN-PAGE の後の高いバックグラウンドレベルは、CII のためのゲル内活性染色を完全にマスクし、CIV ダイマーの活性に関連するバックグラウンドノイズを増強します (図 3)。第3に、cv の活性が BN-PAGE と比較してハイブリッド CN/BN-ページ条件下で実行されている場合 (図 3) によりより高いのは、CB 触媒活性を妨害することが知られているのが減少の量に起因する。26 CN/BN-ページはまた cv のダイマーと関連付けられている総 cv の活動のより大きい比率によって示されているように cv 超分子アセンブリのよりよい維持を可能にする (図 3)。さらに、CV オリゴマーは CN/BN-ページの下で見ることができますが、BN-PAGE 条件下で完全に解離しています。興味深いことに、CV 活性を表示する個別のバンドは、サンプルが CN/BN-ページの下で実行される場合、CV モノマーとダイマーの間でも観察されます (図 2)。
図 5は、超分子アセンブリにおける OXPHOS 複合分布の代表的な解析を示しています。この画像は、4つの異なる健常マウス肝臓ミトコンドリア製剤から得られたサンプルのゲル活性における CI を示す。デンシトメトリー分析は、CI 反応性バンドの曲線下面積を測定し、そして、モノマー (I1) および超分子形態 (i 1 iii2、i1Iii2IV)における C1 活性の相対分布を提示することを可能にする1、I1III2IVn)。同様の分析はイムノブロット以下で行うことができる。
図 1: アッセイのワークフロー。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: 新鮮なマウスの肝臓のミトコンドリアから supercomplexes を抽出する Digitonin 滴定.この例は、マウスの肝臓のミトコンドリアのアリコートを、呼吸 supercomplexes を抽出するために digitonin の量を増加させて治療した1匹の動物から単離されることを示す。その後、ハイブリッド CN/BN ページでサンプルを分解し、CIV のゲル内活性を測定した。CIV1: 複雑な IV モノマー;CIV2: 複雑な IV ダイマー;SC: supercomplexes。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: ハイブリッド CN/BN-page, BN-ページまたは CN-ページに続く OXPHOS 複合体のゲル内活性。1匹のマウスから単離された肝臓のミトコンドリアを digitonin (4 g/g 比 digotonin/タンパク質) で治療し、呼吸 supercomplexes を抽出した。次に、このサンプルのアリコートを、3つの別個のゲルの複数のウェルに装填し、CN/BN-PAGE、BN-page、または CN-ページに提出した。各ゲル内の各複製レーンを切断し、直ちにゲル内活性アッセイ (CI、CII、CIV および CV というラベル付き) に使用しました。1つの車線は、クマシーブルーとの背景 (ラベル付き BG) 染色を示すためにコントロールとして使用された。OXPHOS 複合体および超分子アセンブリは、各 OXPHOS 複合体の分子化学量論を示す指数の数値で、標準の命名法を使用して識別されます。なお、CIII 含有超分子アセンブリの位置は、CIII に対するゲル内活性がこの特定の実験では行われなかったので免疫検出法に基づいている。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4: ハイブリッド CN/bn-page または bn-ページに続く OXPHOS 複合体のイムノブロット分析図 3の凡例に記載の実験からの反復は、単一の膜上でエレクトロ転写された。移送後、個々の車線を切断し、CI、CII、CIII、CIV、および CV を認識する特定の抗体と共にインキュベートします。 OXPHOS 複合体および超分子アセンブリは、標準命名法を使用して識別され、数値は各 OXPHOS 複合体の分子化学量論。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5: モノマーおよび超分子アセンブリにおける CI 分布の定量化(A) CI 中ゲル内活性は、肝臓のミトコンドリア内で4匹から得られた SC 抽出物中のハイブリッド CN/BN-PAGE 以下で決定した。(B) Densitograms は、ci モノマー (i1) および各種 ci 含有超分子複合体 (i 1 iii2, i1iii2IV 1) に対応する明瞭なピークを示す ImageJ のゲル分析ツールを用いて得られたもの、および I1III2IVn)。(C) C1 活性の相対分布の定量化。このデータは、4匹のマウスの平均値および SEM を表す。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| Digitonin/タンパク質比 (g/g) | 2 g/g | 4 g/g | 6 g/g | 8 g/g |
| 抽出液量 (μ l) | 400 | 300 | 200 | 100 |
| 10% ストック digitonin (μ l) の体積 | 100 | 200 | 300 | 400 |
| 総抽出バッファ量 (μ l) | 500 | 500 | 500 | 500 |
表 1: 様々な digitonin/タンパク質比を用いて 5 mg のミトコンドリアタンパク質から SCs を抽出するのに必要な量。
| 化合 物 | 最終濃度 |
| EDTA、pH 7.5 | 1Mm |
| Hepes | 30 mM |
| 酢酸カリウム | 150ミリメートル |
| グリセロール | 12 |
| 6-アミノカプロン酸 | 2mm |
表 2: SC 抽出バッファー (最終濃度)。最大3ヶ月間、4° c で保管してください。
| 化合 物 | 最終濃度 |
| 3X ゲルバッファー:アリコート-20 ° c、pH 7.5 | |
| イミダゾール/HCl pH-7.0 | 75ミリメートル |
| 6-アミノカプロン酸 | 1.5 M |
| アクリルアミド緩衝液:アリコート-20 ° c でキープ | |
| アクリルアミド | 99.5% |
| ビス-アクリルアミド | 3 |
表 3: ゲルストックバッファ。
| 2つのゲルの場合: | 4%(60 mL) | 12%(60 mL) | 積み重ね (4%)(25 mL) |
| 3X ゲルバッファー | 19.8 mL | 19.8 mL | 8.25 mL |
| アクリルアミド緩衝 | 4.8 mL | 14.4 mL | 2Ml |
| H2O | 35 mL | 13.1 mL | 14.6 mL |
| グリセロール | - | 12 mL | - |
| APS 10% | 360μ l | 60μ l | 150μ l |
| TEMED | 24μ l | 12μ l | 10μ l |
表 4: 4% – 12% 勾配ゲル。
| 化合 物 | 最終濃度 |
| アノードバッファ: 4 ° c で維持し、pH 7.5 | |
| イミダゾール | 25 mM |
| 陰極バッファ: 4 ° c で維持し、pH 7.5 | |
| Tricine | 50ミリメートル |
| イミダゾール | 7.5 ミリメートル |
| クマシーブルーの有無にかかわらず (G250) | 0.022% |
表 5: 電気泳動バッファー。
| 化合 物 | 最終濃度 |
| コンプレックス I アクティビティバッファ: 5 mM トリス-HCl pH 7.4 でフレッシュに準備する | |
| Nitrotetrazolium ブルー | 3mm |
| Nadh | 14 mM |
| コンプレックス II アクティビティバッファ: 5 mM トリス-HCl pH 7.4 でフレッシュに準備する | |
| コハク酸 | 20 mM |
| PMSF | 0.2 ミリメートル |
| Nitrotetrazolium ブルー | 3mm |
| 複雑な IV アクティビティバッファ:50 mM Na-リン酸 pH 7.2 での新規準備 | |
| チトクローム C | 0.05 ミリメートル |
| ジアミノベンジジン | 2.3 ミリメートル |
| ATPsynthase アクティビティバッファ: 水に新鮮な準備, KOH と pH を8に調整 | |
| グリシン | 50ミリメートル |
| MgCl2 | 5mm |
| Hepes | 50ミリメートル |
| CaCl2 | 30 mM |
| Atp | 5mm |
表 6: ゲル内活性アッセイバッファー。
| 化合 物 | 最終濃度 |
| 転送バッファ | |
| トリスベース | 25 mM |
| グリシン | 192ミリメートル |
| Sds | 4 |
| メタノール | 20 |
| TBST | |
| トリスベース | 20 mM |
| 塩化 ナトリウム | 137ミリメートル |
| トゥイーン20 | 0.1% |
表 7: イムノブロッティングアッセイバッファー。
| 複雑 | サブユニット | クローン |
| 私 | NDUFA9 | 20C11B11B11 |
| Ii | SDHA | 2E3GC12FB2AE2 |
| Iii | UQCRC2 | 13G12AF12BB11 |
| Iv | COX4 | 1D6E1A8 |
| V | ATPB | 3D5 |
表 8: イムノブロッティングアッセイに使用される抗体は、呼吸鎖 SC を検出する。企業およびロット番号の品目の表を参照してください。
Discussion
ミトコンドリア supercomplexes は、その生理的役割を解明するために積極的に研究されており、多数のヒト疾患の病因におけるその重要性、それらが後天性であるか、または遺伝的ミトコンドリア病であるかを3、7,9,10,11,12,13,14. 信頼できる結果を得るためには、いくつかの側面を考慮する必要があります。このプロトコルは、マウスの肝臓のミトコンドリア、マウス骨格筋のミトコンドリア (結果は示されていない)、ラットの心臓のミトコンドリア、およびヒト線維芽細胞のミトコンドリア (結果は示されていない) でテストされていますが、確かに他の分離源に適応することができますミトコンドリア。この方法は、使用済みのプロトコル20、27、28と比較して洗剤およびアニオン性化合物への曝露を最小限に抑えることを可能にする、BN および CN-PAGE プロトコルのさまざまな側面を最適に組み合わせたものです。
サンプル調製
サンプル調製は、SCs を正常に分離するための重要なステップです。バッファ組成物は、タンパク質およびタンパク質アセンブリの適切な可溶化を達成するために、できるだけその機能を維持しながら、慎重に選択する必要がありますと構造的整合性があります。抽出バッファーのイオン強度および pH は、考慮すべき2つの重要な因子である。塩分濃度が低すぎると (< 50 mM K アセテートまたは NaCl)、非イオン性洗剤の存在下でタンパク質の可溶化が悪くなり、500 mM 以上の塩分濃度がタンパク質のスタッキング/凝集を促進し、CB およびタンパク質29.したがって、SCs は、ほぼ生理的イオン強度でバッファを用いて抽出されるべきである。PH に関しては、近い生理学的な pH の使用は推薦される。
洗剤タイプと洗剤/タンパク質比は、最適な SC 抽出のためにも重要です。ネイティブ SCs の最大保存のために、digitonin が好ましい26である。現在のプロトコルおよび他の公開された方法23、30、31、32に示すように、この穏やかな洗剤は複数の SC アセンブリの超分子組成物を保持し、ダイマーおよびATPsynthase のオリゴマー構造 (図 3および図 4)。様々な量の digitonin を用いた目的のサンプルの滴定は、酵素活性および生理的タンパク質相互作用を維持しながら、最適な可溶化を可能にする条件を特定するために重要である。滴定は、2と 8 g/g26の間の範囲で行われるべきです。肝臓、骨格筋および心臓のミトコンドリアのための最適な結果は、それぞれ4、5、および 6 g digitonin/g タンパク質で得られる。Digitonin は、digitonin2で観察されるものと同様の移行および SC 組成をもたらす最適条件下でのトリトン X −100によって置き換えることができることに留意すべきである。しかし、この洗浄剤は注意して使用すべきであり、洗剤/タンパク質比の比較的小さい増加 (例えば、1〜 1.5 g/g) は、SCs アセンブリー2の完全な解離をもたらす可能性があるため、実験的な不整合をもたらす可能性がある。抽出後、サンプルは伝統的な CN-ページ20、26を除き、ゲルに適用されたときにタンパク質に電荷を与えるためにクマシーブルーを添加しています。クマシーブルーへのタンパク質曝露および不安定なタンパク質の潜在的解離を最小限に抑えるために、このプロトコルではクマシーブルーでサンプルが補充されません。
電気 泳 動
CN ページと BN-ページの両方は、それらのそれぞれが明確な利点と制限を有するミトコンドリア OXPHOS 複合体を研究するために使用されています。CN-ページの下で使用されるより穏やかな条件 (主に、洗剤様の効果を有する CB の不在) は、ATP シンターゼのゲル内活性のより良好な保存を可能にし、高分子量 SCs および ATP シンターゼにおける不安定なタンパク質の解離を制限するアセンブリ26。しかし、タンパク質抽出物および電気泳動バッファーにアニオン性色素 CB が存在しないと、タンパク質は固有電荷および等電点に基づいて移行し、ゲル26内のタンパク質の電気泳動移動性が低下します。さらに、CB の非存在下では、不十分な負電荷を有するタンパク質が凝集する傾向があり、したがってゲル20、26におけるタンパク質複合体の分解能を低下させる。これらの制限を回避するために、いわゆる高解像度 CN ページはウィッティヒおよび Schragger20によって開発されました。このプロトコルでは、デオキシコール酸ナトリウム (DOC) および様々な非イオン性界面活性剤 (DDM、トリトン X100) がカソード緩衝液に添加され、膜タンパク質を可溶化し、タンパク質に負の電荷シフトを課すため、かなりの改善をもたらす解像度20の。
現在のハイブリッド CN/BN プロトコルの特徴は、これらの洗剤なしで同等の解像度に達することができるということです。電気泳動の最初の陰極バッファーへの CB の瞬間的な添加は、タンパク質凝集を制限し、ゲル内の移動性を高めるのに十分です (図 3および図 4)。その結果、このハイブリッド技術により、異なる SC アセンブリの優れた分解能が得られ、洗剤への曝露が非常に少なく、またはまったくなくなりました。CB の低い量の存在はまた、CV 活性のより良好な保存、ダイマーおよびオリゴマー CV アセンブリの改善された保存 (図 3およびウィッティヒおよび Schägger 200526)、およびすることができる青色の背景ノイズの低減を可能にします特に CII および CIV について、ゲル活性の定量化を妨げる (図 2)。さらに、タンパク質抽出物中の CB の欠如は、SCs 内の不安定なタンパク質相互作用の破壊を制限する。例えば、synthasome 33を形成するための ANT との ATP 合成酵素との物理的な会合は、 34が CB の非存在下でよりよく見られる。電気泳動時の CB への瞬間的暴露は、SCs 内で新しいタンパク質相互作用を明らかにするのに有用である可能性があります。全体として、このハイブリッド CN/BN-PAGE プロトコルは、分析とゲル活性測定で正確かつ迅速に組み合わせることができますSCs の高度分析のための二次元電気泳動、免疫検出および/またはプロテオミクスを含む技術。SCs の関心が高まるにつれて、ネイティブページ用に小さい 10 x 10cm のゲルを使用する研究が増えていることに留意すべきである。このアプローチでは、豊富な SC アセンブリの総変化を特定するのに十分かもしれませんが、小さなゲルの低い分離能力は、微妙な再配置を解決したり、プロテオーム解析のために個別のバンドをカットするのに限られます。さらに、小さいゲルを用いたいくつかの研究では、respirasome が ATPsynthase ダイマーと同じサイズで移動することが報告されており、それらを解離することは困難である。したがって、大きなゲルの使用が好まれるべきである。
Disclosures
なし
Acknowledgments
作者は技術支援のためにジェナ・ロッシに感謝し、この方法を開発している間、デビッド・パッテン博士と Ujval アニル Khacho ミレイユ博士に有益な議論をしていただきたいと思います。この研究はカナダ健康研究所 (CIHR) とカナダ国家科学技術評議会 (NSERC) によって賄われました。AC は博士賞の受賞者である-フレデリック・バンティングとチャールズ・ベスト・カナダの大学院奨学金 (CIHR)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3'-Diaminobenzidine tetra-hydrochloride hydrate | Sigma | D5637 | |
| 6-amino caproic acid | sigma | A2504 | |
| Acrylamide | Sigma | A3553 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate | sigma | A3377 | |
| Anti-ATPB antibody [3D5] - Mitochondrial Marker | Abcam | ab14730 | Lot number GR3174539-12, RRID AB_301438 |
| Anti-SDHA antibody [2E3GC12FB2AE2] | Abcam | ab14715 | Lot number GR3235943-1, RRID AB_301433 |
| Anti-UQCRC2 antibody [13G12AF12BB11] | Abcam | ab14745 | Lot number GR304308-3, RRID AB_2213640 |
| Bis N,N'-Methylene-Bis-Acrylamide | Biorad | 1610201 | |
| Brilliant Blue G | Sigma | 27815 | |
| COX4 Monoclonal Antibody (1D6E1A8) | Invitrogen | 459600 | Lot number TI2637158, RRID AB_2532240 |
| Cytochrome c from equine heart | sigma | C7752 | |
| Digitonin | Sigma | D141 | |
| Fisherbrand FH100M Multichannel Peristaltic Pumps | Thermo Fisher | 13-310-660 | |
| Imidazole | Sigma | I0250 | |
| Inner Glass Plates. Pkg of 2, 20 x 20 cm, glass plates for 20 cm PROTEAN II xi and PROTEAN II XL electrophoresis cells, use with outer plate | Biorad | 1651823 | |
| Model 485 Gradient Former. 40-175 ml acrylamide gradient former, includes valve stem and tubing kit, for use with Mini-PROTEAN multi-casting chamber systems | Biorad | 1654120 | |
| NDUFA9 Monoclonal Antibody (20C11B11B11) | Invitrogen | 459100 | Lot number TD2536591, RRID AB_2532223 |
| Nitrotetrazolium Blue chloride | Sigma | N6639 | |
| Outer Glass Plates. Pkg of 2, 22.3 x 20 cm, glass plates for 20 cm PROTEAN II xi and PROTEAN II XL electrophoresis cells, use with inner plate | Biorad | 1651824 | |
| Phenylmethanesulfonyl floride | Sigma | P7626 | |
| Powerpack 1000 | Biorad | Serial Number 286BR 07171 | |
| PROTEAN II Sandwich Clamps. Pkg of 2, clamps for running gels, for 20 cm PROTEAN II xi electrophoresis cell, 1 left and 1 right | Biorad | 1651902 | |
| PROTEAN II xi Cell. Large format vertical electrophoresis cell, 16 x 20 cm gel size, 4 gel capacity, spacers and combs | Biorad | 1651811 | |
| PROTEAN II xi Comb. Pkg of 1, 15-well, 1.5 mm, comb for PROTEAN II xi electrophoresis cell | Biorad | 1651873 | |
| PROTEAN II xi Multi-Gel Casting Chamber. Multi-gel casting chamber, 20 x 20 cm gel size, for up to ten 1.5 mm thick gels, includes sealing plate, gasket, separation sheets, acrylic blocks, PROTEAN II XL alignment cards | Biorad | 1652025 | |
| PROTEAN II xi Spacers. Pkg of 4, 1.5 mm, spacers for 20 cm PROTEAN II xi electrophoresis cell | Biorad | 1651849 | |
| SCIENCEWARE Utility Bags (10 x 12") 4 mil, Bel-Art, Box of 100 | VWR | 11215-388 | |
| Thick Blot Paper. Pkg of 25 sheets, 15 x 20 cm, absorbent filter paper, for use with Trans-Blot cassette | Biorad | 1703956 | |
| Trans-Blot Cell With Plate Electrodes and Super Cooling Coil. Transfer cell and cooling coil (#170-3912), includes 2 gel holder cassettes, buffer tank, lid with cables, fiber pads, 1 pack blot paper | Biorad | 1703939 |
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