Summary
Perineural invasion er en aggressiv fænotype for hoved-og nakke planocellulære karcinomer og andre tumorer. Kyllingen chlorioallantoismembranerne membran model er blevet brugt til at studere angiogenese, kræft invasion, og metastaser. Her demonstrerer vi, hvordan denne model kan udnyttes til at vurdere perineural invasion in vivo.
Abstract
Perineural invasion er en fænotype, hvor kræft omgiver eller invaderer nerverne. Det er forbundet med dårligt klinisk resultat for hoved-og nakke planocellulært karcinom og andre kræftformer. Mekanistiske undersøgelser har vist, at den molekylære kryds stilk mellem nerver og tumorceller forekommer før fysisk interaktion. Der er kun få in vivo modeller til at studere perineural invasion, især for at undersøge tidlig progression, før fysiske nerve-tumor interaktioner forekomme. Kyllingen chlorioallantoismembranerne membran model er blevet brugt til at studere kræft invasion, fordi kælderen membran af den chorioniske epitel efterligner den af humant epitelial væv. Her har vi repurposed chick chlorioallantoismembranerne membran model til at undersøge perineural invasion, podet rotte rygrod ganglier og menneskelige hoved og hals pladecellekarcinom celler på den chorioniske epitel. Vi har demonstreret, hvordan denne model kan være nyttigt at vurdere kræftcellers evne til at invadere neurale væv in vivo.
Introduction
Perineural invasion (PNI) er en understuderet fænotype i kræft, som er forbundet med høj sygdom recidiv og dårlig overlevelse hos patienter med hoved-og nakke planocellulært karcinom (HNC)1. PNI defineres mikroskopisk som tumorceller i eller omkring nerverne2,3. Når PNI detekteres, vil patienterne sandsynligvis få adjuverende behandlinger såsom elektiv hals dissektion og/eller strålebehandling4,5. Men, disse behandlinger er aggressive, og ikke PNI-specifikke. Faktisk er der ingen terapi til at blokere PNI, primært fordi de mekanismer, der underliggende nerve-tumor interaktioner er stadig dårligt forstået.
Forskellige molekylære mekanismer har været impliceret i nerve-tumor tiltrækning; tumorer og stromale celler frigive neuropeptider og vækstfaktorer for at fremme neuritogenesis6,7. Når de er dyrket sammen in vitro, har HNC-celler og dorsalrodsganglier (DRG) en robust respons; virkninger på tumor celle invasion og neuritogenesis kan ses efter et par dage i kultur6,8,9. Men, der er en mangel på passende in vivo modeller til at rekapitulere tumor-nerve interaktioner før invasionen. Her præsenterer vi en in vivo PNI model til at studere tidlige interaktioner mellem HNC-celler og nerver6. Vi tilpassede chick chlorioallantoismembranerne membran (CAM) model til at omfatte en neurale komponent, podning en DRG i cam, efterfulgt af et transplantat af kræftceller til at efterligne en innerveret tumor mikromiljø.
CAM-modellen er blevet brugt med succes til at vurdere invasionen af celler gennem kælderen membran, der efterligner tidlige invasive stadier af carcinomer og melanom10,11,12. CAM består af øvre chorioniske epitel, mellemliggende mesenchyme, og lavere allantois epitel. Den chorioniske epitel er strukturelt ligner humant epitel10,13 i, at kollagen-IV-rige kælder membran simulerer kælderen membran, der adskiller det orale epitel fra det underliggende bindevæv. Da den første tumor grafts blev udført i cam i 191314, mange tilpasninger af metoden blev udviklet for at give mulighed for vurdering af angiogenese15,16,17, tumorprogression, og metastase18. Det er vigtigt, at teknikken med pode tumorer på CAM-modulet har ændret sig meget lidt, men applikationerne er i konstant udvikling. Der er offentliggjort analyser af stigende kompleksitet, herunder lægemiddel screening19, knoglevæv Engineering20og nanopartikel baserede anticancerlægemidler21.
Vores laboratorium bruger en CAM-DRG-model, hvor et pattedyrs DRG isoleres og podes på overfladen af det øvre CAM. Når DRG bliver inkorporeret i CAM-modulet, podes HNC-cellerne i nærheden af DRG og får lov til at interagere med DRG, før hele in vivo-systemet høstes og analyseres. Vigtigere, systemet tillader ex-vivo visuel observation af både DRG og tumor ved fluorescens mærkning af DRG og tumorceller. Denne protokol omfatter flere trin med forskellige kompleksitetsniveauer, der udføres inden for 17 dage, fra inkuering af æg til høst af CAM (figur 1). Celler, der udtrykker forskellige interesse proteiner, kan testes i denne model for at belyse de molekylære veje, der er ansvarlige for nerve invasion i kræft, og også for screening af lægemidler til direkte at målrette neurale invasion. Celler, der forbehandles med et kandidatstof, kan podes på CAM og forekomsten af PNI undersøgt i forhold til ubehandlet kontrol. CAM-modellen er faktisk blevet anvendt til lægemiddel screening som et mellemliggende trin mellem in vitro-undersøgelser og prækliniske in vivo-forsøg hos gnavere19.
Den eksperimentelle design vil variere med hypotesen. For eksempel, hvis test af rollen som et specifikt protein på PNI, den eksperimentelle gruppe vil omfatte DRG podet med tumorceller overudtrykker proteinet, mens kontrolgruppen bør omfatte DRG med celler stabilt transficeret med Tom vektor. Flere forskellige eksperimentelle designs kan bruges til at løse specifikke spørgsmål.
Protocol
Etik erklæring: alle eksperimenter med rotter i denne protokol er udført i overensstemmelse med IACUC (institutionel dyrepleje og brug Udvalget) regler fra vores institution. Eksperimenter med æg i denne undersøgelse er undtaget fra IACUC-forordningen.
1. æginkubation (anslået timing: 5 min, dag nul)
- Få patogenfri befrugtet kommerciel Lohmann White Leghorn æg, fortrinsvis på den første dag efter befrugtning. Der inkumeres seks æg pr. forsøgsgruppe i en ægbefugtning-inkubator ved 38 °C og 54% fugtighed i 8 dage med time rotation. Brug regelmæssig rotation af æggene for at forhindre, at embryonet klæber til ægmembranerne.
Bemærk: før inkubationen skal æggene opbevares i et køleskab på 18 °C for at standse embryo udviklingen i højst 1 uge.
2. høst og klargøring af Drg'er (anslået timing: 2 timer, dag 8)
Bemærk: eksperimenter med mus og rotter kræver godkendelse fra (IACUC). I nogle lande kræver brugen af hønseæg også godkendelse.
- Få seks til syv uger gamle Sprague Dawley rotter (~ 200 g i vægt) til at udtrække Drg'er.
Bemærk: en rotte bør give ~ 40 Cervical og bryst drgs. Mouse DRG integreres også i cam, men betingelserne for denne art skal optimeres uafhængigt. - I et laminært flow kabinet, høst DRG fra cervikale og bryst regioner efter protokollen for mus drgekstraktion offentliggjort andetsteds22. Følg figur 2 for orientering om, hvordan man høster drg'er.
- Euthanize rotten ved hjerte punktering efter administration af ketamin/xylazin injiceret intraperitoneally. Rengør rotte huden med 70% ethanol, og fjern rotte rygsøjlen ved hjælp af en saks. Du må ikke udføre cervikal dislokation, da dette ville beskadige de cervikale Drg'er.
- Adskille de cervikale, thorax og lænde regioner med samme Scissor, efter skematisk anatomisk repræsentation og brutto billeder, der er angivet i figur 2a-D. Placer rygsøjlen sektioner i en 10 cm kultur skål med 1x PBS at holde væv våde.
- Med en delikat knogle saks, åbne vertebrale knogler i rygsøjle og ventrale aspekter, der adskiller rygsøjlen i to laterale halvdele (figur 2E-F). Læg vævs sektionerne i en ren 10 cm skål med frisk 1x PBS.
- Brug pincet til forsigtigt at afmontere rygmarven fra vertebrale knogler for at visualisere Drg'erne (figur 2g).
- Med fine pincet, der holdes under hver DRG, skal du tage fat i den og trække den ud af den knogle hule, hvori den er indgivet. Hold ikke DRG direkte, da dette vil forårsage vævsskade. Du må ikke trimme Axon bundterne fra DRG (figur 2H).
Bemærk: undgå at bruge lænde Drg'er, da disse har reduceret integrationen i CAM-modulet. For DRG-regionens placering skal du følge skematisk illustration og grove anatomiske billeder på figur 2a-D.
- Umiddelbart efter høsten anbringes hver DRG i DMEM-kulturmedium suppleret med 2% penicillin/streptomycin (pen/STREP) og 10% varme inaktiveret føtal bovin serum (FBS) for at forhindre bakteriel kontaminering af Drg'erne. Gruppér alle Drg'er i samme 6 cm kultur skål med 4 mL kulturmedium.
- Efter høst alle Drg'er, overføre dem til en ny kultur skål med DMEM kulturmedium suppleret med 2% pen/STREP plus 10% FBS og indeholder 1,25 μg/mL rødt fluorescerende farvestof. Inkubere i 1 time i cellekulturen inkubator. I denne periode skal æggene forberedes til at modtage DRG som beskrevet nedenfor (trin 3).
Bemærk: intervallet mellem høst af Drg'er og færdiggørelse af fluorescens mærkning bør være tilstrækkeligt til at forberede æggene; Drg'erne kan opbevares i et par timer i inkubator.
3. klargøring af æg til DRG-potering (anslået timing: 1 t for et dusin æg, dag 8)
- I en laminar flow kabinet, dæmpe lyset og transilluminate æggene til at kontrollere for levedygtighed og embryonale fase. Udeluk æg med dårlig vaskulatur, ikke-befrugtede æg eller æg, der ikke er i overensstemmelse med dag 8 efter befrugtning. Hold ægget forsigtigt med den naturligt forekommende luft sæk mod lyskilden (figur 3a).
- Med en blyant skal du markere ægskallen for at modtage åbningerne (figur 3a-B).
- Først skal du identificere det udviklende embryon til CAM som et mørkt fartøj, der er knyttet til ægmembranen, og markere dette område for at undgå interventioner i denne region.
- For det andet, vælge det operativ vindue område som et godt vaskulære område mindst 2 cm fra embryo vedhæftet fil og tegne en 1,5 cm diameter cirkel. Ca. 1 cm fra drifts vinduet, tegne en 0,5 cm firkant i et mindre vaskulariseret område.
- For det tredje skal du trække Luftsækken for at udelukke den fra operationsområdet. Marker midten af Luftsækken med et kors.
- Med et rotationsværktøj og gravering boremaskine, 3 mm i diameter, bor ægskallen i den markerede firkant (figur 3c). Brug stumpe pincet til at fjerne æggeskallen uden at fjerne den ydre æg Shell membran (den hvide membran lige under skallen) (figur 3D). Arbejd omhyggeligt for at undgå utilsigtet perforering af denne membran.
- Ved hjælp af samme boremaskine som i trin 3,3 skal der foretages en lokal perforering i det markerede kryds i luft sædets område for at tillade luftgennemstrømning i ægget (figur 3E). Vær omhyggelig med ikke at lægge for meget pres på ægget, for at undgå at bryde eller beskadige det.
- Der anbringes 30 μL HBSS i kvadrat åbningen over den intakte udvendige ægshell membran (figur 3E). Med en 30-G sprøjte kanyle, skal du foretage en lokal perforering i den ydre membran i dette firkantede område (figur 3F).
- Anbring ægget i lyskilden for at visualisere Luftsækken. Pres på en pipette gummi pære og læg den i den lille perforering, der er foretaget i Luftsækken (trin 3,4). Frigør tryk i pæren, indtil du ser adskillelse af de to membraner i drift vindue område (figur 3g); Gentag dette trin så mange gange som du har brug for at opnå fuldstændig adskillelse af membraner i drift vindue område.
- Gentag trin 3.1-3.6 for alle æg.
- Ved hjælp af samme boremaskine som i trin 3,3 skal du bore det cirkulære betjenings vindue omhyggeligt for ikke at sprænge den ydre ægshell membran (figur 3H). Rengør ægoverfladen ved forsigtigt at stikke et klæbebånd af for at fjerne alle løse partikler.
- Med sløv pincet skal ægskallen fjernes fra det borede område (figur 3I-J). Næste, med de samme pincet, fjerne den ydre æg Shell membran (figur 3K), er omhyggelig med ikke at indføre små Shell partikler inde i ægget for at minimere kontaminering.
- Identificer CAM-modulet ca. 1 cm dybde fra ægoverfladen. Dæk hvert åbnet æg midlertidigt med paraffinvoks membran for at undgå kontaminering (figur 3 l).
- Gentag trin 3.8-3.10 for alle æggene. Læg æggene tilbage i æginkubatoren uden rotation, indtil Drg'erne er klar til potning.
4. potning af DRG på CAM (anslået timing: 40 min., dag 8)
- Forbered en 6 cm kultur skål med HBSS medium, til at vaske Drg'erne før implantation. Bring de forberedte æg til cellekulturen laminar flow kabinet. Fjern paraffin membranen fra ægget (figur 4a).
- Med fine sterile pincet skal du forsigtigt tage fat i en DRG indefra kulturmediet. Dyp det ind i HBSS mediet for at fjerne det overskydende medium, der indeholder det fluorescerende farvestof. Hold DRG meget forsigtigt; ellers vil det holde sig til pincet.
- Anbring DRG på CAM-modulet, idet du er omhyggelig med ikke at punktere membranen (figur 4b-C). Brug om nødvendigt et andet par pincet til at frigøre DRG fra spidsen af pincet, når du placerer det på CAM-modulet.
Bemærk: hold DRG våd med HBSS medium vil også lette løsrivelse fra pincet. - Dæk ægget med en steril transparent film dressing. Dæk alle vinduer og punkteringer lavet i æggeskallen for at undgå bakteriel kontaminering (figur 4d).
- Efter transplantation af Drg'er i alle æg inkuberer æggene i en befugtning-inkubator ved 38 °C og 54% fugtighed i 2 dage uden rotation.
5. pode tumorceller på CAM (anslået timing: 1 t 30 min, dag 10)
- På 48 h før pode cellerne, plade de celler, der er nødvendige i kultur plader. Beregn 0,5 til 1 x 106 celler pr. æg for UM-SCC-1 celler for at generere tredimensionale TUMORER i cam. Vær opmærksom på, at celle nummeret kan variere efter cellelinje.
- Aspirate medium og tilsæt DMEM kulturmedium suppleret med 1% pen/STREP plus 10% FBS og 2,5 μg/mL grøn fluorescerende farvestof. Der inkuleeres i 1 time ved 37 °C i celle kulturens inkubator. Kontroller derefter fluorescens intensitet på mikroskopet, Aspirér medium, vask én gang med 1x PBS, og tilsæt 0,25% trypsin i op til 10 min. Neutralisér trypsin med DMEM suppleret medium.
- Der centrifugeres ved 250 x g i 4 minutter, så der dannes en celle pellet. Aspirer DMEM-mediet, og resuspender i HBSS for at vaske det overskydende fluorescerende farvestof. Tæl celler ved hjælp af en hemocytometer.
- Bring æggene til cellekulturen laminar flow kabinet. Med sakse og tang skal du åbne den transparente film dressing, der dækker ægget (figur 4E-F).
- Det beregnede antal celler centrifugeres igen, og HBSS-mediet aspireres og gensuspenderes ved en endelig koncentration på 0,5 til 1x106 celler pr. 5 μl af det samme medium (figur 4g). Klargør det nødvendige beløb for det samlede antal æg (5 μL cellesuspension pr. æg).
- Der anbringes 5 μL celle opløsning på CAM-modulet, ca. 2 mm fra DRG (figur 4H). Hold ensartede afstande mellem DRG og celler. Vær meget omhyggelig med ikke at forstyrre ægget for at minimere spredningen af cellerne.
Bemærk: for at starte celle implantation skal du vælge æg, hvor CAM-overfladen er visuelt tør. Hvis overfladen er for våd, kan cellerne sprede sig og ikke danne regulære tumorer. - Dæk ægget med en ny film dressing som i trin 4,4. Transplantat cellerne i alle æg. Æggene inkuperes i en befugtning-inkubator ved 38 °C og 54% fugtighed i 7 dage uden rotation.
6. høst af CAM (anslået timing: 1 t for dusin æg, dag 17)
- Forbered 6-brønd plader med 4% PFA (PARAFORMALDEHYD) pH 7.0, en brønd pr. æg, 2 mL pr. brønd.
- Bring æggene til en laboratorie bænk. Ved hjælp af en nål fastgjort til en sprøjte for at perforere filmen dressing, drop omkring 300 μL PFA over CAM til lidt stivere CAM, og dermed lette høstprocessen. Gentag dette for alle æg.
- Med en saks fjernes den øverste halvdel af ægskallen (hvor betjenings vinduet er placeret) med det tilsluttede CAM (fig. 4I). Reducer størrelsen af denne halvdel til ca. 3 cm i diameter, holde den del af CAM, hvor DRG og tumorceller blev podet i midten (figur 4J). Tag fat i CAM-modulet med fine pincet, og Løsn det fra æggeskallen, mens du placerer det i PFA. Vend DRG og cancercellerne opad (figur 4k-L).
Bemærk: 3 cm-området skal omfatte både DRG og celler. Den DRG er let ses som en lille klump fastgjort på CAM, men tumorceller er undertiden vanskeligt at identificere på Gross eksamen. - Alternativt, med en saks, udvide betjenings vinduet fjerne æggeskallen fra toppen af ægget og samtidig holde CAM på plads; fjerne ca. 1 cm ud over drifts vinduet (figur 4M) og identificere DRG og cellerne på CAM-modulet (figur 4n-O). Med delikate fine pincet skal du holde CAM-modulet på en af kanterne og løfte det forsigtigt. Med en skarp delikat saks skal du forsigtigt klippe CAM-modulet ud for at fjerne et cirkulært område, ca. 3 cm i diameter (figur 4P), og placere CAM-modulet i PFA med DRG og kræftceller opad.
Bemærk: undgå at strække eller holde CAM-modulet med tang på flere steder for at minimere vævsskader, der kan generere mikroskopi artefakter. - Anbring hver enkelt CAM-membran i en brønd (figur 4L). Tag forsigtigt fat i kanterne på CAM-modulet for at sprede vævet i PFA, eller Ryst forsigtigt pladen, indtil CAM-modulet er udfoldet, for at undgå at folde artefakter.
- Euthanize embryo (dag 17) ved hurtig halshugning. Fastgør det høstede væv i PFA i 4 timer ved stuetemperatur. Efter fiksering skal PFA udskiftes med 1x PBS, og der opbevares væv i PBS ved 4 °C, indtil der integreres i paraffin til skæring. Undgå over binding, som vil beskadige CAM-kamera Rens delikate vaskulatur.
- Ved hjælp af en fluorescens stereo mikroskopi, fotografere membraner inden for 2 dage efter høst for at undgå at miste fluorescerende signaler.
Representative Results
Når optimeret, denne metode har nær 100% DRG integration i CAM. Repræsentative resultater af DRG-integrationen er vist i figur 5a-B. Integrationen af DRG i CAM-modulet er vigtig, da det giver DRG-vævet levedygtighed under forsøget. Mikroskopisk ses DRG i bindevæv på CAM (H & E bejdse). Blodkar er ofte set inde i DRG væv, tyder på, at CAM blodforsyningen er nærende det podede væv. Implanterede tumorer er også identificeret på CAM af H & E; afhængigt af hvor meget invasion er til stede, tumorer kan præsentere med ingen til talrige tumor øer invaderer bindevæv (figur 5c-D). Den repræsentative figur 5e-F viser det høstede cam på lysfelt Imaging og fusioneret fluorescens. UM-SCC-1 celler overudtrykker Galanin receptor 2 præsenteret øget invasion af DRG i forhold til kontrol celler (figur 5g-H). Cancer-DRG interaktion er observeret som kræftceller præsenterer retningsbestemt invasion mod DRG (figur 5H).
Data analyse udføres på forskellige måder. Den retningsbestemte invasion af cancerceller mod DRG observeres som en dikotomøs variabel, og antallet af æg, der præsenterer dette mønster af invasion tælles i hver gruppe. Statistiske forskelle mellem grupperne beregnes ved hjælp af en binomial test af proportioner. Nærhed mellem kræftceller og DRG, og tumor område måles ved hjælp af ImageJ6 og forskelle mellem grupper vurderes ved hjælp af student's t test. For at sikre nøjagtighed med ImageJ analyse, skal alle billeder fra samme eksperiment tages på lige lys og eksponering indstillinger. Efter justering af billed tærskel og lysstyrke af alle billeder ved hjælp af samme kriterier, den analysere partikler værktøj bruges til at måle tumor område og den lineære måling værktøj måler tumor-DRG afstande. Det er vigtigt at bruge konstant opsætning af størrelsen af partikler analyseret for alle billeder på tværs af forskellige grupper. I nogle tilfælde, tumorer vokse tykkere og kan manuelt måles med en digital caliper, giver mulighed for en volumenmåling.
Ved hjælp af sektioner af paraffin-indlejret cam væv, H & E bejdses eller Immunhistokemi for epitelceller (anti-cytokeratin antistof reaktiv for menneskelige arter) kan udføres, giver mulighed for vurdering af invasion i bindevæv. Invasion er kvantificeret som antallet af tumor øer i bindevæv per æg. Immunofluorescens for kollagen IV kan bruges til at fremhæve kælderen membran. Også, hvis du bruger gfp-mærkede kræftceller, identifikation af disse celler i vævs sektioner lettes uden en Immunhistokemi for cytokeratin. Metastaser og angiogenese analyse i cam eksperimenter diskuteres andre steder10,17.
Figur 1: Eksperimentér tidslinje, herunder de vigtigste trin på dag 0, 8, 10 og 17. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: DRG-ekstraktion på dag 8 . A. rotte skematisk illustrerer den anatomiske placering af rygsøjlen. B. diagram af ryghvirvler i rotte, der viser forskellige kropsområder; grøn for livmoderhals, mørkeblå for thorax, orange for lænde og lyseblå for Sakral hvirvler. C-D. Ventral aspekt af rotte rygsøjlen efter kirurgisk excision; adskillelse af regionerne som illustreret i B. E. dissektion af ryghvirvler til åbning af rygmarvskanalen, adskillelse af vertebrale legemer i to laterale sektioner, der indeholder drg'erne. sektionen bør skære gennem rygsøjle og ventrale aspekt af hver rygsøjlen knogle ved midterlinjen. F. brutto aspekt af den åbne thorax-ryg. G. Når rygmarven er forskudt, er drg'erne let synlige i rygsøjlen (pilehoveder peger 3 drg'er). H. stereomikroskopisk billede af en DRG (pil) med de tilsvarende Axon bundter (pilehoved). Skala stænger: C, D, Fog G, 1 cm; H, 1 mm. Klik venligst her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: klargøring af æggene på dag 8. A-B. Identifikation af ægvaskulatur og mærkning forud for proceduren. Pile på et punkt til den naturligt forekommende luft sæk. C-D. Boring og åbning af æggeskallen på det firkantede åbnings mærke. Pil på D peger på den intakte ydre æg Shell membran efter fjernelse af skallen ved hjælp af sløv pincet. E. det markerede kryds på Luftsækken er perforeret med boret for at tillade luftgennemstrømning i ægget (pilhovedet). 30 μL HBSS-medium anbringes på den ydre ægshell membran på kvadrat åbningen. F. med en fin sprøjte kanyle er den ydre ægshell membran perforeret, hvor HBSS tidligere var anbragt. G. Tryk påføres en gummi pipette pære, mens den fastsættes til perforeringen boret på Luftsækken. Når finger trykket frigives, luft støvsuges, genererer en kunstig luft SAC (hvide pile), der skal udvides til at styre vinduet. H. kanterne af operativ vinduet er boret i en næsten parallel position til æggeskallen, for at undgå utilsigtet perforering. I-J. Fjernelse af ægskallen med sløv tang. K. Fjern den ydre ægshell membran med sløv tang, idet du er omhyggelig med ikke at indføre partikler på cam (observeret ved ̴1 cm under overfladen). L. æggene dækkes midlertidigt med en paraffin membran og sættes tilbage i inkubatoren. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Potering af DRG, celler og høst af cam: på dag 8: A. CAM let observeres efter paraffinvoks membran fjernelse. B-C. Med fine pincet anbringes DRG på CAM-modulet. D. Egg er dækket med film dressing og sat i inkubator; pilene peger på de åbninger, der er dækket. På dag 10: E-F. Film dressing er fjernet og DRG er placeret (pilehoved på F). G-H. 5 μL celle opløsning slippes på CAM-modulet med en afstand på ~ 2 mm fra DRG. På dag 17: I-L og M-P demonstrere to forskellige tilgange, der anvendes til at høste cam. I. æggeskallen åbnes med en fin saks, der starter på den luft sæk, der bores perforering, indtil den øverste halvdel af ægget er fjernet. J. æggeskallen, der indeholder CAM-modulet, er reduceret til ca. 3 cm. K-L. Med fine pincet er CAM løsrevet fra ægskallen og anbragt i PFA. M-O. Udvidelse af drifts vinduet udføres for at visualisere DRG og kræftceller på CAM. Arrowhead peger på tumoren og pilen peger på DRG. P. CAM-modulet er grebet med fine pincetter, skåret ud med en skarp saks, og placeret i PFA som vist i L. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: repræsentative resultater. Afsnit A. H &Amp; E, der viser integrationen af DRG i CAM-modulet. B. højere forstørrelse af A; pilene viser CAM-blodkarrene i DRG. C. UM-SCC-1 celler PODET på cam og høstet fire dage efter potning (H & E bejdning). D. højere forstørrelse af C viser invasive tumor øer i cam bindevæv (pile). E. groft stereomikroskopisk billede af cam-podet med UM-SCC-1-GALR2 celler og rat DRG, høstet på dag 17. F. fusionerede fluorescens og lysfelt billeder fremhæver DRG mærket i rødt og kræftceller mærket med grønt. G-H. Fluorescens stereomikroskopi af CAM-podet med DRG og UM-SCC-1-GALR2 versus kontrol celler, der illustrerer retningsbestemt invasion af UM-SCC-1-GALR2 celler til DRG (H). Skala stænger: A-D, 500 μm; E-H, 2 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Trin | Problem | Grund | Løsning | ||||||
| 3.2.1 | Embryoets vedhæftede fil kunne ikke identificeres. | Fastgørelse position er svært at se, mens ægget er stadig. | Drej ægget hurtigt sidelæns at være i stand til at se en lang beholder fastgjort til ægge membranen. | ||||||
| 3,3 & 3,8 | Perforering af den ydre ægshell membran under boring. | Forkert positionering af boret. | Anbring boret næsten parallelt med ægskallen under boring. Hvis membranen er perforeret i trin 3,3, er der ingen grund til at udføre yderligere perforering med nålen som angivet i trin 3,5. Hvis der sker blødning, kasseres ægget. | ||||||
| 4,3 af | DRG klæber til pincet. | DRG er tørt. | Våd DRG igen i HBSS og/eller brug en fin nål til at hjælpe med at løsne DRG fra pincet. | ||||||
| 5,2 af | Cellerne er ikke perfekt mærket med fluorescerende farvestof. | Inkubationstid. Nogle celler kræver mere tid til at mærke. | Hold celler i en ekstra time i medier med fluorescerende farvestof. | ||||||
| 5,6 af | Luftboble på celle drop. | Brug al væsken i pipettespidsen. | Læg 1 ΜL mere end det ønskede volumen, og brug ikke den sidste μL af pipetten, når cellerne implanteres. Dette vil undgå luftbobler i cellerne mix. | ||||||
| 6,3 af | Det er ikke muligt at identificere DRG eller celler, når CAM-modulet høstes. | Lille DRG, DRG blev fordrevet, kræftceller spredes. | Hvis DRG ikke ses, høstes et større område af CAM og anbringes i en større beholder til fiksering. Kontrollér DRG og cellepositionen under fluorescens i et stereomikroskop, og trim derefter CAM-modulet til en mindre størrelse til paraffin indlejring. | ||||||
Tabel 1: fejlfindings tabel
Discussion
CAM-DRG in vivo model præsenteret her omhandler underskud af tidligere modeller ved at demonstrere nerve-tumor interaktion før fysisk invasion af nerve af tumorceller. De fleste in vivo-studier af PNI fokuserer på tumor spredning og hæmning af motorisk funktion, og afhænger af direkte injektion af tumorceller i sciatiske nerver23,24,25. Den iskiatiske nerve injektion er en in vivo model af PNI, hvor kræftceller injiceres i en mus eller rotte sciatiske nerve, hvor tumoren efterfølgende vokser. Injektion modeller er nyttige til at vise destruktive tumorprogression og smerter som følge af tumorceller i nerver. Den sciatiske nerve model er også velegnet til studiet af faktorer, der tillader kræftceller til at trives i nerven, men mangler evnen til at vurdere den tidlige fase af PNI, fordi det introducerer celler direkte ind i nerve, omgåelse nerve sakse. I en anden tilgang, kirurgisk implanteret ortotopic tumor grafts blev brugt til at karakterisere betydningen af adrenerge og kolinerge nervefibre i at fremme prostatacancer progression, hvilket tyder på en fremtrædende rolle af nerver i tumorprogression 26. denne model bestod af kemisk ablation af murine sympatiske og parasympatiske nerver. De parasympatiske fibre infiltreret tumor væv, en procesrelateret til PNI, men modellen blev ikke specifikt brugt til at vurdere fysiske interaktioner mellem nerve og tumor. CAM-DRG-modellen gør det muligt at undersøge interaktioner mellem nerve og kræft under PNI. Desuden er murine modeller dyre og tidskrævende i forhold til CAM-modellen. Vi foreslår at bruge CAM-DRG modellen til mekanistiske studier af PNI.
Nogle fordele ved CAM-DRG tilgang omfatter vurdering af PNI og andre fænotyper, såsom tumorvækst, metastaser, og angiogenese. Identifikation af humant DNA på den nedre CAM og/eller i leveren kan anvendes til påvisning af metastaser af humane Cancer cellelinjer10, en mere følsom eksperimentel tilgang sammenlignet med vævs skæring og farvning, som ikke kan afsløre små metastaser.
CAM-DRG-metoden har nogle begrænsninger, herunder den korte observations tidsramme. Embryoets immunsystem er fysiologisk aktivt på dag 1827, når afstødning og en inflammatorisk proces kan finde sted, hvilket begrænser forsøgs tiden. Det er også vigtigt at overveje afstanden, når pode tumorceller tæt på DRG; større DRG-Cancer afstande kan forringe de molekylære interaktioner mellem tumorceller og nerve, eller kan forsinke den fysiske kontakt mellem begge komponenter i modellen. Også, hvis embryonerne er ældre end fastsat i denne protokol, embryo bevægelser kan fortrænge tumorcellerne. Derfor er det vigtigt at bruge æg i overensstemmelse med dag 10 post-befrugtning for celletransplantation.
Da immunsystemet ikke er fuldt udviklet før dag 1827, tumor mikromiljø i cam svarer til den immunsupprimerede murine modeller ofte anvendes til kræft undersøgelser. Derfor, denne model er ikke nyttigt at vurdere den rolle, immunceller i tumorprogression. En anden begrænsning er den begrænsede tilgængelighed af reagenser til kyllinge arter, såsom antistoffer, cytokiner og primere.
Det kræver øvelse at udføre denne protokol nøjagtigt. Det kan dog gøres af et laboratorie medlem uden behov for en specialiseret kerne facilitet. Boring af ægskallen kræver træning. Øve på købmand (ikke-befrugtede) æg anbefales, før du forsøger denne model for første gang. Høj embryonal overlevelse og succes af modellen kan opnås, hvis nogle kritiske skridt til at undgå infektion følges: passende antibiotika profylakse af DRG i 2% pen/STREP, arbejder i en laminar flow kabinet, og undgå spredning af æg Shell partikler på CAM-modulet. Det er også afgørende at holde stabil luftfugtighed under den samlede æginkubationstid. Vi anbefaler at øge antallet af æg pr gruppe, indtil teknikken er mestret. De hyppigste problemer for uerfarne laboratoriepersonale er ægkontaminering og unøjagtig teknik til celletransplantation.
DRG høst kræver også uddannelse; praksis ved høst af Drg'er til in vitro-eksperimenter8 før forsøg med in vivo-modellen anbefales. Den in vitro DRG kultur er en mulighed for at optimere forholdene og forbedre teknikken til at forkorte varigheden af DRG udvinding. Særlig opmærksomhed på høst teknik er nødvendig, når gribe DRG med pincet. DRG bør ikke holdes direkte; Tryk skal påføres nedenunder. Vi anbefaler brug af Forstørrelsesglas for bedre at kunne visualisere DRG under udsugning.
Vigtigt, når du udfører denne model for første gang, bør alle betingelser være optimeret til den ønskede cellelinje. Denne model blev optimeret til rotte DRG og HNC cellelinje Umm-SCC-1. Brugen af mus DRG og andre kræft celletyper kan kræve optimering. Med en højere koncentration af podede celler, tumorer tendens til at vokse tykkere og stivere, hvilket letter tumor målinger. Når der tages hensyn til flere æg for hver gruppe og en passende koncentration af celler for hvert æg, kan der kræves flere millioner celler for hvert forsøg. For at lette planlægningen bør der tages hensyn til kendskabet til fordoblings tiden for cellerne. Der findes en fejlfindings tabel for nogle vigtige trin i denne protokol (tabel 1).
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NIH/NIDCR tilskud DE027551 og DE022567 (NJD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | # 25200-056 | |
| ACE light source | SCHOTT North America, Inc. | Used to transilluminate the eggs | |
| CellTracker Green CMFDA fluorescent dye | Life Technologies | # C7025 | Reconstitute 50µg in 20µL of DMSO and stock at -20oC. Use 1µL of stock solution/mL of culture medium. |
| CellTracker Red CMTPX fluorescent dye | Life Technologies | # C34552 | Reconstitute 50µg in 40µL of DMSO and stock at -20oC. Use 1µL of stock solution/mL of culture medium |
| Cordless rotary tool | DREMEL | # 866 | Used to drill the egg shell |
| DMEM (1x) | Gibco | # 11965-092 | Dulbeecco`s Modified Eagle Medium |
| DMSO | Fisher Bioreagents | # BP231-100 | Dimethyl Sulfoxide |
| Dumont # 5 fine forceps | Fine Science Tools (FST) | # 11254-20 | Used to harvest DRG |
| Egg incubator | GQF Digital Sportsman | # 1502 | Egg incubator equipped with automatic rotator, digital thermostat, temperature and humidity controls |
| Engraving cutter | DREMEL | # 108 | Used to drill the egg shell |
| Extra fine Graefe forceps, curved | Fine Science Tools (FST) | # 11151-10 | Used to graft DRG onto the CAM on day 8 and to harvest CAM tissue on day 17 |
| Extra fine Graefe forceps, straight | Fine Science Tools (FST) | # 11150-10 | Used to graft DRG onto the CAM on day 8 and to harvest CAM tissue on day 17 |
| Fertilized Lohmann White Leghorn eggs | Fertilized eggs at early fertilization days, preferably on first day post-fertilization. Eggs used in this protocol are from Michigan State University Poultry Farm. | ||
| Filter Forceps | EMD Millipore | # XX6200006P | Blunt forceps used to remove the egg shell |
| Fine surgical straight sharp scissor | Fine Science Tools (FST) | #14060-09 | Used to harvest the CAM tissue on day 17 |
| HBSS (1x) | Gibco | # 14025-092 | Hank`s Balanced Salt Solution |
| HI FBS | Gibco | # 10082-147 | Heat-inactivated Fetal Bovine Serum |
| Paraffin wax membrane | Parafilm laboratory film | # PM-996 | Used to temporarily cover the egg openings until DRG grafting on day 8 |
| PBS (1x) pH 7.4 | Gibco | # 10010-023 | Phosphate Buffered Saline |
| Pen/Strep | Gibco | # 15140-122 | 10,000 Units/mL Penicilin, 10,000 µg/mL Streptomycin |
| PFA (paraformaldehyde solution) | Sigma-Aldrich | # P6148-1KG | Dilute in water to make a 4% PFA solution |
| Sprague Dawley rats (females) | Charles River laboratories | Strain code: 001 | 6-7 weeks old (190-210g in weight) |
| Tegaderm Transparent Film Dressing | 3M | # 9505W | Sterile, 6x7cm, used to cover the egg openings during incubation |
References
- Schmitd, L. B., Scanlon, C. S., D'Silva, N. J. Perineural Invasion in Head and Neck Cancer. Journal of dental research. 97 (7), 742-750 (2018).
- Liebig, C., Ayala, G., Wilks, J. A., Berger, D. H., Albo, D. Perineural invasion in cancer: a review of the literature. Cancer. 115 (15), 3379-3391 (2009).
- Schmitd, L. B., et al. Redefining Perineural Invasion: Integration of Biology With Clinical Outcome. Neoplasia (New York, N.Y). 20 (7), 657-667 (2018).
- Chinn, S. B., et al. Impact of perineural invasion in the pathologically N0 neck in oral cavity squamous cell carcinoma. Otolaryngology--head and neck surgery : official journal of American Academy of Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 149 (6), 893-899 (2013).
- Tai, S. K., Li, W. Y., Yang, M. H., Chu, P. Y., Wang, Y. F. Perineural invasion in T1 oral squamous cell carcinoma indicates the need for aggressive elective neck dissection. The American journal of surgical pathology. 37 (8), 1164-1172 (2013).
- Scanlon, C. S., et al. Galanin modulates the neural niche to favour perineural invasion in head and neck cancer. Nature communications. 6, 6885 (2015).
- Amit, M., et al. Upregulation of RET induces perineurial invasion of pancreatic adenocarcinoma. Oncogene. 36 (23), 3232-3239 (2017).
- Huyett, P., Gilbert, M., Liu, L., Ferris, R. L., Kim, S. A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma. Journal of visualized experiments : JoVE. (119), (2017).
- Ayala, G. E., et al. In vitro dorsal root ganglia and human prostate cell line interaction: redefining perineural invasion in prostate cancer. The Prostate. 49 (3), 213-223 (2001).
- Liu, M., et al. The Histone Methyltransferase EZH2 Mediates Tumor Progression on the Chick Chorioallantoic Membrane Assay, a Novel Model of Head and Neck Squamous Cell Carcinoma. Translational oncology. 6 (3), 273-281 (2013).
- Busch, C., Krochmann, J., Drews, U. The chick embryo as an experimental system for melanoma cell invasion. PloS one. 8 (1), e53970 (2013).
- Li, M., et al. The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma. Journal of visualized experiments : JoVE. (104), (2015).
- Ota, I., Li, X. Y., Hu, Y., Weiss, S. J. Induction of a MT1-MMP and MT2-MMP-dependent basement membrane transmigration program in cancer cells by Snail1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (48), 20318-20323 (2009).
- Murphy, J. B. TRANSPLANTABILITY OF TISSUES TO THE EMBRYO OF FOREIGN SPECIES : ITS BEARING ON QUESTIONS OF TISSUE SPECIFICITY AND TUMOR IMMUNITY. The Journal of experimental medicine. 17 (4), 482-493 (1913).
- Ribatti, D., Nico, B., Vacca, A., Presta, M. The gelatin sponge-chorioallantoic membrane assay. Nature. 1 (1), 85-91 (2006).
- Auerbach, R., Arensman, R., Kubai, L., Folkman, J. Tumor-induced angiogenesis: lack of inhibition by irradiation. International journal of cancer. 15 (2), 241-245 (1975).
- Banerjee, R., et al. The G protein-coupled receptor GALR2 promotes angiogenesis in head and neck cancer. Molecular cancer therapeutics. 13 (5), 1323-1333 (2014).
- Ossowski, L., Reich, E. Experimental model for quantitative study of metastasis. Cancer research. 40 (7), 2300-2309 (1980).
- Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
- Moreno-Jimenez, I., et al. The chorioallantoic membrane (CAM) assay for the study of human bone regeneration: a refinement animal model for tissue engineering. Scientific reports. 6, 32168 (2016).
- Vu, B. T., et al. Chick chorioallantoic membrane assay as an in vivo model to study the effect of nanoparticle-based anticancer drugs in ovarian cancer. Scientific reports. 8 (1), 8524 (2018).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC research notes. 9, 82 (2016).
- Cavel, O., et al. Endoneurial macrophages induce perineural invasion of pancreatic cancer cells by secretion of GDNF and activation of RET tyrosine kinase receptor. Cancer research. 72 (22), 5733-5743 (2012).
- Guo, K., et al. Interaction of the sympathetic nerve with pancreatic cancer cells promotes perineural invasion through the activation of STAT3 signaling. Molecular cancer therapeutics. 12 (3), 264-273 (2013).
- Deborde, S., et al. An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion. Journal of visualized experiments : JoVE. (134), (2018).
- Magnon, C., et al. Autonomic nerve development contributes to prostate cancer progression. 341 (6142), Science. New York, N.Y. 1236361 (2013).
- Ribatti, D. Chick embryo chorioallantoic membrane as a useful tool to study angiogenesis. International review of cell and molecular biology. 270, 181-224 (2008).
