Summary
Perineural 침략은 머리와 목 편평 상피 세포 암 및 그밖 종양을 위한 공격적인 표현형입니다. 병아리 융모난성 막 모형은 혈관신생, 암 침략 및 전이를 공부하기 위하여 이용되었습니다. 여기에서 우리는 이 모형이 생체내 perineural 침략을 평가하기 위하여 이용될 수 있는 방법을 보여줍니다.
Abstract
Perineural 침략은 암이 신경을 포위하거나 침입하는 표현형입니다. 그것은 머리와 목 편평 상피 세포 암 및 그밖 암을 위한 나쁜 임상 결과와 연관됩니다. 기계론적 연구는 신경과 종양 세포 사이 분자 누화는 물리적 상호 작용의 앞에 생깁니다. 물리 신경 종양 상호 작용이 발생하기 전에, 특히 초기 진행을 조사하기 위해, perineural 침략을 연구하는 생체 내 모델은 몇 가지가 있습니다. 병아리 융모알란토막 모델은 인간 상피 조직의 것을 모방하기 때문에, 외피 상피의 지하 막이 암 침략을 연구하기 위하여 이용되었습니다. 여기에서 우리는 골짜기 상피상에 쥐 등쪽 뿌리 중추 및 인간 머리 및 목 편평 상피 세포 세포를 이식하는 perineural 침략을 조사하기 위하여 병아리 chorioallantoic 막 모형을 용도를 변경했습니다. 우리는 이 모형이 생체 내에서 신경 조직을 침략하는 암세포의 기능을 평가하는 것이 유용할 수 있는 방법을 설명했습니다.
Introduction
Perineural invasion (PNI)는 두경부 편평 세포 암종(HNC)을 가진 환자에서 높은 질병 재발 및 가난한 생존과 연관되는암에 있는 과소 평가된 표현형입니다 1. PNI는 신경내또는 주변 종양 세포로 현미경으로 정의 2,3. PNI가 검출되면, 환자는 선택적인 목 해부 및/또는 방사선 요법4,5와같은 보조 요법을 받을 가능성이 높습니다. 그러나, 이 치료는 공격적이고, PNI 특정이 아닙니다. 사실, PNI를 차단하는 치료법은 없으며, 주로 신경 종양 상호 작용의 근본적인 메커니즘이 여전히 제대로 이해되지 않았기 때문입니다.
다른 분자 메커니즘 신경 종양 매력에 연루 되었습니다.; 종양 및 기질 세포는 신경펩타이드와 신생을 촉진하는 성장인자를 방출6,7. 시험관 내에서 함께 배양할 때, HNC 세포와 등쪽 뿌리 중추 (DRG) 둘 다 강력한 반응을 갖는다; 종양 세포 침입 및 신생에 대한 효과는 배양 6,8,9에서며칠 후에 볼 수 있습니다. 그러나, 침략 의 앞에 종양 신경 상호 작용을 재량화하기 위하여 적당한 생체 내 모형의 부족이 있습니다. 여기에서 우리는 HNC 세포와 신경 사이 초기 상호 작용을 공부하기 위하여 생체 내 PNI 모형을 제출합니다6. 우리는 신경 성분을 포함하도록 병아리 융모암 막 (CAM) 모델을 적용하고, CAM에서 DRG를 이식하고, 암세포의 이식편을 이어서 내막 종양 미세 환경을 모방하였다.
CAM 모델은 암종과 흑색종의 초기 침습 단계를 모방하여 지하 막을 통해 세포의 침입을 평가하는 데 성공적으로 사용되었으며10,11,12. CAM은 상부 융모 상피, 중간엽, 하부 항인성 상피로 구성됩니다. 융모상피는 인간 상피10,13과 구조적으로 유사하며 콜라겐-IV가 풍부한 지하막은 경구 상피를 기본 결합 조직으로부터 분리하는 지하 막을 시뮬레이션한다는 점에서. 1913년14년CAM에서 첫 종양 이식편이 수행된 이래, 혈관신생15,16,17,종양 진행의 평가를 가능하게 하는 방법의 많은 적응이 개발되었다. 전이18. 중요한 것은, CAM에 종양을 이식하는 기술은 아주 조금 변경되었습니다, 그러나 응용은 지속적으로 발전하고 있습니다. 약물 스크리닝19,골조직 공학20,나노입자 기반 항암제(21) 등 복잡성이 증가하는 것으로 발표되었다.
우리의 실험실은 포유류 DRG가 격리되고 상부 CAM의 표면에 접목되는 CAM-DRG 모델을 사용합니다. DRG가 CAM에 통합된 후, HNC 세포는 DRG 근처에서 이식되고 전체 생체 내 시스템을 수확하고 분석하기 전에 DRG와 상호 작용할 수 있습니다. 중요한 것은, 시스템은 DRG 및 종양 세포의 형광 표지에 의하여 DRG 및 종양 둘 다의 전 생체내 시각적 관찰을 허용합니다. 이 프로토콜은 계란 배양에서 CAM 수확에 이르기까지 17 일 이내에 수행 된복잡성의 상이한 수준을 가진 여러 단계로 구성됩니다 (그림 1). 관심있는 다른 단백질을 표현하는 세포는 암에 있는 신경 침략에 책임 있는 분자 통로를 해명하기 위하여 이 모형에서 시험될 수 있고, 또한 신경 침략을 직접 표적으로 하는 약을 검열하기 위하여. 후보 약물로 전처리된 세포는 치료되지 않은 대조군과 비교하여 조사된 CAM 및 PNI의 발생에 이식될 수 있다. 실제로, CAM 모델은 설치류19에서생체 외 내 연구와 전 임상 시험 사이의 중간 단계로 약물 스크리닝에 사용되어 왔다.
실험 설계는 가설에 따라 달라집니다. 예를 들어, PNI에서 특정 단백질의 역할을 테스트하는 경우, 실험군은 단백질을 과발현하는 종양 세포로 이식된 DRG를 포함하지만, 대조군은 빈 벡터로 안정적으로 형질감염된 세포를 가진 DRG를 포함해야 한다. 여러 가지 다른 실험 설계를 사용하여 특정 질문을 해결할 수 있습니다.
Protocol
윤리 성명서: 이 프로토콜에서 쥐를 사용하는 모든 실험은 IACUC (기관 동물 관리 및 사용위원회) 규칙에 따라 수행됩니다. 이 연구에서 계란을 실험하는 것은 IACUC 규정에서 면제됩니다.
1. 계란 배양 (예상 타이밍 : 5 분, 일 제로)
- 병원균이 없는 비옥한 상용 로만 화이트 레그혼 계란을 얻는 것이 바람직하게는 첫날 수정 후. 38°C에서 실험군당 6개의 알을 38°C, 54%의 습도에서 시간당 회전하여 배양한다. 배아가 난막에 달라붙는 것을 막기 위해 계란의 규칙적인 회전을 사용하십시오.
참고: 배양 전에 계란을 18°C 냉장고에 보관하여 배아 발달을 최대 1주동안 중단하십시오.
2. 수확 및 DRG의 준비 (예상 타이밍 : 2 시간, 8 일)
참고: 마우스와 쥐를 실험하려면 (IACUC)의 승인이 필요합니다. 일부 국가에서는 닭고기 계란의 사용도 승인이 필요합니다.
- 6-7주 된 스프라그 도울리 쥐(무게 ~200g)를 얻어 DRG를 추출합니다.
참고 : 한 쥐는 ~ 40 자궁 경부 및 흉부 DRG를 산출해야합니다. 마우스 DRG는 CAM에 통합되지만이 종의 조건은 독립적으로 최적화되어야합니다. - 층류 캐비닛에서, 자궁 경부 및 흉부 부위로부터 DRG를 수확하는 것은 마우스 DRG 추출을 위한 프로토콜에 따라다른 곳에서 22. DRG를 수확하는 방법에 대한 오리엔테이션은 그림 2를 따르십시오.
- 케타민/ 자일라진을 투여한 후 심장 천자에 의해 쥐를 복강내로 주입합니다. 70% 에탄올로 쥐 피부를 청소하고 가위를 사용하여 쥐 척추를 제거합니다. 이것은 자궁 경관 DRGs를 손상할 것이기 때문에 자궁 경관 탈구를 능력을 발휘하지 마십시오.
- 도 2A-D에 제공된 도식 해부학적 표현 및 총 이미지에 따라 동일한 가위로 자궁경부, 흉부 및 요추 영역을 분리한다. 1x PBS와 함께 10cm 배양 접시에 척추 부분을 놓고 조직을 젖은 상태로 유지합니다.
- 섬세한 뼈 가위를 사용하면 등쪽과 복부 측면에서 척추 뼈를 열고 척추를 두 개의 측면 절반으로 분리합니다 (그림2E-F). 깨끗한 10cm 접시에 티슈 섹션을 신선한 1x PBS로 놓습니다.
- 집게를 사용하여 척수를 척추 뼈에서 부드럽게 분리하여 DRG를 시각화합니다(그림2G).
- 각 DRG 아래에 미세 한 집게를 잡고, 그것을 잡고 그것이 박혀있는 뼈 구멍에서 당겨. 조직 손상을 일으킬 수 있으므로 DRG를 직접 보유하지 마십시오. DRG(그림2H)에서축산 번들을 다듬지 마십시오.
참고: CAM의 통합이 감소했기 때문에 요추 DRG를 사용하지 마십시오. DRG 지역 위치의 경우 그림 2A-D의 회로도 그림 및 총 해부학 이미지를 따릅니다.
- 수확 직후, 각 DRG를 2% 페니실린/스트렙토마이신(펜/스트렙)과 10% 열불활성화 된 태아 소 혈청(FBS)으로 보충하여 DRGs의 세균 오염을 방지하는 데 도움을 줍니다. 4 mL의 배양 배지가있는 문화 요리.
- 모든 DRG를 수확한 후, 2% 펜/스트렙과 10% FBS를 보충하고 1.25 μg/mL의 붉은 형광 염료를 함유한 DMEM 배양 배지로 새로운 배양 접시로 옮긴다. 세포 배양 인큐베이터에서 1 시간 동안 배양한다. 이 시간 동안, 아래에 설명된 바와 같이 DRG를 수신하도록 계란을 준비한다(단계 3).
참고 : DRG를 수확하고 형광 라벨링을 완료하는 간격은 계란을 준비하기에 충분해야합니다. DRG는 인큐베이터에서 몇 시간 동안 보관할 수 있다.
3. DRG 접목을위한 계란 준비 (예상 타이밍 : 1 1 달걀, 8 일째)
- 층류 캐비닛에서 빛을 어둡게하고 계란을 비하하여 생존 가능성과 배아 단계를 확인합니다. 혈관이 불량한 계란, 수정되지 않은 계란 또는 수정 후 8일째와 일치하지 않는 계란은 제외합니다. 자연발생적인 공기 주머니를 광원을 향해 부드럽게 계란을 잡습니다(그림3A).
- 연필로 달걀 껍질을 표시하여 개구부를수신합니다(그림 3A-B).
- 첫째, 개발 배아를 CAM에 달걀 막에 부착된 어두운 이동 용기로 식별하고 이 부위를 표시하여 이 부위의 개입을 피한다.
- 둘째, 배아 부착으로부터 2cm 이상 잘 혈관화된 영역으로 작동 창 영역을 선택하고 직경 1.5 cm원을 그립니다. 작동 창에서 약 1cm, 혈관이 적은 부위에 0.5 cm 정사각형을 그립니다.
- 셋째, 공기 낭 영역을 그려 작업 영역에서 제외합니다. 십자가로 공기 주머니의 중간을 표시합니다.
- 회전 공구와 조각 드릴, 직경 3mm, 표시된 사각형에 달걀껍질을 드릴 (그림 3C). 무딘 집게를 사용하여 외부 계란 껍질 막 (껍질 바로 아래의 흰색멤브레인)을 제거하지 않고 달걀 껍질을 제거합니다 (그림 3D). 이 멤브레인의 우발적 인 천공을 피하기 위해 신중하게 노력하십시오.
- 3.3단계에서와 동일한 드릴을 사용하여, 공기 낭 부위의 표시된 십자가에서 핀포인트 천공을 만들어 공기가계란으로 유입될 수 있도록 한다(도 3E). 계란에 너무 많은 압력을 가하지 않도록주의하십시오, 깨지거나 손상하지 않도록.
- HBSS의 30 μL을 정사각형 개구부에 놓고,그대로 외부 계란 껍질 막 위에 놓습니다(그림 3E). 30-G 주사기 바늘로, 이 정사각형 지역에 있는 외부 막에 있는정밀한 천포를 만듭니다 (그림 3F).
- 광원에 계란을 배치하여 공기 주머니를 시각화합니다. 스포이드 고무 전구에 압력을 가하고 공기 주머니 영역에서 만든 작은 천공에 배치 (단계 3.4). 작동 창 영역에서 두 멤브레인의 분리를 볼 때까지 전구내의 방출 압력(도3G); 작동 창 영역에서 멤브레인을 완전히 분리하는 데 필요한 만큼 이 단계를 반복합니다.
- 모든 계란에 대해 3.1-3.6 단계를 반복합니다.
- 3.3단계에서와 동일한 드릴을 사용하여 원형 작동 창을 드릴링하여 외부 계란껍질 막이 파열되지 않도록 주의합니다(그림 3H). 접착 테이프를 부드럽게 부착하여 달걀 표면을 청소하여 모든 느슨한 입자를 제거합니다.
- 무딘 집게를 사용하면 드릴 된 영역에서 달걀 껍질을 제거합니다 (그림3I-J). 다음으로, 동일한 집게로, 외부 계란 껍질막 (그림 3K)을 제거하고, 오염을 최소화하기 위해 계란 내부에 작은 껍질 입자를 도입하지 않도록주의하십시오.
- 달걀 표면에서 약 1cm 깊이의 CAM을 식별합니다. 오염을 피하기 위해 파라핀 왁스 멤브레인으로 각 개개를 일시적으로 덮습니다(그림3L).
- 모든 계란에 대해 3.8-3.10 단계를 반복합니다. DRG가 이식할 준비가 될 때까지 계란을 회전하지 않고 계란 인큐베이터에 다시 놓습니다.
4. CAM에 DRG 접목 (예상 타이밍 : 40 분, 8 일)
- HBSS 배지로 6cm 배양 접시를 준비하고 이식 전에 DRG를 세척합니다. 준비된 계란을 세포 배양 층류 캐비닛에 가져온다. 계란에서 파라핀 막을 제거합니다 (그림4A).
- 미세 멸균 집게로 배양 배지 내부에서 DRG 하나를 부드럽게 잡습니다. 형광 염료를 포함하는 과잉 배지를 제거하기 위해 HBSS 배지에 담급질하십시오. DRG를 매우 부드럽게 잡으십시오. 그렇지 않으면 집게에 달라붙습니다.
- 멤브레인에 구멍을 뚫지 않도록 주의하면서 DRG를CAM에 놓습니다(그림 4B-C). 필요한 경우 다른 한 쌍의 집게를 사용하여 CAM에 배치할 때 집게 끝에서 DRG를 분리합니다.
참고: DRG를 HBSS 배지로 젖은 상태로 유지하면 집게로부터분리가 촉진됩니다. - 멸균 투명 필름 드레싱으로 달걀을 덮습니다. 세균 오염을 피하기 위해 달걀 껍질로 만든 모든창문과 구멍을 덮습니다 (그림 4D).
- 모든 계란에 DRG를 이식 한 후, 회전없이 2 일 동안 38 °C 및 54 % 습도에서 가습 인큐베이터에 계란을 배양하십시오.
5. CAM에 종양 세포 이식 (예상 타이밍 : 1 시간 30 분, 10 일)
- 세포를 이식하기 전에 48 시간에서 배양 판에 필요한 세포를 플레이트. CAM에서 3차원 종양을 생성하기 위해 UM-SCC-1 세포에 대해 달걀 당 0.5 ~ 1 x 106 세포를 계산합니다. 셀 수에 따라 셀 수가 다를 수 있습니다.
- 배지를 흡인하고 1% 펜/스트렙플러스 10% FBS 및 2.5 μg/mL의 녹색 형광 염료로 보충된 DMEM 배양 배지를 첨가합니다. 세포 배양 인큐베이터에서 37°C에서 1시간 동안 배양한다. 그런 다음 현미경에서 형광 강도를 확인하고, 흡인 배지를 흡인하고, 1x PBS로 한 번 씻고, 최대 10 분 동안 0.25 % 트립신을 추가하십시오.
- 세포 펠릿을 형성하기 위해 4 분 동안 250 x g에서 원심 분리기. 흡인 DMEM 배지및 HBSS에서 재중단하여 과잉 형광 염료를 세척하였다. 혈세포계를 사용하여 세포를 계산합니다.
- 계란을 세포 배양 층류 캐비닛에 가져온다. 가위와 집게로 계란을 덮는 투명 필름 드레싱을 엽니다 (그림4E-F).
- 계산된 세포 수를 다시 원심분리하고, HBSS 배지를 흡인하고 동일한 배지의 5 μL당 0.5~ 1x106 세포의 최종 농도에서 다시 현탁한다(도4G). 계란의 총 수에 필요한 양을 준비 (계란 당 세포 현탁액의 5 μL).
- 5 μL의 세포 용액을 DRG로부터 약 2mm 떨어진 CAM에 놓습니다(그림 4H). DRG와 셀 사이의 균일한 거리를 유지합니다. 세포의 확산을 최소화하기 위해 계란을 방해하지 않도록 매우주의하십시오.
참고: 세포 이식을 시작하려면 CAM 표면이 시각적으로 건조한 계란을 선택합니다. 표면이 너무 젖으면 세포가 퍼질 수 있으며 정기적 인 종양을 형성하지 않습니다. - 4.4 단계에서와 같이 새로운 필름 드레싱으로 계란을 덮습니다. 모든 계란에 세포를 이식합니다. 계란을 회전없이 7 일 동안 38 °C 및 54 % 습도에서 가습 인큐베이터에 배양합니다.
6. CAM 수확 (예상 타이밍 : 1 2 개의 계란, 17 일)
- 4 % PFA (파라 포름 알데히드) pH7.0, 계란 당 잘 하나, 잘 당 2 mL6 웰 플레이트를 준비합니다.
- 계란을 실험실 벤치에 가져온다. 주사기에 부착된 바늘을 사용하여 필름 드레싱을 천천하고, CAM 위에 약 300 μL의 PFA를 떨어뜨려 CAM을 약간 경직시켜 수확 과정을 용이하게 한다. 모든 계란에 대해이 작업을 반복합니다.
- 가위를 사용하여 CAM이 부착된 달걀 껍질의 상반부(작동 창이 있는 위치)를 제거합니다(그림4I). DRG와 종양 세포가 중앙에 이식된 CAM의 부분을 중앙에 유지하면서 이 반쪽의 크기를약 3cm 직경으로 줄입니다(그림 4J). 캠을 미세 한 집게로 잡고 PFA에 넣는 동안 달걀 껍질에서 분리하십시오. DRG 및 암세포를 위쪽으로 향하는방향(도 4K-L).
참고: 3cm 영역에는 DRG와 셀이 모두 포함되어야 합니다. DRG는 CAM에 붙어 있는 작은 덩어리로 쉽게 보입니다, 그러나 종양 세포는 때때로 총 시험에서 확인하기 어렵습니다. - 또는, 가위로, 작동 창을 넓히면서 CAM을 제자리에 유지하면서 달걀 의 상부에서 달걀 껍질을 제거하는; 작동 창 에서 약 1cm를 제거하고 (그림4M)CAM에서 DRG 및 셀을 식별합니다 (그림4N-O). 섬세한 미세 한 집게로 CAM을 가장자리 중 하나에 잡고 부드럽게 들어 올립니다. 날카로운 섬세한 가위로 CAM을 부드럽게 자르고 직경 약 3cm(그림4P)의원형 영역을 제거하고 DRG와 암세포를 위쪽을 향하도록 PFA에 CAM을 놓습니다.
참고: 현미경 검사법 유물을 생성할 수 있는 조직 손상을 최소화하기 위해 여러 장소에서 집게로 CAM을 스트레칭하거나 들고 있는 것을 피하십시오. - 각 CAM 멤브레인을하나의 웰에 놓습니다(그림 4L). CAM의 가장자리를 부드럽게 잡고 PFA에서 열린 조직을 펼치거나 CAM이 펼쳐질 때까지 플레이트를 부드럽게 흔들어 접는 아티팩트를 피하십시오.
- 배아를 안락사(17일째)하여 빠른 참수로 안락사시한다. 수확된 조직을 실온에서 4시간 동안 PFA에 고정시다. 고정 후, PFA를 1x PBS로 교체하고 단면화를 위해 파라핀에 포함될 때까지 4°C에서 PBS에 티슈를 저장합니다. CAM의 섬세한 혈관을 손상시키는 과도하게 고정하지 마십시오.
- 형광 입체 현미경을 사용하여, 형광 신호손실을 피하기 위해 수확 후 2 일 이내에 멤브레인을 촬영하십시오.
Representative Results
최적화된 이 방법은 CAM에서 100% DRG 통합에 가깝습니다. DRG 통합의 대표적인 결과는 그림 5A-B에 나와 있습니다. CAM에서 DRG의 통합은 실험 동안 DRG 조직에 생존력을 제공하기 때문에 중요합니다. 현미경으로, DRG는 CAM의 결합 조직 내에서 볼 수 있습니다 (H&E 얼룩). 혈관은 수시로 DRG 조직 안쪽에 보입니다, CAM 혈액 공급이 이식한 조직을 양육하고 있다는 것을 건의합니다. 이식된 종양은 또한 H&E에 의해 CAM에서 확인됩니다; 얼마나 많은 침략이 존재하는지에 따라, 종양은 결합 조직을 침입하는 수많은 종양 섬에 아무도 나타나지 않을 수 있습니다 (그림5C-D). 대표적인 도5E-F는 브라이트필드 이미징 및 병합형형에서 수확된 CAM을 나타낸다. UM-SCC-1 세포를 과발현하는 갈라닌 수용체 2는 대조군 세포에비해 DRG의 증가된 침입을 제시하였다(도 5G-H). 암-DRG 상호작용은 DRG를 향한 지향성 침범을 제시하는 암세포로서 관찰된다(도5H).
데이터 분석은 여러 가지 방법으로 수행됩니다. DRG를 향한 암세포의 지향성 침입은 이분법적변수로 관찰되며, 이러한 침략 패턴을 제시하는 계란의 수는 각 그룹에서 계산된다. 그룹 간의 통계적 차이는 비율의 이항 검정을 사용하여 계산됩니다. 암세포와 DRG, 및 종양 영역 사이의 근접성은 ImageJ6를 사용하여 측정되며, 학생의 t 검정을 사용하여 그룹 간의 차이를 평가합니다. ImageJ 분석을 통해 정확도를 보장하려면 동일한 실험의 모든 이미지를 동일한 조명 및 노출 설정에서 수행해야 합니다. 동일한 기준을 사용하여 모든 이미지의 이미지 임계값 및 밝기를 조정한 후 분석 입자 도구는 종양 영역을 측정하는 데 사용되며 선형 측정 도구는 종양-DRG 거리를 측정합니다. 서로 다른 그룹에 걸쳐 모든 이미지에 대해 분석된 파티클 크기의 일정한 설정을 사용하는 것이 중요합니다. 어떤 경우에는 종양이 두꺼워지고 디지털 캘리퍼스로 수동으로 측정할 수 있어 부피 측정이 가능합니다.
파라핀 이베디드 CAM 조직, 상피 세포 (인간 종에 대한 항 시토 케라틴 항체 반응성)에 대한 H&E 얼룩 또는 면역 조직 화학 의 섹션을 사용하여 수행 할 수 있습니다, 결합 조직 내에서 침략의 평가를 허용. 침략은 계란 당 결합 조직에 있는 종양 섬의 수로 정량화됩니다. 콜라겐 IV에 대한 면역 형광은 지하 막을 강조하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 GFP 표지 암 세포를 사용하는 경우 조직 섹션에서 이러한 세포의 식별이 시토 케라틴에 대한 면역 조직 화학없이 촉진됩니다. CAM 실험에서전이및혈관신생분석은10,17다른곳에서논의된다.
그림 1: 0, 8, 10 및 17의 주요 단계를 포함하는 실험 타임라인입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 8일째에 DRG 추출 . 척추의해부학 적 위치를 보여주는 쥐 회로도. B.다른 신체 영역을 나타내는 쥐 척추 구성의 다이어그램; 자궁 경부에 대한 녹색, 흉부에 대한 어두운 파란색, 요추에 대한 오렌지와 성추에 대한 밝은 파란색. C-D. 외과 적 절제 후 쥐 척추의 복부 양상; B에 도시 된 바와 같이 영역의 분리 . E.척수 관을 열고 척추를 DRGs를 포함하는 두 개의 측면 섹션으로 분리하는 척추의 해부. 섹션은 중간선에 있는 각 척추 뼈의 등뒤 및 복부 측면을 통해 절단해야 합니다. F.열린 흉부 척추의 총 측면. G.척수가 변위된 후, DRG는 척추 운하(3DRG를 가리키는 화살표 머리)에서 쉽게 볼 수 있습니다. H.해당 축손 번들 (화살표 머리)와 하나의 DRG (화살표)의 입체 현미경 이미지. 배율 막대: C, D, F, G , 1cm; H, 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 8일째에 계란을 준비한다. A-B. 절차 전에 계란 혈관 및 표시의 식별. A의 화살표는 자연발생적인 공기 주머니를 가리킵니다. C-D. 사각형 개구부 마크에 달걀 껍질을 뚫고 여는 다. D에 화살표는 무딘 집게의 도움으로 껍질을 제거 한 후 그대로 외부 계란 껍질 막을 가리킵니다. E. 공기 낭에 표시된 십자가는 계란 (화살표 머리)로 공기의 흐름을 허용하는 드릴로 천공된다. HBSS 배지의 30 μL은 사각형 개구부 의 외부 계란 껍질 막 에 놓입니다. F. 미세 주사기 바늘로, 외부 계란 껍질 막은 HBSS가 이전에 배치 된 곳 천포된다. G.압력은 공기 낭에 드릴 천공 천공에 부착하는 동안 고무 점안제 전구에 적용됩니다. 손가락 압력이 방출되면 공기가 진공 청소기로 되어 작동 창으로 확장되어야하는 인공 공기 주머니 (흰색 화살표)가 생성됩니다. H. 작동 창의 가장자리는 우발적 인 천공을 피하기 위해 계란 껍질에 거의 평행한 위치로 드릴링됩니다. I-J. 무딘 집게로 달걀 껍질을 제거합니다. K.무딘 집게로 외부 달걀 껍질 막을 제거하고 CAM에 입자가 들어가지 않도록주의하십시오 (표면 아래 1cm에서 관찰됨). L.계란은 파라핀 왁스 막으로 일시적으로 덮여 인큐베이터에 다시 넣습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: DRG, 세포 및 CAM 수확의 이식: 8일째: A. CAM은 파라핀 왁스 멤브레인 제거 후 쉽게 관찰됩니다. B-C. 미세 집게를 사용하면 DRG가 CAM에 배치됩니다. D.계란은 필름 드레싱으로 덮여 인큐베이터에 넣어; 화살표는 덮여 있는 개구부를 가리킵니다. 10일째: E-F. 필름 드레싱이 제거되고 DRG가 위치합니다 (F에 화살표 머리). G-H. 5 μL의 세포 용액은 DRG로부터 ~2 mm 거리에서 CAM 상에 투하된다. 17일: I-L과 M-P는 CAM을 수확하는 데 사용되는 두 가지 다른 접근 법을 보여줍니다. 나는계란껍질이 알의 상반부를 제거할 때까지 공기 주머니에서 시작하여 미세한 가위로 열립니다. CAM을포함하는 J. 계란 껍질은 약 3cm K-L로크기가 감소됩니다. 미세 집게로 CAM은 달걀 껍질에서 분리되어 PFA에 배치됩니다. M-O. 수술 창의 확대는 CAM에서 DRG 및 암세포를 가시화하기 위해 수행된다. 화살촉은 종양을 가리키고 화살표는 DRG를 가리킵니다. P. CAM은 미세 한 집게로 잡고 날카로운 가위로 잘라 내고 L과 같이 PFA에 배치됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 대표적인 결과. A. CAM에서 DRG의 통합을 보여주는 H&E 섹션. B.A의 더 높은 배율; 화살표는 DRG에 있는 CAM 혈관을 보여줍니다. C.UM-SCC-1 세포를 CAM에 이식하고 이식 후 4일 후에 수확하였다(H&E 얼룩). D.CAM 결합 조직 (화살표)에서 침습성 종양 섬을 나타내는 C의 높은 배율. E.UM-SCC-1-GALR2 세포및 랫트 DRG로 이식한 CAM의 총 입체 현미경 이미지는 17일째에 수확하였다. F.녹색으로 표지된 적색 및 암세포에 표지된 DRG를 강조하는 병합형광및 밝은 필드 이미지. G-H. DRG 및 UM-SCC-1-GALR2 대 대조세포로 이식된 CAM의 형광 체각 현미경은 DRG(H)에 UM-SCC-1-GALR2세포의 방향성 침입을 예시하였다. 스케일 바: A-D,500 μm; E-H, 2mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 단계 | 문제 | 이유 | 솔루션 | ||||||
| 3.2.1 | 배아 부착물을 식별할 수 없습니다. | 달걀이 아직 있는 동안에는 부착 위치를 보기 가 어렵습니다. | 계란을 빠르게 옆으로 돌리면 계란 막에 부착 된 긴 용기를 볼 수 있습니다. | ||||||
| 3.3 및 3.8 | 굴착하는 동안 외부 계란 껍질 막의 천공을. | 드릴의 잘못된 위치. | 드릴링하는 동안 드릴을 달걀 껍질과 거의 평행하게 놓습니다. 멤브레인이 3.3 단계에서 천포되면 3.5 단계에서 언급 된 바와 같이 바늘로 추가 천포를 수행 할 필요가 없습니다. 출혈이 발생하면 계란을 버리십시오. | ||||||
| 4.3 | DRG는 집게에 붙어 있습니다. | DRG가 건조합니다. | HBSS에서 DRG를 다시 적시거나 미세한 바늘을 사용하여 집게에서 DRG를 분리하십시오. | ||||||
| 5.2 | 세포는 형광 염료로 완벽하게 표지되지 않습니다. | 배양 시간. 일부 셀은 레이블을 지정하는 데 더 많은 시간이 필요합니다. | 형광 염료로 미디어에 추가 시간 동안 세포를 유지합니다. | ||||||
| 5.6 | 셀 드롭에 기포. | 파이펫 팁의 모든 유체를 사용. | 원하는 부피보다 1μL 이상 하중하고 세포를 이식할 때 파이펫의 최종 μL을 사용하지 않는다. 이렇게 하면 셀 혼합물의 기포를 피할 수 있습니다. | ||||||
| 6.3 | CAM을 수확할 때 DRG 또는 세포를 식별할 수 없습니다. | 작은 DRG, DRG는 변위있어, 암세포 확산. | DRG가 보이지 않으면 CAM의 더 큰 영역을 수확하고 고정을 위해 더 큰 용기에 넣습니다. 스테레오 현미경으로 형광 하에서 DRG 및 세포 위치를 확인한 다음 파라핀 을 포함하기 위해 CAM을 더 작은 크기로 다듬습니다. | ||||||
표 1: 문제 해결 표
Discussion
여기에 제시된 생체 내 CAM-DRG 모델은 종양 세포에 의한 신경의 물리적 침입 전에 신경 종양 상호 작용을 입증함으로써 이전 모델의 적자를 해결합니다. PNI의 대부분의 생체 내 연구는 종양 확산 및 운동 기능 억제에 초점을 맞추고, 종양 세포를 직접 시골 신경으로 주입하는 데 의존한다23,24,25. 자골신경 주사는 암세포가 마우스 또는 쥐 심막 신경으로 주입되는 PNI의 생체 내 모델이며 종양이 이후에 증가합니다. 주사 모델은 신경 내의 종양 세포에서 유래하는 파괴적인 종양 진행 및 고통을 보여주기 위하여 유용합니다. sciatic 신경 모형은 또한 암세포가 신경에서 번창하는 것을 허용하는 요인의 연구 결과에서 적당합니다 그러나 신경으로 직접 세포를 소개하기 때문에, 신경에 직접 세포를 소개하기 때문에 PNI의 초기 단계를 평가하는 기능이 부족합니다, 신경 칼집을 우회하. 다른 접근법에서, 외과적으로 이식된 정형외과 종양 이식은 전립선암 진행을 촉진하는 아드레날린 및 해 신경 섬유의 중요성을 특성화하기 위하여 이용되었습니다, 따라서 종양 진행에 있는 신경의 중요한 역할을 건의하 26. 이 모델은 뮤린 교감 및 부교감 신경의 화학적 절제로 구성되었습니다. 부교감 섬유는 종양 조직, PNI와 관련된 과정에 침투했지만, 모델은 신경과 종양 사이의 물리적 상호 작용을 평가하기 위해 특별히 사용되지 않았다. CAM-DRG 모델은 PNI 동안 신경과 암 사이의 상호 작용의 조사를 할 수 있습니다. 또한 뮤린 모델은 CAM 모델과 비교할 때 비용이 많이 들고 시간이 많이 걸립니다. 우리는 PNI의 기계론적 연구에 CAM-DRG 모델을 사용하는 것이 좋습니다.
CAM-DRG 접근법에 대한 몇 가지 이점은 종양 성장, 전이 및 혈관신생과 같은 PNI 및 다른 표현형의 평가를 포함한다. 하부 CAM 및/또는 간에서 인간 DNA의 식별은 인간 암 세포주(10)의 전이를 검출하는데 사용될 수 있으며, 이는 작은 전이를 드러내지 않을 수 있는 조직 단면화 및 염색에 비해 보다 민감한 실험접근법이다.
CAM-DRG 방법은 짧은 관찰 시간 프레임을 포함하여 몇 가지 제한사항이 있습니다. 배아의 면역 계통은 1827일까지생리적으로 활성화되며, 거부및 염증 과정이 일어날 수 있을 때, 실험 시간을 제한한다. 또한 DRG에 가까운 종양 세포를 이식할 때 거리를 고려하는 것이 중요합니다. 더 큰 DRG 암 거리는 종양 세포와 신경 사이 분자 상호 작용을 손상시킬 수 있고, 또는 모형의 두 분대 사이 물리적 접촉을 연기할 수 있었습니다. 또한, 배아가 이 프로토콜에 규정된 것보다 오래된 경우에, 태아 운동은 종양 세포를 대체할 수 있습니다. 따라서 세포 이식을 위해 10 일째 수정 후 일과 일치하는 계란을 사용하는 것이 중요합니다.
면역 계통이 1827일전에 완전히 개발되지 않기 때문에, CAM내의 종양 미세환경은 암 연구에 자주 사용되는 면역억제 뮤린 모델의 종양 미세환경과 유사하다. 따라서, 이 모델은 종양 진행에서 면역 세포의 역할을 평가하는 데 유용하지 않다. 또 다른 제한은 항체, 사이토카인 및 프라이머와 같은 닭 종에 대한 시약의 제한된 가용성입니다.
이 프로토콜을 정확하게 수행하려면 연습이 필요합니다. 그러나 전문 핵심 시설없이 실험실 구성원이 수행 할 수 있습니다. 달걀 껍질을 시추하려면 훈련이 필요합니다. 처음으로이 모델을 시도하기 전에 식료품 (비 수정) 계란을 연습하는 것이 좋습니다. 감염을 피하기 위해 몇 가지 중요한 단계를 따르는 경우 모델의 높은 배아 생존과 성공을 달성 할 수있다 : 2 % 펜 / 스트렙에서 DRGs의 적절한 항생제 예방, 층류 캐비닛에서 작업, 계란 껍질 입자의 분산을 피하기 CAM에. 또한 총 계란 배양 시간 동안 안정적인 습도를 유지하는 것이 중요합니다. 기술을 마스터할 때까지 그룹당 계란 수를 늘리는 것이 좋습니다. 경험이 없는 실험실 직원에게 가장 빈번한 문제는 계란 오염과 세포 이식에 대한 부정확한 기술입니다.
DRG 수확은 또한 훈련이 필요합니다; 생체 외 에서 실험을 위한 DRGs를 수확에 연습8 생체 내 모델을 시도 하기 전에 권장. 시험관 내 DRG 배양은 DRG 추출 기간을 단축하기 위해 조건을 최적화하고 기술을 향상시킬 수있는 기회입니다. 집게로 DRG를 잡을 때 수확 기술에 특별한주의가 필요합니다. DRG를 직접 개최해서는 안됩니다. 밑에 압력을 가해야 합니다. 추출 하는 동안 DRG를 더 잘 시각화 하려면 돋보기 렌즈를 사용 하는 것이 좋습니다.
중요한 것은 이 모델을 처음으로 수행할 때 원하는 세포주에 대해 모든 조건을 최적화해야 한다는 것입니다. 이 모델은 랫트 DRG 및 HNC 세포주 UM-SCC-1에 최적화되었다. 마우스 DRG 및 그밖 암 세포 모형의 사용은 최적화를 요구할 수 있습니다. 접목 된 세포의 높은 농도로, 종양은 종양 측정을 용이하게 두껍고 뻣뻣하게 성장하는 경향이있다. 각 그룹에 대한 여러 개의 계란과 각 난자를 위한 세포의 적절한 농도를 고려하여, 각 실험에 대해 수백만 개의 세포가 필요할 수 있습니다. 계획을 용이하게하기 위해 세포의 두 배 시간에 대한 지식을 고려해야합니다. 이 프로토콜의 몇 가지 중요한 단계의 경우문제 해결 테이블이 제공됩니다(표 1).
Disclosures
저자는 경쟁적인 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH / NIDCR 보조금 DE027551 및 DE022567 (NJD)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | # 25200-056 | |
| ACE light source | SCHOTT North America, Inc. | Used to transilluminate the eggs | |
| CellTracker Green CMFDA fluorescent dye | Life Technologies | # C7025 | Reconstitute 50µg in 20µL of DMSO and stock at -20oC. Use 1µL of stock solution/mL of culture medium. |
| CellTracker Red CMTPX fluorescent dye | Life Technologies | # C34552 | Reconstitute 50µg in 40µL of DMSO and stock at -20oC. Use 1µL of stock solution/mL of culture medium |
| Cordless rotary tool | DREMEL | # 866 | Used to drill the egg shell |
| DMEM (1x) | Gibco | # 11965-092 | Dulbeecco`s Modified Eagle Medium |
| DMSO | Fisher Bioreagents | # BP231-100 | Dimethyl Sulfoxide |
| Dumont # 5 fine forceps | Fine Science Tools (FST) | # 11254-20 | Used to harvest DRG |
| Egg incubator | GQF Digital Sportsman | # 1502 | Egg incubator equipped with automatic rotator, digital thermostat, temperature and humidity controls |
| Engraving cutter | DREMEL | # 108 | Used to drill the egg shell |
| Extra fine Graefe forceps, curved | Fine Science Tools (FST) | # 11151-10 | Used to graft DRG onto the CAM on day 8 and to harvest CAM tissue on day 17 |
| Extra fine Graefe forceps, straight | Fine Science Tools (FST) | # 11150-10 | Used to graft DRG onto the CAM on day 8 and to harvest CAM tissue on day 17 |
| Fertilized Lohmann White Leghorn eggs | Fertilized eggs at early fertilization days, preferably on first day post-fertilization. Eggs used in this protocol are from Michigan State University Poultry Farm. | ||
| Filter Forceps | EMD Millipore | # XX6200006P | Blunt forceps used to remove the egg shell |
| Fine surgical straight sharp scissor | Fine Science Tools (FST) | #14060-09 | Used to harvest the CAM tissue on day 17 |
| HBSS (1x) | Gibco | # 14025-092 | Hank`s Balanced Salt Solution |
| HI FBS | Gibco | # 10082-147 | Heat-inactivated Fetal Bovine Serum |
| Paraffin wax membrane | Parafilm laboratory film | # PM-996 | Used to temporarily cover the egg openings until DRG grafting on day 8 |
| PBS (1x) pH 7.4 | Gibco | # 10010-023 | Phosphate Buffered Saline |
| Pen/Strep | Gibco | # 15140-122 | 10,000 Units/mL Penicilin, 10,000 µg/mL Streptomycin |
| PFA (paraformaldehyde solution) | Sigma-Aldrich | # P6148-1KG | Dilute in water to make a 4% PFA solution |
| Sprague Dawley rats (females) | Charles River laboratories | Strain code: 001 | 6-7 weeks old (190-210g in weight) |
| Tegaderm Transparent Film Dressing | 3M | # 9505W | Sterile, 6x7cm, used to cover the egg openings during incubation |
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