Summary
Perineural invasion är en aggressiv fenotyp för huvud och hals skivepitelcancer cell karcinom och andra tumörer. Den chick chorioallantoic membran modell har använts för att studera angiogenes, cancer invasion, och metastaser. Här visar vi hur denna modell kan användas för att bedöma perineural invasion in vivo.
Abstract
Perineural invasion är en fenotyp där cancer omger eller invaderar nerverna. Det är förknippat med dålig klinisk effekt för huvud och hals skivepitelcancer och andra cancer former. Mekanistiska studier har visat att den molekyl ära överhörning mellan nerver och tumör celler sker före fysisk interaktion. Det finns bara ett fåtal in vivo modeller för att studera perineural invasion, särskilt för att undersöka tidig progression, innan fysiska nerv-tumör interaktioner uppstå. Den chick chorioallantoic membran modell har använts för att studera cancer invasion, eftersom källaren membranet i korionic epitel härmar den mänskliga epitelial vävnad. Här har vi återanvända chick chorioallantoic membran modell för att undersöka perineural invasion, ympning råtta dorsala roten ganglier och mänskliga huvud och hals Skivepitelcancer celler cell carcinoma på korionic epitel. Vi har visat hur denna modell kan vara användbar för att utvärdera cancer cellernas förmåga att invadera nervvävnad in vivo.
Introduction
Perineural invasion (PNI) är en understuderad fenotyp i cancer, som är förknippad med hög sjukdoms upprepning och dålig överlevnad hos patienter med huvud och hals skivepitelcancer (HNC)1. PNI definieras mikroskopiskt som tumör celler inom eller kring nerverna2,3. När PNI upptäcks kommer patienterna sannolikt att få adjuvant behandling såsom elektiv hals dissektion och/eller strål behandling4,5. Emellertid, dessa terapier är aggressiva, och inte PNI-specifika. I själva verket, det finns ingen terapi för att blockera PNI, främst eftersom mekanismerna bakom nerv-tumör interaktioner är fortfarande dåligt förstådda.
Olika molekyl ära mekanismer har varit inblandade i nerv-tumör attraktion; tumörer och stromaceller celler frisättning neuropeptider och tillväxtfaktorer för att främja neuritogenesis6,7. När odlade tillsammans in vitro, HNC celler och dorsala root ganglier (DRG) båda har en robust respons; effekter på tumör cell invasion och neuritogenesis kan ses efter några dagar i kultur6,8,9. Emellertid, det finns en brist på lämpliga in vivo modeller för att upprepa tumör-nervinteraktioner före invasionen. Här presenterar vi en in vivo PNI modell för att studera tidiga interaktioner mellan HNC celler och nerver6. Vi anpassade chick chorioallantoic membran (CAM) modell för att inkludera en neural komponent, ympning en DRG i CAM, följt av ett transplantat av cancer celler för att efterlikna en innerveras tumör mikromiljö.
CAM-modellen har använts framgångs rikt för att bedöma invasionen av cellerna genom basal membranet, imitera tidiga invasiva stadier av karcinom och melanom10,11,12. CAM består av övre korionepitel, mellanliggande Mesenchyme, och lägre allantoiskt epitel. Den korionic epitel är strukturellt liknar humant epitel10,13 i att kollagen-IV-rika källaren membran simulerar källaren membranet som separerar det muntliga epitelet från den underliggande bindväv. Sedan den första tumören ympkvistar utfördes i cam i 191314, många anpassningar av metoden utvecklades för att möjliggöra bedömning av angiogenes15,16,17, tumör progression, och metastasering18. Viktigt är att tekniken för ympning tumörer på CAM har förändrats mycket lite, men ansökningarna utvecklas kontinuerligt. Analyser av ökande komplexitet har publicerats, bland annat drog screening19, benvävnads teknik20, och nanopartikelbaserade läkemedel mot cancer21.
Vårt laboratorium använder en CAM-DRG modell där ett däggdjur DRG isoleras och ympas på ytan av den övre CAM. När DRG införlivas i CAM, är HNC celler ympade nära DRG och får interagera med DRG innan hela in vivo-systemet skördas och analyseras. Viktigt, systemet tillåter ex-vivo visuell observation av både DRG och tumör genom fluorescens märkning av DRG och tumör celler. Detta protokoll omfattar flera steg med olika komplexitets nivåer som utförs inom 17 dagar, från inkuberande ägg till skörd av CAM (figur 1). Celler som uttrycker olika proteiner av intresse kan testas i denna modell för att belysa de molekyl ära vägar som ansvarar för nerv invasion i cancer, och även för screening av läkemedel för att direkt rikta neurala invasion. Celler förbehandlade med en läkemedels kandidat kan ympas på CAM och förekomsten av PNI undersökts i jämförelse med obehandlade kontroller. I själva verket, CAM-modellen har använts för drog screening som ett mellanliggande steg mellan in vitro-studier och pre-kliniska in vivo prövningar på gnagare19.
Den experimentella designen kommer att variera med hypotesen. Till exempel, om att testa rollen av ett specifikt protein på PNI, den experimentella gruppen skulle omfatta DRG ympas med tumör celler överuttrycker proteinet, medan kontroll gruppen bör omfatta DRG med celler stabilt transfekterade med Tom vektor. Flera olika experimentella utformningar kan användas för att hantera specifika frågor.
Protocol
Etik uttalande: alla experiment som använder råttor i detta protokoll görs i enlighet med IACUC (institutionell djur omsorg och användning kommitté) regler från vår institution. Experiment med ägg i denna studie är undantagna från IACUC förordning.
1. ägg inkubation (beräknad timing: 5 min, dag noll)
- Få patogen fria befruktade kommersiella Lohmann White leghorn ägg, helst på den första dagen post-fertilisering. Inkubera sex ägg per experimentell grupp i en inkubator för ägg befuktning vid 38 ° c och 54% luft fuktighet i 8 dagar med rotation varje timme. Använd regelbunden rotation av äggen för att förhindra att embryot fastnar på ägg membranen.
Anmärkning: innan inkubation, förvara äggen i en 18 ° c kyl skåp för att stoppa embryots utveckling i högst 1 vecka.
2. skörd och beredning av DRG (beräknad timing: 2 h, dag 8)
Anmärkning: experiment med möss och råttor kräver godkännande från (IACUC). I vissa länder kräver användningen av hönsägg också godkännande.
- Få sex till sju vecka gamla Sprague Dawley råttor (~ 200 g i vikt) för att extrahera DRGs.
Obs: en råtta bör ge ~ 40 cervikal och bröst korg DRGs. mus DRG integreras också i CAM, men villkoren för denna art måste optimeras självständigt. - I ett laminärt flöde skåp, skörd DRGs från livmoder hals cancer och bröst korg regioner efter protokollet för mus DRG utvinning publiceras någon annan stans22. Följ figur 2 för orientering om hur man skördar DRG.
- Euthanize råtta genom hjärt punktering efter administrering av Ketamin/xylazin injiceras intraperitonealt. Rengör rått huden med 70% etanol och ta bort rått ryggraden med en sax. Utför inte cervikal störningen eftersom detta skulle skada de cervikala DRG.
- Separera livmoder halsen, bröst korg och länd ryggen med samma sax, efter den schematiska anatomiska representation och brutto bilder som anges i figur 2A-D. Placera ryggraden sektioner i en 10 cm kultur rätt med 1x PBS att hålla vävnader våta.
- Med en delikat ben sax, öppna kotbenen i rygg och ventrala aspekter, separera ryggraden i två laterala halvor (figur 2e-F). Placera vävnads avsnitten i en ren 10 cm mat rätt med färska 1x PBS.
- Med hjälp av pincett, lossa försiktigt ryggmärgen från kotbenen för att visualisera DRGs (figur 2g).
- Med fina pincett som hålls under varje DRG, greppa den och dra ut den från ben håligheten där den är ingavs. Håll inte DRG direkt eftersom detta kommer att orsaka vävnads skada. Trimma inte Axon buntarna från DRG (figur 2H).
Obs: Undvik att använda lumbala DRGs eftersom dessa har minskat integrationen i CAM. För DRG-områdets placering, Följ den schematiska illustrationen och de grova anatomiska bilderna på bild 2a-D.
- Omedelbart efter skörd, placera varje DRG i DMEM odlings substrat kompletteras med 2% penicillin/streptomycin (Pen/STREP) och 10% Värmeinaktiverade fetal nötkreatur serum (FBS) för att förhindra bakteriell kontaminering av DRGs. gruppera alla DRGs i samma 6 cm kultur mat rätt med 4 mL odlings substrat.
- Efter skörd alla DRGs, överföra dem till en ny kultur mat rätt med DMEM odlings substrat kompletteras med 2% penna/STREP plus 10% FBS och innehåller 1,25 μg/mL rött fluorescerande färg ämne. Inkubera för 1 h i cell kulturens inkubator. Under denna tid, förbereda äggen för att ta emot DRG som beskrivs nedan (steg 3).
Anmärkning: intervallet mellan skörd DRG och för ande av fluorescensmärkning bör vara tillräckligt för att förbereda äggen. DRGs kan förvaras i ett par timmar i inkubator.
3. beredning av ägg för DRG-ympning (beräknad timing: 1 tim för ett dussin ägg, dag 8)
- I ett laminärt flöde skåp, dämpa ljuset och transilluminate äggen för att kontrol lera lönsamhet och embryonal fas. Utesluta ägg med dålig kärl teckning, icke-befruktade ägg, eller ägg som inte överensstämmer med dag 8 post-fertilisering. Håll ägget försiktigt med den naturligt förekommande luft säcken mot ljus källan (figur 3a).
- Med en penna, markera Äggskalet för att ta emot öppningarna (figur 3a-B).
- För det första, identifiera fast sättning av det växande embryot till CAM som ett mörkt rörligt kärl fäst vid ägg membranet och Markera detta område för att undvika interventioner i denna region.
- För det andra, Välj den operativa fönster området som ett väl vaskulariserad område minst 2 cm från embryot kvarstad och dra en 1,5 cm diameter cirkel. Ungefär 1 cm från manöver fönstret, rita en 0,5 cm kvadrat i ett mindre vaskulariserad område.
- För det tredje, rita luft säckens region för att utesluta den från Operations området. Markera mitten av luft säcken med ett kors.
- Med ett roterande verktyg och gravyr borr, 3 mm i diameter, borra äggskal i den markerade kvadraten (figur 3c). Använd trubbiga pincett för att ta bort Äggskalet utan att ta bort det yttre äggskal membranet (det vita membranet rakt under skalet) (figur 3D). Arbeta försiktigt för att undvika oavsiktlig perforering av detta membran.
- Använd samma borr som i steg 3,3, gör en punktformad perforering i det markerade korset i luft säckens område för att tillåta luft flöde in i ägget (figur 3e). Var noga med att inte tillämpa för mycket tryck på ägget, för att undvika att bryta eller skada den.
- Placera 30 μL HBSS i den fyrkantiga öppningen över det intakta yttre äggskal membranet (figur 3e). Med en 30 G sprutnål, gör en punktformiga perforering i det yttre membranet i detta fyrkantiga område (figur 3F).
- Placera ägget i ljus källan för att visualisera luft säcken. Tryck på en pipett gummi glöd lampa och placera den i små perforering som gjorts i luften SAC området (steg 3,4). Släpp trycket i glöd lampan tills du ser separation av de två membranen i Operations fönstret området (figur 3G); Upprepa detta steg så många gånger du behöver för att uppnå fullständig separation av membranen i Operations fönstret området.
- Upprepa steg 3.1-3.6 för alla ägg.
- Genom att använda samma borr som i steg 3,3, borra det cirkulära manöver fönstret försiktigt så att det yttre äggskal membranet inte spritas (figur 3H). Rengör äggytan genom att försiktigt sticka en tejp för att ta bort alla lösa partiklar.
- Med trubbiga pincett tar du bort Äggskalet från det borrade området (figur 3I-J). Därefter, med samma pincett, ta bort det yttre ägget skalet membranet (figur 3k), vara noga med att inte införa små skal partiklar inuti ägget för att minimera kontaminering.
- Identifiera CAM ca på 1 cm djup från äggytan. Täck varje öppnad ägg temporärt med paraffin vax membran för att undvika kontaminering (figur 3L).
- Upprepa steg 3.8-3.10 för alla ägg. Placera äggen tillbaka i ägginkubator utan rotation tills DRGs är redo för ympning.
4. ympning DRG på CAM (beräknad timing: 40 min, dag 8)
- Förbered en 6 cm kultur mat rätt med HBSS medium, att tvätta DRGs före implantation. Ta de beredda äggen till cell kulturen laminärt flöde skåp. Ta bort paraffin membranet från ägget (figur 4a).
- Med fina sterila pincett, greppa försiktigt en DRG inifrån odlings mediet. Doppa den i HBSS-mediet för att avlägsna överflödigt medium som innehåller det fluorescerande färg ämnet. Håll DRG mycket försiktigt; annars kommer det att hålla sig till pincett.
- Placera DRG på CAM, var noga med att inte punktera membranet (figur 4b-C). Om det behövs, Använd ett annat par pincett för att lossa DRG från spetsen på pincett när du placerar den på CAM.
Anmärkning: att hålla DRG våt med HBSS-medium kommer också att under lätta lossnar från pincett. - Täck ägget med en steril transparent film dressing. Täck alla fönster och punkteringar görs i ägget skalet för att undvika bakteriell kontaminering (figur 4D).
- Efter ympning DRGs i alla ägg, Inkubera äggen i en befuktande inkubator vid 38 ° c och 54% luft fuktighet i 2 dagar, utan rotation.
5. ympning tumör celler på CAM (beräknad timing: 1 tim 30 min, dag 10)
- Vid 48 h innan ympning cellerna, plattan de celler som behövs i odlings plattor. Beräkna 0,5 till 1 x 106 celler per ägg för UM-SCC-1 celler för att generera tredimensionell TUMÖRER i cam. Tänk på att cell numret kan variera beroende på cellinjen.
- Aspirera medium och tillsätt DMEM odlings medium kompletterat med 1% penna/STREP plus 10% FBS och 2,5 μg/mL grönt fluorescerande färg ämne. Inkubera i 1 h vid 37 ° c i cell kulturens inkubator. Kontrol lera sedan fluorescensintensitet på Mikroskop, aspirera medium, tvätta en gång med 1x PBS, och tillsätt 0,25% trypsin för upp till 10 min. neutralisera trypsin med DMEM kompletterat medium.
- Centrifugera vid 250 x g i 4 min för att bilda en cellpellet. Aspirera DMEM medium och återsuspendera i HBSS att tvätta överflödigt fluorescerande färg ämne. Räkna celler med en hemocytometer.
- Ta äggen till cell kulturen laminärt flöde skåp. Med sax och pincett, öppna transparent film dressing som täcker ägget (figur 4E-F).
- Centrifugera det beräknade antalet celler igen, aspirera på HBSS-mediet och återsuspendera vid en slutlig koncentration av 0,5 till 1x106 celler per 5 μl av samma medium (figur 4G). Bered det belopp som behövs för det totala antalet ägg (5 μL cell SUS pension per ägg).
- Placera 5 μL av cell lösningen på ca 2 mm från DRG (figur 4h). Håll enhetliga avstånd mellan DRG och celler. Var mycket noga med att inte störa ägget för att minimera spridningen av cellerna.
Anmärkning: för att starta cell implantation, Välj ägg på vilka CAM-ytan är visuellt torr. Om ytan är för våt, kan cellerna spridas och inte bildar regelbundna tumörer. - Täck ägget med en ny film dressing som i steg 4,4. Grafera cellerna i alla ägg. Inkubera äggen i en befuktnings inkubator vid 38 ° c och 54% luft fuktighet i 7 dagar utan rotation.
6. skörd CAM (beräknad timing: 1 h för dussin ägg, dag 17)
- Förbered 6-well plattor med 4% PFA (paraformaldehyd) pH 7.0, en brunn per ägg, 2 mL per brunn.
- Ta äggen till en laboratorie bänk. Använd en nål fäst på en spruta för att perforera film dressing, droppe runt 300 μL av PFA över CAM att något stelna CAM, vilket underlättar avverknings processen. Upprepa detta för alla ägg.
- Med en sax, ta bort den övre halvan av ägget skalet (där arbets fönstret är placerad) med CAM fäst vid den (figur 4I). Minska storleken på denna halv till cirka 3 cm i diameter, hålla den del av CAM där DRG och tumör celler ympades i mitten (figur 4J). Ta tag i CAM med fina pincett och lossa den från äggskal medan du placerar den i PFA. Orientera DRG och cancer cellerna uppåt (figur 4k-L).
Obs: 3 cm området bör innehålla både DRG och celler. Den DRG är lätt ses som en liten klump fäst på CAM, men tumör celler är ibland svårt att identifiera på brutto examen. - Alternativt, med en sax, bredda operativ fönstret ta bort ägget skalet från toppen av ägget samtidigt som CAM på plats; ta bort ca 1 cm bortom manöver fönstret (figur 4M) och identifiera DRG och celler på cam (figur 4n-O). Med fina fin pincett håller du ca-modulen i en av kanterna och lyfter den försiktigt. Med skarpa fina saxar, försiktigt skära CAM för att ta bort ett cirkulärt område, cirka 3 cm i diameter (figur 4P), och placera cam i PFA med DRG och cancer celler uppåt.
Obs: Undvik stretching eller hålla CAM med pincett på flera ställen för att minimera vävnads skada som kan generera mikroskopi artefakter. - Placera varje CAM-membran i en brunn (figur 4L). Ta försiktigt tag i kanterna på CAM för att sprida vävnaden öppen i PFA eller försiktigt skaka plattan tills CAM är veckad, för att undvika veck artefakter.
- Euthanize embryot (dag 17) genom snabb hals decapitation. Fäst de skördade vävnaderna i PFA i 4 timmar vid rums temperatur. Efter fixering, Ersätt PFA med 1x PBS och lagra vävnader i PBS vid 4 ° c tills inbäddning i paraffin för snittning. Undvik överfixering som kommer att skada den känsliga kärl av cam.
- Med hjälp av en fluorescensstereomicroscope, fotografera membranen inom 2 dagar efter skörd för att undvika att förlora fluorescerande signaler.
Representative Results
När optimerad, denna metod har nära 100% DRG integration i CAM. Representativa resultat av DRG-integration visas i figur 5a-B. Integrationen av DRG i CAM är viktig eftersom det ger livs kraft till DRG vävnaden under experimentet. Microscopically, DRG ses inom bindväv av CAM (H & E fläcken). Blod kärl ses ofta inuti DRG vävnaden, vilket tyder på att CAM blodtillförseln är att vårda den ympade vävnaden. Implanterade tumörer identifieras också på CAM av H & E; beroende på hur mycket invasion är närvarande, tumörer kan förekomma med ingen att många tumör öar invaderar bindväv (figur 5c-D). Den representativa siffran 5E-F visar den skördade cam på brightfield Imaging och sammanfogad fluorescens. UM-SCC-1-celler överuttrycker galanin receptor 2 presenterade ökad invasion av DRG i jämförelse med kontroll celler (figur 5G-H). Cancer-DRG interaktion observeras som cancer celler presentera riktad invasion mot DRG (figur 5H).
Data analys utförs på olika sätt. Den riktade invasionen av cancer celler mot DRG observeras som en dikotomös variabel och antalet ägg som uppvisar detta mönster av invasion räknas i varje grupp. Statistiska skillnader mellan grupper beräknas med hjälp av ett binomialt test av proportioner. Närheten mellan cancer celler och DRG, och tumör område mäts med hjälp av ImageJ6 och skillnader mellan grupper bedöms med hjälp av Students t test. För att säkerställa noggrannhet med ImageJ-analys bör alla bilder från samma experiment tas på samma ljus-och exponerings inställningar. Efter justering av bildens tröskel och ljus styrka för alla bilder med samma kriterier, analys partiklarna verktyget används för att mäta tumör område och det linjära mät verktyget mäter tumör-DRG avstånd. Det är viktigt att använda konstant inställning av storleken på partiklar som analyseras för alla bilder i olika grupper. I vissa fall, tumörer växer tjockare och kan mätas manuellt med en digital Caliper, vilket möjliggör en volym mätning.
Använda sektioner av paraffin-inbäddade CAM vävnad, H & E fläck eller immunhistokemi för epitelceller (anti-cytokeratin anti kropp reaktiva för mänskliga arter) kan utföras, vilket möjliggör bedömning av invasion inom bindväv. Invasionen kvantifieras som antalet tumör öar i bindväv per ägg. Immunofluorescens för kollagen IV kan användas för att belysa källaren membranet. Dessutom, om du använder GFP-märkta cancer celler, identifiering av dessa celler i vävnaden sektioner under lättas utan en immunhistokemi för cytokeratin. Metastaser och angiogenesianalys i cam experiment diskuteras på andra ställen10,17.
Figur 1: experiment tids linjen inklusive de viktigaste stegen på dag 0, 8, 10 och 17. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: DRG-extraktion dag 8 . A. råtta Schematisk illustrerar den anatomiska placeringen av ryggraden. B. diagram över rått Kotor konfiguration som visar olika kropps regioner; grön för cervikal, mörkblå för bröst korg, orange för länd ryggen och ljusblå för sakrala Kotor. C-D. Ventral aspekt av rått ryggraden efter kirurgisk excision; av regionerna enligt illustrationen i B. E. dissektion av Kotor för att öppna ryggmärgen kanalen, separera ryggraden organ i två laterala sektioner som innehåller drgs. avsnitt bör skära genom rygg och ventrala aspekten av varje kotben vid mitt linjen. F. Gross aspekt av öppnade bröst korg ryggraden. G. När ryggmärgen har flyttats syns drgs lätt i kotkanalerna (pilhuvuden som pekar 3 DRG). H. stereomicroskopisk bild av en DRG (pil) med motsvarande Axon buntar (pilhuvud). Skal streck: C, D, Foch G, 1 cm; H, 1 mm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: beredning av äggen dag 8. A-B. Identifiering av äggkärl och markeringar före ingreppet. Pilar på en punkt till den naturligt förekommande luft säcken. C-D. Borrning och öppning av äggskal på torget öppnings märket. Arrow på D pekar på intakt yttre äggskal membran efter avlägsnande av skalet med hjälp av trubbiga pincett. E. det markerade korset på luft säcken är perforerat med borren för att tillåta luft flöde in i ägget (pilhuvudet). 30 μL HBSS-medium placeras på det yttre äggskal membranet på den fyrkantiga öppningen. F. med en fin sprutnål är det yttre äggskal membranet perforerat där Hbss tidigare placerades. G. tryck appliceras på en gummi pipett glöd lampa medan fästa den till perforeringen borras på luft säcken. När finger trycket släpps, luft dammsugas, genererar en konstgjord luft SAC (vita pilar) som bör utvidgas till operativ fönstret. H. kanterna på manöver fönstret borras i en nästan parallell position till äggskal, för att undvika oavsiktlig perforation. I-J. Avlägsnande av äggskal med trubbiga pincett. K. ta bort det yttre ägget skalet membran med trubbiga pincett, vara noga med att inte införa partiklar på cam (observeras vid ̴1 cm under ytan). L. ägg täcks tillfälligt med ett paraffin vax membran och sätta tillbaka i inkubator. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: ympning av DRG, celler och skörd av cam: på dag 8: A. CAM lätt observeras efter paraffin vax membran avlägsnas. B-C. Med fina pincett, är DRG placerad på CAM. D. Egg är täckt med film dressing och sätta i inkubator; pilarna pekar mot öppningarna som täcks. På dag 10: E-F. Film dressing avlägsnas och DRG är placerad (pilhuvud på F). G-H. 5 μL cell lösning tappas på ca 2 mm avstånd från DRG. På dag 17: i-L och M-P visar två olika metoder som används för att skörda cam. I. äggskal öppnas med en fin sax som börjar på luft säcken borrade perforeringen tills den övre halvan av ägget avlägsnas. J. äggskal innehåll ande cam reduceras i storlek till ca 3 cm. K-L. Med fina pincett är CAM frånkopplad från Äggskalet och placeras i PFA. M-O. Breddning av Operations fönstret utförs för att visualisera DRG och cancer celler på CAM. Arrowhead pekar på tumören och pilen pekar på DRG. P. cam är grep med fina pincett, skär ut med en vass sax, och placeras i PFA som visas i L. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: representativa resultat. A. H &Amp; E avsnitt som visar integrationen av DRG i cam. B. högre förstoring av A; pilarna visar CAM blod kärl i DRG. C. UM-SCC-1-celler YMPADE på cam och skördas fyra dagar efter ympning (H & E fläck). D. högre förstoring av C visar INVASIVA tumör öar i cam bindväv (pilar). E. brutto stereomikroskopisk bild av cam ympade med UM-SCC-1-GALR2 celler och råtta DRG, skördas på dag 17. F. sammanslagna fluorescens och brightfield bilder belyser DRG märkt i rött och cancer celler märkta i grönt. G-H. Fluorescens-stereomikroskopserie av cam ympas med DRG och UM-SCC-1-GALR2 kontra kontroll celler, illustrerar riktad invasion av UM-SCC-1-GALR2 celler till DRG (H). Skal streck: A-D, 500 μm; E-H, 2 mm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Steg | Problem | Anledning | Lösning | ||||||
| 3.2.1 | Det går inte att identifiera embryobilagan. | Fäst positionen är svårt att se medan ägget är fortfarande. | Rotera ägget snabbt i sidled för att kunna se en lång kärl fäst vid ägg membranet. | ||||||
| 3,3 & 3,8 | Perforering av det yttre äggskal membranet under borrning. | Fel placering av borren. | Placera borren nästan parallellt med Äggskalet medan du borrar. Om membranet är perforerat i steg 3,3, finns det ingen anledning att utföra ytterligare perforering med nål som anges i steg 3,5. Om blödningen inträffar, kassera ägget. | ||||||
| 4,3 | DRG fastnar på pincett. | DRG är torrt. | Våt DRG igen i HBSS och/eller använda en fin nål för att lossa DRG från pincett. | ||||||
| 5,2 | Cellerna är inte perfekt märkta med fluorescerande färg ämne. | Inkubations tid. Vissa celler kräver mer tid att märka. | Förvara cellerna ytterligare en timme i media med fluorescerande färg ämne. | ||||||
| 5,6 | Luft bubbla på cell Drop. | Använd all vätska i pipettspetsen. | Fyll på 1μL mer än den önskade volymen och Använd inte pipettens sista μL vid implantation av celler. Detta kommer att undvika luft bubblor i cellerna blanda. | ||||||
| 6,3 | Det går inte att identifiera DRG eller celler vid skörd av CAM. | Små DRG, fick DRG fördrivna, cancer celler sprids. | Om DRG inte syns, skörda ett större område av CAM och placera i en större behållare för fixering. Kontrol lera DRG och cell position under fluorescens i ett stereo Mikroskop, och trimma sedan CAM till en mindre storlek för paraffin inbäddning. | ||||||
Tabell 1: fel söknings tabell
Discussion
CAM-DRG in vivo-modellen som presenteras här behandlar underskott tidigare modeller genom att demonstrera nerv-tumör interaktion innan fysisk invasion av nerven av tumör celler. De flesta in vivo studier av PNI fokus på tumör spridning och hämning av motorisk funktion, och beror på direkt insprutning av tumör celler i ischiasnerven23,24,25. Den ischiasnerven injektion är en in vivo modell av PNI där cancer celler injiceras i en mus eller råtta ischiasnerven där tumören därefter växer. Injektion modeller är användbara för att Visa destruktiva tumör progression och smärta till följd av tumör celler i nerver. Ischiasnerven modellen är också lämplig för studiet av faktorer som gör att cancer celler att frodas i nerven men saknar förmåga att utvärdera den tidiga fasen av PNI, eftersom det introducerar celler direkt i nerven, förbi nerv slidor. I ett annat tillvägagångs sätt, kirurgiskt implanteras ortotopisk tumör transplantat användes för att karakterisera vikten av adrenerga och kolinerga nerv fibrer för att främja prostata cancer progression, vilket tyder på en framträdande roll av nerver i tumör progression 26. denna modell bestod av kemisk ablation av murina sympatiska och parasympatiska nerver. Den Parasympatiska fibrer infiltrerade tumör vävnader, en process i samband med PNI, men modellen var inte specifikt används för att bedöma fysiska interaktioner mellan nerv och tumör. CAM-DRG-modellen möjliggör utredning av interaktioner mellan nerv och cancer under PNI. Dessutom är murina modeller dyra och tids krävande jämfört med CAM-modellen. Vi föreslår att man använder CAM-DRG-modellen för mekanistiska studier av PNI.
Några fördelar med CAM-DRG tillvägagångs sätt inkluderar bedömning av PNI och andra fenotyper, såsom tumör tillväxt, metastaser, och angiogenes. Identifiering av mänskligt DNA på nedre CAM och/eller i levern kan användas för detektion av metastaser av mänskliga cancer cellinjer10, en känsligare experimentell metod jämfört med vävnad snittning och färgning, som inte kan avslöja små metastaser.
CAM-DRG-metoden har vissa begränsningar, inklusive den korta observations tids ramen. Embryots immun system är fysiologiskt aktivt vid dag 1827, då avstötning och en inflammatorisk process kan äga rum, vilket begränsar den experimentella tiden. Det är också viktigt att beakta avståndet vid ympning tumör celler nära DRG; större DRG-cancer avstånd kan försämra den molekyl ära interaktioner mellan tumör celler och nerv, eller kan fördröja den fysiska kontakten mellan båda komponenterna i modellen. Även om embryona är äldre än vad som föreskrivs i detta protokoll, embryorörelser kan tränga undan tumör cellerna. Därför är det viktigt att använda ägg i enlighet med dag 10 post-fertilisering för cell ympning.
Eftersom immun försvaret inte är fullt utvecklad före dag 1827, tumören mikromiljö i cam liknar den hos de immunsupprimerade murina modeller som ofta används för cancer studier. Därför är denna modell inte användbar för att bedöma immun cellernas roll i tumör progression. En annan begränsning är den begränsade till gången på reagenser för kyckling arter, såsom anti kroppar, cytokiner och primers.
Korrekt utförande av detta protokoll kräver övning; Det kan dock göras av en laboratorie medlem utan behov av en specialiserad Core anläggning. Borrning av äggskal kräver träning. Öva på livsmedels butiker (icke-befruktade) ägg rekommenderas innan du försöker denna modell för första gången. Hög embryonal överlevnad och framgång av modellen kan uppnås om vissa kritiska åtgärder för att undvika infektion följs: lämplig antibiotika profylax av DRGs i 2% penna/STREP, arbetar i ett laminärt flöde skåp, och undvika spridning av äggskal partiklar på ca-modulen. Det är också viktigt att hålla en stabil fuktighet under den totala ägg inkubations tiden. Vi rekommenderar att du ökar antalet ägg per grupp tills tekniken behärskar. De vanligaste problemen för oerfarna laboratorie personal är äggkontaminering och felaktig teknik för cell ympning.
DRG skörd kräver också utbildning; metoder för skörd av DRG för in vitro-experiment8 innan man försöker in vivo-modellen rekommenderas. DRG-kulturen in vitro är en möjlighet att optimera förhållanden och förbättra tekniken för att förkorta DRG-extraktionstiden. Särskild uppmärksamhet på skörd teknik krävs när greppa DRG med pincett. DRG bör inte hållas direkt. Tryck bör appliceras under den. Vi rekommenderar användning av förstorings glas för att bättre visualisera DRG under extraktion.
Viktigt, när du utför denna modell för första gången, alla villkor bör optimeras för önskad cellinjen. Denna modell var optimerad för råtta DRG och HNC cellinjen UM-SCC-1. Användning av mus DRG och andra cancer cell typer kan kräva optimering. Med en högre koncentration av ympade celler, tumörer tenderar att växa tjockare och styvare, vilket underlättar tumör mätningar. Med hänsyn till flera ägg för varje grupp och en lämplig koncentration av celler för varje ägg, kan flera miljoner celler krävas för varje experiment. För att under lätta planeringen bör man ta hänsyn till kunskapen om fördubblings tiden för cellerna. För vissa kritiska steg i det här protokollet finns en fel söknings tabell (tabell 1).
Disclosures
Författarna deklarerar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH/NIDCR-bidrag DE027551 och DE022567 (NJD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | # 25200-056 | |
| ACE light source | SCHOTT North America, Inc. | Used to transilluminate the eggs | |
| CellTracker Green CMFDA fluorescent dye | Life Technologies | # C7025 | Reconstitute 50µg in 20µL of DMSO and stock at -20oC. Use 1µL of stock solution/mL of culture medium. |
| CellTracker Red CMTPX fluorescent dye | Life Technologies | # C34552 | Reconstitute 50µg in 40µL of DMSO and stock at -20oC. Use 1µL of stock solution/mL of culture medium |
| Cordless rotary tool | DREMEL | # 866 | Used to drill the egg shell |
| DMEM (1x) | Gibco | # 11965-092 | Dulbeecco`s Modified Eagle Medium |
| DMSO | Fisher Bioreagents | # BP231-100 | Dimethyl Sulfoxide |
| Dumont # 5 fine forceps | Fine Science Tools (FST) | # 11254-20 | Used to harvest DRG |
| Egg incubator | GQF Digital Sportsman | # 1502 | Egg incubator equipped with automatic rotator, digital thermostat, temperature and humidity controls |
| Engraving cutter | DREMEL | # 108 | Used to drill the egg shell |
| Extra fine Graefe forceps, curved | Fine Science Tools (FST) | # 11151-10 | Used to graft DRG onto the CAM on day 8 and to harvest CAM tissue on day 17 |
| Extra fine Graefe forceps, straight | Fine Science Tools (FST) | # 11150-10 | Used to graft DRG onto the CAM on day 8 and to harvest CAM tissue on day 17 |
| Fertilized Lohmann White Leghorn eggs | Fertilized eggs at early fertilization days, preferably on first day post-fertilization. Eggs used in this protocol are from Michigan State University Poultry Farm. | ||
| Filter Forceps | EMD Millipore | # XX6200006P | Blunt forceps used to remove the egg shell |
| Fine surgical straight sharp scissor | Fine Science Tools (FST) | #14060-09 | Used to harvest the CAM tissue on day 17 |
| HBSS (1x) | Gibco | # 14025-092 | Hank`s Balanced Salt Solution |
| HI FBS | Gibco | # 10082-147 | Heat-inactivated Fetal Bovine Serum |
| Paraffin wax membrane | Parafilm laboratory film | # PM-996 | Used to temporarily cover the egg openings until DRG grafting on day 8 |
| PBS (1x) pH 7.4 | Gibco | # 10010-023 | Phosphate Buffered Saline |
| Pen/Strep | Gibco | # 15140-122 | 10,000 Units/mL Penicilin, 10,000 µg/mL Streptomycin |
| PFA (paraformaldehyde solution) | Sigma-Aldrich | # P6148-1KG | Dilute in water to make a 4% PFA solution |
| Sprague Dawley rats (females) | Charles River laboratories | Strain code: 001 | 6-7 weeks old (190-210g in weight) |
| Tegaderm Transparent Film Dressing | 3M | # 9505W | Sterile, 6x7cm, used to cover the egg openings during incubation |
References
- Schmitd, L. B., Scanlon, C. S., D'Silva, N. J. Perineural Invasion in Head and Neck Cancer. Journal of dental research. 97 (7), 742-750 (2018).
- Liebig, C., Ayala, G., Wilks, J. A., Berger, D. H., Albo, D. Perineural invasion in cancer: a review of the literature. Cancer. 115 (15), 3379-3391 (2009).
- Schmitd, L. B., et al. Redefining Perineural Invasion: Integration of Biology With Clinical Outcome. Neoplasia (New York, N.Y). 20 (7), 657-667 (2018).
- Chinn, S. B., et al. Impact of perineural invasion in the pathologically N0 neck in oral cavity squamous cell carcinoma. Otolaryngology--head and neck surgery : official journal of American Academy of Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 149 (6), 893-899 (2013).
- Tai, S. K., Li, W. Y., Yang, M. H., Chu, P. Y., Wang, Y. F. Perineural invasion in T1 oral squamous cell carcinoma indicates the need for aggressive elective neck dissection. The American journal of surgical pathology. 37 (8), 1164-1172 (2013).
- Scanlon, C. S., et al. Galanin modulates the neural niche to favour perineural invasion in head and neck cancer. Nature communications. 6, 6885 (2015).
- Amit, M., et al. Upregulation of RET induces perineurial invasion of pancreatic adenocarcinoma. Oncogene. 36 (23), 3232-3239 (2017).
- Huyett, P., Gilbert, M., Liu, L., Ferris, R. L., Kim, S. A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma. Journal of visualized experiments : JoVE. (119), (2017).
- Ayala, G. E., et al. In vitro dorsal root ganglia and human prostate cell line interaction: redefining perineural invasion in prostate cancer. The Prostate. 49 (3), 213-223 (2001).
- Liu, M., et al. The Histone Methyltransferase EZH2 Mediates Tumor Progression on the Chick Chorioallantoic Membrane Assay, a Novel Model of Head and Neck Squamous Cell Carcinoma. Translational oncology. 6 (3), 273-281 (2013).
- Busch, C., Krochmann, J., Drews, U. The chick embryo as an experimental system for melanoma cell invasion. PloS one. 8 (1), e53970 (2013).
- Li, M., et al. The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma. Journal of visualized experiments : JoVE. (104), (2015).
- Ota, I., Li, X. Y., Hu, Y., Weiss, S. J. Induction of a MT1-MMP and MT2-MMP-dependent basement membrane transmigration program in cancer cells by Snail1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (48), 20318-20323 (2009).
- Murphy, J. B. TRANSPLANTABILITY OF TISSUES TO THE EMBRYO OF FOREIGN SPECIES : ITS BEARING ON QUESTIONS OF TISSUE SPECIFICITY AND TUMOR IMMUNITY. The Journal of experimental medicine. 17 (4), 482-493 (1913).
- Ribatti, D., Nico, B., Vacca, A., Presta, M. The gelatin sponge-chorioallantoic membrane assay. Nature. 1 (1), 85-91 (2006).
- Auerbach, R., Arensman, R., Kubai, L., Folkman, J. Tumor-induced angiogenesis: lack of inhibition by irradiation. International journal of cancer. 15 (2), 241-245 (1975).
- Banerjee, R., et al. The G protein-coupled receptor GALR2 promotes angiogenesis in head and neck cancer. Molecular cancer therapeutics. 13 (5), 1323-1333 (2014).
- Ossowski, L., Reich, E. Experimental model for quantitative study of metastasis. Cancer research. 40 (7), 2300-2309 (1980).
- Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
- Moreno-Jimenez, I., et al. The chorioallantoic membrane (CAM) assay for the study of human bone regeneration: a refinement animal model for tissue engineering. Scientific reports. 6, 32168 (2016).
- Vu, B. T., et al. Chick chorioallantoic membrane assay as an in vivo model to study the effect of nanoparticle-based anticancer drugs in ovarian cancer. Scientific reports. 8 (1), 8524 (2018).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC research notes. 9, 82 (2016).
- Cavel, O., et al. Endoneurial macrophages induce perineural invasion of pancreatic cancer cells by secretion of GDNF and activation of RET tyrosine kinase receptor. Cancer research. 72 (22), 5733-5743 (2012).
- Guo, K., et al. Interaction of the sympathetic nerve with pancreatic cancer cells promotes perineural invasion through the activation of STAT3 signaling. Molecular cancer therapeutics. 12 (3), 264-273 (2013).
- Deborde, S., et al. An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion. Journal of visualized experiments : JoVE. (134), (2018).
- Magnon, C., et al. Autonomic nerve development contributes to prostate cancer progression. 341 (6142), Science. New York, N.Y. 1236361 (2013).
- Ribatti, D. Chick embryo chorioallantoic membrane as a useful tool to study angiogenesis. International review of cell and molecular biology. 270, 181-224 (2008).
