Summary
Perinevral invazyonu baş ve boyun skuanöz hücre karsinomları ve diğer tümörlerde agresif bir fenotiptir. Piliç chorioallantoik membran modeli anjiyogenez, kanser istilası ve metastif eğitimi için kullanılmıştır. Burada bu modelin perineval invazyonu in vivo olarak değerlendirmek için nasıl kullanılabilirler olduğunu gösteriyoruz.
Abstract
Perinevral invazyonu kanser çevreleyen veya sinirleri istila bir fenotip olduğunu. Baş ve boyun skuayöz Hücre Karsinomu ve diğer kanserler için kötü klinik sonuçlar ile ilişkilidir. Mekanik çalışmalar, sinirler ve tümör hücreleri arasındaki moleküler çapraz fiziksel etkileşimden önce oluştuğunu göstermiştir. Perinevral invazyonu incelemek için, özellikle fiziksel sinir-tümör etkileşimleri oluşmadan önce erken ilerlemeyi araştırmak için sadece birkaç in vivo model vardır. Piliç chorioallantoik membran modeli kanserli invazyonu incelemek için kullanılmıştır, çünkü koronik epitelin Bodrum membranı, insan epitelyal dokusunu taklit eder. Burada, perinevral invazyonu araştırmak için piliç chorioallantoik membran modelini repurposed, sıçan dorsal kök ganglionlar ve insan baş ve boyun skuasöz Hücre Karsinomu hücrelerinde koronik epitelyum üzerine grepleme. Biz nasıl bu model kanser hücrelerinin yeteneği in vivo nöral doku istila yeteneğini değerlendirmek için yararlı olabilir göstermiştir.
Introduction
Perinevral invazyon (PNı), baş ve boyun skuayöz Hücre Karsinomu (HNC)1olan hastalarda yüksek hastalık nüks ve kötü hayatta kalma ile ilişkili olan kanserde underokudu phenoype olduğunu. Pni mikroskobik olarak tanımlanan veya sinirler çevreleyen tümör hücreleri olarak2,3. Pni algılandığında, hastalar seçmeli boyun diseksiyonu ve/veya radyasyon terapisi gibi adjuvan tedaviler almak muhtemeldir4,5. Ancak, bu tedaviler agresif, ve PNı özgü değil. Aslında, PNı engellemek için hiçbir terapi, öncelikle çünkü sinir-tümör etkileşimleri temel mekanizmaları hala kötü anlaşılmasıdır.
Sinir-tümör cazibe içinde farklı moleküler mekanizmalar karışmıştır; tümör ve stromal hücreler neuritogenesis yükseltmek için nöropeptidler ve büyüme faktörleri serbest6,7. İn vitro ile birlikte kültürlü olduğunda, HNC hücreleri ve dorsal kök ganglionlar (DRG) hem sağlam bir yanıt var; tümör hücre invazyonu ve neuritogenesis üzerindeki etkileri birkaç gün sonra kültür6,8,9görülebilir. Ancak, invazyonu öncesinde tümör-sinir etkileşimlerini tekrar etmek için uygun in vivo modellerde eksikliği vardır. Burada HNC hücreleri ve sinirler arasında erken etkileşimleri incelemek için bir in vivo PNı modeli sunuyoruz6. Biz piliç chorioallantoic membran (CAM) model bir nöral bileşeni dahil etmek için adapte, CAM bir DRG greftleme, kanser hücrelerinin bir greft tarafından takip eden bir iç tümör mikroçevre taklit.
CAM modeli, kanseromlar ve melanom erken invaziv aşamaları taklit, Bodrum membran aracılığıyla hücrelerin istilasını değerlendirmek için başarıyla kullanılmıştır10,11,12. CAM, üst koronik epitelyum, müdahale eden mesenmüme ve düşük allantotik epitelyondan oluşur. Koronik epitelyum, kolajen-IV açısından zengin Bodrum membranının temel bağ dokusundan oral epitelin ayıran Bodrum membranı simüle eden insan epitelyum10,13 ' e yapısal olarak benzer. 191314' te cam 'de ilk tümör greftleri gerçekleştirildiği için, anjiyojenik15,16,17, tümör progresyonunun değerlendirilmesine izin vermek üzere yöntemin birçok adaptasyon geliştirilmesi ve metasif18. Daha da önemlisi, CAM üzerine greyleme tümörlerinin tekniği çok az değişti, ancak uygulamalar sürekli gelişmektedir. İlaç taraması19, kemik dokusu Mühendisliği20ve Nanoparticle tabanlı antikanser ilaçları21de dahil olmak üzere, artan karmaşıklık asdaları yayımlandı.
Laboratuvarımız, bir memeli DRG 'nin üst CAM yüzeyine izole ve grestli olduğu bir CAM-DRG modeli kullanır. DRG CAM 'e eklendikten sonra, HNC hücreleri DRG 'nin yakınında erir ve tüm in vivo sistem hasat edildikten ve analiz edildikten önce DRG ile etkileşime girilebilir. Daha da önemlisi, sistem DRG ve tümör hücrelerinin floresans etiketleme ile hem DRG ve tümör ex-vivo görsel gözlem sağlar. Bu protokol 17 gün içinde gerçekleştirilen farklı karmaşıklık düzeylerine sahip birden fazla adımla birlikte yumurta kulkartan CAM hasat etmek için (Şekil 1) oluşmaktadır. Farklı ilgi proteinlerini ifade eden hücreler, kanserde sinir istilasından sorumlu moleküler yollar ve aynı zamanda doğrudan nöral istilayı hedefleyen ilaçların taranması için bu modelde test edilebilir. Bir aday ilaçla önceden tedavi edilen hücreler, CAM üzerinde grepte edilebilir ve tedavi edilmemiş kontrollere kıyasla PıNI 'nin oluşumu incelenebilir. Aslında, CAM modeli, uyuşturucu taraması için, in vitro etütler arasında bir ara adım ve kemirgenlerde klinik öncesi in vivo denemeler olarak kullanılmıştır19.
Deneysel tasarım hipotezi ile farklılık gösterecektir. Örneğin, PNI üzerinde belirli bir proteinin rolünü test ederseniz, deneysel grup, proteini aşırı ifade eden tümör hücrelerine sahip DRG 'yi içerirken, kontrol grubu boş vektörle birlikte stabil transferat edilen hücrelerle DRG içermelidir. Bazı farklı Deneysel tasarımlar belirli soruları ele almak için kullanılabilir.
Protocol
Etik Beyanı: Bu protokolde sıçan kullanan tüm deneyler kurumumuzu ıATUC (kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi) kurallarına uygun olarak yapılır. Bu çalışmada yumurtalarla yapılan deneyler IAM UC yönetmeliğine tabidir.
1. yumurta kuluçka (tahmini zamanlama: 5 dk, gün sıfır)
- Patojen içermeyen döllenmiş ticari Lohmann beyaz Leghorn yumurtaları, tercihen ilk gün sonrası fertilizasyon alın. 38 °c ' de bir yumurta nemlendirme kuluçka ve saatlik rotasyon ile 8 gün boyunca% 54 nem ile deneysel grup başına altı yumurta inkulat. Yumurta membranlarına yapışmasını embriyonun önlemek için yumurtaların düzenli rotasyonu kullanın.
Not: kuluçtan önce, en fazla 1 hafta embriyo gelişimini durdurmak için 18 °C buzdolabında yumurta tutun.
2. hasat ve DRGs hazırlanması (tahmini zamanlama: 2 saat, gün 8)
Not: fareler ve fareler ile deneyler (ıatuc) onay gerektirir. Bazı ülkelerde, tavuk yumurtası kullanımı da onay gerektirir.
- DRGs ayıklamak için altı-yedi hafta-eski Sprague Dawley fareler (~ 200 g ağırlığı) alın.
Not: bir sıçan ~ 40 servikal ve torasik DRGs verim gerekir. fare DRG Ayrıca CAM entegre, ancak bu türün koşulları bağımsız olarak optimize edilmesi gerekir. - Bir laminar akış kabininde, başka bir yerde yayımlanan fare DRG ekstraksiyon protokolünün ardından servikal ve torasik bölgelerden DRGs topla22. DRGs hasat nasıl oryantasyon için Şekil 2 izleyin.
- Ketamin/xylazine uygulandıktan sonra kardiyak delinme tarafından sıçan euthanize intraperitoneally enjekte. 70% etanol ile sıçan derisi temizleyin ve bir makas kullanarak sıçan omurgasını çıkarın. Bu servikal drgs zarar verebilecek çünkü servikal çıkığı gerçekleştirmeyin.
- Aynı makas ile servikal, torasik ve lomber bölgeleri ayırın, Şekil 2a-Diçinde sağlanan şematik anatomik temsili ve brüt görüntüleri takip. Dokularda ıslak tutmak için 1x PBS ile 10 cm kültür çanak omurga bölümlerini yerleştirin.
- Hassas bir kemik makas ile, dorsal ve ventral yönleri vertebral kemikleri açın, iki lateral yarıya omurga ayırarak (Şekil 2E-F). Taze 1x PBS ile temiz 10 cm çanak doku bölümlerini yerleştirin.
- Forseps kullanarak, yavaşça vertebral kemikleri omurilik ayırmak DRGs görselleştirmek için (Şekil 2G).
- Her bir DRG altında tutulan ince forseps ile, onu kavramak ve içinde yer aldığı kemik boşluğundan çekin. Bu doku hasarına neden olacak çünkü DRG doğrudan tutmayın. Axon demetleri DRG 'den kırmayın (Şekil 2H).
Not: Bunlar CAM entegrasyonu azaltılmış olduğundan lomber DRGs kullanmaktan kaçının. DRG bölgesinin konumu için, Şekil 2a-Düzerinde şematik Illustration ve brüt anatomik görüntüleri takip edin.
- Hasat işleminden hemen sonra, her bir DRG 'yi, DRGs 'in bakteriyel kontaminasyonunu önlemeye yardımcı olmak için% 2 penisilin/streptomisin (pen/strep) ve% 10 ısı inaktive fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenen DMEM kültür ortamına yerleştirin. Grup tüm DRGs aynı 6 cm Kültür yemek 4 mL kültürü orta.
- Tüm DRGs hasat sonra, DMEM kültür orta ile yeni bir kültür çanak aktarmak 2% pen/strep artı 10% FBS ve içeren 1,25 μg/mL kırmızı floresan boya. Hücre kültürü kuluçk 1 h için inkübe. Bu süre zarfında, yumurtayı aşağıda açıklandığı gibi DRG almak için hazırlayın (adım 3).
Not: hasat DRGs ve floresans etiketleme tamamlanması arasındaki Aralık yumurta hazırlamak için yeterli olmalıdır; DRGs birkaç saat boyunca kuluçkunda saklanabilir.
3. DRG gret için yumurta hazırlanması (tahmini zamanlama: bir düzine yumurta için 1 saat, gün 8)
- Bir laminar akış kabininde, ışık dimdik ve akımlı ve embriyonik faz kontrol etmek için yumurta tranillüminasyonu. Düşük damar, döllenmeyen yumurtalar veya 8 ' i döllenme sonrası ile tutarlı olmayan yumurtalarla yumurtayı dışlayın. Yumurtayı doğal olarak ortaya çıkan hava kesesi ile ışık kaynağına doğru hafifçe tutun (Şekil 3A).
- Bir kalem ile, açıklıkları almak için yumurta kabuğu işaretleyin (Şekil 3A-B).
- İlk olarak, yumurta membranı bağlı karanlık bir hareketli gemi olarak CAM gelişmekte olan embriyonun eki tanımlamak ve bu bölgede müdahaleler önlemek için bu alanı işaretlemek.
- İkincisi, embriyo eki en az 2 cm iyi vaskülarize alan olarak işletim pencere alanını seçin ve 1,5 cm çap daire çizin. Çalışma penceresinden yaklaşık 1 cm, daha az vaskülarize alan bir 0,5 cm kare çizin.
- Üçüncü olarak, hava kesesi bölgesini operasyon alanından dışlamak için çizin. Hava kesesinin ortasına bir haç ile işaretle.
- Bir döner takım ve gravür matkap ile, çapı 3 mm, işaretli meydanda yumurta kabuğu matkap (Şekil 3c). Dış yumurta kabuğu membranı (kabuk altında beyaz membran) (şekil 3D) çıkarmadan yumurta kabuğu kaldırmak için künt forseps kullanın. Bu membranın kazara perforasyonu önlemek için dikkatle çalışın.
- 3,3 adımda olduğu gibi aynı matkap kullanarak, havada hava akışına izin vermek için hava kesesi alanında işaretlenmiş haç içinde bir nokta perforasyonu yapın (Şekil 3E). Yumurta, kırma veya zarar önlemek için çok fazla baskı uygulamak için dikkatli olun.
- Kare açılışta 30 μL HBSS yerleştirin, bozulmamış dış yumurta kabuğu membranı (Şekil 3E). 30-G şırınga iğnesi ile bu kare alandaki dış membranda bir delikli perforasyon yapın (Şekil 3F).
- Hava kesesi görselleştirmek için ışık kaynağına yumurta yerleştirin. Bir damlaya kauçuk ampul basınç uygulayın ve hava sac alanında yapılan küçük perforasyon yerleştirin (adım 3,4). İşletim penceresi alanında iki zarın ayrılması görünene kadar ampulün basıncını bırakın (Şekil 3G); işletim penceresi alanında membranların tam ayrılması elde etmek için gereken gibi birçok kez bu adımı tekrarlayın.
- Tüm yumurta için 3.1-3.6 arasındaki adımları yineleyin.
- 3,3 adımda olduğu gibi aynı matkap kullanarak, dairesel işletim penceresi dış yumurta kabuk membran (Şekil 3H) rüptür için dikkatli olmak matkap. Tüm gevşek parçacıkları kaldırmak için hafifçe yapışkan bant yapışarak yumurta yüzeyini temizleyin.
- Künt forseps ile, yumurta kabuğu delinmiş alandan çıkarın (Şekil 3I-J). Sonra, aynı forseps ile, dış yumurta kabuk membranı çıkarın (Şekil 3K), kirlilik en aza indirmek için yumurta içinde küçük kabuk parçacıkları tanıtmak için dikkatli olmak.
- CAM 'i yumurta yüzeyinden yaklaşık 1 cm derinlikte tanımlayın. Kontaminasyonu önlemek için her açılan yumurtayı geçici olarak Parafin balmumu membranı ile koruyun (Şekil 3L).
- Tüm yumurtalar için 3.8-3.10 arasındaki adımları yineleyin. DRGs grevleme için hazır olana kadar yumurtayı geri dönme olmadan yumurta kuluçta yerleştirin.
4. CAM üzerinde DRG gret (tahmini zamanlama: 40 dk, gün 8)
- İmplantasyon öncesinde DRG 'Leri yıkamak için HBSS orta ile 6 cm 'lik bir kültür yemeği hazırlayın. Hazırlanmış yumurtaları hücre kültürü laminar akış kabinine getirin. Parafin membranı yumurtadan çıkarın (Şekil 4A).
- İnce steril forseps ile, bir DRG 'i kültür ortamının içinden hafifçe kavrama. Floresan boya içeren aşırı orta kaldırmak için HBSS orta içine daldırma. DRG 'ye çok nazikçe tutun; Aksi takdirde, bu forseps sopa olacaktır.
- DRG 'i CAM üzerine yerleştirin, membranı delmemeye dikkat edin (Şekil 4b-C). Gerekirse, DRG 'nin cam üzerine yerleştirilirken forseps ucundan ayırmasına yardımcı olmak için başka bir forseps çifti kullanın.
Not: HBSS orta ile DRG ıslak tutmak da forseps dan dekolmanı kolaylaştıracaktır. - Steril şeffaf film pansuman ile yumurta kapak. Bakteri kontaminasyonunu önlemek için yumurta kabuğu içinde yapılan tüm pencereleri ve delikleri kapın (Şekil 4d).
- Tüm yumurtalar içinde DRGs grevleme sonra, 38 °C ve% 54 nem ile 2 gün boyunca
5. CAM üzerindeki tümör hücrelerini eritme (tahmini zamanlama: 1 saat 30 dk, gün 10)
- At 48 h önce hücreleri greplme, plaka kültür plakaları gerekli hücreler. CAM 'de üç boyutlu tümör oluşturmak için UM-SCC-1 hücreleri için yumurta başına 1 x 106 hücreye 0,5 hesaplayın. Hücre numarasının hücre çizgisine göre değişebileceğini unutmayın.
- Aspirate orta ve% 1 pen/strep artı% 10 FBS ve 2,5 μg/mL yeşil floresan boya ile tamamlayıcı DMEM kültür orta ekleyin. 37 °C ' de hücre kültürü kuluçk kısmında 1 saat boyunca Inküye yapın. Daha sonra, mikroskopla floresan yoğunluğunu kontrol edin, orta aspirat, 1x PBS ile bir kez yıkayın ve 10 dakikaya kadar% 0,25 tripsin ekleyin. DMEM tamamlayıcı orta ile tripsin nötralize.
- 250 x g 'de santrifüjün bir hücre Pelet oluşturmak için 4 dakika. DMEM orta aspirate ve aşırı floresan boya yıkamak için HBSS yeniden askıya. Bir hemokytometer kullanarak hücreleri saymak.
- Hücre kültürü laminar akış kabine yumurta getirin. Makas ve forseps ile, yumurta kapsayan şeffaf film pansuman açın (Şekil 4E-F).
- Hesaplanan hücre sayısını tekrar santrifüjler, HBSS ortamını Aspire ve 0,5 son konsantrasyonunda aynı ortamın 5 μL başına 1x106 hücreye yeniden askıya alın (Şekil 4g). Toplam yumurta sayısı için gerekli miktarı hazırlayın (yumurta başına 5 μL hücre süspansiyonu).
- 5 μL hücre çözümünü CAM üzerine yerleştirin, DRG 'den yaklaşık 2 mm (Şekil 4h). DRG ve hücreler arasında Tekdüzen mesafeler tutun. Hücrelerin yayılmasını en aza indirmek için yumurta rahatsız değil çok dikkatli olun.
Not: hücre implantasyonu başlatmak Için, CAM yüzeyinin görsel olarak kuru olduğu yumurtaları seçin. Yüzey çok ıslak ise, hücreler yayılabilir ve normal tümör oluşturmaz. - Kapak yeni bir film ile adım 4,4 olarak soyunma yumurta. Tüm yumurtaların hücrelerini greft. Yumurtaları 38 °c ve% 54 nem ile 7 gün boyunca, rotasyona gerek kalmadan nemlendirme inküside kuluçat.
6. CAM hasat (tahmini zamanlama: düzine yumurta için 1 saat, gün 17)
- Hazırlamak 6-kuyu plakaları ile 4% PFA (paraformaldehyde) pH 7.0, bir iyi yumurta başına, 2 mL başına iyi.
- Yumurtaları laboratuar bankına getir. Film pansuman delmek için bir şırınga bağlı bir iğne kullanarak, cam üzerinde biraz PFA 300 μL aşağı damla, böylece hasat süreci kolaylaştırmak. Bunu tüm yumurtalar için tekrarlayın.
- Bir makas ile, yumurta kabuğunun (işletim penceresinin bulunduğu yer) üst yarısını, CAM 'e bağlı olarak (Şekil 4I) çıkarın. Bu yarısını yaklaşık 3 cm çapına kadar azaltın ve CAM 'in ortasında DRG ve tümör hücrelerinin merkezdeki (Şekil 4J) Grebe edildiği kısmı tutudur. Cam 'i ince forseps ile tutun ve onu PFA 'ya yerleştirirken yumurta kabuğundan ayırın. DRG ve kanser hücrelerini yukarı dönük olarak yönlendirmek (Şekil 4k-L).
Not: 3 cm alan hem DRG hem de hücreleri içermelidir. DRG kolayca küçük bir yumru CAM üzerinde bağlı olarak görülür, ancak tümör hücreleri bazen brüt sınav tanımlamak zordur. - Alternatif olarak, bir makas ile, CAM yerinde tutarken yumurta kabuktan yumurta kabuğu kaldırarak işletim penceresini genişletmek; çalışma penceresinin yaklaşık 1 cm ötesinde (Şekil 4m) çıkarın ve cam üzerindeki DRG ve hücreleri belirleyin (Şekil 4N-O). Hassas ince forseps ile CAM kenarlarından birinde tutun ve yavaşça kaldırın. Keskin hassas makası ile, yaklaşık 3 cm çapında (Şekil 4P) dairesel bir alanı ÇıKARMAK için cam 'i hafifçe keser ve DRG ve kanser hücreleri yukarı bakacak şekilde cam 'ı PFA 'ya yerleştirin.
Not: mikroskobik eserler üretebilir doku hasarı en aza indirmek için birden çok yerde forseps ile CAM tutarak veya germe kaçının. - Her CAM membranı bir kuyunda yerleştirin (Şekil 4L). CAM 'in kenarlarını, PFA 'da dokuyu açık bir şekilde yaymak için hafifçe tutun veya CAM katlanmış yapılardan kaçınmak için plakası hafifçe sallayın.
- Embriyo (17. gün) ile hızlı kırılma ile ötenize. PFA 'da hasat edilen dokularda oda sıcaklığında 4 saat düzeltin. Sabitleme sonrasında, PFA 'yı 4 °C ' de PBS 'de 1x PBS ve mağaza dokularıyla değiştirin, Bölüm kesmesi için parafine gömene kadar. CAM 'in Hassas damarına zarar verecek aşırı fikitasyon kaçının.
- Floresan sinyalleri kaybetme önlemek için hasat sonra 2 gün içinde membranları fotoğraf, floresan stereomikoskop kullanarak.
Representative Results
En iyi duruma getirildiğinde, bu yöntem CAM% 100 DRG entegrasyonu yakın vardır. DRG entegrasyonunun temsili sonuçları Şekil 5A-B ' d agösterilir. DRG 'nin CAM 'de entegrasyonu, deney sırasında DRG dokusuna uygunluk sağlamasından dolayı önemlidir. Microscopically, DRG CAM bağ dokusu içinde görülür (H & E leke). Kan damarlarının genellikle DRG dokusu içinde görülür, CAM kan kaynağı grestte doku besleyen olduğunu düşündürmektedir. İmplante edilen tümörler Ayrıca H & E tarafından CAM üzerinde tanımlanır; ne kadar istilaya bağlı olarak, tümörler bağ dokusunu işgal eden çok sayıda tümör adasına hiçbiri ile mevcut olabilir (Şekil 5c-D). Temsilci Şekil 5e-F , hasat edilen cam 'i aydınlık alan Imaging ve birleştirilmiş floresans üzerinde gösterir. Galanin reseptörü 2 ' nin aşırı ifade edilen Umm-SCC-1 hücreleri, kontrol hücrelerine kıyasla DRG 'nin işgal edilmesini artırdı (Şekil 5G-H). Kanser-DRG etkileşimi DRG doğru yönlü istila sunan kanser hücreleri olarak görülür (Şekil 5h).
Veri analizi farklı şekillerde gerçekleştirilir. DRG 'ye doğru kanser hücrelerinin yönlü istilası, bir Dichotomous değişken olarak gözlemlenmiştir ve bu işgal modelini sunan yumurta sayısı her grupta sayılır. Gruplar arasındaki istatistiksel farklar, binom oran testi kullanılarak hesaplanır. Kanser hücreleri ve DRG arasındaki yakınlık ve tümör alanı ımagej6 kullanılarak ölçülür ve gruplar arasındaki farklar öğrenci t testi kullanılarak değerlendirilir. Imagej analiziyle doğruluğu sağlamak için, aynı denemenin tüm görüntüleri eşit ışık ve pozlama ayarlarında alınmalıdır. Aynı ölçütleri kullanarak tüm görüntülerin görüntü eşik ve parlaklığını ayarladıktan sonra, analiz parçacıkları aracı tümör alanını ölçmek için kullanılır ve doğrusal ölçüm aracı tümör-DRG mesafelerini ölçer. Farklı gruplar arasında tüm görüntüler için analiz parçacıklarının boyutu sabit kurulum kullanmak önemlidir. Bazı durumlarda, tümörler kalın büyür ve manuel olarak dijital bir Kaliper ile ölçülebilir, hacim ölçümü için izin verir.
Parafin-gömülü CAM dokusu, H & E leke veya epitel hücreleri için immünhistokimya bölümlerini kullanarak (insan türleri için reaktif Anti-sitorokeratin antikor) yapılabilir, bağ dokusu içinde işgali değerlendirilmesi için izin. İstila, yumurta başına bağ dokusunda tümör adalarının sayısı olarak ölçülebilir. Kollajen IV için immünofluorescence Bodrum membranı vurgulamak için kullanılabilir. Ayrıca, GFP etiketli kanser hücrelerini kullanıyorsanız, doku bölümlerinde bu hücrelerin tanımlanması sitokeratin için bir immünhistokimya olmadan kolaylaştırılır. Cam deneylerinde metasozis ve anjiyogenez analizi başka yerlerde10,17' de tartışılmaktadır.
Şekil 1: deneme zaman çizelgesi 0, 8, 10 ve 17 gün üzerinde önemli adımlar dahil. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2:8. gün DRG ekstraksiyon . Omurganın anatomik yerini gösteren A. rat şematik. B. farklı vücut bölgeleri gösteren sıçan vertebra konfigürasyonun diyagramı; Servikal için yeşil, torasik için koyu mavi, lomber için turuncu ve sakral vertebra için açık mavi. C-D. Cerrahi eksizyondan sonra sıçan omurgasının ventral yönü; Bolarak gösterildiği gibi bölgelerin ayrılması. Vertebra, omurilik kanalını açmak için, vertebralı organları DRGs içeren iki lateral bölüme ayıran e. diseksiyon. bölüm, orta çizgiden her vertebral kemiğin dorsal ve ventral yönünü kesmelidir. F. açılmış torasik omurganın brüt yönü. G. omurilik yerlerinden sonra, drgs vertebral kanallarda kolayca görülebilir (ok kafaları 3 DRG işaret ediyor). H. BIR DRG (ok) ile ilgili Axon demetleri (ok başlığı) ile stereomicroskopik görüntü. Ölçek çubukları: C, D, Fve G, 1 cm; H, 1 mm. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen tıklayın .
Şekil 3: yumurtaların hazırlanması gün 8. A-B. Prosedürden önce yumurta damarının ve işaretlerin tanımlanması. Bir nokta üzerinde oklar doğal olarak meydana gelen hava kesesi. C-D. Sondaj ve kare açılış işareti yumurta kabuğu açılışı. Ok D işaret bozulmamış dış yumurta kabuk membran künt forseps yardımıyla kabuk kaldırdıktan sonra. E. hava kesesinin üzerindeki işaretli haç, yumurtanın içine hava akışına izin vermek için matkap ile delinebilir (ok başlığı). 30 μL HBSS orta kare açılışında dış yumurta kabuk membran üzerine yerleştirilir. F. ince şırınga iğnesi ile, dış yumurta kabuğu membranı, HBSS 'in daha önce yerleştirildiği yerde perforedir. G. basınç lastik damlalar ampulüne uygulanır ve hava kesesi üzerinde delinmiş olan perforasyon üzerine takılarak kullanılır. Parmak basıncı serbest bırakıldığında, hava vakumlanır ve işletim penceresine uzatılmalıdır yapay hava kesesi (beyaz oklar) üretiliyor. H. işletim penceresinin kenarları, yanlışlıkla perforasyonu önlemek için yumurta kabuğu için neredeyse paralel bir konumda delinir. ı-J. Yumurta kabuğu, künt forseps ile kaldırılması. K. dış yumurta kabuğu membranı künt forseps ile çıkarın, cam üzerinde parçacıklar tanıtmamaya dikkat edin (yüzeyin altında ̴1 cm olarak gözlenen). L. yumurtalar geçici olarak Parafin balmumu membranı ile kaplıdır ve kuluçlunun içine geri konur. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: DRG, hücreler ve cam hasat greft: 8. gün: A. CAM Parafin balmumu membran kaldırma sonra kolayca gözlenen. B-C. İnce forseps ile, DRG CAM üzerine yerleştirilir. D. Egg film pansuman ile kaplıdır ve kuluçka koymak; oklar, kapsanan açıklıklara işaret ederler. 10. gün: E-F. Film pansuman kaldırılır ve DRG (F üzerinde ok başlığı) bulunur. G-H. 5 μL hücre çözeltisi DRG 'ye ~ 2 mm mesafede CAM üzerine bırakılır. 17. gün: ı-L ve M-P , cam 'i hasat etmek için kullanılan iki farklı yaklaşım göstermektedir. I. yumurta kabuğu, yumurtanın üst yarısında çıkarılıncaya kadar delik delinmesi ile başlayan ince bir makas ile açılır. J. cam içeren yumurta kabuğu yaklaşık 3 cm. K-Lboyutunda azalır. İnce forseps ile CAM yumurta kabuğu ayrılır ve PFA yerleştirilir. M-O. CAM üzerindeki DRG ve kanser hücrelerini görselleştirmek için işletim penceresinin genişletilmesi gerçekleştirilir. Okwhead, tümör ve ok noktalarını DRG 'ye işaret ediyor. P. cam ince forseps ile ortaya çıkıyor, keskin bir makas ile kesilmiş, ve L'de gösterildiği gibi PFA yerleştirilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 5: temsili sonuçlar. DRG 'nın cam 'de entegrasyonunu gösteren A. H &Amp; E bölümü. B. daha yüksek birbüyütme; oklar DRG CAM kan damarlarını gösterir. C. um-SCC-1 hücreleri cam üzerine greylenmiş ve üç gün sonra hasat (H & E leke). D. C yüksek büyütme cam bağ dokusu (oklar) invazif tümör Adaları gösteriliyor. E. um-SCC-1-GALR2 hücreler ve sıçan DRG, 17. günde hasat edilen cam brüt stereomicroskopik görüntü. F. birleştirilmiş floresan ve aydınlık alan görüntüler DRG vurgulayarak kırmızı ve kanser hücrelerinde etiketli yeşil. G-H. DRG ve UM-SCC-1-GALR2 karşı kontrol hücrelerine karşı uygulanan CAM floresan stereomikroskopisi, UM-SCC-1-GALR2 hücrelerinin DRG 'ye (H) yönlü olarak istila edilmesini gösteren. Ölçek çubukları: A-D, 500 μm; E-H, 2 mm. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın .
| Adım | Sorun | Neden | Çözüm | ||||||
| 3.2.1 | Embriyo eki tanımlanamıyor. | Ek pozisyon yumurta hala iken görmek zordur. | Yumurta membranı bağlı uzun bir gemi görmek edebilmek için hızla yan yumurta döndürün. | ||||||
| 3,3 & 3,8 | Sondaj sırasında dış yumurta kabuğu membranı perforasyonu. | Matkap yanlış konumlandırılması. | Sondaj sırasında matkap neredeyse yumurta kabuğu paralel konumlandırın. 3,3 adımda membran delikli ise, 3,5 adımda belirtildiği gibi iğne ile daha fazla perforasyon gerçekleştirmek için gerek yoktur. Eğer kanama olursa, yumurtayı atın. | ||||||
| 4,3 | DRG, forseplere yapışır. | DRG kuru. | HBSS 'de tekrar ıslak DRG ve/veya DRG 'yi forsepden ayırmasına yardımcı olmak için ince bir iğne kullanın. | ||||||
| 5,2 | Hücreler floresan boya ile mükemmel bir şekilde etiketlenmez. | İnkübasyon zamanı. Bazı hücreler etiketlemek için daha fazla zaman gerektirir. | Floresan boya ile medyada ek bir saat için hücreleri tutun. | ||||||
| 5,6 | Hücre damlası üzerinde hava balonu. | Pipet ucunda tüm sıvıyı kullanıyorum. | 1μL 'i istediğiniz hacimde daha fazla yükleyin ve hücreleri implante ederken pipetin son μL değerini kullanmayın. Bu hücreler karışımı hava kabarcıkları kaçınacaktır. | ||||||
| 6,3 | CAM hasat edildiğinde DRG veya hücreler tanımlanamıyor. | Küçük DRG, DRG yerlerinden edildi, kanser hücreleri yayıldı. | DRG görülmediği takdirde, CAM daha büyük bir alan hasat ve sabitleme için daha büyük bir kap içine yerleştirin. DRG ve hücre konumunu floresans altında stereo mikroskop içinde kontrol edin ve sonra CAM 'i parafin katıştırma için daha küçük bir boyuta kırpın. | ||||||
Tablo 1: sorun giderme tablosu
Discussion
Burada sunulan CAM-DRG in vivo modeli, tümör hücreleri tarafından sinir fiziksel işgali önce sinir-tümör etkileşimi göstererek önceki modellerin açıkları giderir. Çoğu in vivo çalışmalar PNI odak tümör yayılması ve motor fonksiyonunun inhibisyonu üzerine, ve siyatik sinirler içine tümör hücrelerinin doğrudan enjeksiyon bağlı23,24,25. Siyatik sinir enjeksiyonu, kanser hücrelerinin bir fare veya sıçan Siyatik sinirin içine enjekte edildiği PNı 'nın bir in vivo modelidir ve tümör daha sonra büyür. Enjeksiyon modelleri sinir içindeki tümör hücrelerinden kaynaklanan yıkıcı tümör ilerlemesini ve ağrıyı göstermek için yararlıdır. Siyatik sinir modeli de kanser hücrelerinin sinir gelişmek için izin faktörler çalışma için uygundur ama PNı erken faz değerlendirmek için yeteneği yoksun, sinir kılıfları bypass, doğrudan sinirin içine hücreleri tanıtır, çünkü. Farklı bir yaklaşımla, prostat kanseri ilerlemesini teşvik eden adrenergik ve kolinerjik sinir liflerinin önemini karakterize etmek için cerrahi olarak implante edilmiş ortootopik tümör greftleri kullanılmıştır, böylece tümör ilerlemesinde sinirlerin önemli bir rolü olduğunu düşündürmektedir 26. bu model, murin sempatik ve parasempatik sinirlerin kimyasal ablasyonu oluşur. Parasempatik lifleri tümör dokularına sızmış, PNı ile ilgili bir süreç, ancak model özellikle sinir ve tümör arasındaki fiziksel etkileşimleri değerlendirmek için kullanılmadı. CAM-DRG modeli PNı sırasında sinir ve kanser arasındaki etkileşimlerin araştırılması sağlar. Ayrıca, duvar modelleri CAM modeline kıyasla pahalı ve zaman alıcı. PNı 'nın mekanik çalışmaları için CAM-DRG modelini kullanmanızı öneririz.
CAM-DRG yaklaşımının bazı avantajları arasında PNı ve tümör büyümesi, metasrat ve anjiyojenez gibi diğer fenotiplerin değerlendirilmesi yer almaktadır. İnsan DNA 'sının alt CAM ve/veya karaciğerde tanımlanması, insan kanseri hücre hatlarının metastaz algılanması için kullanılabilir10, doku sekleme ve boyama ile karşılaştırıldığında daha hassas deneysel bir yaklaşım, küçük metasatik ortaya koymayabilir.
CAM-DRG yönteminin kısa gözlem zaman dilimi de dahil olmak üzere bazı sınırlamaları vardır. Embriyonun bağışıklık sistemi fizyolojik olarak günde 1827, ret ve enflamatuar bir süreç gerçekleşebilir, deneysel süreyi sınırlandırarak etkindir. Ayrıca, DRG 'ye yakın tümör hücrelerini eritme mesafesini dikkate almak önemlidir; daha büyük DRG-Cancer mesafeler tümör hücreleri ve sinir arasındaki moleküler etkileşimleri zarar verebilir, ya da modelin her iki bileşeni arasında fiziksel temas geciktirebilir. Ayrıca, embriyolar Bu protokolde belirtilenden daha yaşlandıkça bu tümör hücrelerini ayırabilir. Bu nedenle, hücre grestleme için 10 gün sonrası fertilizasyon ile tutarlı yumurta kullanmak önemlidir.
Bağışıklık sistemi, 1827günden önce tam olarak gelişmemiş olduğundan, cam 'deki tümör mikroortamı genellikle kanser çalışmaları için kullanılan immünolojik olarak bastırılmış murin modellerinin benzeridir. Bu nedenle, bu model tümör ilerlemesinde bağışıklık hücrelerinin rolünü değerlendirmek için yararlı değildir. Başka bir sınırlama, antikorlar, sitokinler ve astar gibi tavuk türleri için reaktiflerin kısıtlanmasıdır.
Bu protokol doğru şekilde gerçekleştirilmesi uygulama gerektirir; Ancak, özel bir çekirdek tesisi için gerek kalmadan bir laboratuvar üyesi tarafından yapılabilir. Yumurta kabuğu sondaj eğitim gerektirir. İlk kez bu model çalışmadan önce bakkal (döllenmeyen) yumurta üzerinde pratik tavsiye edilir. Yüksek embriyonik hayatta kalma ve modelin başarısı elde edilebilir eğer enfeksiyon önlemek için bazı kritik adımlar takip edilir:% 2 pen/strep içinde DRGs uygun antibiyotik profilaksi, bir laminar akış kabininde çalışan, ve yumurta kabuğu parçacıkları dağılımı kaçınarak CAM üzerine takın. Aynı zamanda toplam yumurta kuluçka süresi sırasında istikrarlı nem tutmak için çok önemlidir. Teknik hakim olana kadar grup başına yumurta sayısını artırmanızı öneririz. Deneyimsiz laboratuar personeli için en sık karşılaşılan sorunlar, hücre grerekleme için yumurta kontaminasyonu ve yanlış tekniktir.
DRG hasat da eğitim gerektirir; in vitro deneyler için DRGs hasat pratiği8 in vivo modeli denemeden önce önerilir. İn vitro DRG kültürü, koşulları optimize etmek ve DRG ekstraksiyon süresini kısaltmak için tekniği iyileştirmek için bir fırsattır. DRG 'nin forseps ile yakalanırken hasat tekniğine özel dikkat gereklidir. DRG doğrudan tutulmamalıdır; altında basınç uygulanmalıdır. Biz daha iyi ekstraksiyon sırasında DRG görselleştirmek için Büyüteç objektif kullanımını öneririz.
Daha da önemlisi, bu modeli ilk kez gerçekleştirirken, tüm koşulların istenen hücre çizgisi için optimize edilmesi gerekir. Bu model Rat DRG ve HM-SCC-1 HNC hücre hattı için optimize edilmiştir. Fare DRG ve diğer kanser hücre türlerinin kullanımı optimizasyon gerektirebilir. Daha yüksek konsantrasyonlarda grepi hücreler, tümörlerin daha kalın ve daha sert büyümeye eğilimindedir, hangi tümör ölçümleri kolaylaştırır. Her bir grup için birden fazla yumurta ve her yumurta için uygun bir hücre konsantrasyonu dikkate alındığında, her deney için birkaç milyon hücre gerekebilir. Planlamanın kolaylaştırılması için hücrelerin ikiye katlama süresini dikkate almak gerekir. Bu protokoldeki bazı kritik adımlar için, bir sorun giderme tablosu sağlanır (Tablo 1).
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip ilgi bildirir.
Acknowledgments
Bu çalışma NıH/NıCR hibe DE027551 ve DE022567 (NJD) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | # 25200-056 | |
| ACE light source | SCHOTT North America, Inc. | Used to transilluminate the eggs | |
| CellTracker Green CMFDA fluorescent dye | Life Technologies | # C7025 | Reconstitute 50µg in 20µL of DMSO and stock at -20oC. Use 1µL of stock solution/mL of culture medium. |
| CellTracker Red CMTPX fluorescent dye | Life Technologies | # C34552 | Reconstitute 50µg in 40µL of DMSO and stock at -20oC. Use 1µL of stock solution/mL of culture medium |
| Cordless rotary tool | DREMEL | # 866 | Used to drill the egg shell |
| DMEM (1x) | Gibco | # 11965-092 | Dulbeecco`s Modified Eagle Medium |
| DMSO | Fisher Bioreagents | # BP231-100 | Dimethyl Sulfoxide |
| Dumont # 5 fine forceps | Fine Science Tools (FST) | # 11254-20 | Used to harvest DRG |
| Egg incubator | GQF Digital Sportsman | # 1502 | Egg incubator equipped with automatic rotator, digital thermostat, temperature and humidity controls |
| Engraving cutter | DREMEL | # 108 | Used to drill the egg shell |
| Extra fine Graefe forceps, curved | Fine Science Tools (FST) | # 11151-10 | Used to graft DRG onto the CAM on day 8 and to harvest CAM tissue on day 17 |
| Extra fine Graefe forceps, straight | Fine Science Tools (FST) | # 11150-10 | Used to graft DRG onto the CAM on day 8 and to harvest CAM tissue on day 17 |
| Fertilized Lohmann White Leghorn eggs | Fertilized eggs at early fertilization days, preferably on first day post-fertilization. Eggs used in this protocol are from Michigan State University Poultry Farm. | ||
| Filter Forceps | EMD Millipore | # XX6200006P | Blunt forceps used to remove the egg shell |
| Fine surgical straight sharp scissor | Fine Science Tools (FST) | #14060-09 | Used to harvest the CAM tissue on day 17 |
| HBSS (1x) | Gibco | # 14025-092 | Hank`s Balanced Salt Solution |
| HI FBS | Gibco | # 10082-147 | Heat-inactivated Fetal Bovine Serum |
| Paraffin wax membrane | Parafilm laboratory film | # PM-996 | Used to temporarily cover the egg openings until DRG grafting on day 8 |
| PBS (1x) pH 7.4 | Gibco | # 10010-023 | Phosphate Buffered Saline |
| Pen/Strep | Gibco | # 15140-122 | 10,000 Units/mL Penicilin, 10,000 µg/mL Streptomycin |
| PFA (paraformaldehyde solution) | Sigma-Aldrich | # P6148-1KG | Dilute in water to make a 4% PFA solution |
| Sprague Dawley rats (females) | Charles River laboratories | Strain code: 001 | 6-7 weeks old (190-210g in weight) |
| Tegaderm Transparent Film Dressing | 3M | # 9505W | Sterile, 6x7cm, used to cover the egg openings during incubation |
References
- Schmitd, L. B., Scanlon, C. S., D'Silva, N. J. Perineural Invasion in Head and Neck Cancer. Journal of dental research. 97 (7), 742-750 (2018).
- Liebig, C., Ayala, G., Wilks, J. A., Berger, D. H., Albo, D. Perineural invasion in cancer: a review of the literature. Cancer. 115 (15), 3379-3391 (2009).
- Schmitd, L. B., et al. Redefining Perineural Invasion: Integration of Biology With Clinical Outcome. Neoplasia (New York, N.Y). 20 (7), 657-667 (2018).
- Chinn, S. B., et al. Impact of perineural invasion in the pathologically N0 neck in oral cavity squamous cell carcinoma. Otolaryngology--head and neck surgery : official journal of American Academy of Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 149 (6), 893-899 (2013).
- Tai, S. K., Li, W. Y., Yang, M. H., Chu, P. Y., Wang, Y. F. Perineural invasion in T1 oral squamous cell carcinoma indicates the need for aggressive elective neck dissection. The American journal of surgical pathology. 37 (8), 1164-1172 (2013).
- Scanlon, C. S., et al. Galanin modulates the neural niche to favour perineural invasion in head and neck cancer. Nature communications. 6, 6885 (2015).
- Amit, M., et al. Upregulation of RET induces perineurial invasion of pancreatic adenocarcinoma. Oncogene. 36 (23), 3232-3239 (2017).
- Huyett, P., Gilbert, M., Liu, L., Ferris, R. L., Kim, S. A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma. Journal of visualized experiments : JoVE. (119), (2017).
- Ayala, G. E., et al. In vitro dorsal root ganglia and human prostate cell line interaction: redefining perineural invasion in prostate cancer. The Prostate. 49 (3), 213-223 (2001).
- Liu, M., et al. The Histone Methyltransferase EZH2 Mediates Tumor Progression on the Chick Chorioallantoic Membrane Assay, a Novel Model of Head and Neck Squamous Cell Carcinoma. Translational oncology. 6 (3), 273-281 (2013).
- Busch, C., Krochmann, J., Drews, U. The chick embryo as an experimental system for melanoma cell invasion. PloS one. 8 (1), e53970 (2013).
- Li, M., et al. The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma. Journal of visualized experiments : JoVE. (104), (2015).
- Ota, I., Li, X. Y., Hu, Y., Weiss, S. J. Induction of a MT1-MMP and MT2-MMP-dependent basement membrane transmigration program in cancer cells by Snail1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (48), 20318-20323 (2009).
- Murphy, J. B. TRANSPLANTABILITY OF TISSUES TO THE EMBRYO OF FOREIGN SPECIES : ITS BEARING ON QUESTIONS OF TISSUE SPECIFICITY AND TUMOR IMMUNITY. The Journal of experimental medicine. 17 (4), 482-493 (1913).
- Ribatti, D., Nico, B., Vacca, A., Presta, M. The gelatin sponge-chorioallantoic membrane assay. Nature. 1 (1), 85-91 (2006).
- Auerbach, R., Arensman, R., Kubai, L., Folkman, J. Tumor-induced angiogenesis: lack of inhibition by irradiation. International journal of cancer. 15 (2), 241-245 (1975).
- Banerjee, R., et al. The G protein-coupled receptor GALR2 promotes angiogenesis in head and neck cancer. Molecular cancer therapeutics. 13 (5), 1323-1333 (2014).
- Ossowski, L., Reich, E. Experimental model for quantitative study of metastasis. Cancer research. 40 (7), 2300-2309 (1980).
- Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
- Moreno-Jimenez, I., et al. The chorioallantoic membrane (CAM) assay for the study of human bone regeneration: a refinement animal model for tissue engineering. Scientific reports. 6, 32168 (2016).
- Vu, B. T., et al. Chick chorioallantoic membrane assay as an in vivo model to study the effect of nanoparticle-based anticancer drugs in ovarian cancer. Scientific reports. 8 (1), 8524 (2018).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC research notes. 9, 82 (2016).
- Cavel, O., et al. Endoneurial macrophages induce perineural invasion of pancreatic cancer cells by secretion of GDNF and activation of RET tyrosine kinase receptor. Cancer research. 72 (22), 5733-5743 (2012).
- Guo, K., et al. Interaction of the sympathetic nerve with pancreatic cancer cells promotes perineural invasion through the activation of STAT3 signaling. Molecular cancer therapeutics. 12 (3), 264-273 (2013).
- Deborde, S., et al. An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion. Journal of visualized experiments : JoVE. (134), (2018).
- Magnon, C., et al. Autonomic nerve development contributes to prostate cancer progression. 341 (6142), Science. New York, N.Y. 1236361 (2013).
- Ribatti, D. Chick embryo chorioallantoic membrane as a useful tool to study angiogenesis. International review of cell and molecular biology. 270, 181-224 (2008).
