Summary
L'invasione perialinale è un fenotipo aggressivo per carcinomi a cellule squamose testa e collo e altri tumori. Il modello di membrana corioalltoica del pulcino è stato utilizzato per studiare angiogenesi, invasione del cancro e metastasi. Qui dimostriamo come questo modello può essere utilizzato per valutare l'invasione perineurale in vivo.
Abstract
L'invasione perialinale è un fenotipo in cui il cancro circonda o invade i nervi. È associato a scarso esito clinico per il carcinoma a cellule squamose della testa e del collo e altri tipi di cancro. Studi meccanicistici hanno dimostrato che il crosstalk molecolare tra nervi e cellule tumorali si verifica prima dell'interazione fisica. Ci sono solo pochi modelli in vivo per studiare l'invasione perineurale, soprattutto per indagare la progressione precoce, prima che si verifichino interazioni fisico nervo-tumore. Il modello di membrana corioallantoica del pulcino è stato utilizzato per studiare l'invasione del cancro, perché la membrana seminterrato dell'epitelio coronico imita quella del tessuto epiteliale umano. Qui abbiamo riproposto il modello di membrana corioallantoica pulcino per indagare l'invasione perineurale, innestando gangli di radice dorsale del ratto e cellule carcinoma a cellule squamose umane sull'epitelio coronico. Abbiamo dimostrato come questo modello possa essere utile per valutare la capacità delle cellule tumorali di invadere il tessuto neurale in vivo.
Introduction
L'invasione perineurale (PNI) è un fenotipo poco studiato nel cancro, che è associato ad alta recidiva della malattia e scarsa sopravvivenza nei pazienti con carcinoma a cellule squamose testa e collo (HNC)1. La PNI è definita microscopicamente come cellule tumorali all'interno o che circondano i nervi2,3. Quando viene rilevato il PNI, è probabile che i pazienti ricevano terapie adiuvanti come la dissezione elettiva del collo e/o la radioterapia4,5. Tuttavia, queste terapie sono aggressive e non specifiche del PNI. Infatti, non esiste una terapia per bloccare il PNI, soprattutto perché i meccanismi alla base delle interazioni nervo-tumore sono ancora poco compresi.
Diversi meccanismi molecolari sono stati implicati nell'attrazione nervo-tumorale; tumori e cellule stromali rilasciano neuropeptidi e fattori di crescita per promuovere la neuritogenesi6,7. Quando coltivate insieme in vitro, le cellule HNC e i gangli della radice dorsale (DRG) hanno entrambi una risposta robusta; effetti sull'invasione delle cellule tumorali e neuritogenesi può essere visto dopo pochi giorni in coltura6,8,9. Tuttavia, c'è una mancanza di modelli in vivo appropriati per ricapitolare le interazioni tumora-nervo prima dell'invasione. Qui presentiamo un modello PNI in vivo per studiare le prime interazioni tra cellule HNC e nervi6. Abbiamo adattato il modello di membrana corioallantonica (CAM) del pulcino per includere una componente neurale, innestando una DRG nella CAM, seguita da un innesto di cellule tumorali per imitare un microambiente tumorale innervato.
Il modello CAM è stato utilizzato con successo per valutare l'invasione delle cellule attraverso la membrana del seminterrato, imitando le prime fasi invasive di carcinomi e melanoma10,11,12. Il CAM è composto da epitelio coronico superiore, intervenendo mesenchyme, e abbassare l'epitelio allantoico. L'epitelio coronico è strutturalmente simile all'epitelio umano10,13 in quanto la membrana sotterranea ricca di collagene-IV simula la membrana del seminterrato che separa l'epitelio orale dal tessuto connettivo sottostante. Dal momento che i primi innesti tumorali sono stati eseguiti nel CAM nel 191314, molti adattamenti del metodo sono stati sviluppati per consentire la valutazione dell'angiogenesi15,16,17, progressione tumorale, e metastasi18. È importante sottolineare che la tecnica di innesto dei tumori sulla CAM è cambiata molto poco, ma le applicazioni sono in continua evoluzione. Sono stati pubblicati saggi di crescente complessità, tra cui lo screening farmacologico19, l'ingegneria dei tessuti ossei20e i farmaci anticancro basati sulle nanoparticelle21.
Il nostro laboratorio utilizza un modello CAM-DRG in cui un mammifero DRG è isolato e innestato sulla superficie del CAM superiore. Dopo che il DRG viene incorporato nel CAM, le cellule HNC vengono innestate vicino al DRG e possono interagire con il DRG prima che l'intero sistema in vivo venga raccolto e analizzato. È importante sottolineare che il sistema consente l'osservazione visiva ex-vivo sia della DRG che del tumore mediante l'etichettatura a fluorescenza delle cellule DRG e tumorali. Questo protocollo comprende più passaggi con diversi livelli di complessità eseguiti entro 17 giorni, dall'incubazione delle uova alla raccolta del CAM (Figura 1). Le cellule che esprimono diverse proteine di interesse possono essere testate in questo modello per chiarire i percorsi molecolari responsabili dell'invasione dei nervi nel cancro, e anche per lo screening di farmaci per indirizzare direttamente l'invasione neurale. Le cellule pretrattate con un farmaco candidato possono essere innestati sul CAM e l'insorgenza di PNI studiata rispetto ai controlli non trattati. Infatti, il modello CAM è stato utilizzato per lo screening farmacologico come passaggio intermedio tra studi in vitro e studi preclinici in vivo nei roditori19.
Il progetto sperimentale varierà con l'ipotesi. Ad esempio, se si testa il ruolo di una proteina specifica sul PNI, il gruppo sperimentale includerebbe DRG innestato con cellule tumorali che sovraesprimono la proteina, mentre il gruppo di controllo dovrebbe includere DRG con cellule strapazzate trascate con vettore vuoto. Diversi progetti sperimentali possono essere utilizzati per affrontare domande specifiche.
Protocol
Dichiarazione etica: Tutti gli esperimenti che utilizzano ratti in questo protocollo sono fatti in conformità con le regole IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) della nostra istituzione. Gli esperimenti con le uova in questo studio sono esenti dalla regolamentazione IACUC.
1. Incubazione delle uova (tempo stimato: 5 min, giorno zero)
- Ottenere uova commerciali senza patogeni Lohmann White Leghorn, preferibilmente il primo giorno dopo la fecondazione. Incubare sei uova per gruppo sperimentale in un'incubatrice umidificante delle uova a 38 gradi centigradi e il 54% di umidità per 8 giorni con rotazione oraria. Utilizzare la rotazione regolare delle uova per evitare che l'embrione si attacchi alle membrane dell'uovo.
NOTA: Prima dell'incubazione, conservare le uova in un frigorifero a 18 gradi centigradi per arrestare lo sviluppo dell'embrione per un massimo di 1 settimana.
2. Raccolta e preparazione dei DRG (tempo stimato: 2 h, giorno 8)
NOTA: Gli esperimenti con topi e ratti richiedono l'approvazione di (IACUC). In alcuni paesi, l'uso di uova di gallina richiede anche l'approvazione.
- Ottenere da sei a sette settimane-vecchio ratti Sprague Dawley ( 200 g di peso) per estrarre DRGs.
NOTA: Un ratto dovrebbe produrre 40 DRG cervicali e toracici. - In un armadietto a flusso laminare, raccogliere drG da regioni cervicali e toraciche seguendo il protocollo per l'estrazione del mouse DRG pubblicato altrove22. Seguire la figura 2 per l'orientamento su come raccogliere i DRG.
- Eutanasia del ratto per puntura cardiaca dopo la somministrazione di Ketamina / Xylazina iniettata per via intraperitonela. Pulire la pelle di ratto con il 70% di etanolo e rimuovere la colonna vertebrale del ratto utilizzando una forbice. Non eseguire lussazione cervicale perché questo danneggerebbe i DRG cervicali.
- Separare le regioni cervicali, toraciche e lombari con la stessa forbice, seguendo la rappresentazione anatomica schematica e le immagini lorde fornite nella Figura 2A-D. Posizionare le sezioni della colonna vertebrale in un piatto di coltura di 10 cm con 1x PBS per mantenere i tessuti bagnati.
- Con una delicata forbice ossea, aprire le ossa vertebrali negli aspetti dorsali e ventrali, separando la colonna vertebrale in due metà laterali (Figura 2E-F). Mettere le sezioni di tessuto in un piatto pulito di 10 cm con 1x PBS fresco.
- Utilizzando le pinze, staccare delicatamente il midollo spinale dalle ossa vertebrali per visualizzare i DRG (Figura 2G).
- Con pinze sottili tenute sotto ogni DRG, afferrarlo e tirarlo fuori dalla cavità ossea in cui è alloggiato. Non tenere direttamente il DRG perché questo causerà danni ai tessuti. Non tagliare i fasci di assone dal DRG (Figura 2H).
NOTA: Evitare l'utilizzo di DRG lombari poiché questi hanno ridotto l'integrazione nel CAM. Per la posizione della regione DRG, seguire l'illustrazione schematica e le immagini anatomiche lorde nella figura 2A-D.
- Subito dopo la raccolta, collocare ogni DRG nel mezzo di coltura DMEM integrato con il 2% Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) e il 10% di siero fetale Bovino inattivato dal calore (FBS) per aiutare a prevenire la contaminazione batterica delle DRG. piatto di coltura con 4 mL di mezzo di coltura.
- Dopo aver raccolto tutte le DRG, trasferirle in un nuovo piatto di coltura con mezzo di coltura DMEM integrato con 2% Penna/Strepe più 10% FBS e contenente 1,25 g/mL di tintura fluorescente rossa. Incubare per 1 h nell'incubatrice di coltura cellulare. Durante questo periodo, preparare le uova a ricevere il DRG come descritto di seguito (passaggio 3).
NOTA: l'intervallo tra i DRG di raccolta e il completamento dell'etichettatura a fluorescenza dovrebbe essere sufficiente per preparare le uova; I DRG possono essere conservati per alcune ore nell'incubatrice.
3. Preparazione delle uova per l'innesto DRG (tempo stimato: 1 h per una dozzina di uova, giorno 8)
- In un armadio a flusso laminare, attenuare la luce e trasilluminare le uova per verificare la vitalità e la fase embrionale. Escludere le uova con scarsa vascolatura, uova non fecondate o uova non coerenti con l'ottava giornata dopo la fecondazione. Tenere l'uovo delicatamente con la sacca d'aria naturale verso la sorgente luminosa (Figura 3A).
- Con una matita, segnare il guscio dell'uovo per ricevere le aperture (Figura 3A-B).
- In primo luogo, identificare l'attaccamento dell'embrione in via di sviluppo alla CAM come un vaso in movimento scuro attaccato alla membrana dell'uovo e contrassegnare questa area per evitare interventi in questa regione.
- In secondo luogo, scegliere l'area della finestra operativa come un'area ben vascolarizzata almeno 2 cm dall'attacco embrione e disegnare un cerchio di 1,5 cm di diametro. A circa 1 cm dalla finestra operativa, disegnare un quadrato di 0,5 cm in una zona meno vascolarizzata.
- In terzo luogo, disegnare la regione sacco d'aria per escluderlo dalla zona di operazione. Segna il centro del sacco d'aria con una croce.
- Con un attrezzo rotativo e un trapano di incisione, di 3 mm di diametro, forare il guscio dell'uovo nel quadrato contrassegnato (Figura 3C). Utilizzare pinze smussate per rimuovere il guscio dell'uovo senza rimuovere la membrana del guscio dell'uovo esterna (la membrana bianca proprio sotto il guscio) (Figura 3D). Lavorare con attenzione per evitare la perforazione accidentale di questa membrana.
- Utilizzando lo stesso trapano del passaggio 3.3, effettuare una perforazione con punta nella croce marcata nell'area del sacco d'aria per consentire il flusso d'aria nell'uovo (Figura 3E). Fare attenzione a non applicare troppa pressione all'uovo, per evitare di romperlo o danneggiarlo.
- Collocare 30 l di HBSS nell'apertura quadrata, sopra la membrana del guscio d'uovo esterna intatta (Figura 3E). Con un ago di siringa 30-G, fare una perforazione pinpoint nella membrana esterna in questa area quadrata (Figura 3F).
- Posizionare l'uovo nella sorgente luminosa per visualizzare il sacco d'aria. Applicare la pressione su una lampadina di gomma contagocce e posizionarla nella piccola perforazione fatta nell'area del sacco d'aria (passaggio 3.4). Rilasciare la pressione nella lampadina fino a quando non si vede la separazione delle due membrane nell'area della finestra di funzionamento (Figura 3G); ripetere questo passaggio tutte le volte che è necessario per ottenere la completa separazione delle membrane nell'area della finestra di funzionamento.
- Ripetere i passaggi da 3.1 a 3.6 per tutte le uova.
- Utilizzando lo stesso trapano del passaggio 3.3, forare la finestra circolare di funzionamento facendo attenzione a non rompersi la membrana esterna del guscio dell'uovo (Figura 3H). Pulire la superficie dell'uovo attaccando delicatamente un nastro adesivo per rimuovere tutte le particelle sciolte.
- Con pinze smussate, rimuovere il guscio dell'uovo dall'area forata (Figura 3I-J). Successivamente, con le stesse pinze, rimuovere la membrana del guscio dell'uovo esterno (Figura 3K), facendo attenzione a non introdurre piccole particelle di guscio all'interno dell'uovo per ridurre al minimo la contaminazione.
- Identificare il CAM approssimativamente a 1 cm di profondità dalla superficie dell'uovo. Coprire temporaneamente ogni uovo aperto con membrana di cera di paraffina per evitare la contaminazione (Figura 3L).
- Ripetere i passaggi da 3,8 a 3,10 per tutte le uova. Riporre le uova nell'incubatrice di uova senza rotazione fino a quando i DRG non sono pronti per l'innesto.
4. Innesto DRG sul CAM (tempo stimato: 40 min, giorno 8)
- Preparare un piatto di coltura di 6 cm con mezzo HBSS, per lavare i DRG prima dell'impianto. Portare le uova preparate nell'armadio del flusso laminare della coltura cellulare. Rimuovere la membrana di paraffina dall'uovo (Figura 4A).
- Con pinze sterili fini, afferrare delicatamente un DRG dall'interno del mezzo di coltura. Immergerlo nel mezzo HBSS per rimuovere il mezzo in eccesso che contiene il tinrito fluorescente. Tenere il DRG molto delicatamente; in caso contrario, si attaccherà alle pinze.
- Posizionare il DRG sul CAM, facendo attenzione a non forare la membrana (Figura 4B-C). Se necessario, utilizzare un'altra coppia di pinze per scollegare il DRG dalla punta delle pinze quando lo si posiziona sul CAM.
NOTA: Mantenere il DRG bagnato con il mezzo HBSS faciliterà anche il distacco dalle pinze. - Coprire l'uovo con una medicazione sterile trasparente. Coprire tutte le finestre e le forature fatte nel guscio dell'uovo per evitare la contaminazione batterica (Figura 4D).
- Dopo aver innestato i DRG in tutte le uova, incubare le uova in un'incubatrice umidificante a 38 e 54% di umidità per 2 giorni, senza rotazione.
5. Innesto di cellule tumorali sulla CAM (tempo runità stimata: 1 h 30 min, giorno 10)
- A 48 h prima di innestare le cellule, placcare le cellule necessarie in piastre di coltura. Calcolare da 0,5 a 1 x 106 cellule per uovo per le cellule UM-SCC-1 al fine di generare tumori tridimensionali nella CAM. Tieni presente che il numero di cella può variare in base alla linea di celle.
- Mezzo aspirato e aggiungere il mezzo di coltura DMEM integrato con 1% Penna/Strepp più 10% FBS e 2,5 g/mL di colorante fluorescente verde. Incubare per 1 h a 37 gradi centigradi nell'incubatrice a coltura cellulare. Quindi, controllare l'intensità di fluorescenza al microscopio, mezzo aspirato, lavare una volta con 1x PBS, e aggiungere 0.25% trypsin per un massimo di 10 min. Neutralizza la trypsin con il mezzo integrato DMEM.
- Centrifuga a 250 x g per 4 min per formare un pellet cellulare. Aspirare il mezzo DMEM e ri-sospendere in HBSS per lavare il colorno fluorescente in eccesso. Contare le cellule usando un emocitometro.
- Portare le uova all'armadio del flusso laminare coltura cellulare. Con forbici e pinze, aprire la medicazione trasparente che copre l'uovo (Figura 4E-F).
- Centrifugare nuovamente il numero calcolato di celle, aspirare il mezzo HBSS e sospendere nuovamente a una concentrazione finale di 0,5-1x106 celle per 5 celle dello stesso mezzo (Figura 4G). Preparare la quantità necessaria per il numero totale di uova (5 - L of cell suspension per uovo).
- Posizionare 5 -L di soluzione cellulare sul CAM, a circa 2 mm dal DRG (Figura 4H). Mantenere distanze uniformi tra il DRG e le cellule. Fare molta attenzione a non disturbare l'uovo per ridurre al minimo la diffusione delle cellule.
NOTA: per avviare l'impianto cellulare, scegliere le uova su cui la superficie CAM è visivamente asciutta. Se la superficie è troppo umida, le cellule possono diffondersi e non formano tumori regolari. - Coprire l'uovo con un nuovo condimento per pellicole come al punto 4.4. Innestare le cellule in tutte le uova. Incubare le uova in un'incubatrice umidificante a 38 gradi centigradi e il 54% di umidità per 7 giorni, senza rotazione.
6. Raccolta del CAM (tempo stimato: 1 h per dozzina di uova, giorno 17)
- Preparare 6 piatti con 4% PFA (paraformaldeide) pH7.0, un pozzo per uovo, 2 mL per pozzo.
- Portate le uova su un banco di laboratorio. Utilizzando un ago attaccato ad una siringa per perforare la medicazione della pellicola, cadere intorno a 300 -L di PFA sopra la CAM per irrigidire leggermente il CAM, facilitando così il processo di raccolta. Ripetere l'operazione per tutte le uova.
- Con una forbice, rimuovere la metà superiore del guscio dell'uovo (dove si trova la finestra operatoria) con il CAM collegato ad esso (Figura 4I). Ridurre le dimensioni di questa metà a circa 3 cm di diametro, mantenendo la porzione del CAM dove DRG e cellule tumorali sono stati innestati al centro (Figura 4J). Afferrare il CAM con pinze sottili e staccarlo dal guscio dell'uovo mentre lo si mette nel PFA. Orientare il DRG e le cellule tumorali rivolte verso l'alto (Figura 4K-L).
NOTA: l'area di 3 cm deve includere sia il DRG che le celle. Il DRG è facilmente visto come un piccolo grumo attaccato sulla CAM, tuttavia le cellule tumorali sono a volte difficili da identificare durante l'esame lordo. - In alternativa, con una forbice, allargare la finestra operativa rimuovendo il guscio dell'uovo dalla parte superiore dell'uovo mantenendo la CAM in posizione; rimuovere circa 1 cm oltre la finestra operativa (Figura 4M) e identificare il file DRG e le celle sul CAM (Figura 4N-O). Con delicate pinze sottili, tenere il CAM su uno dei bordi e sollevarlo delicatamente. Con forbici delicate e taglienti, tagliare delicatamente il CAM per rimuovere un'area circolare, di circa 3 cm di diametro (Figura 4P), e posizionare il CAM in PFA con DRG e cellule tumorali rivolte verso l'alto.
NOTA: Evitare di allungare o trattenere la CAM con pinze in più punti per ridurre al minimo i danni ai tessuti che possono generare artefatti di microscopia. - Posizionare ogni membrana CAM in un pozzo (Figura 4L). Afferrare delicatamente i bordi del CAM per stendere il tessuto aperto nel PFA o scuotere delicatamente la piastra fino a quando il CAM è spiegato, per evitare artefatti di piegatura.
- Eutanasia l'embrione (giorno 17) per rapida decapitazione. Fissare i tessuti raccolti in PFA per 4 h a temperatura ambiente. Dopo la fissazione, sostituire PFA con 1x PBS e conservare i tessuti in PBS a 4 gradi centigradi fino all'incorporamento in paraffina per la sezionamento. Evitare di correggere eccessivamente che danneggino la delicata vascolatura del CAM.
- Utilizzando uno stereomicroscopio a fluorescenza, fotografare le membrane entro 2 giorni dalla raccolta per evitare di perdere segnali fluorescenti.
Representative Results
Quando ottimizzato, questo metodo ha quasi 100% DRG integrazione nel CAM. I risultati rappresentativi dell'integrazione di DRG sono riportati nella figura 5A-B. L'integrazione della DRG nella CAM è importante in quanto fornisce vitalità al tessuto DRG durante l'esperimento. Microscopicamente, la DRG è vista all'interno del tessuto connettivo della CA (macchia H&E). I vasi sanguigni sono spesso visti all'interno del tessuto DRG, suggerendo che l'afflusso di sangue CAM sta alimentando il tessuto innestato. I tumori impiantati sono identificati anche sulla CAM da H&E; a seconda di quanta invasione è presente, i tumori potrebbero presentare non con nessuna a numerose isole tumorali che invadono il tessuto connettivo (Figura 5C-D). La figura 5E-F rappresentativa mostra il CAM raccolto sull'imaging a campo luminoso e la fluorescenza fusa. Le cellule UM-SCC-1 che sovraesprimono il recettore Galanin 2 hanno rappresentato una maggiore invasione del DRG rispetto alle cellule di controllo (Figura 5G-H). L'interazione cancro-DRG è osservata come cellule tumorali che presentano l'invasione direzionale verso il DRG (Figura 5H).
L'analisi dei dati viene eseguita in modi diversi. L'invasione direzionale delle cellule tumorali verso la DRG è osservata come una variabile dicotoma e il numero di uova che presentano questo modello di invasione è contato in ogni gruppo. Le differenze statistiche tra i gruppi vengono calcolate utilizzando un test binomiale di proporzioni. La vicinanza tra le cellule tumorali e DRG, e l'area del tumore sono misurati utilizzando ImageJ6 e le differenze tra i gruppi vengono valutate utilizzando il test di non di Student. Per garantire la precisione con l'analisi ImageJ, tutte le immagini dello stesso esperimento devono essere prese in base alle impostazioni di luce e luminosità uguali. Dopo aver regolato la soglia dell'immagine e la luminosità di tutte le immagini utilizzando gli stessi criteri, lo strumento Analizza particelle viene utilizzato per misurare l'area del tumore e lo strumento di misurazione lineare misura le distanze tumora-DRG. È importante utilizzare l'impostazione costante delle dimensioni delle particelle analizzate per tutte le immagini in gruppi diversi. In alcuni casi, i tumori crescono più spessi e possono essere misurati manualmente con una pinza digitale, consentendo una misurazione del volume.
Utilizzando sezioni di tessuto CAM incorporato nella paraffina, è possibile eseguire la macchia H&E o l'immunostochimica per le cellule epiteliali (anticorpi anti-citokeratina reattivi per le specie umane), consentendo la valutazione dell'invasione all'interno del tessuto connettivo. L'invasione è quantificata come il numero di isole tumorali nel tessuto connettivo per uovo. L'immunofluorescenza per il collagene IV può essere utilizzata per evidenziare la membrana del seminterrato. Inoltre, se si utilizzano cellule tumorali con etichetta su GFP, l'identificazione di queste cellule nelle sezioni del tessuto è facilitata senza un'immunohistochimica per la citokertina. La metastasi e l'analisi dell'angiogenesi negli esperimenti CAM sono discusse altrove10,17.
Figura 1: sequenza temporale dell'esperimento che include i passaggi principali nei giorni 0, 8, 10 e 17. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Estrazione DRG il giorno 8 . A. Schema del ratto che illustra la posizione anatomica della colonna vertebrale. B.Diagramma della configurazione delle vertebre del ratto che mostra diverse regioni del corpo; verde per cervicale, blu scuro per toracico, arancione per lombare e azzurro per le vertebre sacrali. C-D. Aspetto ventrale della colonna vertebrale del ratto dopo l'escissione chirurgica; separazione delle regioni, come illustrato in B. E. Dissezione delle vertebre per aprire il canale del midollo spinale, separando i corpi vertebrali in due sezioni laterali contenenti le DRG. Sezione dovrebbe tagliare attraverso l'aspetto dorsale e ventrale di ogni osso vertebrale alla linea mediana. F. Aspetto lordo della colonna vertebrale toracica aperta. G.Dopo lo sfollamento del midollo spinale, i DRG sono facilmente visibili nei simboli vertebrali (teste di freccia che puntano a 3 DRG). H. Immagine stereomicroscopica di un DRG (freccia) con i corrispondenti fasci di assoni (testa di freccia). Barre della scala: C, D, Fe G, 1 cm; H, 1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Preparazione delle uova il giorno 8. A-B. Identificazione della vascolatura e dei segni delle uova prima della procedura. Frecce su Un punto al sacco d'aria naturale. C-D. Foratura e apertura del guscio d'uovo sul segno di apertura quadrato. Freccia su D punta alla membrana del guscio dell'uovo esterno intatta dopo aver rimosso il guscio con l'aiuto di pinze smussate. E. La croce marcata sul sacco d'aria viene perforata con il trapano per consentire il flusso d'aria nell'uovo (testa di freccia). 30 -L di mezzo HBSS è posto sulla membrana del guscio dell'uovo esterna sull'apertura quadrata. F.Con un ago a siringa sottile, la membrana esterna del guscio dell'uovo è perforata dove l'HBSS è stato precedentemente posizionato. G.La pressione viene applicata a una lampadina a gocciolamento di gomma mentre la si attacca alla perforazione perforata sul sacco d'aria. Quando la pressione delle dita viene rilasciata, l'aria viene aspirata, generando un sacco d'aria artificiale (frecce bianche) che dovrebbe estendersi alla finestra operativa. H. I bordi della finestra operativa sono forati in posizione quasi parallela al guscio dell'uovo, per evitare la perforazione accidentale. I-J. Rimozione del guscio dell'uovo con pinze smussate. K. Rimuovere la membrana del guscio dell'uovo esterna con pinze smussate, facendo attenzione a non introdurre particelle sulla CAM (osservate a 1 cm sotto la superficie). L.Le uova sono coperte temporaneamente con una membrana di cera di paraffina e rimesse nell'incubatrice. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: innesto di DRG, cellule e raccolta del CAM: Il giorno 8: A. CAM facilmente osservabile dopo la rimozione della membrana di cera di paraffina. B-C. Con le pinze sottili, DRG viene posizionato sul CAM. D.L'uovo è coperto di pellicola e messo nell'incubatrice; le frecce indicano le aperture coperte. Il giorno 10: E-F. La medicazione per pellicole viene rimossa e si trova DRG (testa di freccia su F). G-H. La soluzione a 5 celle viene rilasciata sul CAM ad una distanza di 2 mm dalla DRG. Il giorno 17: I-L e M-P dimostrano due diversi approcci utilizzati per la raccolta del CAM. I. Il guscio dell'uovo viene aperto con una forbice fine che inizia sul sacco d'aria perforato fino a quando la metà superiore dell'uovo non viene rimossa. J. Il guscio d'uovo contenente la CAM è ridotto di circa 3 cm. Con le pinze sottili, cam viene staccato dal guscio dell'uovo e posto in PFA. M-O. L'allargamento della finestra operativa viene eseguito per visualizzare il DRG e le cellule tumorali sul CAM. La punta della freccia indica il tumore e la freccia indica il DRG. P.Il CAM è afferrato con pinze sottili, ritagliato con una forbice affilata e posto in PFA come mostrato in L. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Risultati rappresentativi. A. sezione H&E che mostra l'integrazione del DRG nel CAM. B.Ingrandimento superiore di A; le frecce mostrano i vasi sanguigni CAM nel DRG. C.Le cellule UM-SCC-1 si sono innestate sul CAM e raccolte quattro giorni dopo l'innesto (macchia H&E). D.Ingrandimento più alto di C che mostra isole tumorali invasive nel tessuto connettivo DELLA CAM (frecce). E. Immaginestereomicroscopica lorda del CAM innestata con cellule UM-SCC-1-GALR2 e ratto DRG, raccolte il giorno 17. F.Fluorescenza unita e immagini luminose che evidenziano il DRG etichettato in rosso e cellule tumorali etichettate in verde. G-H. Stereomicroscopia stereomicroscopia fluorescenza del CAM innestata con DRG e UM-SCC-1-GALR2 rispetto alle cellule di controllo, illustrando l'invasione direzionale delle cellule UM-SCC-1-GALR2 al DRG (H). Barre della scala: A-D, 500 m; E-H, 2 mm. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| passo | problema | motivo | soluzione | ||||||
| 3.2.1 | Impossibile identificare l'attaccamento dell'embrione. | La posizione di attacco è difficile da vedere mentre l'uovo è fermo. | Ruotare l'uovo rapidamente lateralmente per essere in grado di vedere un lungo vaso attaccato alla membrana dell'uovo. | ||||||
| 3.3 e 3.8 | Perforazione della membrana esterna del guscio dell'uovo durante la perforazione. | Posizionamento errato del trapano. | Posizionare il trapano quasi parallelo al guscio dell'uovo durante la perforazione. Se la membrana è perforata nel passaggio 3.3 , non è necessario eseguire un'ulteriore perforazione con ago come indicato al punto 3.5. Se succede un sanguinamento, scartare l'uovo. | ||||||
| 4.3 (in questo stato del documento in stato | DRG si attacca alle pinze. | DRG è asciutto. | Umidità DRG in HBSS e/o utilizzare un ago sottile per aiutare a staccare DRG dalle pinze. | ||||||
| 5.2 (in questo modo) | Le cellule non sono perfettamente etichettate con tintura fluorescente. | Tempo di incubazione. Alcune celle richiedono più tempo per etichettare. | Conservare le celle per un'ora aggiuntiva in supporto con tinri fluorescente. | ||||||
| 5.6 (in inglese) | La bolla d'aria sulla goccia cellulare. | Utilizzando tutto il fluido nella punta della pipetta. | Caricare 1 -L in più rispetto al volume desiderato e non utilizzare l'ultima luna della pipetta durante l'impianto delle cellule. Questo eviterà bolle d'aria nella miscela delle cellule. | ||||||
| 6.3 La sua | Impossibile identificare DRG o cellule durante la raccolta del CAM. | Le piccole DRG, DRG sono state sfollate, le cellule tumorali si sono diffuse. | Se DRG non è visto, raccogliere un'area più ampia del CAM e mettere in un contenitore più grande per la fissazione. Controllare DRG e la posizione delle cellule sotto la fluorescenza in un microscopio stereo, quindi tagliare il CAM a una dimensione più piccola per l'incorporamento della paraffina. | ||||||
Tabella 1: tabella di risoluzione dei problemi
Discussion
Il modello IN vivo CAM-DRG qui presentato affronta i deficit dei modelli precedenti dimostrando l'interazione nervo-tumorale prima dell'invasione fisica del nervo da parte delle cellule tumorali. La maggior parte degli studi in vivo di PNI si concentrano sulla diffusione del tumore e l'inibizione della funzione motoria, e dipendono dall'iniezione diretta delle cellule tumorali nei nervi sciatici23,24,25. L'iniezione di nervo sciatico è un modello in vivo di PNI dove le cellule tumorali vengono iniettate in un nervo sciatico di topo o ratto dove il tumore cresce successivamente. I modelli di iniezione sono utili per mostrare la progressione del tumore distruttivo e dolore derivante da cellule tumorali all'interno dei nervi. Il modello nervoso sciatico è adatto anche per lo studio di fattori che consentono alle cellule tumorali di prosperare nel nervo ma manca la capacità di valutare la fase iniziale del PNI, perché introduce le cellule direttamente nel nervo, bypassando le guaine nervose. In un approccio diverso, gli innesti tumorali ortotopici impiantati chirurgicamente sono stati utilizzati per caratterizzare l'importanza delle fibre nervose adrenergiche e colinergiche nella promozione della progressione del cancro alla prostata, suggerendo così un ruolo prominente dei nervi nella progressione del tumore 26. Questo modello consisteva nell'ablazione chimica dei nervi comprensivi e parasimpatici. Le fibre parasimpatiche si sono infiltrate nei tessuti tumorali, un processo legato al PNI, ma il modello non è stato specificamente utilizzato per valutare le interazioni fisiche tra il nervo e il tumore. Il modello CAM-DRG consente di sforare le interazioni tra il nervo e il cancro durante il PNI. Inoltre, i modelli murini sono costosi e richiedono molto tempo rispetto al modello CAM. Suggeriamo di utilizzare il modello CAM-DRG per studi meccanicistici di PNI.
Alcuni vantaggi dell'approccio CAM-DRG includono la valutazione del PNI e di altri fenotipi, come la crescita tumorale, la metastasi e l'angiogenesi. L'identificazione del DNA umano sulla CAM inferiore e/o nel fegato può essere utilizzata per il rilevamento di metastasi delle linee10delle cellule tumorali umane, un approccio sperimentale più sensibile rispetto alla sezionamento e alla colorazione dei tessuti, che non può rivelare piccole metastasi.
Il metodo CAM-DRG presenta alcune limitazioni, incluso il breve lasso di tempo di osservazione. Il sistema immunitario dell'embrione è fisiologicamente attivo al giorno 1827, quando può avvenire il rigetto e un processo infiammatorio, limitando il tempo sperimentale. È anche importante considerare la distanza durante l'innesto di cellule tumorali vicino alla DRG; distanze più grandi del cancro della DRG potrebbero compromettere le interazioni molecolari tra le cellule tumorali e il nervo, o potrebbero ritardare il contatto fisico tra entrambi i componenti del modello. Inoltre, se gli embrioni sono più vecchi di quanto stabilito in questo protocollo, i movimenti degli embrioni potrebbero spiazzare le cellule tumorali. Pertanto, è importante utilizzare uova coerenti con il giorno 10 post-fecondazione per l'innesto cellulare.
Poiché il sistema immunitario non è completamente sviluppato prima del giorno 1827, il microambiente tumorale nella CAM è simile a quello dei modelli murini immunosoppressi spesso utilizzati per gli studi sul cancro. Pertanto, questo modello non è utile per valutare il ruolo delle cellule immunitarie nella progressione del tumore. Un'altra limitazione è la limitata disponibilità di reagenti per le specie di polli, come anticorpi, citochine e primer.
L'esecuzione accurata di questo protocollo richiede pratica; tuttavia, può essere fatto da un membro di laboratorio senza bisogno di una struttura centrale specializzata. La perforazione del guscio d'uovo richiede formazione. Si raccomanda di praticare con le uova di generi alimentari (non fecondate) prima di tentare questo modello per la prima volta. Alta sopravvivenza embrionale e successo del modello può essere raggiunto se vengono seguiti alcuni passaggi critici per evitare l'infezione: adeguata profilassi antibiotica delle DRG nel 2% Pen/Strep, lavorando in un armadio di flusso laminare ed evitando la dispersione di particelle di guscio dell'uovo sul CAM. È inoltre fondamentale mantenere un'umidità stabile durante il tempo totale di incubazione degli ovociti. Si consiglia di aumentare il numero di uova per gruppo fino a quando la tecnica è padroneggiata. I problemi più frequenti per il personale di laboratorio inesperto sono la contaminazione delle uova e la tecnica imprecisa per l'innesto cellulare.
Anche la raccolta DRG richiede formazione; pratica nella raccolta di DRG per esperimenti in vitro8 prima di tentare il modello in vivo è raccomandato. La cultura DRG in vitro è un'opportunità per ottimizzare le condizioni e migliorare la tecnica per ridurre la durata dell'estrazione DRG. Particolare attenzione alla tecnica di raccolta è necessaria quando si afferra il DRG con pinze. Il DRG non deve essere tenuto direttamente; pressione deve essere applicata sotto di esso. Si consiglia l'uso di lenti di ingrandimento per visualizzare meglio il DRG durante l'estrazione.
È importante sottolineare che quando si esegue questo modello per la prima volta, tutte le condizioni devono essere ottimizzate per la linea di celle desiderata. Questo modello è stato ottimizzato per ratto DRG e la linea cellulare HNC UM-SCC-1. L'uso di mouse DRG e altri tipi di cellule tumorali può richiedere l'ottimizzazione. Con una maggiore concentrazione di cellule innestate, i tumori tendono a crescere più spessi e rigidi, il che facilita le misurazioni del tumore. Prendendo in considerazione più uova per ogni gruppo e un'adeguata concentrazione di cellule per ogni uovo, possono essere necessari diversi milioni di cellule per ogni esperimento. Per facilitare la pianificazione, la conoscenza del tempo di raddoppio delle cellule dovrebbe essere presa in considerazione. Per alcuni passaggi critici di questo protocollo, viene fornita una tabella di risoluzione dei problemi (Tabella 1).
Disclosures
Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni NIH/NIDCR DE027551 e DE022567 (NJD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | # 25200-056 | |
| ACE light source | SCHOTT North America, Inc. | Used to transilluminate the eggs | |
| CellTracker Green CMFDA fluorescent dye | Life Technologies | # C7025 | Reconstitute 50µg in 20µL of DMSO and stock at -20oC. Use 1µL of stock solution/mL of culture medium. |
| CellTracker Red CMTPX fluorescent dye | Life Technologies | # C34552 | Reconstitute 50µg in 40µL of DMSO and stock at -20oC. Use 1µL of stock solution/mL of culture medium |
| Cordless rotary tool | DREMEL | # 866 | Used to drill the egg shell |
| DMEM (1x) | Gibco | # 11965-092 | Dulbeecco`s Modified Eagle Medium |
| DMSO | Fisher Bioreagents | # BP231-100 | Dimethyl Sulfoxide |
| Dumont # 5 fine forceps | Fine Science Tools (FST) | # 11254-20 | Used to harvest DRG |
| Egg incubator | GQF Digital Sportsman | # 1502 | Egg incubator equipped with automatic rotator, digital thermostat, temperature and humidity controls |
| Engraving cutter | DREMEL | # 108 | Used to drill the egg shell |
| Extra fine Graefe forceps, curved | Fine Science Tools (FST) | # 11151-10 | Used to graft DRG onto the CAM on day 8 and to harvest CAM tissue on day 17 |
| Extra fine Graefe forceps, straight | Fine Science Tools (FST) | # 11150-10 | Used to graft DRG onto the CAM on day 8 and to harvest CAM tissue on day 17 |
| Fertilized Lohmann White Leghorn eggs | Fertilized eggs at early fertilization days, preferably on first day post-fertilization. Eggs used in this protocol are from Michigan State University Poultry Farm. | ||
| Filter Forceps | EMD Millipore | # XX6200006P | Blunt forceps used to remove the egg shell |
| Fine surgical straight sharp scissor | Fine Science Tools (FST) | #14060-09 | Used to harvest the CAM tissue on day 17 |
| HBSS (1x) | Gibco | # 14025-092 | Hank`s Balanced Salt Solution |
| HI FBS | Gibco | # 10082-147 | Heat-inactivated Fetal Bovine Serum |
| Paraffin wax membrane | Parafilm laboratory film | # PM-996 | Used to temporarily cover the egg openings until DRG grafting on day 8 |
| PBS (1x) pH 7.4 | Gibco | # 10010-023 | Phosphate Buffered Saline |
| Pen/Strep | Gibco | # 15140-122 | 10,000 Units/mL Penicilin, 10,000 µg/mL Streptomycin |
| PFA (paraformaldehyde solution) | Sigma-Aldrich | # P6148-1KG | Dilute in water to make a 4% PFA solution |
| Sprague Dawley rats (females) | Charles River laboratories | Strain code: 001 | 6-7 weeks old (190-210g in weight) |
| Tegaderm Transparent Film Dressing | 3M | # 9505W | Sterile, 6x7cm, used to cover the egg openings during incubation |
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